CN115407063A - 一种量子点荧光免疫层析法肿瘤标志物（g3bp）试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种量子点荧光免疫层析法肿瘤标志物(G3BP)试剂盒及其检测方法。本发明的定量检测G3BP荧光免疫层析方法是利用量子点的优良荧光特性，结合双色标记技术及免疫层析技术，在优化试纸条各组成部件基础上，实现的荧光定量检测。与常规胶体金免疫层析方法相比，本发明具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确的优势。本发明试剂盒对G3BP进行的定量检测，可同时检测全血、血清及血浆样品，适用于各级医院，特别有助于在基层医院及诊所的广泛推广。

Description

一种量子点荧光免疫层析法肿瘤标志物(G3BP)试剂盒及其检 测方法

技术领域

本发明涉及医学检验领域，特别涉及一种利用肿瘤标志物(G3BP)相关的免疫反应及荧光免疫层析技术，以早期、敏感、特异的定量检测炎症。

背景技术

G3BP是1996年在法国RhonePoulencRorer实验室于由ParkerF等从生长状态的中国仓鼠肺成纤维细胞中首次克隆它是一种位于细胞质中RasGAPSH3结构域特异性结合蛋白。参与Ras下游信号通路有研究发现RASGAP的SH3结构域对于信号转导途径发挥作用是必不可少的，而且还能以RAS非依赖方式调节Rho介导的细胞骨架重建以及细胞凋亡。

G3BP是一种能够与Ras-GAP结构域特异性结合的蛋白。RasGAP是Ras活性的负调控蛋白，同时又参与Ras信号的传递，与细胞增殖，迁移和凋亡相关。研究发现只有在增殖的细胞中才能免疫共沉淀得到G3BP与RasGAP复合物。该结果提示，当Ras处于活性状态时，G3BP与RasGAP结合。同样有研究发现只有在生长的细胞中才能免疫共沉淀得到G3BP与RasGAP，并且依赖于Ras的活化状态。这进一步提示G3BP可能通过GAP参与Ras活性调节，而且参与Ras的信号传导。基于以上认识，我们认为G3BP可能是一个潜在的肿瘤治疗靶点，阻断RasGAP与G3BP的结合可能是一个新的肿瘤治疗策略。同时，已有许多证据表明，G3BP参与多种细胞信号途径和RNA代谢；在多种肿瘤组织和细胞中过量表达。因此，G3BP可作为肿瘤标志物检测的重要指标之一。

重庆大学王贵学；李天函；邱菊辉申请了《一种G3bp2多肽疫苗及应用》专利，申请号：201910486071.X，申请日：2019.06.05。具体涉及一种G3bp2多肽疫苗及其应用。本发明提供了一种皮下免疫注射的G3bp2多肽疫苗，其可以刺激小鼠体内产生大量的抗G3bp2蛋白的特异性抗体，降低血液中炎症因子水平，能够有效抑制动脉粥样硬化的发展过程，为目前动脉粥样硬化的治疗提供新的靶标和途径。该专利所申请中涉及G3BP，但申请保护内容、方法均与本专利不同。

中国农业科学院上海兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心上海分中心)孙英杰、丁铲、谭磊等人申请了《一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用》，申请号：202010230130.X，申请日：202010230130.X。本发明提供了一种G3BP1重组慢病毒载体及其应用，所述重组慢病毒载体包括插入有外源G3BP1基因的慢病毒载体；所述慢病毒载体包括pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro。本发明基于人源G3BP1基因和载体pLenti-CMV-GFP-EF1a-Puro，扩增了人源G3BP1基因DNA序列，成功构建pLenti-GFP-G3BP1重组慢病毒载体，并利用慢病毒包装系统成功构建稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系，在探究应激刺激调控SG形成机制方面具有重要意义。该专利所申请中涉及G3BP，但申请保护内容、方法均与本专利不同。

