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Gebiet der
Erfindung
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Das
Gebiet dieser Erfindung ist die analytische Messung.
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Hintergrund der Erfindung
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Die
analytische Messung in physiologischen Flüssigkeiten, z. B. Blut oder
Blut-abgeleitete Stoffe, hat eine stets zunehmende Bedeutung für die heutige
Gesellschaft. Analytische Detektionsassays finden in einer Vielzahl
von Anwendungsmöglichkeiten
Anwendung, einschließlich
der klinischen Laboruntersuchung, Selbstüberprüfung, etc., wobei die Ergebnisse
einer solchen Untersuchung eine bedeutende Rolle in der Diagnose und
der Handhabung einer Vielzahl von Erkrankungszuständen spielen.
Die Analyte von Interesse umfassen Alkohol, Formaldehyd, Glucose,
Glutaminsäure,
Glycerol, beta-Hydroxybutyrat, L-Lactat,
Leucin, Hydroxybernsteinsäure,
Brenztraubensäure,
Steroide, etc. In Erwiderung auf diese zunehmende Bedeutung der
analytischen Messung ist eine Vielzahl von analytischen Messprotokollen
und Mitteln sowohl für
die klinische als auch für
die häusliche
Verwendung entwickelt worden.
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Viele
der Protokolle und Mittel, die bis heute entwickelt worden sind,
verwenden ein Signal erzeugendes System, um das Vorhandensein des
Analyts von Interesse in einer physiologischen Probe, wie zum Beispiel
Blut, zu identifizieren.
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Während eine
Vielzahl von solchen Signal erzeugenden Systemen bis heute für die Verwendung
in der Messung einer breiten Anzahl von unterschiedlichen Analyten
entwickelt worden sind, besteht weiterhin das Bedürfnis für Weiterentwicklung
solcher Systeme.
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Relevante
Literatur
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Die
Patentdokumente von Interesse umfassen:
US 6,200,773 ;
US 5,902,731 ;
EP 0 908 453 A1 ; WO 94/01578
und WO 94/01544. Die
EP
0 990 706 A und
EP
1 130 111 A beziehen sich auf Reagenzien, die unter anderem
einen Tetrazolium-Farbstoff Vorläufer
für die
Messung der Konzentration eines Analyten in einer Hämoglobin-enthaltenden
biologischen Flüssigkeit
umfassen. Diese Dokumente lehren, daß die Tetrazolium-Verbindungen
gegenüber
Licht sehr empfindlich sind.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wird ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins oder zur Bestimmung
der Konzentration eines Analyten in einer physiologischen Probe
zur Verfügung
gestellt. Dieses Verfahren umfasst: (a) Kontaktierung der physiologischen
Probe mit einem Signal erzeugenden System, umfassend einen wasserlöslichen Tetrazolium-Farbstoff
Vorläufer
und ein Nitrit stabilisierendes Mittel in einer Menge, die ausreichend
ist, um den Tetrazolium-Farbstoff
Vorläufer
zu stabilisieren, wobei der Tetrazolium-Farbstoff Vorläufer nicht
nachteilig beeinträchtigt
wird, wenn das besagte Signal erzeugende System dem Licht ausgesetzt
wird, und wobei das Verhältnis
des besagten Nitrit stabilisierenden Mittels zu dem besagten wasserlöslichen
Tetrazolium-Farbstoff Vorläufer
von 2 bis 500 reicht; und (b) Nachweisen eines Signals des Signal
erzeugenden Systems, um das Vorhandensein oder die Konzentration
des Analyten in der besagten physiologischen Probe zu bestimmen.
In vielen Ausführungsformen
umfasst das Signal erzeugende System Analyten oxidierende Systeme,
von welchen der Tetrazolium-Farbstoff ein Mitglied ist, wobei das
System eine oder mehrere der folgenden zusätzlichen Komponenten umfasst:
ein Analyten oxidierendes Enzym, wie zum Beispiel eine Analyten-Dehydrogenase oder
eine Analyten-Oxidase; ein Elektronen übertragendes Mittel; und einen
Enzym-Cofaktor. Auch werden Verfahren zur Verfügung gestellt, welche Reagenz-Teststreifen
einbeziehen, die die Signal erzeugenden Systeme umfassen, wobei
das Reagenz des besagten letzten Reagenzstreifens nicht nachteilig
beeinträchtigt wird,
wenn er Licht ausgesetzt wird. Die Verfahren finden in der Messung
einer breiten Anzahl von Analyten in einer Probe Anwendung, wie
zum Beispiel einer physiologischen Probe, wie zum Beispiel Blut
oder Fraktionen davon oder ISF (interstitiale Flüssigkeit).
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KURZE BESCHREIBUNG
DER FIGUREN
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1 stellt
ein UV-Vis Spektrum für
WST-5 in wäßriger Lösung ohne
NaNO2 bei Licht oder Dunkelheit für 24 h zur
Verfügung.
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2 stellt
ein UV-Vis Spektrum für
WST-5 in wäßriger Lösung ohne
NaNO2 bei Licht oder Dunkelheit für 24 h bereit.
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3 stellt
ein Reflektionsspektrum von WST-5 auf einer Membran, ohne NaNO2, bei Licht und Dunkelheit für 7 h bereit.
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4 stellt
ein Reflektionsspektrum von WST-5 auf einer Membran, die 0,3 M NaNO2 enthält,
bei Licht und Dunkelheit für
7 h bereit.
