JPH0379665B2 - - Google Patents
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Description
本発明は免疫検定システム、特に螢光免疫検定
を行なう方法と、そのための器械に関連したもの
であり、この検定においては螢光マーカーが、励
起波長から螢光放出の波長へと相対的に大きなス
トークスシフトをみせる。 免疫検定は医学の分野において様々な応用法で
用いられている。そうした検定は、患者から取つ
た血液サンプルに存在する様々な物質の濃度を調
べるテストである。特定の物質に関しては、多く
の既知の検定法がある。最も一般的なクラスの検
定のひとつは、患者の血液中の特定のホルモンの
濃度を調べるものである。たとえば、T4とも呼
ばれているチロキシンは、人間の代謝作用を調整
するホルモンである。すべての新生児にたいし、
T4の欠乏状態の有無をテストするのが望ましい
が、これはT4の欠乏状態を放置しておくと、取
り返しのつかない精神遅滞を引き起こすことがあ
るからである。同様に、T3としても知られてい
るトリヨードチロキシンは、患者の甲状腺刺激ホ
ルモン過剰症の検査に用いることのできるもので
ある。 また患者の体内のビールスやバクテリアの存在
を調べるための検定もある。また患者の治療に用
いられている新薬の中には、血液中で高濃度にな
るまで蓄積されると、最終的には有害となるもの
もある。ダイゴキシンを用いた治療で問題となる
のは、血液流の中で一定の濃度に達するまでに要
する薬の量は、患者ごとにはなはだしく異なり、
しかも濃度が上がり過ぎると有害になるというこ
とである。 近代的な免疫検定システムは、3つのカテゴリ
ーに分けられる:つまり(1)放射免疫検定;(2)酵素
免疫検定;(3)螢光免疫検定である。このそれぞれ
に共通した特徴は、マーク付きまたは標識付きの
標準溶液を用いることである。典型的な免疫検定
方法は、テストが行なわれる物質(抗原)に特定
の抗体を用意することから始まる。抗原のサンプ
ルはテスターによつて用意され、各サンプルごと
に問題のマーカーがつけられる。放射免疫検定
(RIA)の場合、標識をつける物質は放射性物質
であり、螢光免疫検定(FIA)の場合は、既知の
螢光性を備えた物質である。酵素免疫検定は分光
測光法的に測定されるので、放射免疫検定や螢光
免疫検定ほど敏感なものではない。 次の段階で行なうのは、標識のついた溶液また
は抗原溶液と、濃度の様々に異なる標準のマーク
付きでない抗原溶液を混ぜて得られる線量応答曲
線をだし、これら様々な混合物を、たとえば特定
の抗体で塗装したマイクロタイターウエルのよう
な容器の中で、抗体の場を競わせることである。
混合物中のマーク付きとマーク付きでない抗原
は、抗体の場を争い、その混合物中での存在割合
に比例して抗体の場につくるようになる。 混合物の残りは、吸引その他の方法で、抗体を
収容した井戸から除去され、次に標識のついた抗
原の存在が調べられる。標識つき溶液は、濃度の
わかつている様々な標識なしの抗原と混ぜられて
いるので、調合反応曲線は、手でも、あるいはコ
ンピユーターを使つてでも描くことができ、使用
されているマーク付きの抗原溶液の特定のサンプ
ルにたいする標識なしの抗原の濃度とラベル検出
器の出力が相関関係づけられる。このようにして
線量応答曲線は、抗体の場についたマーク付きの
抗原の量を、マーク付き溶液がそれと混ぜられた
ところのマークなしの抗原の濃度に直接置き換え
る方法を与えるものである。 この作業を終えた後は、マーク付き溶液のサン
プルを患者の血清と混ぜられ、マーク付き抗原分
子は抗体の場で患者の抗原分子に匹敵することに
なる。上記のごとく、同様に患者の抗原分子と標
識つき抗原分子は、利用できる抗体の場を競い、
それら各々の溶液中の濃度に応じて、その場を獲
得するのである。 溶液の残りの部分が排除されたなら、容器内の
標識つき抗原の存在がテストされる。線量応答曲
線(使用されている特定のマークつき溶液用の)
を用いると、抗体の場について残つている標識つ
きの抗原の量によつて線量応答曲線からはずれた
患者の血清サンプル内にある特定の抗原の濃度が
直接に示されることになる。 RIAの場合、最も一般的に用いられる標識つき
抗原は、ヨウ素の放射活性同位元素、125Iであ
る。抗体の場についた標識つき抗原の量をテスト
する際には、患者の血清中の抗原濃度を示す線量
応答曲線外の読取りを行なうために、サンプルか
らの放射性放出を測らねばならない。 放射免疫検定は非常に信頼度が高く、感受性も
優れているため、評判もよく一般に行なわれるよ
うになつてきている。放射免疫検定の根本的欠点
は、それが非常に費用の重むものであるというこ
とである。まず第1に、放射能の存在の有無を調
べるために必要な器械は、複雑で高価なものであ
る。第2に、用いられるヨウ素の特定の同位元素
の半減期は60日なのである。放射活性同位元素の
標識のついた抗原溶液は、つくつた後速やかに使
用しなくてはならないが、これはマーカー物質の
放射性崩壊が急速なために、保存期間が厳しく制
限されているからである。故にこの物質の配布に
は、1度に各ユーザーに少量を供給し、しかもつ
くられた場所から最終的に使用されるところま
で、大急ぎで輸送するという方法をとらなけれ
ば、経済的な採算はとれないのである。 また、輸送を行なう側、特に空輸の場合に、放
射性物質を輸送することが嫌われる傾向が強まつ
てきている。 こうしたRIAテクニツクの基本的欠点を克服す
るために、螢光免疫検定がつくられたのである。
放射免疫検出に優る螢光免疫検定の利点は、抗原
につけられる標識として使用される螢光化合物
は、RIAに用いられるマーカーの半減期が短かい
のと比較して非常に安定しているということであ
る。また、FIAの場合のテスト器械の費用は、だ
いたいにおいてRIAよりも安くて済み、放射性物
質のように取扱いの点でも外的な問題はないとい
うこともある。 螢光免疫検定における螢光標識の使用の基本原
理は、可視光線のまわりのスペクトル中の放射に
よつて照らされた場合に、特定の物質がその照射
に反応して、低周波(波長のより長い)の放射を
行なうということである。FIAで用いられるほと
んどの螢光物質の場合、発された放射は可視光線
の中にあるので、螢光標識の存在を確かめるの
に、光検出器を用いることができる。 そうした螢光物質の場合、螢光放射は物質に螢
光を発させている輻射よりも周波数が低いという
ことはすでに明らかにされていることである。故
に螢光放射の波長は、物質を照らしている輻射の
波長よりも長いということになる。螢光放射の波
長と照射(励起)の波長の差は、ストークスシフ
トと呼ばれている。螢光標識として用いられる各
物質は、特有の励起波長とそれによつて生じる螢
光放射の波長を有しており、従つて特有のストー
クシフトを有することにもなつている。 先行技術による螢光免疫検定には、2つの大き
な欠点がある:つまり(1)使用される螢光マーカー
物質は、20〜35マノメートルという比較的低いス
トークスシフトをもつて特徴づけられているもの
である;(2)螢光マーカーの螢光放射の波長が、患
者の血清中によく見られる成分によつて示される
自家螢光の波長に非常に近いものである、という
ことである。 上述の第1の欠点は、螢光物質の波長特性を有
する光と螢光物質を励起するのに用いられる光を
圧別するために、非常に感度の高い検出器と複雑
な光学器械を必要とするものである。ストークス
シフトが低いため、螢光の波長に反応し、且つ励
起光線の波長には比較的に感度が鈍い光線センサ
ーを設計するのは困難であり、また費用のかかる
ことである。この問題を克服するため、先行技術
による多くの螢光免疫検定装置は、螢光標識を含
むサンプルと光学センサーの間に高価な回折格子
を差し込んで用いている。この回折格子は、励起
波長で光線の方向に直交するように置かれてい
る。 上記第2の欠点は、先行技術による螢光免疫検
定のRIAと比較した上での感度と信頼度を減ずて
いる。血清中に自家螢光成分が存在している場合
には、螢光物質の存在についての究極的テストが
行なわれる前に抗体を含んだサンプルからこうし
た自家螢光物質を確実に排除しておく余分の処置
と余分の注意が必要とされるのである。このた
め、サンプル作成の複雑さと費用が増大してい
る。さらに、自家螢光物質を完全に排除すること
は困難であり、従つて先行技術による螢光免疫検
定の信頼度は、放射免疫検定よりも劣る傾向にあ
る。 発明の要約 この発明は、比較的高いストークスシフトによ
つて特徴づけられる螢光標識物質を用いることに
よつて、これまでの螢光免疫検定の欠点を補つた
ものである。さらにこの発明による検定では、患
者の血清サンプルにみられるほとんどの自家螢光
物質に特徴的な波長よりもかなりに長い波長で螢
光を発する螢光標識物質を提供するものである。 さらにこの発明は、これまでの螢光免疫検定器
械よりもはるかにシンプルで安価な螢光免疫検定
を行なう器械を提供するものである。この発明
は、信号路に用いる光学システムを提供するもの
であるが、このシステムは高価な回折格子やその
他の高価な光学器械は使用せず、また励起光源に
よるセンサーの照明とは適合しなくなるものであ
る。 従つて、高いストークスシフトと自家螢光プロ
テインの特徴的波長とはかけ離れた螢光波長によ
つて特徴づけられる螢光標識物質を用いたこの発
明によつて提供される器械では、たとえば光セン
サーが直接穴の下に置かれているマイクロタイタ
ープレートの穴のように、励起光源を直接サンプ
ルの上に置くことができるものである。 この発明の光学的伝導路には、回折格子や高価
なレンズなどは必要ないので、この発明による配
置は、光学的経路を何回も重ねたシンプルなもの
である。これによつてこの発明のもうひとつの重
要な局面が示される;つまりひとつの器械で1度
に多数のテストを行なえ、線量応答曲線の計算プ
ロセスを自動化して、患者のサンプルについての
テストの量的結果をだすことのできる能力であ
る。 従つて、改良された螢光免疫検定システムを提
供することが、この発明の目的である。 また非常にシンプルな光学器具を用いた、改良
型の螢光免疫検定器械を提供することが、この発
明の目的である。 さらに、コンピユーター制御に基づいたシーケ
ンスで複数のサンプルをテストできる螢光免疫検
定を行なうための自動化された配置を提供するこ
とも、この発明の目的である。さらに、検定の結
果はコンピユータに多重送信され、線量応答曲
線、及び患者の複数サンプルの数量による結果が
非常に速やかに与えられる。 また、光学的センシング信号路が、標識の螢光
物質に特徴的波長と一般的血清成分の螢光物質に
特徴的波長から、感度におけて少なくとも10デシ
ベル降下によつて特徴づけられる螢光免疫検定を
提供することも、この発明の目的である。 さらに、複数の光センサーの出力がアナログか
らデイジタルへの変換器に多重送信され、その結
果生ずるデイジタル出力が自動的にコンピユータ
ーに伝送されて、患者のサンプル中の抗原濃度の
量的表示が行なわれるようになつている自動化さ
れたFIA器械を提供することも、この発明の目的
である。 また、往々にしてFIA方式に伴うプロテイン分
子によつて示される自家螢光波長と比較的大きな
差のある螢光放射の波長と比較的大きなストーク
スシフトを有する、FIA方式で使用可能な螢光標
識物質を提供することも、この発明の目的であ
る。 この発明のこれら、及びその他の目的、特質、
利点は、開示実施例と添付図面とクレームについ
ての以下の詳しい説明を検討すれば明らかとな
る。 この発明の実施にあたり、検定試薬には、150
ナノメートル以上のストークスシフトを有する螢
光標識づけ薬剤の標識がつけられている。標識つ
き検定試薬は、試薬と標識づけ薬剤を混ぜて得ら
れる。この発明は、この発明の螢光標識づけ薬剤
と混ぜることのできる検定試薬の実質上すべてに
適用可能である。そうした検定試薬に含まれるの
は、たとえば抗原、抗体、ホルモン、ビールス、
粒子、ハプテン、バクテリア成分、薬物、モノク
ロナル抗体、抗抗体(2重抗体または第2抗体と
しても知られている)、免疫グロブリン、たくぱ
く質などである。この発明で使用できる特定の検
定試薬は、チロキシン、トリヨードチロキシン、
甲状腺刺激ホルモン、チロキシン拘束グロブリ
ン、チロトロピン解放ホルモン、ジゴキシン、ゲ
ンタマイシン、トブラマイシン、フエントイン、
テオフイリン、テトラサイクリン、肝炎B表面抗
原、肝炎B核抗原、肝炎A抗原、癌胎児抗原、前
立腺酸ホスフアターゼ、ヒト絨主膜性生殖腺刺激
ホルモンである。 この発明に使用できる螢光標識づけ薬剤は、ク
ロロフイルとポルフイリンで、これらは少なくと
も150ナノメートル以上のストークスシフトを有
する。 クロロフイルは緑色の色素で、すべての
autotropic及びchemoauto植物や化学独立栄養植
物から得られる有機溶剤から抽出可能である。お
よそ10のクロロフイルが、様々な植物の緑色部分
から取り出されている。最も豊富な緑色成分はク
ロロフイルaで、以下クロロフイルb、クロロフ
イルC1,C2、クロロフイルd、プロトクロロフ
イル、バクテリアクロロフイル、そしてクロロビ
ウムクロロフイルと続く、。上記すべてのクロロ
フイルは、150ナノメートル以上のストークスシ
フトを有しており、この発明に使用できるもので
ある。 クロロフイルは、ポジシヨンC−7とC−8の
ところで2つの余分の水素原子を持つているマグ
ネシウム混成のジヒドロポルフイリンである。ク
ロロフイルaは、黄緑、青緑海藻類、及び幾つか
の紅藻類中に形成される唯一の緑色色素であり、
その他の少量のクロロフイルと一緒になつてユー
グレナ、珪藻類、双鞭主虫類、緑藻類、褐藻類、
及び2.3の紅藻類などに見うけられるものである。
クロロフイルaは次のごとくの構造式を有してい
る: クロロフイルbもまたジヒドロポルフイリンで