中国人民解放军军事科学院军事医学研究院张学敏、李涛、周涛等申请了《一种cGAMP生物合成方法》，申请号：201811338217.8，电请日：2018.11.12。本发明公开了一种cGAMP生物合成方法。本发明提供了一种合成cGAMP的方法，为用核苷转移酶cGAS和蛋白G3BP1催化反应缓冲液中的ATP、GTP和DNA，收集反应产物，即得到合成的cGAMP；所述反应缓冲液包括ATP、GTP和DNA。本发明的实验证明，蛋白G3BP1能促进核苷转移酶cGAS催化ATP、GTP和DNA合成cGAMP，与已报道的cGAS催化ATP、GTP和DNA合成cGAMP方法相比，能够显著提高cGAMP的合成效率。该专利所申请中涉及G3BP，但申请保护内容、方法均与本专利不同。

阿文蒂斯药物股份有限公司F·帕克尔、M·肯戈斯博格、M·杜啻斯尼、I·巴拉特申请了《抗G3BP蛋白的单克隆抗体及应用，申请号：199807417.9电请日：1999.06.17。本发明涉及抗G3BP蛋白的单克隆抗体和产生它们的细胞系。本发明还涉及所述抗体或其衍生物在制备药物和诊断试剂中的应用。其中提出权利要求1“能在不同类型的肿瘤细胞中诱导细胞凋亡的抗G3BP蛋白的单克隆抗体，其能够识别位于G3BP蛋白22-34位和42-55位氨基酸的表位。”和权利要求8“1-2之任一的抗体用于制备诊断试剂的应用。”。该专利所申请中涉及G3BP，尤其是G3B抗体的制备，但申请保护内容、方法均与本专利不同。其中限制G3BP在诊断试剂的应用，没有给出具体领域和方法，而我们申请的是应用量子点荧光免疫层析法来制备一种量子点荧光免疫层析法肿瘤标志物(G3BP)试剂盒及其检测方法。

目前，多采用化学发光法、酶联免疫吸附法及胶体金免疫层析法等测定血清中的待测物。但化学发光法对技术要求高，不易在临床实验室中进行常规开展；酶联免疫吸附法操作复杂，检测耗时长；胶体金免疫层析法虽然具有样品用量少，简便快速，便宜的优势，然而当遇到某些样品中目标分析物含量较低时，胶体金的颜色将很浅，很难用肉眼来判断结果，容易出现误判，灵敏度低。

量子点是一种纳米级别的半导体，通过对这种纳米半导体材料施加一定的电场或光压，它们便会发出特定频率的光，而发出的光的频率会随着这种半导体的尺寸的改变而变化，因而通过调节这种纳米半导体的尺寸就可以控制其发出的光的颜色，由于这种纳米半导体拥有限制电子和电子空穴(Electron hole)的特性，这一特性类似于自然界中的原子或分子，因而被称为量子点。

量子点具有如下特性：

(1)量子点的发射光谱可以通过改变量子点的尺寸大小来控制。通过改变量子点的尺寸和它的化学组成可以使其发射光谱覆盖整个可见光区。以CdTe量子为例，当它的粒径从2.5nm生长到4.0nm时，它们的发射波长可以从510nm红移到660nm。而硅量子点等其他量子点的发光可以到近红外区。

(2)量子点具有很好的光稳定性。量子点的荧光强度比最常用的有机荧光材料“罗丹明6G”高20倍，它的稳定性更是“罗丹明6G”的100倍以上。因此，量子点可以对标记的物体进行长时间的观察，这也为研究细胞中生物分子之间长期相互作用提供了有力的工具。一般来讲，共价键型的量子点(如硅量子点)比离子键型的量子点具有更好的光稳定性。

(3)量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱。使用同一激发光源就可实现对不同粒径的量子点进行同步检测，因而可用于多色标记，极大地促进了在荧光标记中的应用。而传统的有机荧光染料的激发光波长范围较窄，不同荧光染料通常需要多种波长的激发光来激发，这给实际的研究工作带来了很多不便。此外，量子点具有窄而对称的荧光发射峰，且无拖尾，多色量子点同时使用时不容易出现光谱交叠。

(4)量子点具有较大的斯托克斯位移。量子点不同于有机染料的另一光学性质就是宽大的斯托克斯位移，这样可以避免发射光谱与激发光谱的重叠，有利于荧光光谱信号的检测。

(5)生物相容性好。量子点经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，其细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标记和检测。在各种量子点中，硅量子点具有最佳的生物相容性。对于含镉或铅的量子点，有必要对其表面进行包裹处理后再开展生物应用。