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BESCHREIBUNG
DER SPEZIELLEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Es
werden Verfahren für
die Verwendung von Zusammensetzungen von stabilisierten Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz
für die
Messung eines Analyten in einer Probe zur Verfügung gestellt. Die Reagenzzusammensetzungen
umfassen eine Tetrazolium-Farbstoffkomponente, z. B. ein wasserlösliches
Tetrazoliumsalz, und eine wirksame Menge eines Nitrit stabilisierenden
Mittels, z. B. ein Nitritsalz. In vielen Ausführungsformen umfassen die Reagenzzusammensetzungen
zusätzliche
Mitglieder eines den Analyten oxidierendes Signal erzeugenden Systems,
wie zum Beispiel: ein Analyten oxidierendes Enzym, wie zum Beispiel
eine Analyten-Dehydrogenase oder eine Analyten-Oxidase; ein Elektronen übertragendes
Mittel; und einen Enzym-Cofaktor. Auch werden Verfahren zur Verfügung gestellt,
welche die Verwendung von Teststreifen umfassen, die die Reagenzzusammensetzungen
beinhalten. Die Verfahren finden in der Detektion einer breiten
Vielzahl von Analyten in einer Probe Anwendung, wie zum Beispiel
einer physiologischen Probe, z. B. Blut oder Fraktionen davon, oder
ISF (interstitielle Flüssigkeit).
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Bevor
der Gegenstand der Erfindung weiter beschrieben wird, ist es selbstverständlich,
daß die
Erfindung nicht auf die unten beschriebenen besonderen Ausführungsformen
der Erfindung beschränkt
ist, da Änderungen
der besonderen Ausführungsformen
gemacht werden können
und trotzdem innerhalb des Umfangs der angefügten Ansprüche fallen. Es wird auch verstanden,
daß die
verwendete Terminologie stets für
den Zweck der Beschreibung der besonderen Ausführungsformen ist, und nicht
als einschränkend beabsichtigt
ist. Anstatt dessen wird der Umfang der vorliegenden Erfindung durch
die angefügten
Ansprüche
begründet.
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In
dieser Beschreibung und in den angefügten Ansprüchen umfasst die Singularform „ein" „eine" und „die" einen Pluralbezug, wenn nicht der Sinnzusammenhang
klar anderes diktiert. Wenn nicht anderswo definiert, haben alle
hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die
gleiche Bedeutung, wie es üblicherweise
von einem Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet, auf welchem die
Erfindung liegt, verstanden wird.
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Wo
ein Bereich von Werten bereitgestellt wird, ist es selbstverständlich,
dass jeder dazwischen liegende Wert, bis zum Zehntel der Einheit
des unteren Grenzwertes, es sei denn, aus dem Zusammenhang geht etwas
anderes deutlich hervor, zwischen dem oberen und dem unteren Grenzwert
des Bereiches und jedem anderen angegebenen oder dazwischen liegenden
Wert in dem bezeichneten Bereich von der Erfindung umfasst wird.
Die oberen und unteren Grenzwerte dieser kleineren Bereiche können unabhängig von
den kleineren Bereichen umfasst sein und sind auch von der Erfindung
umfasst, Gegenstand jedes spezifisch ausgenommenen Grenzwerts in
dem ausgewiesenen Bereich. Wo der ausgewiesene Bereich einen oder
beide der Grenzwerte umfasst, sind die Bereiche, die einen von beiden
oder beide oder beide von jenen umfassten Grenzwerten ausschließen, auch
von der Erfindung umfasst. Wenn nicht anders definiert, haben alle
hierin verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die
gleiche Bedeutung, wie es von einem Durchschnittsfachmann auf dem
Gebiet, auf welchem die Erfindung liegt, verstanden wird. Obwohl
andere Verfahren, Mittel und Materialien, ähnlich oder äquivalent
zu jenen, die hierin beschrieben sind, in der Ausübung oder der
Erprobung der Erfindung verwendet werden können, werden nun die bevorzugten
Verfahren, Vorrichtungen und Materialien beschrieben.
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Wie
oben zusammengefasst wurde, stellt der Gegenstand der Erfindung
Verfahren für
die Verwendung von Zusammensetzungen von stabilisierten Tetrazolium-Farbstoff,
Reagenzteststreifen und Systemen zur Verfügung. In der weiteren Beschreibung
der Erfindung wird jedes dieser erfindungsgemäßen Merkmale nachstehend in
näheren
Einzelheiten diskutiert.
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REAGENZZUSAMMENSETZUNGEN
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Wie
oben zusammengefasst wurde, stellt der Gegenstand der Erfindung
Verfahren für
die Verwendung von Zusammensetzungen von stabilisierten Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz
zur Verfügung,
die Methode findet in der Detektion einer breiten Anzahl von Analyten
in einer Probe Anwendung. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen von Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz sind dadurch
charakterisiert, daß sie
zumindest ein Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz und eine wirksame Menge
eines Nitrit stabilisierenden Mittels umfassen.
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Das
Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz ist eine Tetrazoliumverbindung (Farbstoffvorläufer), die
auf die Übernahme
eines transferierten Hydrids ein farbiges Farmazanprodukt bildet.
In vielen Ausführungsformen
ist das Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz ein wasserlösliches
Tetrazoliumsalz, daß in
der Lage ist, ein Hydrid zu übernehmen,
um ein wasserlösliches,
farbiges Farmazanprodukt zu bilden. Wasserlösliche Tetrazoliumsalze von
Interesse umfassen jene, die in
EP
0 908 453 beschrieben sind. Eine Klasse von wasserlöslichen
Tetrazoliumsalzen von Interesse umfassen jene, die durch die Formel
2 auf Seite 2, Zeilen 35 bis 48 der
EP
0 908 453 beschrieben werden. Eine andere Klasse von wasserlöslichen
Tetrazoliumsalzen von Interesse umfassen jene, die durch die Formel
1 auf Seite 3, Zeilen 10 bis 25 der
EP
0 908 453 beschrieben werden.