あるが、C−3のメチルグループがホルミルグル
ープに代わつている点で、クロロフイルaと異な
つている。クロロフイルbは、維管束植物、緑藻
類及びユーグリア中の主な緑色色素として生じ、
次のごとくの構造式を有する: クロロフイルCは、珪藻類、双鞭主虫類、褐藻
類、及びいそぎんちやくの特定の寄生海藻類にみ
られる。クロロフイルCは、2つの合成物クロロ
フイルC1とC2の混合として生じる。クロロフイ
ルC1(マグネシウムテトラジヒドロ
pheoporphyrin a5モノメチルエステル)は、次
のごとくの構造式を有している: クロロフイルC2(マグネシウムHexadehydro
pheoporphyrinモノメチルエスター)は、次のご
とくの構造式を有している: プロトクロロフイルは2つの形で生じ得るもの
である;つまり普通のphytolエステルあるいは遊
離酸、protochlorophylliedである。プロトクロ
ロフイルは、クロロフイルaを2,3−dichloro
−5,6−dicyano−1,4−benzoquinoneで酸
化することによつてつくられ、きゆうり、スクウ
オツシユ、かぼちやの内側の種皮に微量が自然に
存在している。プロトクロロフイルの構造式は、
次のごとくである: クロロフイルはジヒドロポルフイリン(2−
desvinyl−2−ホルミル−クロロフイルa)であ
り、幾つかの紅藻類中にクロロフイルaをともな
つて微少クロロフイルとして存在する。クロロフ
イルdは次の構造式を有する: クロロビウムクロロフイルの詳しい構成はまだ
わかつていない。クロロビウムクロロフイルは、
側鎖の変異によつて差異のある6種のクロロフイ
ルの混合したものであると考えられている。2つ
の異なつたクロロビウムクロロフイルが明らかに
されており、エーテル中の赤色吸収最高点の波長
に従つて、クロロビウムクロロフイル660とクロ
ロビウムクロロフイル650と名づけられている。
元はバクテリオビリジンと名づけられていたクロ
ロビウムクロロフイルは、緑色の化学独立栄養生
物硫黄細菌中に見られるもので、少量のバクテリ
オクロロフイルaを伴つている。 バクテリオクロロフイルは、化学独立栄養生物
硫黄細菌(無硫黄細菌科、紅色硫黄細菌科、及び
ビフオミクロビウム科)の主要クロロフイルであ
る。3つのクロロフイルの存在は、バクテリオク
ロロフイルap,バクテリオクロロフイルagg、及
びバクテリオクロロフイルbの3つの有機体の中
に生じることが知られている。 バクテリオクロロフイルの構造式は次のごとく
である: ここでRは: である。 バクテリオクロロフイルapとバクテリオクロ
ロフイルaggは、ロドシユードモナス属
(ATCC17001)及びロドスピリルム属
photometricum(NTHC13)から得ることができ
る。バクテリオクロロフイルaggはロドスピリル
ム属rubrumから主要緑色色素として隔離されて
いる。バクテリオクロロフイルbは、光合成バク
テリアロドシユードモナス属viridis中にみられる
主要クロロフイルである。 バクテリオクロロフイルbの構造式は次のをと
くである: 上記すべてのクロロフイルのストークスシフト
は150ナノメートル以上であるにもかかわらず、
バクテリオクロロフイルbがその準備が比較的容
易なことと、ストークスシフトがおよそ250ナノ
メートルであることから、一番好まれている。そ
の他のクロロフイルも、ストークスシフトがおよ
そ150ナノメートル以上である限り、この発明に
使用可能である。 様々なクロロフイルの吸収最大値と特定の係数
は以下表1に示されている:
を行なう方法と、そのための器械に関連したもの
であり、この検定においては螢光マーカーが、励
起波長から螢光放出の波長へと相対的に大きなス
トークスシフトをみせる。 免疫検定は医学の分野において様々な応用法で
用いられている。そうした検定は、患者から取つ
た血液サンプルに存在する様々な物質の濃度を調
べるテストである。特定の物質に関しては、多く
の既知の検定法がある。最も一般的なクラスの検
定のひとつは、患者の血液中の特定のホルモンの
濃度を調べるものである。たとえば、T4とも呼
ばれているチロキシンは、人間の代謝作用を調整
するホルモンである。すべての新生児にたいし、
T4の欠乏状態の有無をテストするのが望ましい
が、これはT4の欠乏状態を放置しておくと、取
り返しのつかない精神遅滞を引き起こすことがあ
るからである。同様に、T3としても知られてい
るトリヨードチロキシンは、患者の甲状腺刺激ホ
ルモン過剰症の検査に用いることのできるもので
ある。 また患者の体内のビールスやバクテリアの存在
を調べるための検定もある。また患者の治療に用
いられている新薬の中には、血液中で高濃度にな
るまで蓄積されると、最終的には有害となるもの
もある。ダイゴキシンを用いた治療で問題となる
のは、血液流の中で一定の濃度に達するまでに要
する薬の量は、患者ごとにはなはだしく異なり、
しかも濃度が上がり過ぎると有害になるというこ
とである。 近代的な免疫検定システムは、3つのカテゴリ
ーに分けられる:つまり(1)放射免疫検定;(2)酵素
免疫検定;(3)螢光免疫検定である。このそれぞれ
に共通した特徴は、マーク付きまたは標識付きの
標準溶液を用いることである。典型的な免疫検定
方法は、テストが行なわれる物質(抗原)に特定
の抗体を用意することから始まる。抗原のサンプ
ルはテスターによつて用意され、各サンプルごと
に問題のマーカーがつけられる。放射免疫検定
(RIA)の場合、標識をつける物質は放射性物質
であり、螢光免疫検定(FIA)の場合は、既知の
螢光性を備えた物質である。酵素免疫検定は分光
測光法的に測定されるので、放射免疫検定や螢光
免疫検定ほど敏感なものではない。 次の段階で行なうのは、標識のついた溶液また
は抗原溶液と、濃度の様々に異なる標準のマーク
付きでない抗原溶液を混ぜて得られる線量応答曲
線をだし、これら様々な混合物を、たとえば特定
の抗体で塗装したマイクロタイターウエルのよう
な容器の中で、抗体の場を競わせることである。
混合物中のマーク付きとマーク付きでない抗原
は、抗体の場を争い、その混合物中での存在割合
に比例して抗体の場につくるようになる。 混合物の残りは、吸引その他の方法で、抗体を
収容した井戸から除去され、次に標識のついた抗
原の存在が調べられる。標識つき溶液は、濃度の
わかつている様々な標識なしの抗原と混ぜられて
いるので、調合反応曲線は、手でも、あるいはコ
ンピユーターを使つてでも描くことができ、使用
されているマーク付きの抗原溶液の特定のサンプ
ルにたいする標識なしの抗原の濃度とラベル検出
器の出力が相関関係づけられる。このようにして
線量応答曲線は、抗体の場についたマーク付きの
抗原の量を、マーク付き溶液がそれと混ぜられた
ところのマークなしの抗原の濃度に直接置き換え
る方法を与えるものである。 この作業を終えた後は、マーク付き溶液のサン
プルを患者の血清と混ぜられ、マーク付き抗原分
子は抗体の場で患者の抗原分子に匹敵することに
なる。上記のごとく、同様に患者の抗原分子と標
識つき抗原分子は、利用できる抗体の場を競い、
それら各々の溶液中の濃度に応じて、その場を獲
得するのである。 溶液の残りの部分が排除されたなら、容器内の
標識つき抗原の存在がテストされる。線量応答曲
線(使用されている特定のマークつき溶液用の)
を用いると、抗体の場について残つている標識つ
きの抗原の量によつて線量応答曲線からはずれた
患者の血清サンプル内にある特定の抗原の濃度が
直接に示されることになる。 RIAの場合、最も一般的に用いられる標識つき
抗原は、ヨウ素の放射活性同位元素、125Iであ
る。抗体の場についた標識つき抗原の量をテスト
する際には、患者の血清中の抗原濃度を示す線量
応答曲線外の読取りを行なうために、サンプルか
らの放射性放出を測らねばならない。 放射免疫検定は非常に信頼度が高く、感受性も
優れているため、評判もよく一般に行なわれるよ
うになつてきている。放射免疫検定の根本的欠点
は、それが非常に費用の重むものであるというこ
とである。まず第1に、放射能の存在の有無を調
べるために必要な器械は、複雑で高価なものであ
る。第2に、用いられるヨウ素の特定の同位元素
の半減期は60日なのである。放射活性同位元素の
標識のついた抗原溶液は、つくつた後速やかに使
用しなくてはならないが、これはマーカー物質の
放射性崩壊が急速なために、保存期間が厳しく制
限されているからである。故にこの物質の配布に
は、1度に各ユーザーに少量を供給し、しかもつ
くられた場所から最終的に使用されるところま
で、大急ぎで輸送するという方法をとらなけれ
ば、経済的な採算はとれないのである。 また、輸送を行なう側、特に空輸の場合に、放
射性物質を輸送することが嫌われる傾向が強まつ
てきている。 こうしたRIAテクニツクの基本的欠点を克服す
るために、螢光免疫検定がつくられたのである。
放射免疫検出に優る螢光免疫検定の利点は、抗原
につけられる標識として使用される螢光化合物
は、RIAに用いられるマーカーの半減期が短かい
のと比較して非常に安定しているということであ
る。また、FIAの場合のテスト器械の費用は、だ
いたいにおいてRIAよりも安くて済み、放射性物
質のように取扱いの点でも外的な問題はないとい
うこともある。 螢光免疫検定における螢光標識の使用の基本原
理は、可視光線のまわりのスペクトル中の放射に
よつて照らされた場合に、特定の物質がその照射
に反応して、低周波(波長のより長い)の放射を
行なうということである。FIAで用いられるほと
んどの螢光物質の場合、発された放射は可視光線
の中にあるので、螢光標識の存在を確かめるの
に、光検出器を用いることができる。 そうした螢光物質の場合、螢光放射は物質に螢
光を発させている輻射よりも周波数が低いという
ことはすでに明らかにされていることである。故
に螢光放射の波長は、物質を照らしている輻射の
波長よりも長いということになる。螢光放射の波
長と照射(励起)の波長の差は、ストークスシフ
トと呼ばれている。螢光標識として用いられる各
物質は、特有の励起波長とそれによつて生じる螢
光放射の波長を有しており、従つて特有のストー
クシフトを有することにもなつている。 先行技術による螢光免疫検定には、2つの大き
な欠点がある:つまり(1)使用される螢光マーカー
物質は、20〜35マノメートルという比較的低いス
トークスシフトをもつて特徴づけられているもの
である;(2)螢光マーカーの螢光放射の波長が、患
者の血清中によく見られる成分によつて示される
自家螢光の波長に非常に近いものである、という
ことである。 上述の第1の欠点は、螢光物質の波長特性を有
する光と螢光物質を励起するのに用いられる光を
圧別するために、非常に感度の高い検出器と複雑
な光学器械を必要とするものである。ストークス
シフトが低いため、螢光の波長に反応し、且つ励
起光線の波長には比較的に感度が鈍い光線センサ
ーを設計するのは困難であり、また費用のかかる
ことである。この問題を克服するため、先行技術
による多くの螢光免疫検定装置は、螢光標識を含
むサンプルと光学センサーの間に高価な回折格子
を差し込んで用いている。この回折格子は、励起
波長で光線の方向に直交するように置かれてい
る。 上記第2の欠点は、先行技術による螢光免疫検
定のRIAと比較した上での感度と信頼度を減ずて
いる。血清中に自家螢光成分が存在している場合
には、螢光物質の存在についての究極的テストが
行なわれる前に抗体を含んだサンプルからこうし
た自家螢光物質を確実に排除しておく余分の処置
と余分の注意が必要とされるのである。このた
め、サンプル作成の複雑さと費用が増大してい
る。さらに、自家螢光物質を完全に排除すること
は困難であり、従つて先行技術による螢光免疫検
定の信頼度は、放射免疫検定よりも劣る傾向にあ
る。 発明の要約 この発明は、比較的高いストークスシフトによ
つて特徴づけられる螢光標識物質を用いることに
よつて、これまでの螢光免疫検定の欠点を補つた
ものである。さらにこの発明による検定では、患
者の血清サンプルにみられるほとんどの自家螢光
物質に特徴的な波長よりもかなりに長い波長で螢
光を発する螢光標識物質を提供するものである。 さらにこの発明は、これまでの螢光免疫検定器
械よりもはるかにシンプルで安価な螢光免疫検定
を行なう器械を提供するものである。この発明
は、信号路に用いる光学システムを提供するもの
であるが、このシステムは高価な回折格子やその
他の高価な光学器械は使用せず、また励起光源に
よるセンサーの照明とは適合しなくなるものであ
る。 従つて、高いストークスシフトと自家螢光プロ
テインの特徴的波長とはかけ離れた螢光波長によ
つて特徴づけられる螢光標識物質を用いたこの発
明によつて提供される器械では、たとえば光セン
サーが直接穴の下に置かれているマイクロタイタ
ープレートの穴のように、励起光源を直接サンプ
ルの上に置くことができるものである。 この発明の光学的伝導路には、回折格子や高価
なレンズなどは必要ないので、この発明による配
置は、光学的経路を何回も重ねたシンプルなもの
である。これによつてこの発明のもうひとつの重
要な局面が示される;つまりひとつの器械で1度
に多数のテストを行なえ、線量応答曲線の計算プ
ロセスを自動化して、患者のサンプルについての
テストの量的結果をだすことのできる能力であ
る。 従つて、改良された螢光免疫検定システムを提
供することが、この発明の目的である。 また非常にシンプルな光学器具を用いた、改良
型の螢光免疫検定器械を提供することが、この発
明の目的である。 さらに、コンピユーター制御に基づいたシーケ
ンスで複数のサンプルをテストできる螢光免疫検
定を行なうための自動化された配置を提供するこ
とも、この発明の目的である。さらに、検定の結
果はコンピユータに多重送信され、線量応答曲
線、及び患者の複数サンプルの数量による結果が
非常に速やかに与えられる。 また、光学的センシング信号路が、標識の螢光