(6)量子点的荧光寿命长。有机荧光染料的荧光寿命一般仅为几纳秒(这与很多生物样本的自发荧光衰减的时间相当)。而具有直接带隙的量子点的荧光寿命可持续数十纳秒(20-50ns)，具有准直接带隙的量子点如硅量子点的荧光寿命则可持续超过100μs。这样在光激发情况下，大多数的自发荧光已经衰变，而量子点的荧光仍然存在，此时即可得到无背景干扰的荧光信号。

总而言之，量子点具有激发光谱宽且连续分布，而发射光谱窄而对称，颜色可调，光化学稳定性高，荧光寿命长等优越的荧光特性，因此，应用于荧光检测具有很多优点。

在免疫层析系统中，除胶体金、胶体硒、乳胶颗粒及碳颗粒以外，量子点亦可被用作可视或可被仪器检测的指示物质。它具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等众多优点，在荧光检测领域具有取代传统有机荧光染料的潜力，已成为新一代生物荧光标记物。对胶体金免疫层析而言，定性/半定量分析是依据胶体金颗粒对光的吸收和散射进行检测的。与检测荧光强度相比，具有灵敏度低、定量不准确等缺点。

因此，基于量子点及免疫层析的诸多优势，需要研制一种利用量子点来检测肿瘤标志物(G3BP)的方法，弥补现有技术中检测肿瘤标志物(G3BP)灵敏度低、定量不准确或操作步骤繁琐、成本高的不足之处。胶状量子点具有制作成本低，产率大，发光效率高(尤其是在可见光和紫外光波段)等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题为针对现有技术中检测肿瘤标志物(G3BP)灵敏度低、定量不准确的缺点，提供了一种定量检测肿瘤标志物(G3BP)的荧光免疫层析方法及其试剂盒。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将肿瘤标志物(G3BP)的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为510～1500nm；

步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为510～1500nm，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应肿瘤标志物(G3BP)的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具量子不含荧光特性；

步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现肿瘤标志物(G3BP)的定量检测。

本发明提供的一种定量检测G3BP的荧光免疫层析的方法，是一种以量子点为荧光信号，在免疫层析试纸条上实现G3BP快速灵敏检测的方法。

本发明定量检测G3BP的荧光免疫层析方法能够解决现有荧光免疫层析技术中背景与信号难区分、灵敏度低、荧光定量方法不明确的不足和缺陷，可实现对微量样品的检测。由于量子点荧光受激发光干扰小，灵敏度大大提高，其灵敏度是用传统染料和有色标记物检测方法的几十到上千倍。

本发明采用化学交联或生物分子间特异性作用，将G3BP的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，其中所述特异性抗体为抗G3BP的单克隆抗体或多克隆抗体。

本发明中，当量子点表面存在活性基团时，巯基乙酸修饰的量子点表面带负电，与带正电的蛋白质表面区域可通过静电吸引连接起来，而不需要其他试剂。对于带中性电荷的蛋白质，可以通过改造蛋白质在其末端构建带正电荷的结构，使其能静电吸附于量子点表面。另外，通过对量子点表面修饰使其带负电荷后，除了上述的直接静电吸引靶标物质外，还可以静电吸附连接上亲和素，然后依靠生物素-亲和素的高特异性结合，间接将量子点连接到蛋白质分子上。

本发明中，当量子点表面存在非活性基团时，则采用化学交联剂，将抗体与量子点相偶联。是将抗体与量子点相偶联,其中，化学交联剂包括三乙烯基交联剂、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、异丙醇中的一种或一种以上的组合。

作为优选，在本发明的一个实施例中，采用其中优选采用三乙烯基交联剂、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)交联法对量子点进行蛋白修饰。其一般步骤为：将纯化后的量子点溶液与三乙烯基交联剂和N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)混合，然后加入定量的蛋白质，以缓冲液作为反应介质，培育4小时，加入酪氨酸封闭，并以色谱、层析柱或超滤离心等方式纯化，从而得到蛋白修饰的量子点荧光纳米颗粒。

生物分子间特异性作用包括生物素-亲和素系统和抗原-抗体系统。作为优选，在本发明的另一个实施例中，采用生物素-亲和素系统的结合方式对标记物进行量子点修饰，该结合方式具有放大信号的作用。具体为：将生物素连接到蛋白质分子表面，通过亲和素-生物素间的相互作用，将蛋白质分子偶联到链霉亲和素修饰量子点的表面。