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Spezifische
wasserlösliche
Tetrazoliumverbindungen oder -salze, die von besonderem Interesse
sind, umfassen, sind aber nicht limitiert auf: 2-(2'-Benzothiazolyl)-5-styryl-3-(4'-phthalhydrazidyl) tetrazolium (BSPT),
2-Benzothiazolyl-(2)-3,5-diphenyl Tetrazolium (BTDP), 2,3-di(4-nitrophenyl)
tetrazolium (DNP), 2,5-Diphenyl-3-(4-styrylphenyl) tetrazolium (DPSP),
Distyryl Nitroblau Tetrazolium (DS-NBT), 3,3'-[3,3'-Dimethoxy-(1,1'-biphenyl)-4,4'-diyl]-bis[2-(4-nitrophenyl)-5-phenyl(-2H
tetrazolium (NBT), 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H Tetrazolium
(MTT), 2-Phenyl-3-(4-carboxyphenyl)-5-methyl Tetrazolium (PCPM),
Tetrazoliumblau (TB), Thiocarbamyl Nitroblau Tetrazolium (TCNBT),
Tetranitroblau Tetrazolium (TNBT), Tetrazoliumviolet, (TV), 2-Benzothiazothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium
(WST-4) und 2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene) ditetrazolium,
Dinatriumsalz (WST-5). In einigen Ausführungsformen werden die Farbstoffverbindungen
ausgewählt
aus der Gruppe von: 2,2'-Dibenzothiazolyl-5,5'-bis[4-di(2-sulfoethyl)carbamoylphenyl]-3,3'-(3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylen) ditetrazolium,
Dinatriumsalz (WST-5); 2-Benzothiazolyl-3-(4-carboxy-2-methoxyphenyl)-5-[4-(2-sulfoethylcarbamoyl)phenyl]-2H-tetrazolium
(WST-4) und ähnliche.
WST-5 ist in vielen Ausführungsformen
bevorzugt, daß es
sich leicht in wässrigem
Medium löst,
was am besten mit biologischen Proben kompatibel ist. Darüber hinaus
zeigt die resultierende Formazanverbindung eine starke spektrale
Absorption in der blau-violett Region, auf diese Weise das Erfordernis
für die
Korrektur der Hintergrundsignale von Hämoglobin reduzierend. Während die
Menge des Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz in Abhängigkeit von der An der Reagenzzusammensetzung
variieren kann, zum Beispiel ob sie in trockener oder nasser Form
ist, reicht die Konzentration des Farbstoffreagenz in vielen Ausführungsformen
von ungefähr
1,5 mM bis ungefähr
50 mM, üblicherweise
von ungefähr
3 mM bis ungefähr
40 mM und noch üblicher
von ungefähr
3,5 mM bis ungefähr
28 mM.
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Zusätzlich zu
der oben beschriebenen Tetrazolium-Farbstoff-Verbindung umfassen
die Reagenzzusammensetzungen auch eine wirksame Menge eines Nitrit
stabilisierenden Mittels. Mit wirksamer Menge ist eine Menge gemeint,
die ausreichend ist, um die Tetrazoliumverbindung zu stabilisieren,
so daß sie
nicht nachteilig beeinträchtigt
oder beeinflusst wird, z. B. verändert
durch Exposition gegenüber
Licht. In anderen Worten, die verwendete Menge an Nitrit stabilisierenden
Mittel ist eine, die ausreichend ist, um für eine stabilisierte Tetrazoliumverbindung
zu sorgen, die im wesentlichen gleiche Signalcharakteristika liefert,
gleichgültig
ob sie Licht oder Dunkelheit vor der Charakterisierung ausgesetzt
ist. Eine in einer flüssigen
Reagenzzusammensetzung vorhandene Tetrazolium-Farbstoff-Verbindung
wird für
die Zwecke der Erfindung als stabilisiert betrachtet, wenn jeliche
Differenz seiner Signal-gebenden Eigenschaften nach Exposition gegenüber Licht
ungefähr das
2-fache nicht überschreitet, üblicherweise
ungefähr
das 2,5-fache, im Vergleich zu den Signaleigenschaften, die beobachtet
werden, wenn sie nicht Licht ausgesetzt wird, wie unter Verwendung
des im nachstehenden Beispiel 1 berichteten Evaluierungsprotokoll
wird. Eine Tetrazolium-Farbstoff-Verbindung, die in einer trockenen
Reagenzzusammensetzung vorhanden ist, wird für die Zwecke der Erfindung
als stabilisiert betrachtet, wenn jeglicher Unterschied in seinen
Signal-gebenden Eigenschaften nach der Exposition gegenüber Licht das
ungefähr
das 2-fache nicht überschreitet, üblicherweise
ungefähr
das 2,3-fache im Vergleich zu den Signaleigenschaften, die beobachtet
werden, wenn sie nicht Licht ausgesetzt wird, wie unter Verwendung
des nachstehenden Beispiels 2 berichteten Evaluierungsprotokoll
bestimmt wird. Das Verhältnis
der Nitrit stabilisierenden Komponente zu dem Tetrazolium Farbstoff
in der Zusammensetzung reicht üblicherweise
von ungefähr
2 bis ungefähr
500, üblicherweise
von ungefähr
7 bis ungefähr
200. Als solche reicht in vielen Ausführungsformen die Konzentration
des Nitrit stabilisierenden Mittels in der Zusammensetzung von ungefähr 0,1 M bis
ungefähr
0,8 M, üblicherweise
von ungefähr
0,2 M bis ungefähr
0,6 M. Während
jedes geeignete Nitrit stabilisierendes Mittel verwendet werden
kann, sind von besonderem Interesse Nitritsalze, wie zum Beispiel
Natriumnitrit, Kaliumnitrit und ihre Derivate, wobei das Natriumnitrit
von besonderem Interesse in vielen Ausführungsformen der Erfindung
ist. Das Vorhandensein des Nitrit stabilisierenden Mittels stabilisiert
den Tetrazolium Farbstoff im Hinblick auf die Lichtexposition über ungefähr 3 Stunden,
oftmals zumindest ungefähr
5 Stunden und manchmal zumindest ungefähr 10, 15, 20, 24, 48, 72 Stunden
oder mehr.
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Wie
oben erwähnt,
erhalten die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Reagenzzusammensetzungen üblicherweise
zusätzliche
Elemente eines Analyten oxidierenden Signal erzeugenden Systems.