物質に特徴的波長と一般的血清成分の螢光物質に
特徴的波長から、感度におけて少なくとも10デシ
ベル降下によつて特徴づけられる螢光免疫検定を
提供することも、この発明の目的である。 さらに、複数の光センサーの出力がアナログか
らデイジタルへの変換器に多重送信され、その結
果生ずるデイジタル出力が自動的にコンピユータ
ーに伝送されて、患者のサンプル中の抗原濃度の
量的表示が行なわれるようになつている自動化さ
れたFIA器械を提供することも、この発明の目的
である。 また、往々にしてFIA方式に伴うプロテイン分
子によつて示される自家螢光波長と比較的大きな
差のある螢光放射の波長と比較的大きなストーク
スシフトを有する、FIA方式で使用可能な螢光標
識物質を提供することも、この発明の目的であ
る。 この発明のこれら、及びその他の目的、特質、
利点は、開示実施例と添付図面とクレームについ
ての以下の詳しい説明を検討すれば明らかとな
る。 この発明の実施にあたり、検定試薬には、150
ナノメートル以上のストークスシフトを有する螢
光標識づけ薬剤の標識がつけられている。標識つ
き検定試薬は、試薬と標識づけ薬剤を混ぜて得ら
れる。この発明は、この発明の螢光標識づけ薬剤
と混ぜることのできる検定試薬の実質上すべてに
適用可能である。そうした検定試薬に含まれるの
は、たとえば抗原、抗体、ホルモン、ビールス、
粒子、ハプテン、バクテリア成分、薬物、モノク
ロナル抗体、抗抗体(2重抗体または第2抗体と
しても知られている)、免疫グロブリン、たくぱ
く質などである。この発明で使用できる特定の検
定試薬は、チロキシン、トリヨードチロキシン、
甲状腺刺激ホルモン、チロキシン拘束グロブリ
ン、チロトロピン解放ホルモン、ジゴキシン、ゲ
ンタマイシン、トブラマイシン、フエントイン、
テオフイリン、テトラサイクリン、肝炎B表面抗
原、肝炎B核抗原、肝炎A抗原、癌胎児抗原、前
立腺酸ホスフアターゼ、ヒト絨主膜性生殖腺刺激
ホルモンである。 この発明に使用できる螢光標識づけ薬剤は、ク
ロロフイルとポルフイリンで、これらは少なくと
も150ナノメートル以上のストークスシフトを有
する。 クロロフイルは緑色の色素で、すべての
autotropic及びchemoauto植物や化学独立栄養植
物から得られる有機溶剤から抽出可能である。お
よそ10のクロロフイルが、様々な植物の緑色部分
から取り出されている。最も豊富な緑色成分はク
ロロフイルaで、以下クロロフイルb、クロロフ
イルC1,C2、クロロフイルd、プロトクロロフ
イル、バクテリアクロロフイル、そしてクロロビ
ウムクロロフイルと続く、。上記すべてのクロロ
フイルは、150ナノメートル以上のストークスシ
フトを有しており、この発明に使用できるもので
ある。 クロロフイルは、ポジシヨンC−7とC−8の
ところで2つの余分の水素原子を持つているマグ
ネシウム混成のジヒドロポルフイリンである。ク
ロロフイルaは、黄緑、青緑海藻類、及び幾つか
の紅藻類中に形成される唯一の緑色色素であり、
その他の少量のクロロフイルと一緒になつてユー
グレナ、珪藻類、双鞭主虫類、緑藻類、褐藻類、
及び2.3の紅藻類などに見うけられるものである。
クロロフイルaは次のごとくの構造式を有してい
る: クロロフイルbもまたジヒドロポルフイリンで
あるが、C−3のメチルグループがホルミルグル
ープに代わつている点で、クロロフイルaと異な
つている。クロロフイルbは、維管束植物、緑藻
類及びユーグリア中の主な緑色色素として生じ、
次のごとくの構造式を有する: クロロフイルCは、珪藻類、双鞭主虫類、褐藻
類、及びいそぎんちやくの特定の寄生海藻類にみ
られる。クロロフイルCは、2つの合成物クロロ
フイルC1とC2の混合として生じる。クロロフイ
ルC1(マグネシウムテトラジヒドロ
pheoporphyrin a5モノメチルエステル)は、次
のごとくの構造式を有している: クロロフイルC2(マグネシウムHexadehydro
pheoporphyrinモノメチルエスター)は、次のご
とくの構造式を有している: プロトクロロフイルは2つの形で生じ得るもの
である;つまり普通のphytolエステルあるいは遊
離酸、protochlorophylliedである。プロトクロ
ロフイルは、クロロフイルaを2,3−dichloro
−5,6−dicyano−1,4−benzoquinoneで酸
化することによつてつくられ、きゆうり、スクウ
オツシユ、かぼちやの内側の種皮に微量が自然に
存在している。プロトクロロフイルの構造式は、
次のごとくである: クロロフイルはジヒドロポルフイリン(2−
desvinyl−2−ホルミル−クロロフイルa)であ
り、幾つかの紅藻類中にクロロフイルaをともな
つて微少クロロフイルとして存在する。クロロフ
イルdは次の構造式を有する: クロロビウムクロロフイルの詳しい構成はまだ
わかつていない。クロロビウムクロロフイルは、
側鎖の変異によつて差異のある6種のクロロフイ
ルの混合したものであると考えられている。2つ
の異なつたクロロビウムクロロフイルが明らかに
されており、エーテル中の赤色吸収最高点の波長
に従つて、クロロビウムクロロフイル660とクロ
ロビウムクロロフイル650と名づけられている。
元はバクテリオビリジンと名づけられていたクロ
ロビウムクロロフイルは、緑色の化学独立栄養生
物硫黄細菌中に見られるもので、少量のバクテリ
オクロロフイルaを伴つている。 バクテリオクロロフイルは、化学独立栄養生物
硫黄細菌(無硫黄細菌科、紅色硫黄細菌科、及び
ビフオミクロビウム科)の主要クロロフイルであ
る。3つのクロロフイルの存在は、バクテリオク
ロロフイルap,バクテリオクロロフイルagg、及
びバクテリオクロロフイルbの3つの有機体の中
に生じることが知られている。 バクテリオクロロフイルの構造式は次のごとく
である: ここでRは: である。 バクテリオクロロフイルapとバクテリオクロ
ロフイルaggは、ロドシユードモナス属
(ATCC17001)及びロドスピリルム属
photometricum(NTHC13)から得ることができ
る。バクテリオクロロフイルaggはロドスピリル
ム属rubrumから主要緑色色素として隔離されて
いる。バクテリオクロロフイルbは、光合成バク
テリアロドシユードモナス属viridis中にみられる
主要クロロフイルである。 バクテリオクロロフイルbの構造式は次のをと
くである: 上記すべてのクロロフイルのストークスシフト
は150ナノメートル以上であるにもかかわらず、
バクテリオクロロフイルbがその準備が比較的容
易なことと、ストークスシフトがおよそ250ナノ
メートルであることから、一番好まれている。そ
の他のクロロフイルも、ストークスシフトがおよ
そ150ナノメートル以上である限り、この発明に
使用可能である。 様々なクロロフイルの吸収最大値と特定の係数
は以下表1に示されている:
【表】
表1 クロロフイルの吸収最大値(λ)と特定の
吸収係数(e) 化合物 (2) 溶液 (3) 放射線吸収 (4) アセトン (5) ピリジン (6) プロトクロロフイル (7) バクテリオクロロフイル (8) クロロビウムクロロフイル660 (9) クロロビウムクロロフイル650 クロロフイルの代替物質が派生物も、この発明
に使用可能であり、この中に含まれるものは:ク
ロロフイル異性体、たとえばクロロフイルa,
b,dであり、バクテリオクロロフイルは、C−
10のジアステレオ異性体;Chlorophyllides;
Chlorophyllideエステル;酸化クロロフイル,異
質同形クロロフイル,ピロクロロフイル9−
Deoxo−9−ヒドロキシクロロフイル;アミンと
反応させた代替の塩素−6−アミド;クロロフイ
リン(強アルカリ性のアルコール溶液で加水分解
したクロロフイル);2−Devinyl−2−アセチ
ルクロロフイルa。 様々なクロロフイルaの派生物の構造と性質は
表2に示されている。 表 2 クロロフイルa(クロマトグラフイーによる) 化学式:C55H72O5N4Mg.MW:892.5350 構造:R1=−H.R2=−CO2CH3,R3=−C20H38 クロロフイルa′(ピリジン中での加熱による) 化学式:C55H72O5N4Mg.MW:892.5350 構造:クロロフイルaと同じ、C−10あたりに転
化あり 吸収最大値エーテル:661,0nm;428,5nm;比
率:1.29 Chlorophyllide a(phytylグループの酵素の加
水分解による) 化学式:C35H34O5N4Mg MW:614,2387 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3 R3=−H 吸収最大値エーテル:660.5nm;e 131000;
428nm;e,88200 メチルchlorophyllide a(メタノール中での酵素
加水分解による) 化学式:C36H36O5N4Mg MW:628,2533 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2,R3=−CH3 吸収最大値エーテル:660.5nm;e,83000;
427.5nm;比率:1.30 エチルchlorophyllide a(エタノール中での酵
素加水分解による) 化学式:C37H38O5N4Mg MW:642.2690 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3,R3=−
CH2CH2 吸収最大値エーテル:660nm;e,893000;
427.5nm;e,119000;比率:1.33 10−Hydroxychlorophyll a(酵素酸化または
非酵素異質同形化による) 化学式:C55H72O8N4Mg MW:908.5301 構造:R1=−OH,R2=−CO2CH2,R3=−
C20H28 吸収最大値エーテル:660.5nm:428nm;比率:
1.29 10−Methoxychlorophyll a(異質同形化によ
る) 化学式:C56H74O6N4Mg MW:922.5457 構造:R1=−OCH2,R2=−CO2CH2 R3=−C20H26 吸収最大値エーテル:660.5nm;428.5nm 10−Methoxylactoneクロロフイルa(異質同
形化による) 化学式:C56H74O7N4Mg MW:938.5406 構造:R1=−OCH3,R2=−CO2CH2,R3=−
C20H38 吸収最大値エーテル:656nm;416nm;比率:
1.82 ピロクロロフイルa(ピリジン中での長時間の
加熱による) 化学式:C52H70O2N6Mg MW:834.5297 構造;R1=−H,R2=−H,R3=−C20H38 吸収最大値エーテル:659,5nm;e,80.000;
429.1nm;比率:1.49 Methyl Pxrochlorophyllide a(酵素加水分解
とピリジン中での加熱による) 化学式:C34H34O3N4Mg MW:570.2480 構造:R1=−H,R2=H,R3=−CH3 吸収最大値エーテル:659,0nm;e,72.000;
428.0nm;比率:1.52 9−Deoxo−9−hyproxychlorophyll a(水
素化ホウ素ナトリウムでの還元による) 化学式:C5H74O5N4Mg MW:894.5 506 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3,R3=−C20H3 C−9における=Oの代わりに−Hと−
OH 吸収最大値エーテル:655.0nm;e ,53.000;
397nm;e,172.000;比率:3.25 クロロフイルaアミン物質(アミンとの反応に
よる) 一般的化学式:C55H72O5N4Mg(NR′R″) 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3,R3=−
C20H38 (1) 壁開されたリングV= クロロフイルa+n−プロピルアミンの吸収ス
ペクトル、エーテル:641nm;416nm 2−Devinyl−2−アセチルクロロフイルa
(バクテリオクロロフイルの酸化による) 化学式:C55H72O6N4Mg MW:908.5301 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−C20H38 ポジシヨン2におけるH2C=C−の代わりに−
C−CH2 吸収最大値アセトン:678.5nm;437nm;比率
208 様々なマグネシウムを含まないクロロフイルa
の派生物の構造と特性は、表3に示されている。 表3 クロロフイルaのマグネシウムを含まない
派生物の構造の特性 Pheophytin a(aqueousミネラル酸での処置によ
る) 化学式:C55H74O5N4 MW:870,565750 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−C20H28 吸収最大値エーテル:667.0nm;e,76,900;
409nm;e,156000;比率;2.09 Pheophorbide a(酸性アセトン中での還流によ
る) 化学式:C35H36O5N4 MW:592.2684 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−H 吸収最大値エーテル:667.0nm;e 70200;
408.5nm;e,141500;比率;2.07 Methyl Pheophorbide a(酸性メタノール中で
の還流による) 化学式:C36H30O5N4,nm;606,2841 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−CH3 吸収最大値エーテル:667,0nm;e,59200;
408.5nm;e,135.000;比率;2.07 Pyropheophyrin a(ピリジン中での長時間の加