为了提高信号与背景的区分度，本发明选用发射光波长为500～1500nm的量子点。因在紫外照射下，层析膜、底板和卡壳的荧光强度在550nm以下远强于550nm以上，从而对低浓度G3BP检测时产生一定的影响，故优选发射波长大于550nm的量子点。此外，层析膜、底板和卡壳在近红外区域(750～1500nm)荧光强度极弱，结合量子点合成技术，优选近红外波长的量子点(750～1500nm)进一步提高灵敏度。

本发明所用量子点包含单一化合物形成的量子点或是几种化合物组装成的复合物量子点，且量子点具有较强的光稳定性。形成量子点的化合物是从硒化铕、碲化铕、硫化铕氯化铕、硒化锌(ZnSe)、磷化铟(InP)或砷化铟(InAs)组中选择一种或一种以上的组合。

其中，质控分子修饰的量子点与G3BP抗体修饰的量子点可选用相同发射波长的量子点。但在本发明中，为了减弱质控分子修饰的量子点对定量带及背景信号的影响，采用双色标记技术，即选用两种发射波长不同的量子点分别标记质控分子和抗体。

作为优选，在本发明的一个实施例中，标记垫中与G3BP结合的抗体修饰的量子点的发射波长为600nm，质控分子修饰的量子点的发射波长为550nm。

作为优选，在本发明的另一个实施例中，标记垫中与G3BP结合的抗体修饰的量子点的发射波长为800nm，质控分子修饰的量子点的发射波长为600nm。

作为优选，在本发明的实施例中，使用有机相方法合成550nm、600nm和800nm的硒化铕/硫化铕，并把量子点由脂溶性转为水溶性，此过程中量子点荧光无明显变化；使用水相方法合成800nm的InAs。

为了降低对量子点荧光信号的影响，本发明采用弱或无荧光的层析膜、低或无荧光的底板以及低或无荧光的卡壳，从而保证获得高荧光信背比，能良好区分信号与背景，进而提高检测灵敏度。

作为优选，在本发明的实施例中，底板为黑色，表面附有不干胶，且卡壳、层析膜、底板及不干胶均不含有荧光剂。

作为优选，所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的底板基垫(7)，位于卡壳底部，具体位置在视窗(11)方向端超过卡壳正中间位置，使试剂条自上样孔(10)端到视窗(11)方向端与水平桌面形成锐角坡度放置。以便于加样后加快层析速度，并减少上样孔(10)样本残留。

作为优选，所述的底板基垫(7)尺寸、形状、颜色可以任意选择，优选宽度等于底板(6)宽度、长度1～10mm、高度1～10mm，优选形状为长方体、三角棱形，优选颜色为白色、黑色。

本发明实施例中荧光免疫层析试纸条由样品垫、标记垫、过滤膜、层析膜、吸水垫和底板组成，如图1所示。在标记垫上固定有G3BP特异性抗体修饰的量子点，以及质控分子修饰的量子点。在试纸条层析膜上分别设有定量带和两条质控带，其中定量带固定有对应G3BP的与上述标记垫中特异性抗体不同抗原表位的特异性抗体，质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子。

本发明定量带是判定样品中G3BP含量的主要指标，并且受质控带荧光信号强度校正，以提高定量准确度。此外，通过增加定量带的条数，可扩大试纸条的检测范围，避免出现HOOK效应。

在本发明的一个实施例中，发明人所选用的样品为血清，且样品进一步包含全血和血浆。当样品为全血时，荧光免疫层析试纸条还包括在样品垫与层析膜之间设置的过滤膜，用于凝固、过滤细胞，该过滤膜可分别与标记垫和层析膜直接毛细作用接触，也可与样品垫和标记垫直接毛细作用接触。