Mit Signal erzeugendem System ist eine Kollektion von zwei oder
mehreren Verbindungen oder Molekülen
gemeint, welche in der Lage sind, zusammen zu arbeiten, wenn sie
kombiniert werden, um ein detektierbares Signal zu erzeugen, daß für das Vorhandensein,
und oftmals der Menge, eines bestimmten Analyten in einer gegebenen Probe
anzeigend ist. Der Begriff Signal erzeugendes System wird allgemein
verwendet, um sowohl ein Gemisch aller Reagenzbestandteile des Signal
erzeugenden Systems, als auch ein System zu umfassen, in welchem
eines oder mehrere der Reagenzbestandteile von dem Rest der Reagenzbestandteile
getrennt sind, zum Beispiel wie in einem Kit vorhanden.
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Wie
oben erwähnt,
ist das Signal erzeugende System des gegenständlichen Verfahrens ein Analyten oxidierendes
Signal erzeugendes System. Das Analyten oxidierende Mittel ist üblicherweise
ein Enzym, daß in
der Lage ist, ein Hydrid von dem Analyten von Interesse zu entfernen,
um eine oxidierte Form des Analyten zu bilden. Analyten oxidierende
Enzyme von Interesse umfassen Analyten-Oxidase und Analyten-Dehydrogenasen.
Analytenoxidasen von Interesse umfassen, sind aber nicht limitiert
auf: Glucoseoxidase (wo der Analyt Glucose ist); Cholesteroloxidase
(wo der Analyt Cholesterin ist); Alkoholoxidase (wo der Analyt Alkohol
ist); Bilirubinoxidase (wo der Analyt Bilirubin ist); Cholinoxidase
(wo der Analyt Cholin ist); Formaldehyddehydrogenase (wo der Analyt
Formaldehyd ist); Glutamatoxidase (wo der Analyt L-Glutaminsäure ist);
Glyceroloxidase (wo der Analyt Glycerol ist); Galactoseoxidase (wo
der Analyt Galactose ist); L-Ascorbatoxidase (wo der Analyt Ascorbinsäure ist);
Lactatoxidase (wo der Analyt Milchsäure ist); Leucinoxidase (wo
der Analyt Leucin ist); Malatoxidase (wo der Analyt Maleinsäure ist);
Pyruvatoxidase (wo der Analyt Brenztraubensäure ist); Uratoxidase (wo der
Analyt Urinsäure
ist); und ähnliches.
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Analyt-Dehydrogenasen
von Interesse umfassen, sind aber nicht limitiert auf: Alkoholdehydrogenase für Alkohol,
Formaldehyddehydrogenase für
Formaldehyd, Glucosedehydrogenase für Glucose, Glucose-6-Phoshatdehydrogenase
für Glucose-6-Phosphat; Gutamatdehydrogenase
für Glutaminsäure; Glyceroldehydrogenase
für Glycerin,
beta-Hydroxybutyratdehydrogenase für beta-Hydroxybutyrat, Hydroxysteroiddehydrogenase
für Steroid;
L-Lactatdehydrogenase für
L-Lactat, Leucindehydrogenase für
Leucin, Malatdehydrogenase für
Hydroxybernsteinsäure
und Pyruvatdehydrogenase für
Brenztraubensäure.
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In
vielen Ausführungsformen
umfassen die gegenständlichen
Signal erzeugenden Systeme auch einen Enzym-Cofaktor, der in der
Lage ist, mit dem oxidierenden Mittel in einer An und Weise zu Wechselwirken, so
daß der
Analyt von Interesse durch das oxidierende Agens oxidiert wird,
welches Mittel gleichzeitig den Enzym-Cofaktor reduziert. Enzym-Cofaktor
von Interesse umfassen, sind aber nicht limitiert auf: das heißt, beta-Nikotinamid
Adenindinukleotid (beta-NAD); Beta-Nikotinamid Adenindinukleotidphosphat
(beta-NADP); Thionikotinamid Adenindinukleotid; Thionikotinamid
Adenindinukleotidphosphat; Nikotinamid 1,N6-Ethenadenindinukleotid;
Nikotinamid 1,N6-Ethenadenindinukleotidphosphat;
und Pyrrol-quinolinquinon (PQQ) und Flavinverbindungen, wie zum
Beispiel FAD und FMN. Enzym-Cofaktoren von besonderem Interesse,
die in den gegenständlichen
Signal erzeugenden Sysemen eingeschlossen sein können, umfassen: NADH oder NAD(P)H und
PQQH2.
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Zusätzlich zu
dem Analyten oxidierenden Mittel umfassen die gegenständlichen
Signal erzeugenden Systeme üblicherweise
ein Elektronenübertragungsmittel.
Mit Elektronenübertragungsmittel
ist eine Verbindung oder Molekül
gemeint, das ein Elektron in Form von Hydridionen von einem reduzierten
Enzym-Cofaktor auf das wasserlösliche
Tetrazoliumprodukt transferieren kann. Elektronenübertragungsmittel
von Interesse umfassen sowohl nieder- als auch hochmolekulare Elektronenübertragungsmittel.
In dieser Beschreibung bedeutet niedriges Molekulargewicht ein Molekulargewicht,
das ungefähr
2000 Dalton nicht überschreitet, üblicherweise
ungefähr
1000 Dalton und in vielen Ausführungsformen
ungefähr
500 Dalton. Hohes Molekulargewicht bedeutet ein Molekulargewicht
von mindestens ungefähr
5000 Dalton und in vielen Ausführungsformen 10000
oder 20000 Dalton oder höher.
Das Molekulargewicht des hochmolekularen Elektronübertragungsmittel überschreitet
oftmals nicht 100000 Dalton. In vielen Ausführungsformen ist das niedermolekulare
Elektronenübertragungsmittel
eine nicht proteinöse
Verbindung, während
das hochmolekulare Elektronentransfermittel eine proteinöse Verbindung
ist. Mit proteinös
ist ein Polypeptid oder ein polymeres Mimetikum davon gemeint.