熱と酸性化による) 化学式:C53H72O3N4 MW:812.5603 構造:R1=−H,R2=−H, R2=−C20H38 吸収最大値エーテル:667.0nm;e,59200;
408.5nm;e,135000;比率:2.07 Methyl pyrophephorbide a(酸性メタノール中
での還流、後にピリジンでの加熱による) 化学式:C34H36O3N4 MW:548.2786 構造:R1=−H,R2=−H,R3=CH3 吸収最大値エーテル:667.0nm;e,52000;
409.0nm;比率:2.09 10−Hydroxypheophylin a(異質同形化と酸性
化による) 化学式:C55H74O8N4 MW;886.5606 構造:R1=−OH R2=−CO2CH2 R3=−C24H38 9−Deoxo−9−hydroxypheophytin a(還元、
後に酸性化による) 化学式:C55H74O5N4 MW;872,5816 構造;R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−C20H38 C−9のところの=Oの代わりに−Hと−
OH 吸収最大値エーテル:655nm;e,53.000;
397nm;e.172.000 Pheophytin aアミン物質(酸性化による) 一般的化学式;C55H74O5N4(NR′R″)
pheophytin a+n−プロピルアミンの吸収最
大値、エーテル:662nm;441nm ポルフイリンは、正式には周囲ポジシヨンの幾
つか、あるいはすべてを様々な側鎖に替えること
によつて、ポルフインからつくられるものであ
る。 ポルフインの化学式は次のごとくである: この発明に使用可能な幾つかの代表的ポルフイ
リンが表4に挙げられており、またこの表によつ
て、代替グループとそれらのポルフイン構造にお
ける位置が明らかにされている。
吸収係数(e) 化合物 (2) 溶液 (3) 放射線吸収 (4) アセトン (5) ピリジン (6) プロトクロロフイル (7) バクテリオクロロフイル (8) クロロビウムクロロフイル660 (9) クロロビウムクロロフイル650 クロロフイルの代替物質が派生物も、この発明
に使用可能であり、この中に含まれるものは:ク
ロロフイル異性体、たとえばクロロフイルa,
b,dであり、バクテリオクロロフイルは、C−
10のジアステレオ異性体;Chlorophyllides;
Chlorophyllideエステル;酸化クロロフイル,異
質同形クロロフイル,ピロクロロフイル9−
Deoxo−9−ヒドロキシクロロフイル;アミンと
反応させた代替の塩素−6−アミド;クロロフイ
リン(強アルカリ性のアルコール溶液で加水分解
したクロロフイル);2−Devinyl−2−アセチ
ルクロロフイルa。 様々なクロロフイルaの派生物の構造と性質は
表2に示されている。 表 2 クロロフイルa(クロマトグラフイーによる) 化学式:C55H72O5N4Mg.MW:892.5350 構造:R1=−H.R2=−CO2CH3,R3=−C20H38 クロロフイルa′(ピリジン中での加熱による) 化学式:C55H72O5N4Mg.MW:892.5350 構造:クロロフイルaと同じ、C−10あたりに転
化あり 吸収最大値エーテル:661,0nm;428,5nm;比
率:1.29 Chlorophyllide a(phytylグループの酵素の加
水分解による) 化学式:C35H34O5N4Mg MW:614,2387 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3 R3=−H 吸収最大値エーテル:660.5nm;e 131000;
428nm;e,88200 メチルchlorophyllide a(メタノール中での酵素
加水分解による) 化学式:C36H36O5N4Mg MW:628,2533 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2,R3=−CH3 吸収最大値エーテル:660.5nm;e,83000;
427.5nm;比率:1.30 エチルchlorophyllide a(エタノール中での酵
素加水分解による) 化学式:C37H38O5N4Mg MW:642.2690 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3,R3=−
CH2CH2 吸収最大値エーテル:660nm;e,893000;
427.5nm;e,119000;比率:1.33 10−Hydroxychlorophyll a(酵素酸化または
非酵素異質同形化による) 化学式:C55H72O8N4Mg MW:908.5301 構造:R1=−OH,R2=−CO2CH2,R3=−
C20H28 吸収最大値エーテル:660.5nm:428nm;比率:
1.29 10−Methoxychlorophyll a(異質同形化によ
る) 化学式:C56H74O6N4Mg MW:922.5457 構造:R1=−OCH2,R2=−CO2CH2 R3=−C20H26 吸収最大値エーテル:660.5nm;428.5nm 10−Methoxylactoneクロロフイルa(異質同
形化による) 化学式:C56H74O7N4Mg MW:938.5406 構造:R1=−OCH3,R2=−CO2CH2,R3=−
C20H38 吸収最大値エーテル:656nm;416nm;比率:
1.82 ピロクロロフイルa(ピリジン中での長時間の
加熱による) 化学式:C52H70O2N6Mg MW:834.5297 構造;R1=−H,R2=−H,R3=−C20H38 吸収最大値エーテル:659,5nm;e,80.000;
429.1nm;比率:1.49 Methyl Pxrochlorophyllide a(酵素加水分解
とピリジン中での加熱による) 化学式:C34H34O3N4Mg MW:570.2480 構造:R1=−H,R2=H,R3=−CH3 吸収最大値エーテル:659,0nm;e,72.000;
428.0nm;比率:1.52 9−Deoxo−9−hyproxychlorophyll a(水
素化ホウ素ナトリウムでの還元による) 化学式:C5H74O5N4Mg MW:894.5 506 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3,R3=−C20H3 C−9における=Oの代わりに−Hと−
OH 吸収最大値エーテル:655.0nm;e ,53.000;
397nm;e,172.000;比率:3.25 クロロフイルaアミン物質(アミンとの反応に
よる) 一般的化学式:C55H72O5N4Mg(NR′R″) 構造:R1=−H,R2=−CO2CH3,R3=−
C20H38 (1) 壁開されたリングV= クロロフイルa+n−プロピルアミンの吸収ス
ペクトル、エーテル:641nm;416nm 2−Devinyl−2−アセチルクロロフイルa
(バクテリオクロロフイルの酸化による) 化学式:C55H72O6N4Mg MW:908.5301 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−C20H38 ポジシヨン2におけるH2C=C−の代わりに−
C−CH2 吸収最大値アセトン:678.5nm;437nm;比率
208 様々なマグネシウムを含まないクロロフイルa
の派生物の構造と特性は、表3に示されている。 表3 クロロフイルaのマグネシウムを含まない
派生物の構造の特性 Pheophytin a(aqueousミネラル酸での処置によ
る) 化学式:C55H74O5N4 MW:870,565750 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−C20H28 吸収最大値エーテル:667.0nm;e,76,900;
409nm;e,156000;比率;2.09 Pheophorbide a(酸性アセトン中での還流によ
る) 化学式:C35H36O5N4 MW:592.2684 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−H 吸収最大値エーテル:667.0nm;e 70200;
408.5nm;e,141500;比率;2.07 Methyl Pheophorbide a(酸性メタノール中で
の還流による) 化学式:C36H30O5N4,nm;606,2841 構造:R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−CH3 吸収最大値エーテル:667,0nm;e,59200;
408.5nm;e,135.000;比率;2.07 Pyropheophyrin a(ピリジン中での長時間の加
熱と酸性化による) 化学式:C53H72O3N4 MW:812.5603 構造:R1=−H,R2=−H, R2=−C20H38 吸収最大値エーテル:667.0nm;e,59200;
408.5nm;e,135000;比率:2.07 Methyl pyrophephorbide a(酸性メタノール中
での還流、後にピリジンでの加熱による) 化学式:C34H36O3N4 MW:548.2786 構造:R1=−H,R2=−H,R3=CH3 吸収最大値エーテル:667.0nm;e,52000;
409.0nm;比率:2.09 10−Hydroxypheophylin a(異質同形化と酸性
化による) 化学式:C55H74O8N4 MW;886.5606 構造:R1=−OH R2=−CO2CH2 R3=−C24H38 9−Deoxo−9−hydroxypheophytin a(還元、
後に酸性化による) 化学式:C55H74O5N4 MW;872,5816 構造;R1=−H,R2=−CO2CH2 R3=−C20H38 C−9のところの=Oの代わりに−Hと−
OH 吸収最大値エーテル:655nm;e,53.000;
397nm;e.172.000 Pheophytin aアミン物質(酸性化による) 一般的化学式;C55H74O5N4(NR′R″)
pheophytin a+n−プロピルアミンの吸収最
大値、エーテル:662nm;441nm ポルフイリンは、正式には周囲ポジシヨンの幾
つか、あるいはすべてを様々な側鎖に替えること
によつて、ポルフインからつくられるものであ
る。 ポルフインの化学式は次のごとくである: この発明に使用可能な幾つかの代表的ポルフイ
リンが表4に挙げられており、またこの表によつ
て、代替グループとそれらのポルフイン構造にお
ける位置が明らかにされている。
【表】
【表】
表5はこの発明に使用できるさらなるポルフオ
リンを挙げたもので、これにはその代替物質と分
光吸収データも含まれている:
リンを挙げたもので、これにはその代替物質と分
光吸収データも含まれている:
【表】
a 25℃で2.5%の硫酸ドデシルナトリウム中で
測定 b ジオキサン中 c 20℃での値から補外 d ±0.2ユニツト、イオン強度のバリエーシヨ
ンによつて不正確さがでている。 (1) ポルフオリン (2) 代替物 この発明に使用できるさらなるポルフイリンは
次のものである:2−4−ジアセチル,
deuterodioxime,2−ホルミル−4−ビニル−
deuterooxime,2.4−ジホルミル
deuterodioxime,4−Propionyldeutero,4−
ホルミルdeutero,2−ホルミル−4−ビニル
deutero(chlorocruoro),2.4−ジアセチル
deutero,2.4−Dipropionyldeutero,4−
Nitrodeutero,2−ビニル−4−cyanodeutero,
2−4−Di−メトキシカルボニル−deutero,2
−4−Dibromodeutero及び2−4−ジホルミル
deutero。 プロフイリンの代替物、派生物、及び同質異性
体もまた、この発明に使用可能であり、その中に
含まれるのは次のものである:クロリン、フロリ
ン、オキソフロリン、コリン、コルフイン、コロ
ール及びエチオポルフイリンである。クロリンは
7,8−ジヒドロポルフイリンである。クロリン
のマグネシウム合成物がクロロフイルである。ク
ロリンの構造は次のごとくである。: クロリンはまたジヒドロポルフイリンでもあ
り、その構造は次のごとくである。 テトラヒドロポルフイリンは2つの種類が明ら
かにされており、a−とb−テトラヒドロポルフ
イリンと呼ばれるものであるが、これらの構造は
次のごとくである: コルフインはヘキサヒドロポルフインであり、
次の構造をもつものである: その他ヘキサヒドロポルフイリンにはコリン 及びポルフイリノゲン:
測定 b ジオキサン中 c 20℃での値から補外 d ±0.2ユニツト、イオン強度のバリエーシヨ
ンによつて不正確さがでている。 (1) ポルフオリン (2) 代替物 この発明に使用できるさらなるポルフイリンは
次のものである:2−4−ジアセチル,
deuterodioxime,2−ホルミル−4−ビニル−
deuterooxime,2.4−ジホルミル
deuterodioxime,4−Propionyldeutero,4−
ホルミルdeutero,2−ホルミル−4−ビニル
deutero(chlorocruoro),2.4−ジアセチル
deutero,2.4−Dipropionyldeutero,4−
Nitrodeutero,2−ビニル−4−cyanodeutero,
2−4−Di−メトキシカルボニル−deutero,2
−4−Dibromodeutero及び2−4−ジホルミル
deutero。 プロフイリンの代替物、派生物、及び同質異性
体もまた、この発明に使用可能であり、その中に
含まれるのは次のものである:クロリン、フロリ
ン、オキソフロリン、コリン、コルフイン、コロ
ール及びエチオポルフイリンである。クロリンは