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Eine
Vielzahl von niedermolekularen nicht-proteinösen Elektronentransfermitteln
sind von Interesse. Diese Mittel umfassen: Flavine, wie zum Beispiel
Riboflavin (RBF), Alloxazin (ALL) und Lumichrom (LC); Phenazine,
wie zum Beispiel Phenazin, Phenazinmethosulfat (PMS), Phenazinethosulfat,
Methoxyphenazin Methosulfat und Safranine; Methyl-1,4-natphthol (Menadion),
Phenothiazin, wie zum Beispiel PT und sein radikales Kation, PT+,
Thionin (TH), Azur A (AA), Azur B (AB), Azur C (AC), Methylenblau
(MB), Methylengrün (MG)
und Toluidinblau O (TOL); Phenoxazine, wie zum Beispiel Phenoxazin
(POA), Basischblau 3 (BB3) und Brilliant-Cresylblau ALD (BCBA),
Benzo-α-Phenazoxoniumchlorid
(Medolas Blau); Indophenole, wie zum Beispiel 2,6-Dichlorphenol
Indophenol (DCIP) und Indamine, wie zum Beispiel Bindschedler's Grün und Phenylenblau;
und ähnliches.
Von besonderem Interesse sind in vielen Ausführungsformen Phenazinverbindungen, wie
zum Beispiel PMS, Phenazinethosulfat, Methoxyphenazinmethosulfat
und Safranin, wo PMS das niedermolekulare, nicht-proteinöse Elektronentransfermittel
in vielen Ausführungsformen
ist.
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In
vielen Ausführungsformen
ist das hochmolekulare proteinöse
Elektronentransfermittel ein Enzym, das in der Lage ist einen reduzierten
Cofaktor zu oxidieren, zum Beispiel NAD(P)H, und gleichzeitig das
Tetrazoliumsalz des Signal erzeugenden Systems zu reduzieren. In
vielen Ausführungsformen
ist dieses Elektronenübertragungsenzym
eine Diaphorase, wie zum Beispiel Lipondehydrogenase, Ferredoxin-NADP-Reduktase,
Lipoamiddehydrogenase, NADPH-Dehydrogenase etc. Eine Vielzahl von
Diaphorasen sind verfügbar
und können
verwendet werden, wo repräsentative,
kommerziell erhältliche
Diaphorasen, die in dem gegenständlichen
Signal erzeugenden Systemen sein können, Bacillus Diaphorase,
Clostridium Diaphorase, Vibrio Diaphorase, Schweine Diaphorase und ähnliches
umfassen.
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Wie
oben angezeigt, sind die Signal erzeugenden Systeme der vorliegenden
Erfindung entweder als nasse oder trockene Zusammensetzungen vorhanden.
Mit nassen Zusammensetzungen sind flüssige Zusammensetzungen gemeint, üblicherweise
wässrige
Zusammensetzungen. Solche Zusammensetzungen finden in verschiedenen
Assaykonfigurationen Anwendung, wie zum Beispiel Küvetten-Konfigurationen,
welche auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt sind. Mit trockenen Zusammensetzungen
ist eine Zusammensetzung gemeint, die flüssig ist, d. h. in trockener
Form, wie zum Beispiel eine Zusammensetzung, die im Wesentlichen frei
von ungebundenem Wasser ist. Solche Zusammensetzungen werden üblicherweise
im Reagenzteststreifen gefunden, wie nachstehend in näheren Einzelheiten
beschrieben wird.
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REAGENZTESTSTREIFEN
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Von
besonderen Interessen in vielen Ausführungsformen des Erfindungsgegenstandes
sind Verfahren, welche Reagenzteststreifen einsetzen, die die oben
beschriebenen trockenen Reagenzzusammensetzungen umfassen und für die Verwendung
zur Messung des Vorhandenseins oder der Konzentration eines Analyten
in einer Probe vorgesehen sind. Insbesondere umfasst die Erfindung
trockene Streifen für
die Untersuchung auf ein bestimmtes Analyt im Gesamtblut, z. B.
beta-Hydroxybutyrat, Glucose etc. Im weitesten Sinne umfasst der
Reagenzteststreifen einen festen Träger und eine darauf vorhandene
trockene Reagenzzusammensetzung, wobei die trockene Reagenzzusammensetzung
aus allen Reagenzverbindungen hergestellt ist, die notwendig sind,
um ein detektierbares Signal in der Gegenwart des Analyten von Interesse
zu erzeugen. Die meisten Ausführungsformen
des Erfindungsgegenstandes ist die trockene Reagenzzusammensetzung, welche
auf dem Versuchsteststreifen vorhanden ist, eine, die die folgenden
Elemente umfasst: ein Analyten oxidierendes Enzym, einen Enzym-Cofaktor,
ein Elektronenübertragungsmittel,
ein wasserlösliches
Tetrazoliumsalz und ein Nitrit stabilisierendes Reagenz, wobei jedes
dieser Bestandselemente oben detaillierter beschrieben ist.
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In
vielen Ausführungsformen
umfasst der Versuchsteststreifen ein Membrantestkissen, das auf
einem festen Träger
befestigt ist. Der Träger
kann Plastik sein, wie zum Beispiel Polystyrol, Nylon, oder Polyester – oder ein
Metallblech oder jedes andere geeignete Material, das auf dem Fachgebiet
bekannt ist. Die Reagenzzusammensetzung ist mit dem Testfeld verbunden,
z. B. auf das Testfeld beschichtet, in das Testfeld inkorporiert
etc. Der Streifen kann auch in komplexeren Anordnungen konfiguriert
sein, z. B. wo das Testfeld zwischen dem Träger und einer Oberflächenschicht
vorhanden ist, wo ein oder mehrere verwendete Reagenzien in der Probenverarbeitung
auf der Oberflächenschicht
vorhanden sind. Darüber
hinaus können
Flusswege oder Kanäle
auf dem Teststreifen vorhanden sein, wie sie auf dem Fachgebiet
bekannt sind. In vielen Ausführungsformen
sind die Teststreifenkonfigurationen von Interesse, welche in U.S.
Patent Nr. 5,902,731 offenbart sind.
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In
den Versuchsteststreifen ist die trockene Reagenzzusammensetzung
mit, einem Trägermaterial oder
einem Substrat verbunden, zum Beispiel ist es darauf oder darin
vorhanden. Das Substrat kann saugfähig oder nicht saugfähig sein.
Mit saugfähig
(bibulous) ist ein Material gemeint, das bevorzugt die Retention
von einem oder mehreren Bestandteilen zeigt, wie z. B. in Materialien
beobachtet werden würde,
welche in der Lage sind, eine oder mehrere Bestandteile zu absorbieren
oder „aufzusaugen", wie in chromatographischen Trennungen
zu beobachten ist. Beispiele von saugfähigen Materialien umfassen,
sind aber nicht limitiert auf: Nylon, unbehandelte Formen von Papier,
Nitrocellulose und ähnliches,
was eine chromatographische Trennung von Bestandteilen, welche in
Flüssigkeiten
enthalten sind, welche hierdurch geflossen sind, zur Folge hat.
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Wahlweise
kann das Substrat nicht saugfähig
sein. Nicht saugfähige
Substrate umfassen inerte poröse
Grundsubstanzen, welche einen Träger
für die
verschiedenen Teile des Signal erzeugenden Systems zur Verfügung stellen,
beschrieben infra, und können
eine positive Ladung haben. Diese Grundsubstanzen sind üblicherweise
konfiguriert, um einen Ort für
die Aufbringung einer physiologischen Probe, z. B. Blut, und der Detektion
des chromogenen Produkts, welches durch den Farbstoff des Signal
erzeugenden Systems erzeugt wurde, bereitzustellen. Als solche ist
die Matrix üblicherweise
eine, die für
eine Flüssigkeitsströmung durchlässig ist
und die ausreichende Hohlräume
für die
ablaufenden chemischen Reaktionen des Signal erzeugenden Systems
zur Verfügung
stellt. Eine Anzahl von verschiedenen porösen Grundsubstanzen sind für die Verwendung
in verschiedenen analytischen Messungsassays entwickelt worden,
wobei die Grundsubstanzen sich im Bezug auf die Materialien, die
Porengrößen, Dimensionen
und ähnlichen
unterscheiden können,
wobei repräsentative
Grundsubstanzen jene umfassen, die beschrieben sind in den U.S.
Patenten Nummern: 55,932,431; 5,874,099; 5,871,767; 5,869,077; 5,866,322;
5,834,001; 5,800,829; 5,800,828; 5,798,113; 5,670,381; 5,663,054;
5,459,080; 5,459,078; 5,441,894 und 5,212,061. Die Dimensionen und
die Porösität des Teststreifen
kann stark variieren, wobei die Grundsubstanz einen Porösitätsgradienten
haben kann oder nicht haben kann, z. B. mit größeren Poren nahe oder an der
Probenauftragungsregion und kleinere Poren an der Detektionsregion.
In vielen Ausführungsformen
ist die Grundsubstanz als ein Membrantestkissen konfiguriert und
ist an einen festen Träger
befestigt, wobei der Träger
Plastik (z. B. Polystyrol, Nylon oder Polyester) oder ein Metallblech
sein kann, oder jedes andere geeignete Material, was auf dem Fachgebiet
bekannt ist. In vielen Ausführungsformen
sind Teststreifenkonfigurationen von Interesse, welche offenbart
sind in den U.S. Patent Nummern.: 5,972,294; 5,968,836; 5,968,760;
5,902,731; 5,846,486; 5,843,692; 5,843,691; 5,789,255; 5,780,304; 5,753,452;
5,753,429; 5,736,103; 5,719,034; 5,714,123; 383,550; 381,591; 5,620,863;
5,605,837; 5,563,042; 5,526,120; 5,515,170; 367,109; 5,453,360;
5,426,032; 5,418,142; 5,306,623; 5,304,468; 5,179,005; 5,059,394;
5,049,487; 4,935,346; 4,900,666 und 4,734,360.
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Beispiele
von geeigneten repräsentativen
Teststreifenkonfigurationen werden in den U.S. Patent Nummern 6,200,733
und 5,902,731 zur Verfügung
gestellt.
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Die
Versuchsteststreifen können
unter Anwendung jedes geeigneten Protokolls hergestellt werden. Ein
geeignetes Protokoll ist, zumindest den Testkissenteil des Streifens
mit einer wässrigen
Zusammensetzung zu kontaktieren, die alle Bestandteile der Reagenzzusammensetzung
umfasst, die mit dem Testkissen in dem endgültigen Reagenzteststreifen
zu verbinden sind. In geeigneter Weise kann das Testkissen in die
wässrige
Zusammensetzung eingetaucht werden, darin für eine ausreichende Zeitdauer
gehalten werden und dann getrocknet, wobei das Testkissen des Reagenzteststreifens,
das die Reagenzzusammensetzung damit verbunden hat, hergestellt
wird. Wie oben angegeben, wird die wässrige Zusammensetzung die
verschiedenen Bestandteile der Reagenzzusammensetzung umfassen,
welche mit dem Testkissen des Reagenzteststreifens zu verbinden
sind, wobei die verschiedenen Bestandteile in Mengen vorhanden sind,
die ausreichend sind, um die gewünschten
Mengen in der Reagenzzusammensetzung bereitzustellen, welche auf
dem Testkissen erzeugt wird. Als solche, wo das Elektronenübertragungsmittel
nicht proteinös
ist, reicht die Konzentration des Elektronentransfermittels, welches
in dieser wässrigen
Zusammensetzung vorhanden ist, üblicherweise
von ungefähr
10 bis 50000, üblicherweise
von ungefähr
50 bis 10000 und noch üblicher
von ungefähr
100 bis 5000 μM.