7,8−ジヒドロポルフイリンである。クロリン
のマグネシウム合成物がクロロフイルである。ク
ロリンの構造は次のごとくである。: クロリンはまたジヒドロポルフイリンでもあ
り、その構造は次のごとくである。 テトラヒドロポルフイリンは2つの種類が明ら
かにされており、a−とb−テトラヒドロポルフ
イリンと呼ばれるものであるが、これらの構造は
次のごとくである: コルフインはヘキサヒドロポルフインであり、
次の構造をもつものである: その他ヘキサヒドロポルフイリンにはコリン 及びポルフイリノゲン:
【式】がある。
オキソフロリンは1〜4の中間ポジシヨンに酸
素官能をもつた酸化ポルフイリンであり、構造は
次のごとくである:
素官能をもつた酸化ポルフイリンであり、構造は
次のごとくである:
【式】
【式】
【式】
【式】コロールの構
造は次のものである:
【式】
エチオポルフイリンは4個の同質異性体として
存在し、次の構造をもつものである:
存在し、次の構造をもつものである:
【式】
【式】
【式】
【式】
上記すべてのポルフイリンはすべて150ナノメ
ートル以上のストークスシフトをもち、この発明
に使用できるものである。その他のポルフイリン
及び派生物、または代替物も、ストークスシフト
が150ナノメートル以上である限り、この発明に
使用可能である。 クロロフイルまたはポルフイリンは、化学的に
処理されて、検定試薬との共有結合ができるよう
になつている。クロロフイルまたはポルフイリン
を検定試薬と結合させるやり方は、クロロフイ
ル、ポルフイリン、及び試薬の性質により異なる
が、クロロフイルまたはポルフイリンと検定試薬
間のアミド連鎖を、都合よく用いることができ
る。バクテリオクロロフイルbのたとえばチロキ
シンなどの抗原との結合の場合、これを行なう方
法はバクテリオクロロフイルbを加水分解してそ
こからphytyl連鎖を除去し、抗原または抗原の派
生物へのアミド連結とアシル化を行なうものであ
る。バクテリオクロロフイルbのチロキシン,ト
リヨードチロキシン、甲状腺刺激ホルモンとの結
合のあらましは、以下に示される: バクテリオクロロフイルb NaOH ―――――――――――― 加熱SOCl2/加熱 Bacteriochlorophillide b +チロキシン carbodiimide,またはPsobutyl−ch
loroformate /dioxaneとのアミノ化 チロキシン−バクテリオ
クロロフイルb バクテリオクロロフイルb NaOH ―――――――――――― 加熱SOCl2/加熱 Bacteriochlorophillide b +トリヨードチロキシン carbodiimideまたはisob
utylchloroformate /dioxaneとのアミド連鎖チロキシン−バクテリオ
クロロフイルb バクテリオクロロフイルb NaOH ―――――――――――― 加熱SOCl2/加熱 Bacteriochlorophyilide b +チロキシン gluteraldehydeとのアミド連刺激ホ
ルモン鎖 チロキシン刺激ホルモン−バクテリオクロロフイル
b バクテリオクロロフイルb NaOH ――――― 加熱 Bacteriochlorophillide b +ジゴキシン Succinicanhybride/ピリジン/car
bodiimide ジゴキシン−バクテリオクロロフイルb その他のクロロフイルまたはポルフイリンとそ
の他の検定試薬とを結合させる別のやり方を決め
るのは、技術上の問題である。 以下に挙げる例は、この発明の場合のみを説明
するものであるが、この発明の範囲を限定するも
のではない。温度はすべて摂氏で表わされ、すべ
ての部分は、特に述べられていない限り、重量に
よつて表わされている。 例 ロドシユードモナス属viridis.G.Drews strain
(ATCC19567)はMaryland,Rockvilleの
American Type Culture Collectionから得たも
のである。次に挙げる媒質を含んだフラスコが用
意された: コハク酸ナトリウム2.5g,K2PO4,MgSO4・
7H2O 0.2g,(NH4)2SO4 1.25g,CaCl2 0.07
g,クエン酸鉄0.003g,EDTA 0.002g,酵母
菌抽出物0.5g,消イオン水1.0。PHは7.0に調整
された。フラスコ中の媒質にバクテリアが加えら
れ、その後フラスコはしつかりとふたをされて、
タングステンランプの下に置かれた。フラスコ中
のバクテリアは、5日間温度30℃に保たれ、その
後液体媒質に暗緑色の色が観察され、それによつ
てバクテリアの多産成長が示された。 媒質のうちの整除できる数だけ試験管に移され
20℃で15分間、1000倍の重力で遠心分離機にかけ
られた。表面に浮いたものは捨てられ、試験管に
残つたバクテリア細胞は、1.0mlのアセトンで再
び懸濁化された。アセトンをバクテリア細胞に加
えることによつて、細胞膜が崩壊され、バクテリ
オクロロフイルが溶液中に抽出された。抽出され
た溶液はひとつに集められて、ジヨージア州
FairburnのGlasrockプロダクツ社による20マイ
クロメートル気孔のポリエチレンフイルターで濾
過された。濾過された250mlの溶液は、次に回転
式フラツシユ蒸発フラスコに入れられた。フラス
コは熱湯の中で90RPMで回転させられた。アセ
トンは蒸発しバクテリオクロロフイル及びその他
の抽出物が後に残された。 フラスコ中の残留物は石油エーテルで分解され
た。次に、溶液25mlがピペツトで測られて、シリ
カゲルGの薄い層がしかれたクロマトグラフイー
プレートに移され、9:1:0.45の比率の石油エ
ーテル−アセトン−プロパノールで展開された。
クロマトグラフイープレートの抽出物は、高圧液
体クロマトグラフイー(HPLC)装置(ジヨージ
ア州Norcross,Micromeritics社製)に注入され
た。抽出物が逆相オクタデシルシランでパツクさ
れたコラムに押し込まれた後に、浄化されたサン
プルがHPLCから収集された。収集されたサンプ
ルは、再びHPLCに注入され、鋭い螢光ピークを
もつた小片が探集された。 薄層クロマトグラフイーとHPLCから最終的に
得られたものがBacteriochlorophyllide bであ
る。このことはUV−可視、螢光,赤外線、核磁
気共鳴分光学によつて確認されている。 この後、Bacteriochlorophyllide bは、下記
のようにチロキシンと結合される: トリエチルアミンとジオキサン溶液中の
IsobutylchloroformateがBacteriochlorophillide
bと反応し、RCOOCO2CH2CH(CH3)2という合
成物を形成するが、RCOO-が合成物中の
Bacteriochlorophyllide bの部分である。次に、
チロキシンが加えられて、合成物RCONH−R′が
つくられるが、このうちのRが
Bacteriochlorophyllide bの部分であり、R′が
チロキシンである。 Bacteriochlorophyllide bとチロキシンが結
合してチロキシン−Bacteriochlorophyllide b
がつくられた後、放射免疫検定方法を用いて、標
識のついた抗原の濃度が明らかにされる。次に検
定に際しての最適濃度を判断するために、結合さ
れたチロキシン−Bacteriochlorophyllide bの
様々な希釈物の線量応答曲線が作成される。 患者から血液サンプルを取り、遠心分離機にか
けて血球と血清を分離させる。次に血清の方を検
定のために取り出す。 前もつてチロキシン抗体を塗布した複数の試験
管を用意する。このように塗布された試験管は、
市販されたものがあり、また試験管の代わりにウ
エルやマイクロタイタープレートを用いることも
できる。 抗体は薄膜にされて試験管の底の内側のガラス
壁に塗布されるが、場合によつては、ポリスチレ
ンやポリプロピレンでつくられた試験管に、抗体
が塗布されたり共有結合されたりすることもあ
る。次に2〜15ミリリツトルの患者の血清が、別
の試験管に入れられた量のわかつている(キヤリ
ブレーター)チロキシンと血清制御剤と共に、塗
布済みの試験管に加えられる。たとえば、溶液1
デシリツトルあたり0.2,4,8,10,12,及び
14マイクログラムの溶液を含んだ溶液がつくら
れ、塗布された試験管に加えられる。各基準溶液
に、たとえば1〜3mlと量のわかつている、上記
のごとくつくられたチロキシン−
Bacteriochlorophyllide bの溶液が加えられる。
螢光物質はジエチルバルビツル酸ナトリウム緩衝
液、炭酸ナトリウム−重炭酸緩衝液、tris緩衝液
(trisaminoethyltetramethane),リン酸塩で緩衝
した塩水または酢酸ナトリウム緩衝液などの中に
ある。螢光物質に加えられる緩衝液の量は、螢光
物質の濃度がそれが加えられる基準液の濃度とほ
ぼ同じになる量である。緩衝液中の量のわかつて
いる螢光物質も、患者の血清の入つた試験管に加
えられる。そこで基準溶液と患者の血清の入つた
試験管が渦巻機で混ぜられ、15分から3時間、望
むらくは1時間の間、25゜と37゜の間の温度で培養
される。次に試験管の中の液体は、吸い出される
か、別の容器に移されるかして、試験管は消イオ
ン水または緩衝溶液で洗浄される。アセトン、メ
タノールまたはアセトントリルの溶液が試験管に
加えられて、試験管の壁面から螢光物質が抽出さ
れる。基準溶液及び患者の血清サンプルの各液
は、マーク付きとマークなしの抗原と抗体の合成
物を含んでいるが、それが、螢光物質を励起させ
るのに十分な波長の輻射にさらされ、放出された
放射が測定される。そこで患者のサンプル中のチ
ロキシンの濃度が判断されるのである。 上記説明の検定を行なうために用いられるこの
発明による器械は、各部を番号で参照するように
して図面に示されている。図1はこの発明による
器械の第1の好適実施例を絵で表わした図であ
る。この発明による多重送信と計算の装置は、ハ
ウジング10に納められている従来の独立型マイ
クロコンピユーターユニツトである。一対の小型
フロツピーデイスクドライブ11aと11bは、
患者の記録を記憶し、またこの発明による機能を
働かせていない場合に、装置が行なえる他のプロ
グラムを記憶するために含まれている。このマイ
クロコンピユーターにはまた、従来のキーボード
15も含まれている。この発明による器械の第1
の好適実施例では、DRTデイスプレイ12、デ
イスクドライブ11及びキーボード15を含むデ
スクトツプメインフレームを用いており、これは
EXORSET30という名称で製造されていたもの
であるが、現在はアリゾナ州フエニツクスの
Motorola半導体プロダクツ社によつて製造され
ている。第1の好適実施例では、Motorola−タ
イプのM68MM19ワンボードマイクロコンピユー
ターが、図1に示されるメインフレームの上に差
し込まれて用いられている。M68MM19は、16ビ
ツトシステムアドレスバス、8ビツトシステムデ
ータバス、及び15ビツトシステム制御バスと接続
したMC6809中央処理装置を用いたワンボードマ
イクロコンピユーターであるという点で、技術的
にも評価されるものである。 このワンボードマイクロコンピユーターはまた
8及び4ビツトの並行バツフアド入/出力ポート
と、アメリカ電子協会によつて実施されている
RS232CまたはRS422スタンダードのどちらにあ
わせることもできる連続入/出力ポートを備えて
いる。さらにまたこのマイクロコンピユーター
は、リードオンリーメモリーの16Kまで用の直接
差し込みソケツトも備えている。 第1好適実施例で用いられているマイクロコン
ピユーターのリードオンリーメモリーは、ここに
説明されている線量応答曲線及び患者の抗原レベ
ルの双方を計算するようにプログラムされている
ということも、理解すべき点である。これらのパ
ラメーターの計算は、こうした特殊技術をもつて
すれば可能であり、この計算のルーチンはそれ自
体では目新しいものであるとはみなされない。 図1に示されたマイクロコンピユーター10に
接続されるのは光電変換器の8×12アレイ16
で、この上に8×12のマイクロ滴定多層井戸プレ
ート17が置かれている。 光検出器のアレイ16の各光検出器は、次のパ
ラメーターの範囲内の周波応答を有していること
で特徴づけられるものである。光検出器は680ナ
ノメートルの波長をもつ光に確実な応答を示さな
ければならない。OdB基準として680ナノメート
ル応答を用いた場合、光電変換器の電気出力は、
560ナノメートルにおける光にたいする応答の際
に、少なくとも10dB下でなければならない。こ
の要求条件は、両方の波長における光電変換器に
当たる等しい光束を求めるものである。この要求
条件がだされる理由は、上記説明の螢光標識の特
質、及びこの発明による器械の使用が意図される
環境状況は、マイクロ滴定プレート17の井戸
が、500〜520ナノメートルの範囲内の波長で自家
螢光を発する血清物質を収容できるようなもので
あるという事実にある。好適実施例において、ア
レイ16の各光電変換器は、カリフオルニア州
Palo Alto,Hewlett−Packard Inc.,オプトエ
レクトロニクス部によつて現在製造されているタ
イプHEDS−1000である。この特別なオプト検出
器の電圧出力の周波応答曲線は、一定した光束状
態にもとづいて図5に示されている。 故に、タイプHESD−1000は、この発明による
器械に用いる光検出器にたいし、上に述べられた
基準に適したものであることが評価されるもので
ある。 同じく図1に示されるのは、第1好適実施例に
よる器械の残りの部分である。もうひとつの8×
12の構成要素のアレイは19として示されてい
る。アレイ19の各構成要素は、96フアイバーオ
プテイツクグループのリンク20のうちのひとつ
の従来の端末であり、これは紫外線21の光源か
ら光を運ぶものである。紫外線21は従来の螢光