In einer anderen Ausführungsform,
wo das Elektronentransfermittel proteinös ist, reicht die Konzentration des
Elektronentransfermittels, welches in der wässrigen Zusammensetzung vorhanden
ist, üblicherweise
von ungefähr
10 bis 10000, üblicherweise
von ungefähr
50 bis 5000, noch üblicher
von ungefähr
100 bis 3000 U/ml. Die Konzentration des Tetrazoliumfarbstoffs,
z. B. Tetrazoliumsalz, welches in der wässrigen Zusammensetzung vorhanden
ist, reicht van ungefähr
3 mM bis ungefähr
36 mM, üblicherweise
von ungefähr
6 mM bis 24 mM. Wenn vorhanden, reicht der Enzym-Cofaktor von einer
Konzentration von ungefähr
1,5 mM bis 28 mM, üblicherweise
von ungefähr
3,5 mM bis 14 mM. In ähnlicher
Weise reicht das Analyten oxidierende Enzym in Konzentration von
ungefähr
100 U bis 5000 U, und üblicherweise
von ungefähr
200 bis 3000 U, wenn vorhanden. Die Menge des Nitrit stabilisierenden
Mittels, z. B. Nitritsalz, wie z. B. Natriumnitrit, reicht üblicherweise von
ungefähr
0,1 M bis ungefähr
0,8 M, üblicherweise
von ungefähr
0,2 M bis ungefähr
0,6 M. Siehe im experimentellen Teil, infra, für eine noch detailliertere
Beschreibung eines repräsentativen
Verfahrens für
die Herstellung des Versuchsreagenzteststreifens.
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VERFAHREN
DER ANALYTISCHEN MESSUNG
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Die
oben beschriebenen Signal erzeugenden Systeme, Reagenzzusammensetzungen
und Teststreifen finden Anwendung in den Verfahren der vorliegenden
Erfindung, wobei die Verfahren Methoden der Detektion des Vorhandenseins
von, und oftmals der Menge von, d. h. der Konzentration eines Analyten
in einer Probe umfassen. Eine Vielzahl von unterschiedlichen Analyten
kann unter Verwendung der Testmethoden detektiert werden, wobei
repräsentative
Analyten jene umfassen, die oben beschrieben sind, z. B. Alkohol,
Formaldehyd, Glucose, Glutaminsäure,
Glycerol, beta-Hydroxybutyrat, L-Lactat, Leucin, Hydroxybernsteinsäure, Brenztraubensäure, Steroide,
etc. Wenn im Prinzip Testverfahren verwendet werden können, um
das Vorhandensein, und häufig
die Konzentration, eines Analyten in einer Vielzahl von unterschiedlichen
physiologischen Proben, wie z. B. Urin, Tränen, Speichel und ähnlichen,
zu bestimmen, sind sie für
die Verwendung und Bestimmung der Konzentration eines Analyten im
Blut oder Blutfraktionen besonders geeignet, z. B. Blutabgeleitete
Proben, und noch bevorzugter im Gesamtblut, in der ISF (interstitielle
Flüssigkeit).
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In
den Testverfahren werden die Probe und das Signal erzeugende System
in ein Reaktionsgemisch zusammengegeben, der Reaktion wird ermöglicht,
eine ausreichende Zeitdauer abzulaufen, um ein Signal zu generieren,
was das Vorhandensein von (und oftmals der Menge) eines Analyten
in einer Probe anzeigt, und das resultierende Signal wird detektiert
und in Beziehung zu dem Vorhandensein (und oftmals der Menge) eines
Analyten in der Probe gesetzt. Die obigen Schritte können in
einem geeigneten Volumeneingrenzungsmittel stattfinden, z. B. einer
Küvette,
wo die Reagenzzusammensetzung eine flüssige Zusammensetzung ist.
In vielen Ausführungsformen
finden die obigen Schritte auf einem Reagenzteststreifen wie oben
beschrieben statt.
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In
einigen Ausführungsformen
ist ein Merkmal des Testverfahrens, das das detektierbare Signal
aus einem nicht abwaschbaren Flecken besteht, der sich auf der Oberfläche des
Substrates des Streifens bildet. Der nicht waschbare Fleck besteht
aus einem wasserlöslichen
Formazanprodukt, welches an die Substratoberfläche fest gebunden ist, so daß es nicht
leicht von der Oberfläche
unter Standardwaschbedingungen entfernt werden kann. Mit Standardwaschbedingungen
sind die Bedingungen gemeint, die experimentell durch Substratoberflächen in
Analytendetektionsassays ermittelt wurden, wo ein ungebundener Bestandteil
von der Oberfläche
zu entfernen ist. Zum Beispiel sind Standardwaschbedingungen jene,
die durch jene auf dem Fachgebiet in Array-basierenden Nukleinsäurehybridisierungsassays
verwendet werden, wobei nicht hybridisierende Nukleinsäuren von
der Oberfläche
eines Arrays auf den Hybridisierungsschritt folgend entfernt werden.
Solche Bedingungen sind jenen auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt.
Als solches ist ein Merkmal der Testverfahren die Herstellung eines
nicht abwaschbaren Fleckens auf der Oberfläche des positiv geladenen Substrats,
wobei der nicht abwaschbare Flecken aus dem wasserlöslichen
Formazanprodukt besteht.
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In
der Ausübung
vieler Ausführungsformen
der Versuchsverfahren ist der erste Schritt, eine Menge der physiologischen
Probe auf den Teststreifen aufzubringen, wobei der Teststreifen
oben beschrieben ist. Die Menge der physiologischen Probe, z. B.
Blut, die auf den Teststreifen aufzubringen ist, kann variieren,
aber erstreckt sich üblicherweise
im Bereich von ungefähr
2 μl bis
40 μl, üblicherweise
von ungefähr
5 μl bis
20 μl. Aufgrund
der Art des Versuchsteststreifens kann die auf den Teststreifen
aufzutragende Blutprobengröße relativ
klein sein, sich erstreckend über
Größen von
ungefähr
2 μl bis
40 μl, üblicherweise
von 5 μl
bis 20 μl.
Wo Blut die physiologische Probe ist, können Blutproben mit einer Vielzahl
von unterschiedlichen Hematocrit mit den Versuchsverfahren untersucht
werden, wobei der Hematocrit von ungefähr 20% bis 65% reicht, üblicherweise
von ungefähr
25% bis 60%.
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Nach
der Aufbringung der Probe auf den Teststreifen wird der Probe ermöglicht,
mit den Bestandteilen des Signal erzeugenden Systems zu reagieren,
um ein detektierbares Produkt zu erzeugen, d. h. den nicht abwaschbaren
Flecken, der in einer Menge proportional zur anfänglichen Menge des Analyten
von Interessen in der Probe vorhanden ist. Die Menge des detektierbaren
Produkts, d. h. das Signal, welches durch das Signal erzeugende
System erzeugt wurde, in Form eines nicht abwaschbaren Fleckens,
wird dann bestimmt und wird zu der Menge des Analyten in der anfänglichen
Probe in Beziehung gesetzt. In einigen Ausführungsformen werden automatisierte
Instrumente verwendet, die die oben erwähnten Detektions- und Relationsschritte durchführen. Die
oben beschriebene Reaktion, Detektion und ähnliche Schritte, als auch
die Instrumente für die
Durchführung
der gleichen, sind weiter beschrieben in den U.S. Patent Nummern
4,734,360; 4,900,666; 4,935,346; 5,059,394; 5,304,468; 5,306,623;
5,418,142; 5,426,032; 5,515,170; 5,526,120; 5,563,042; 5,620,863;
5,753,429; 5,573,452; 5,780,304; 5,789,255; 5,843,691; 5,846,486;
5,902,731; 5,968,836 und 5,972,294. In dem Relationsschritt wird
in die erhaltene Analytkonzentration der konstante Beitrag konkurrierender
Reaktionen zu dem beobachteten Signal mit einberechnet, d. h. durch
Kalibrierung der entsprechenden Instrumente.
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Die
folgenden Beispiele werden als Veranschaulichung angeführt, aber
nicht als Einschränkung.
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VERSUCHE
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Beispiel 1, in wässriger
Form.
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- 0,1 M MES, pH 6,5, WST-5 6,75 mM, NaNO2 (0 oder 0,3 M)
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Die
obigen Lösungen
sind Licht und Dunkelheit einzeln ausgesetzt worden. Die Lösung ist
durch UV-Vis in 10-fache Verdünnung
gemessen worden. Die Ergebnisse sind in den 1 und 2 gezeigt.
Die 1 zeigt die Ergebnisse der Lösung ohne NaNO2,
die Lösung
ist jeweils Dunkelheit oder Licht ausgesetzt worden. Die 2 zeigt
die Ergebnisse der Lösung
mit NaNO2, die Lösung ist jeweils Dunkelheit
oder Licht ausgesetzt worden.
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Beispiel 2, in trockener
Form
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Tabelle
1. Tabelle der Bestandteile der trockenen Form
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- * Gantrez AN-139 (Polymethylvinylether-alt-Maleinsäureanhydrid,
MW 1,080,000, Cat# 41632-0, Aldrich Chemicals, Milwaukee, WI, USA)
Stelle 6% Gantrez in Wasser her, erhitze auf 95°C für weniger als 45 min., um Gantrez
6% zu erhalten, welches für
die Verwendung fertig ist.
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Eine
0,8 μm Nylonmembran,
erhalten von Pall Corporation (East Hills, NY), ist in das Reagenz
der Tabelle 1 bis zur Sättigung
getaucht worden. Das überschüssige Reagenz
ist vorsichtig von einem Glasstab abgeschabt worden. Die resultierende
Membran ist in einen 56°C
Ofen für
10 Minuten aufgehängt
worden, um zu trocknen.
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Die
mit und ohne Natriumnitrit beschichtete Membran ist Licht oder Dunkelheit
jeweils einzeln für
7 Stunden ausgesetztworden. Die Reflektion der Membran ist mit Macbath
gemessen worden. Die Ergebnisse sind in den 3 und 4 gezeigt.
Die 3 zeigt die Ergebnisse der Membran ohne NaNO2, die Membran ist jeweils Dunkelheit oder
Licht ausgesetzt worden. Die 4 zeigt
die Ergebnisse der Membran mit NaNO2, die
Membran ist jeweils Dunkelheit und Licht ausgesetzt worden.
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Es
ist von den obigen Ergebnissen und der Diskussion ersichtlich, daß der Gegenstand
der Erfindung eine Verbesserung gegenüber vorherigen Verfahren, welche
Zusammensetzungen von Tetrazolium-Farbstoff-Reagenz umfassen, dahingehend
zur Verfügung
stellt, daß er
eine geeignete Art und Weise zur Verfügung stellt, um die Farbstoffbestandteile
zu stabilisieren, so daß die
Lichtexposition den Farbstoff nicht nachteilig beeinflusst. Als
solche stellt der Gegenstand der Erfindung einen signifikanten Beitrag
zum Fachgebiet dar.
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Die
Zitierung einer Publikation erfolgt auf Grund ihrer Offenbarung
vor dem Anmeldetag und sollte nicht als Zugeständnis ausgelegt werden, dass
die vorliegende Erfindung durch die Veröffentlichung auf Grund einer
früheren
Erfindung vorweggenommen wird.
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Obwohl
die vorangegangene Erfindung in einigen Einzelheiten durch Veranschaulichung
beschrieben worden ist, und Beispiele für die Zwecke der Klarheit des
Verständnisses
gegeben worden sind, ist es jenen auf dem Fachgebiet leicht ersichtlich,
das im Lichte der Lehren dieser Erfindung bestimmte Änderungen
und Modifikationen davon gemacht werden können, ohne aus dem Umfang der
angefügten
Ansprüche
zu fallen.