紫外線であり、励起輻射源を成すものである。 フアイバーオプテイクス20は複数の光伝導フ
アイバーから成り、この各フアイバーはその一方
の端で紫外線源21からの励起輻射を受け入れ、
それを端末アレイ19の端末に伝えるよう配置さ
れている。端末アレイ19の各構成要素は、フア
イバーオプテイツクケーブブル20のフアイバー
のうちのひとつの磨かれた一方の端であることに
注目すべきである。さらに図1から、ケーブル2
0の各フアイバーは、それぞれがアレイの端末の
ひとつと接合し、フアイバーの残りの分との前も
つて間隔を定めた関係を決定するような形で、終
端アレイ19に接合されていることにも注目すべ
きである。 使用にあたつては、端子群19がマイクロ滴定
プレート17上にセツトされて、16,17,1
9の各アレイの1構成要素が、それらのおよその
幾何学上の中心が同一線にくるような形で並んで
いることが評価される。 従つて、この配置構造が接続され、マイクロ滴
定プレート17の各井戸に上記説明のごとくに用
意されたサンプルが入れられた場合、ケーブル1
8の各導線が、それぞれ接続された光電変換器ア
レイ16の構成要素に当たるおよそ680ナノメー
トルの光束に比例した電圧を運んでゆくことも評
価される点である。 第1の好適実施例のブロツク線図は、図2に示
されている。紫外線源21は、フアイバーオプテ
イツクケーブル20を通じて、前述の説明どおり
複数の端末22に接続されているとして示されて
おり、またフアイバーオプテイツクケーブルのう
ち、3つのフアイバーのみが示されている。マイ
クロ滴定井戸アレイ17は、光電変換器アレイ1
6の上にセツトされ、その出力はケーブル18で
多重送信装置とアナログからデイジタルへの変換
器のブロツク25に連結されている。多重送信と
アナログからデイジタルへのブロツク25は2方
向通信のためにリンク26によつて、上記説明の
M68MM19コンピユーターボードに接続されてい
る。 キーボード15がワンボート−コンピユーター
28に入力を与え、これが図2で11として示さ
れている前述のデイスク記憶装置と、双方向的に
通信する。 同じく図2に示されているのは、検定の結果の
ハードコピーをつくるのに用いられるプリンター
29である。 図3に示されるのは、この発明の第2の好適実
施例であり、1度に1つづつこの発明に関連のテ
ストを行なうための、より安価でシンプルな構造
のものとして解釈されるものである。この第2の
好適実施例の器械を使用するにあたり、別に線量
応答曲線を計算することが必要なのは明らかであ
る。 図3からわかるように、第2の好適実施例は、
マイクロ滴定井戸(またはcurvette)30を照ら
す紫外線源21′から成つており、この井戸の下
に光電変換器31が置かれている。紫外線源2
1、マイクロ滴定井戸30、及び光電変換器31
は、すべて図3に示されているごとく縦方向の軸
37上に並んでいることがわかる。光電変換器3
1の出力は、レベル調整増幅器32に供給され、
この増幅器の出力は集積回路デイジタルマルチメ
ーター35に供給される。 好適実施例では、デイジタル式マルチメーター
回路35は、現在カリフオルニア州のNational
Semiconductor Corporation of Santa Claraに
よつて製造されているADD3501デイジタル式マ
ルチメーターチツプが用いられている。 DMMチツプ35の出力は3 1/2デイジツト
の7セグメントデイスプレイ36に接続され、マ
イクロ滴定井戸30に入つている物質によつて放
射される。前もつて定められた波長(680ナノメ
ートルが望ましい)での光束の量が、数字で表示
されるようになつている。もちろん明らかに、レ
ベル調整増幅光沢のある端末コネクターのひとつ
に接続されているとして示されており、これは図
1に示されているそうした端末のアレイ19のひ
とつであることが理解される。 39のボツクスに入つているのは、光電変換ア
レイ16の光電変換器のひとつである。その電気
出力はライン18′に現われており、これは図1
と2に示されているケーブル18の導線の一本で
あることがわかる。 ライン18′からの出力は、16チヤンネル多重
送信装置41cへのひとつの入力として接続さ
れ、残りの15入力は40cとされ、ケーブル18の
導線に接続されるものとして理解されることにな
る。同様に、多重送信装置41aと41bによつ
て、16のさらなるチヤンネルが供給されてい
る。これらの多重送信装置への入力はそれぞれ4
0aと40bであり、またケーブル18に接続さ
れている。図4に示されている多重送信ブロツク
25は、32チヤンネルの容量を備えているので、
25として示されている配置は、光電変換器アレ
イ16の全部で96の構成要素の出力を、1器32
は、3 1/2デイジツト7セグメント出力36に
適合するように測られた出力を供給できるように
調整されるべきである。 図4に示されるのは、多重送信とアナログから
デイジタルへの変換のブロツク25とマイクロ滴
定井戸プレート17からの代表的井戸の好適具体
例である。図4に示されるごとく、紫外線ランプ
21は96要素を備えたフアイバーオプテイツクケ
ーブル20によつて、端末ブロツクアレイ19に
接続されている。代表的フアイバーオプテイツク
要素46は、度にひとつづつ多重送信してゆく能
力をもたせるための好適実施例に用いられている
3つの同一のボードの典型的なひとつであること
が、すぐに理解される。 多重送信ボード25は、プログラム可能な利得
増幅器から成り、これは多重送信装置41a…4
1cからの出力を増幅するものである。増幅器4
2の出力はサンプルとホールドゲート47に与え
られるが、その出力は12ビツトのアナログからデ
イジタルへの変換器49へのアナログ入力とし
て、ライン48上に現われている。タイミングと
変換は、変換制御ブロツク50によつて制御され
ている。 アナログ/デイジタル変換器49の出力は、8
つのtristateバツフア52へのライン51に供給
されるが、これらのバツフアは、前述の単一ボー
ドコンピユーフーに接続された8ビツトのデータ
バスで、ボード25を接合させているものであ
る。8ビツトバス56は、データワードが正しく
アドレスされている場合に、これを、モード制御
ブロツク57と利得及び多重送信の制御装置58
に運ぶものである。モード制御ブロツク57は、
信号の特定のシーケンスを制御するものである
が、この信号は変換コントローラー50を操作し
てアナログからデイジタルへの変換を行なわしめ
るために、システムのアドレスバスとデータバス
に現われなければならないものである。 アドレスバツフアとボードセレクトデユーダス
イツチは、図4中の59である。接続部は示され
ていないが、このブロツクからの出力がボード2
5の特定のデータエレメントを制御し、また単一
ボードコンピユーターからの特定の入力/出力サ
クルの間に、このボードエレメントにデータが記
入され、ここから読み取られるということが理解
されるべきである。 図4に示されているボード25の好適形態は、
アリゾナ州フエニツクス、Motorola
Semiconductor Products,Inc.で現在製造され
ているモデルNo.M68MM15Aとして入手できる。 光沢端末22、マイクロ滴定井戸38、光電変
換器39の代表的配置を検討するに際し、フアイ
バーオプテイツクエレメント46の端末22にお
いて、フアイバーオプテイツク46は縦軸45に
よつて特徴づけられるということに注意すべきで
ある。図面に示されているごとく、光電変換器3
9は縦軸45の上にあり、マイクロ滴定井戸22
は端末22と光電変換器の間にはさまれて、縦軸
49がマイクロ滴定井戸の中心を通るようになつ
ている。
ートル以上のストークスシフトをもち、この発明
に使用できるものである。その他のポルフイリン
及び派生物、または代替物も、ストークスシフト
が150ナノメートル以上である限り、この発明に
使用可能である。 クロロフイルまたはポルフイリンは、化学的に
処理されて、検定試薬との共有結合ができるよう
になつている。クロロフイルまたはポルフイリン
を検定試薬と結合させるやり方は、クロロフイ
ル、ポルフイリン、及び試薬の性質により異なる
が、クロロフイルまたはポルフイリンと検定試薬
間のアミド連鎖を、都合よく用いることができ
る。バクテリオクロロフイルbのたとえばチロキ
シンなどの抗原との結合の場合、これを行なう方
法はバクテリオクロロフイルbを加水分解してそ
こからphytyl連鎖を除去し、抗原または抗原の派
生物へのアミド連結とアシル化を行なうものであ
る。バクテリオクロロフイルbのチロキシン,ト
リヨードチロキシン、甲状腺刺激ホルモンとの結
合のあらましは、以下に示される: バクテリオクロロフイルb NaOH ―――――――――――― 加熱SOCl2/加熱 Bacteriochlorophillide b +チロキシン carbodiimide,またはPsobutyl−ch
loroformate /dioxaneとのアミノ化 チロキシン−バクテリオ
クロロフイルb バクテリオクロロフイルb NaOH ―――――――――――― 加熱SOCl2/加熱 Bacteriochlorophillide b +トリヨードチロキシン carbodiimideまたはisob
utylchloroformate /dioxaneとのアミド連鎖チロキシン−バクテリオ
クロロフイルb バクテリオクロロフイルb NaOH ―――――――――――― 加熱SOCl2/加熱 Bacteriochlorophyilide b +チロキシン gluteraldehydeとのアミド連刺激ホ
ルモン鎖 チロキシン刺激ホルモン−バクテリオクロロフイル
b バクテリオクロロフイルb NaOH ――――― 加熱 Bacteriochlorophillide b +ジゴキシン Succinicanhybride/ピリジン/car
bodiimide ジゴキシン−バクテリオクロロフイルb その他のクロロフイルまたはポルフイリンとそ
の他の検定試薬とを結合させる別のやり方を決め
るのは、技術上の問題である。 以下に挙げる例は、この発明の場合のみを説明
するものであるが、この発明の範囲を限定するも
のではない。温度はすべて摂氏で表わされ、すべ
ての部分は、特に述べられていない限り、重量に
よつて表わされている。 例 ロドシユードモナス属viridis.G.Drews strain
(ATCC19567)はMaryland,Rockvilleの
American Type Culture Collectionから得たも
のである。次に挙げる媒質を含んだフラスコが用
意された: コハク酸ナトリウム2.5g,K2PO4,MgSO4・
7H2O 0.2g,(NH4)2SO4 1.25g,CaCl2 0.07
g,クエン酸鉄0.003g,EDTA 0.002g,酵母
菌抽出物0.5g,消イオン水1.0。PHは7.0に調整
された。フラスコ中の媒質にバクテリアが加えら
れ、その後フラスコはしつかりとふたをされて、
タングステンランプの下に置かれた。フラスコ中
のバクテリアは、5日間温度30℃に保たれ、その
後液体媒質に暗緑色の色が観察され、それによつ
てバクテリアの多産成長が示された。 媒質のうちの整除できる数だけ試験管に移され
20℃で15分間、1000倍の重力で遠心分離機にかけ
られた。表面に浮いたものは捨てられ、試験管に
残つたバクテリア細胞は、1.0mlのアセトンで再
び懸濁化された。アセトンをバクテリア細胞に加
えることによつて、細胞膜が崩壊され、バクテリ
オクロロフイルが溶液中に抽出された。抽出され
た溶液はひとつに集められて、ジヨージア州
FairburnのGlasrockプロダクツ社による20マイ
クロメートル気孔のポリエチレンフイルターで濾
過された。濾過された250mlの溶液は、次に回転
式フラツシユ蒸発フラスコに入れられた。フラス
コは熱湯の中で90RPMで回転させられた。アセ
トンは蒸発しバクテリオクロロフイル及びその他
の抽出物が後に残された。 フラスコ中の残留物は石油エーテルで分解され
た。次に、溶液25mlがピペツトで測られて、シリ
カゲルGの薄い層がしかれたクロマトグラフイー
プレートに移され、9:1:0.45の比率の石油エ
ーテル−アセトン−プロパノールで展開された。
クロマトグラフイープレートの抽出物は、高圧液
体クロマトグラフイー(HPLC)装置(ジヨージ
ア州Norcross,Micromeritics社製)に注入され
た。抽出物が逆相オクタデシルシランでパツクさ
れたコラムに押し込まれた後に、浄化されたサン
プルがHPLCから収集された。収集されたサンプ
ルは、再びHPLCに注入され、鋭い螢光ピークを
もつた小片が探集された。 薄層クロマトグラフイーとHPLCから最終的に
得られたものがBacteriochlorophyllide bであ
る。このことはUV−可視、螢光,赤外線、核磁
気共鳴分光学によつて確認されている。 この後、Bacteriochlorophyllide bは、下記
のようにチロキシンと結合される: トリエチルアミンとジオキサン溶液中の
IsobutylchloroformateがBacteriochlorophillide
bと反応し、RCOOCO2CH2CH(CH3)2という合
成物を形成するが、RCOO-が合成物中の
Bacteriochlorophyllide bの部分である。次に、
チロキシンが加えられて、合成物RCONH−R′が
つくられるが、このうちのRが
Bacteriochlorophyllide bの部分であり、R′が
チロキシンである。 Bacteriochlorophyllide bとチロキシンが結
合してチロキシン−Bacteriochlorophyllide b
がつくられた後、放射免疫検定方法を用いて、標
識のついた抗原の濃度が明らかにされる。次に検
定に際しての最適濃度を判断するために、結合さ
れたチロキシン−Bacteriochlorophyllide bの
様々な希釈物の線量応答曲線が作成される。 患者から血液サンプルを取り、遠心分離機にか
けて血球と血清を分離させる。次に血清の方を検
定のために取り出す。 前もつてチロキシン抗体を塗布した複数の試験
管を用意する。このように塗布された試験管は、
市販されたものがあり、また試験管の代わりにウ
エルやマイクロタイタープレートを用いることも
できる。 抗体は薄膜にされて試験管の底の内側のガラス
壁に塗布されるが、場合によつては、ポリスチレ
ンやポリプロピレンでつくられた試験管に、抗体
が塗布されたり共有結合されたりすることもあ
る。次に2〜15ミリリツトルの患者の血清が、別
の試験管に入れられた量のわかつている(キヤリ
ブレーター)チロキシンと血清制御剤と共に、塗
布済みの試験管に加えられる。たとえば、溶液1
デシリツトルあたり0.2,4,8,10,12,及び
14マイクログラムの溶液を含んだ溶液がつくら
れ、塗布された試験管に加えられる。各基準溶液
に、たとえば1〜3mlと量のわかつている、上記
のごとくつくられたチロキシン−
Bacteriochlorophyllide bの溶液が加えられる。
螢光物質はジエチルバルビツル酸ナトリウム緩衝
液、炭酸ナトリウム−重炭酸緩衝液、tris緩衝液
(trisaminoethyltetramethane),リン酸塩で緩衝
した塩水または酢酸ナトリウム緩衝液などの中に
ある。螢光物質に加えられる緩衝液の量は、螢光
物質の濃度がそれが加えられる基準液の濃度とほ
ぼ同じになる量である。緩衝液中の量のわかつて
いる螢光物質も、患者の血清の入つた試験管に加
えられる。そこで基準溶液と患者の血清の入つた
試験管が渦巻機で混ぜられ、15分から3時間、望
むらくは1時間の間、25゜と37゜の間の温度で培養
される。次に試験管の中の液体は、吸い出される
か、別の容器に移されるかして、試験管は消イオ
ン水または緩衝溶液で洗浄される。アセトン、メ
タノールまたはアセトントリルの溶液が試験管に
加えられて、試験管の壁面から螢光物質が抽出さ
れる。基準溶液及び患者の血清サンプルの各液
は、マーク付きとマークなしの抗原と抗体の合成
物を含んでいるが、それが、螢光物質を励起させ
るのに十分な波長の輻射にさらされ、放出された
放射が測定される。そこで患者のサンプル中のチ
ロキシンの濃度が判断されるのである。 上記説明の検定を行なうために用いられるこの
発明による器械は、各部を番号で参照するように
して図面に示されている。図1はこの発明による
器械の第1の好適実施例を絵で表わした図であ
る。この発明による多重送信と計算の装置は、ハ
ウジング10に納められている従来の独立型マイ
クロコンピユーターユニツトである。一対の小型
フロツピーデイスクドライブ11aと11bは、
患者の記録を記憶し、またこの発明による機能を
働かせていない場合に、装置が行なえる他のプロ
グラムを記憶するために含まれている。このマイ
クロコンピユーターにはまた、従来のキーボード
15も含まれている。この発明による器械の第1
の好適実施例では、DRTデイスプレイ12、デ
イスクドライブ11及びキーボード15を含むデ
スクトツプメインフレームを用いており、これは
EXORSET30という名称で製造されていたもの
であるが、現在はアリゾナ州フエニツクスの
Motorola半導体プロダクツ社によつて製造され
ている。第1の好適実施例では、Motorola−タ
イプのM68MM19ワンボードマイクロコンピユー
ターが、図1に示されるメインフレームの上に差
し込まれて用いられている。M68MM19は、16ビ
ツトシステムアドレスバス、8ビツトシステムデ
ータバス、及び15ビツトシステム制御バスと接続
したMC6809中央処理装置を用いたワンボードマ
イクロコンピユーターであるという点で、技術的
にも評価されるものである。 このワンボードマイクロコンピユーターはまた
8及び4ビツトの並行バツフアド入/出力ポート
と、アメリカ電子協会によつて実施されている
RS232CまたはRS422スタンダードのどちらにあ
わせることもできる連続入/出力ポートを備えて
いる。さらにまたこのマイクロコンピユーター
は、リードオンリーメモリーの16Kまで用の直接
差し込みソケツトも備えている。 第1好適実施例で用いられているマイクロコン
ピユーターのリードオンリーメモリーは、ここに
説明されている線量応答曲線及び患者の抗原レベ
ルの双方を計算するようにプログラムされている
ということも、理解すべき点である。これらのパ
ラメーターの計算は、こうした特殊技術をもつて
すれば可能であり、この計算のルーチンはそれ自
体では目新しいものであるとはみなされない。 図1に示されたマイクロコンピユーター10に
接続されるのは光電変換器の8×12アレイ16
で、この上に8×12のマイクロ滴定多層井戸プレ
ート17が置かれている。 光検出器のアレイ16の各光検出器は、次のパ
ラメーターの範囲内の周波応答を有していること
で特徴づけられるものである。光検出器は680ナ
ノメートルの波長をもつ光に確実な応答を示さな
ければならない。OdB基準として680ナノメート
ル応答を用いた場合、光電変換器の電気出力は、
560ナノメートルにおける光にたいする応答の際
に、少なくとも10dB下でなければならない。こ
の要求条件は、両方の波長における光電変換器に
当たる等しい光束を求めるものである。この要求
条件がだされる理由は、上記説明の螢光標識の特
質、及びこの発明による器械の使用が意図される
環境状況は、マイクロ滴定プレート17の井戸
が、500〜520ナノメートルの範囲内の波長で自家
螢光を発する血清物質を収容できるようなもので
あるという事実にある。好適実施例において、ア
レイ16の各光電変換器は、カリフオルニア州
Palo Alto,Hewlett−Packard Inc.,オプトエ
レクトロニクス部によつて現在製造されているタ
イプHEDS−1000である。この特別なオプト検出
器の電圧出力の周波応答曲線は、一定した光束状
態にもとづいて図5に示されている。 故に、タイプHESD−1000は、この発明による
器械に用いる光検出器にたいし、上に述べられた
基準に適したものであることが評価されるもので
ある。 同じく図1に示されるのは、第1好適実施例に
よる器械の残りの部分である。もうひとつの8×
12の構成要素のアレイは19として示されてい
る。アレイ19の各構成要素は、96フアイバーオ
プテイツクグループのリンク20のうちのひとつ
の従来の端末であり、これは紫外線21の光源か
ら光を運ぶものである。紫外線21は従来の螢光
紫外線であり、励起輻射源を成すものである。 フアイバーオプテイクス20は複数の光伝導フ
アイバーから成り、この各フアイバーはその一方
の端で紫外線源21からの励起輻射を受け入れ、
それを端末アレイ19の端末に伝えるよう配置さ
れている。端末アレイ19の各構成要素は、フア
イバーオプテイツクケーブブル20のフアイバー
のうちのひとつの磨かれた一方の端であることに
注目すべきである。さらに図1から、ケーブル2
0の各フアイバーは、それぞれがアレイの端末の
ひとつと接合し、フアイバーの残りの分との前も
つて間隔を定めた関係を決定するような形で、終
端アレイ19に接合されていることにも注目すべ
きである。 使用にあたつては、端子群19がマイクロ滴定
プレート17上にセツトされて、16,17,1
9の各アレイの1構成要素が、それらのおよその
幾何学上の中心が同一線にくるような形で並んで
いることが評価される。 従つて、この配置構造が接続され、マイクロ滴
定プレート17の各井戸に上記説明のごとくに用
意されたサンプルが入れられた場合、ケーブル1
8の各導線が、それぞれ接続された光電変換器ア
レイ16の構成要素に当たるおよそ680ナノメー
トルの光束に比例した電圧を運んでゆくことも評
価される点である。 第1の好適実施例のブロツク線図は、図2に示
されている。紫外線源21は、フアイバーオプテ
イツクケーブル20を通じて、前述の説明どおり
複数の端末22に接続されているとして示されて
おり、またフアイバーオプテイツクケーブルのう
ち、3つのフアイバーのみが示されている。マイ
クロ滴定井戸アレイ17は、光電変換器アレイ1
6の上にセツトされ、その出力はケーブル18で
多重送信装置とアナログからデイジタルへの変換
器のブロツク25に連結されている。多重送信と
アナログからデイジタルへのブロツク25は2方
向通信のためにリンク26によつて、上記説明の
M68MM19コンピユーターボードに接続されてい
る。 キーボード15がワンボート−コンピユーター
28に入力を与え、これが図2で11として示さ
れている前述のデイスク記憶装置と、双方向的に
通信する。 同じく図2に示されているのは、検定の結果の
ハードコピーをつくるのに用いられるプリンター
29である。 図3に示されるのは、この発明の第2の好適実
施例であり、1度に1つづつこの発明に関連のテ
ストを行なうための、より安価でシンプルな構造
のものとして解釈されるものである。この第2の
好適実施例の器械を使用するにあたり、別に線量
応答曲線を計算することが必要なのは明らかであ
る。 図3からわかるように、第2の好適実施例は、
マイクロ滴定井戸(またはcurvette)30を照ら
す紫外線源21′から成つており、この井戸の下
に光電変換器31が置かれている。紫外線源2
1、マイクロ滴定井戸30、及び光電変換器31
は、すべて図3に示されているごとく縦方向の軸
37上に並んでいることがわかる。光電変換器3
1の出力は、レベル調整増幅器32に供給され、
この増幅器の出力は集積回路デイジタルマルチメ
ーター35に供給される。 好適実施例では、デイジタル式マルチメーター
回路35は、現在カリフオルニア州のNational
Semiconductor Corporation of Santa Claraに
よつて製造されているADD3501デイジタル式マ
ルチメーターチツプが用いられている。 DMMチツプ35の出力は3 1/2デイジツト
の7セグメントデイスプレイ36に接続され、マ
イクロ滴定井戸30に入つている物質によつて放
射される。前もつて定められた波長(680ナノメ
ートルが望ましい)での光束の量が、数字で表示
されるようになつている。もちろん明らかに、レ
ベル調整増幅光沢のある端末コネクターのひとつ
に接続されているとして示されており、これは図
1に示されているそうした端末のアレイ19のひ
とつであることが理解される。 39のボツクスに入つているのは、光電変換ア
レイ16の光電変換器のひとつである。その電気
出力はライン18′に現われており、これは図1
と2に示されているケーブル18の導線の一本で
あることがわかる。 ライン18′からの出力は、16チヤンネル多重
送信装置41cへのひとつの入力として接続さ
れ、残りの15入力は40cとされ、ケーブル18の
導線に接続されるものとして理解されることにな
る。同様に、多重送信装置41aと41bによつ
て、16のさらなるチヤンネルが供給されてい
る。これらの多重送信装置への入力はそれぞれ4
0aと40bであり、またケーブル18に接続さ
れている。図4に示されている多重送信ブロツク
25は、32チヤンネルの容量を備えているので、
25として示されている配置は、光電変換器アレ
イ16の全部で96の構成要素の出力を、1器32
は、3 1/2デイジツト7セグメント出力36に
適合するように測られた出力を供給できるように
調整されるべきである。 図4に示されるのは、多重送信とアナログから
デイジタルへの変換のブロツク25とマイクロ滴
定井戸プレート17からの代表的井戸の好適具体
例である。図4に示されるごとく、紫外線ランプ
21は96要素を備えたフアイバーオプテイツクケ
ーブル20によつて、端末ブロツクアレイ19に
接続されている。代表的フアイバーオプテイツク
要素46は、度にひとつづつ多重送信してゆく能
力をもたせるための好適実施例に用いられている
3つの同一のボードの典型的なひとつであること
が、すぐに理解される。 多重送信ボード25は、プログラム可能な利得
増幅器から成り、これは多重送信装置41a…4
1cからの出力を増幅するものである。増幅器4
2の出力はサンプルとホールドゲート47に与え
られるが、その出力は12ビツトのアナログからデ
イジタルへの変換器49へのアナログ入力とし
て、ライン48上に現われている。タイミングと
変換は、変換制御ブロツク50によつて制御され
ている。 アナログ/デイジタル変換器49の出力は、8
つのtristateバツフア52へのライン51に供給
されるが、これらのバツフアは、前述の単一ボー
ドコンピユーフーに接続された8ビツトのデータ
バスで、ボード25を接合させているものであ
る。8ビツトバス56は、データワードが正しく
アドレスされている場合に、これを、モード制御
ブロツク57と利得及び多重送信の制御装置58
に運ぶものである。モード制御ブロツク57は、
信号の特定のシーケンスを制御するものである
が、この信号は変換コントローラー50を操作し
てアナログからデイジタルへの変換を行なわしめ
るために、システムのアドレスバスとデータバス
に現われなければならないものである。 アドレスバツフアとボードセレクトデユーダス
イツチは、図4中の59である。接続部は示され
ていないが、このブロツクからの出力がボード2
5の特定のデータエレメントを制御し、また単一
ボードコンピユーターからの特定の入力/出力サ
クルの間に、このボードエレメントにデータが記
入され、ここから読み取られるということが理解
されるべきである。 図4に示されているボード25の好適形態は、
アリゾナ州フエニツクス、Motorola
Semiconductor Products,Inc.で現在製造され
ているモデルNo.M68MM15Aとして入手できる。 光沢端末22、マイクロ滴定井戸38、光電変
換器39の代表的配置を検討するに際し、フアイ
バーオプテイツクエレメント46の端末22にお
いて、フアイバーオプテイツク46は縦軸45に
よつて特徴づけられるということに注意すべきで
ある。図面に示されているごとく、光電変換器3
9は縦軸45の上にあり、マイクロ滴定井戸22
は端末22と光電変換器の間にはさまれて、縦軸
49がマイクロ滴定井戸の中心を通るようになつ
ている。
図1は、この発明の第1の好適実施例の描写図
である。図2は、この発明の第1の好適実施例の
ブロツク線図である。図3は、この発明の第2の
よりシンプルな実施例のブロツク線図である。図
4は、この発明の第1の好適実施例の多重送信配
置のブロツク線図である。図5は、好適実施例を
つくるにあたつて用いられた光検出器の周波数応
答曲線である。
である。図2は、この発明の第1の好適実施例の
ブロツク線図である。図3は、この発明の第2の
よりシンプルな実施例のブロツク線図である。図
4は、この発明の第1の好適実施例の多重送信配
置のブロツク線図である。図5は、好適実施例を
つくるにあたつて用いられた光検出器の周波数応
答曲線である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 少なくとも150ナノメートルのストークスシ
フトを有するクロロフイルと結合した検定試薬か
ら成ることを特徴とする螢光標識つき試薬。 2 少なくとも150ナノメートルのストークスシ
フトを有するポルフイリンと結合した検定試薬か
ら成る螢光標識つき試薬。 3 抗体、抗原、ホルモン、ビールス、ハプテ
ン、バクテリア、薬剤、モノクロナル抗体、抗−
抗体、免疫グロブリン及びたんぱく質から成るグ
ループから検定試薬が選択されたことを特徴とす
る特許請求の範囲1に記載の螢光標識つき試薬。 4 抗体、抗原、ホルモン、ビールス、ハプテ
ン、バクテリア、薬剤、モノクロナル抗体、抗−
抗体、免疫グロブリン及びたんぱく質から成るグ
ループから検定試薬が選択されたことを特徴とす
る特許請求の範囲2に記載の螢光標識つき試薬。 5 クロロフイルa、クロロフイルb、クロロフ
イルb、クロロフイルc1、クロロフイルc2、クロ
ロフイルd、プロトクロロフイル及びクロロビウ
ムクロロフイルから成るグループからクロロフイ
ルが選択されたことを特徴とする特許請求の範囲
1に記載の螢光標識つき試薬。 6 バクテリオクロロフイルap、バクテリオク
ロロフイルagg、及びバクテリオクロロフイルb
から成るグループからクロロフイルが選択された
ことを特徴とする特許請求の範囲1に記載の螢光
標識つき試薬。 7 クロリン、フロリン、オキソフロリン、コリ
ン、コルフイン、コロレス(corroles)及びエテ
イオポルヒリンス(etioporphyrins)から成るグ
ループからポリフイリンが選択されることを特徴
とする特許請求の範囲2記載の螢光標識つき試
薬。 8 特許請求の範囲2に記載の螢光標識付き試薬
で、そこにおいては、ポリフイリンが、エチオポ
ルフイリン−、オクタエチルポルフイリン、ド
イテロポルフイリン−、メソポルフイリン−
、ヘマトポルフイレン−、プロトポルフイリ
ン−、コプロポルフイリン−、コプロポルフ
イリン−、ウロポルフイリン−、ウロポルフ
イリン−、クロロクルオロポルフイリン、ペン
プトポルフイリン、ドイテロポルフイリン−、
2,4−ジ−アクリル酸、2,4−ジフオルミル
ドイテロポルフイリン−、2,4−ジアセチ
ル・デユーテロポルフイリン、ドイテロポルフ
イリン−、2,4−ジスルホン酸、フイロポル
フイリン−、ピロポルフイリン、ロード
ポルフイリン、フイロエリトリン、デソキソ
フイロエリトリン、フエオポルフイリン−a5、
ウロポルフイリン−、フエオポルフイリン−
a5、フエオフアイチン−a、フエオフオルビデ
−b、メソフエオフオルビデー−a、クロリン−
e6、メソクロリン−e6とローデイン−g7、2,
4−ジアセチル・デユーテロジオキシーム、2−
フオルミル−4−ビニール−デユーテロオキシー
ム、2,4−ジホルミルデユーテロジオキシー
ム、4−プロピオニルデユテロ、4−ホルミルデ
ユテロ、2−ホルミル−4−ビニールデユテロ、
2,4−ジアセチルデユテロ、2,4−ジプロピ
オニルデユテロ、4−ニトロデユテロ、2−ビニ
ール−4−シアノデユテロ、2,4−メトキシカ
ルボニルデユテロ、2,4−ジブロモデユテロ、
そして、2,4−ジホルミルデユテロからなる群
から選択されていることを特徴とする螢光標識つ
き試薬。 9 特許請求の範囲1に記載の螢光標識つき試薬
で、そこでは、検定試薬が抗原(アンチゲン)で
あることを特徴とする螢光標識つき試薬。 10 特許請求の範囲2に記載の螢光標識つき試
薬で、そこでは、検定試薬が抗原(アンチゲン)
であることを特徴とする螢光標識つき試薬。 11 特許請求の範囲1に記載の螢光標識つき試
薬で、そこでは、検定試薬が、チロキシン、トリ
ヨードチロニン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシ
ン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン、解放ホ
ルモン、ゲンタマイシン、ドブラマイシン、フエ
ニトイン、テオフイリン、テトラサイクリン、ヘ
パタイタスB核アンチゲン、ヘパタイタスAアン
チゲン、癌初期アンチゲン、前立腺酸ホスフアー
タゼと人の絨毛膜ゴナドトロピンから成る群から
選択されていることを特徴とする螢光標識つき試
薬。 12 特許請求の範囲2に記載の螢光標識つき試
薬で、そこでは、検定試薬が、チロキシン、トリ
ヨードチロニン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシ
ン結合グロブリン、甲状腺刺激ホルモン解放ホル
モン、ゲンタマイシン、ドブラマイシン、フエニ
トイン、テオフイリン、テトラサイクリン、ヘパ
タイタスB核アンチゲン、ヘパタイタスAアンチ
ゲン、癌初期アンチゲン、前立腺酸ホスフアータ
ゼと人の絨毛膜ゴナドトロピンから成る群から選
択されていることを特徴とする螢光標識つき試
薬。 13 検定試薬を少なくとも150ナノメートルの
ストークスシフトをもつクロロフイルと結合させ
る方法を含む螢光標識つき試薬の調整方法。 14 検定試薬を、少なくとも150ナノメートル
のストークスシフトをもつポルフイリンと結合さ
せる方法を含む螢光標識つき試薬の調整方法。 15 特許請求の範囲13記載の方法で、そこに
おいて、検定試薬が、抗体、抗原、ホルモン、ウ
イルス粒、ハプテン、細菌成分、薬剤、モノクロ
ナル(monoclonal)抗体、抗抗体、免疫グロブ
リン、そして蛋白質より成る群から選定されるこ
とを特徴とする調整方法。 16 特許請求の範囲14記載の方法で、そこに
おいて、検定試薬が、抗体、抗原、ホルモン、ウ
イルス粒、ハプテン、細菌成分、薬剤、モノクロ
ナル(monoclonal)抗体、抗抗体、免疫グロブ
リン、そして蛋白質より成る群から選定されるこ
とを特徴とする調整方法。 17 特許請求の範囲13の方法で、そこにおい
ては、クロロフイルが、クロロフイルa、クロロ
フイルb、クロロフイルc1、クロロフイルc2、ク
ロロフイルd、原葉緑素、そしてクロロビウム・
クロロフイルから成る群から選択されることを特
徴とする調整方法。 18 特許請求の範囲13の方法で、そこにおい
ては、クロロフイルが、細菌クロロフイルap、
細菌クロロフイルaggそしてクロロフイルbから
成る群から選択されていることを特徴とする調整
方法。 19 特許請求の範囲14の方法で、そこにおい
ては、ポルフイリンが、クロリン、フロリン、オ
キソフロリン、コリン、コルフイン、コロール、
そしてエチオポルフイリンから成る群から選択さ
れることを特徴とする調整方法。 20 特許請求の範囲14の方法で、そこにおい
ては、ポルフイリンが、エチオポルフイリン−
、オクタエチオポルフイリン、ドイテロポルフ
イリン−、メソポルフイリン、ヘマトポルフ
イリン−、プロトポルフイリン、コプロポル
フイリン−、コプロポルフイリン、ウロポル
フイリン−、ウロポルフイリン、クロロクル
オロポルフイリン、ペンプトポルフイリン、ドイ
テロポルフイリン、2,4・ジ−アクリル酸、
2,4・ジフオルミルドイテロポルフイリン・
、2,4・ジアセチル・デユーテロポルフイリ
ン、ドイテロポルフイリン、2,4・ジスル
フオン酸、フイロポルフイリン−、ピロポル
フイリン−、ロードポルフイリン−、フ
イロエリトリン、デソキソフイロエリトリン、フ
エオポルフイリン−a5、ウロポルフイリン−、
フエポルフイリン−a5、フイロエリトリン、フ
イオフアイチンa、フエオホルビドーa、フエオ
フオルビドーb、メソフエオフオルビドー−a、
クロリン−e6、メソクロリン−e6とロジン−g7、
2,4−ジアセチル・デユーテロジオキシム、2
−ホルミル−4−ビニール・デユテロオキシム、
2,4−ジホルミルデユテルジオキシム、4−プ
ロピオニルデユーテロ、4−ホルミルデユーテ
ロ、2−ホルミル−4−ビニールデユーテロ、
2,4−ジアセチル・デユーテロ、2,4−ジプ
ロピオニルデユーテロ、4−ニテロデユテロ、2
−ビニール−4−シアノデユーテロ、2,4−ジ
−メトキシカルボニルデユーテロ、2,4−ジブ
ロモデユーテロ、そして、2,4−ジホルミルデ
ユーテロから成る群から選択されることを特徴と
する螢光標識つき試薬。 21 特許請求の範囲13の方法で、そこでは、
検定試薬が抗原であることを特徴とする調整方
法。 22 特許請求の範囲14の方法で、そこでは、
検定試薬が抗原であることを特徴とする調整方
法。 23 特許請求の範囲13の方法で、そこにおい
ては、検定試薬が、チロキシン、トリヨードチロ
ニン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン結合グロ
ブリン、甲状腺ホルモン解放ホルモン、ジゴシ
ン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、フエニト
イン、テオフイリン、テトラサイクリン、肝炎B
表面抗原、肝炎B核抗原、肝炎A抗原、癌初期抗
原、前立腺酸ホスフアターゼ、そして人のゴナド
トロピンから成る群から選択されることを特徴す
る調整方法。 24 特許請求の範囲14の方法で、そこにおい
ては、検定試薬が、チロキシン、トリヨードチロ
ニン、甲状腺刺激ホルモン、チロキシン結合グロ
ブリン、甲状腺ホルモン解放ホルモン、ジゴシ
ン、ゲンタマイシン、トブラマイシン、フエニト
イン、テオフイリン、テトラサイクリン、肝炎B
表面抗原、肝炎B核抗原、肝炎A抗原、癌初期抗
原、前立腺酸ホスフアターゼ、そして人のゴナド
トロピンから成る群から選択されることを特徴す
る調整方法。 25 次のステツプから成る螢光光度計技術によ
る試料の分析方法: 少なくとも150ナノメーターのストークスシフ
トを持つクロロフイルの標識付の抗原・抗体複合
体に、上記クロロフイルを励起するに十分な周波
数帯をもつ励起放射線を照射すること、そして、 上記のクロロフイル標識付の抗原−抗体複合体
から放射された放射線を検知測定すること。 26 次のステツプから成る螢光光計技術による
試料の分析方法: 少なくとも150ナノメーターのストークスシフ
トを持つポルフイリンの標識付の抗原−抗体複合
体に、上記ポルフイリンを励起するに十分な周波
数帯を持つ励起放射線を照射すること、そして、 上記ポルフイリンの標識付きの抗原−抗体の一
対から放射された放射線を検知測定すること。 27 特許請求の範囲25の方法で、そこにおい
ては、クロロフイルが、クロロフイルa、クロロ
フイルb、クロロフイルc1、クロロフイルc2、ク
ロロフイルd、原葉緑素およびクロロビウムクロ
ロフイルから成る群から選択されることを特徴と
する方法。 28 特許請求の範囲25の方法で、そこにおい
ては、上記クロロフイルが、細菌クロロフイル
ap、細菌クロロフイルaggおよび細菌クロロフイ
ルbから成る群から選択されることを特徴とする
方法。 29 特許請求の範囲26の方法で、そこにおい
ては、ポルフイリンが、クロリン、フロリン、オ
キソフロリン、コリン、コルフイン、コロール、
そして、エチオポルフイリンより成る群から選択
されることを特徴とする方法。 30 特許請求の範囲26の方法で、そこにおい
ては、上記ポルフイリンが、エチオポルフイリン
−、オクタエチルポルフイリン、ドイテロポル
フイリン−、メソポルフイリン−、ヘマトポ
ルフイリン−、プロトポルフイリン−、コプ
ロポルフイリン、コプロポルフイリン、ウロ
ポルフイリン−、ウロポルフイリン、クロロ
クルオロポルフイリン、ペンプトポルフイリン、
ドイテロポルフイリン−、2,4−ジ・アクリ
ル酸、2,4−ジホルミルデユーテロポルフイリ
ン−、2,4−ジアセチルデユーテロポルフイ
リン−、ドイテロポルフイリン−、2,4−
ジスルホン酸、フイロポルフイリン、ピロポ
ルフイリン−、ロードポルフイリン−、
フイロエリトリン、デソキソフイロエリトリン、
フエオポルフイリン−a5、ウロポルフイリン−
、フエオポルフイリン−a5、フイオフアイチ
ン−a、フエオホルビド−b、メソフエオホルビ
ドー−a、クロリン−e6、メソクロリン−e6、ロ
ジン−g7、2,4−ジアセチル・デユーテロジ
オキシム、2−ホルミル−4−ビニール−デユー
テロオキシム、2,4−ジホルミルデユーテロジ
オキシム、4−プロピオニルデユテロ、4−ホル
ミルデユテロ、2−ホルミル−4−ビニールデユ
テロ、2,4−ジアセチルデユテロ、2,4−ジ
プロピオニルデユテロ、4−ニトロデユテロ、2
−ビニール−4−シアノデユテロ、2,4−ジ−
メトキシカルボニルデユテロ、2,4−ジブロモ
デユテロ、そして2,4−ジホルミルデユーテロ
から成る群から選択されていることを特徴とする
方法。
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