其中，过滤膜还可以与样品垫合并为同一结构，同时拥有样品收集、释放及过滤的作用。

本发明实施例采用预润免疫层析方法对待测样品中的G3BP进行定量检测。其中预润免疫层析为：滴加一定体积的缓冲液到层析膜上，润湿一定时间后，将样品加入样品垫中，然后样品沿层析膜向吸水垫方向层析运动。预润的目的是预润湿层析膜，封闭非特异性结合位点，以使量子点标记物均匀通过层析膜，减少在层析膜上的非特异性吸附，并减缓样品的层析速度，从而提高特异性结合效率。其中滴加缓冲液体积一般为20～100μl，润湿时间为30秒～2分钟，而样品层析时间通常为5～20分钟。

本发明的缓冲液为pH6.8～9.8的缓冲液，且该缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白及表面活性剂。其中，表面活性剂可包括吐温20、吐温40、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷、鲸蜡硬脂基葡糖苷、聚乙二醇中的一种或一种以上的组合。

作为优选，在本发明的实施例中使用包含牛血清白蛋白和吐温20的pH8.6的磷酸缓冲液。

本发明的检测用荧光定量仪包含激发光源模块、滤光模块、光电转换模块、控制分析模块以及软件系统。其中激发光源模块包含光源及聚光装置，该光源为发光二极管或激光二极管，且波长位于300～400nm之间或500～600nm之间。滤光模块包含滤光片轮，该滤光片轮包含不同种滤光片，以获取相应量子点的荧光信号。光电转换模块包括图像传感器或者光电倍增管。

层析结束后，在光源激发下，试纸条产生的荧光信号经滤光模块滤除杂散光及背景荧光，到达光电转换模块，获得数字信号。其中所获质控带与定量带的荧光信号强度具有一定的相关性，主要影响因素包括温度、湿度、基质等。

本发明检测结果的判定方法：如果质控带荧光信号强度超出荧光定量仪内部设定的可接受值，说明检测结果无效；在检测结果有效前提下，定量带与质控带荧光信号强度的比值越高，表示样品中目标检测物的浓度越高，反之越低。

本发明采用荧光定量仪检测一系列不同浓度的标准品，绘制标准曲线。其中标准曲线为标准品系列浓度(c)与所对应的校正荧光信号强度(F)的关系曲线，关系式为F＝f(c)，校正荧光信号强度为F＝αF定量带/F质控带，其中α为校正系数，受温度、湿度和基质等影响。然后检测样品，依据标准曲线可获得样品中G3BP的浓度。

本发明提供了一种定量检测肿瘤标志物(G3BP)的荧光免疫层析试剂盒其结构见图1、图2所示，包括卡壳(12)、荧光免疫层析试纸条及缓冲液。该试剂盒采用直接预润免疫层析方法。卡壳(12)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(9)、视窗(10)，且具低荧光特性或不含荧光剂。

本发明实施例中的直接预润免疫层析试纸条，其结构见图1、图2所示，包括样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)、吸水垫(5)和底板(6)，层析膜(4)包含质控带(8)和定量带(7)，当进行全血样品检测时，试纸条还包括过滤膜(3)，具体结构如图1所示，其中样品垫(1)、标记垫(2)、过滤膜(3)、层析膜(4)和吸水垫(5)搭载于底板(6)之上，样品垫(1)位于上样孔(9)的下方，且连接于标记垫(2)，标记垫(2)连接于过滤膜(3)，过滤膜(3)连接于层析膜(4)，层析膜(4)上固定有两条质控带(8)和两条定量带(7)，且质控带(8)位于定量带(7)的两侧，层析膜(4)位于视窗(10)的下方，层析膜(4)连接于吸水垫(5)。

本发明还提供了一种定量检测肿瘤标志物(G3BP)的荧光免疫层析试剂盒，包括卡壳(12)、荧光免疫层析试纸条及缓冲液，卡壳(12)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(9)、视窗(10)，且具低荧光特性或不含荧光剂。

本发明实施例中的荧光免疫层析试纸条，其包含样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)、吸水垫(5)和底板(6)。层析膜(4)包含质控带(8)和定量带(7)。其中样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)和吸水垫(5)搭载于底板(6)之上，样品垫(1)位于上样孔(9)的下方，且连接于标记垫(2)，标记垫(2)连接于层析膜(4)，层析膜(4)上固定有两条质控带(8)和两条定量带(7)，且质控带(8)位于定量带(7)的两侧，层析膜(4)位于视窗(10)的下方，层析膜(4)连接于吸水垫(5)。

进行全血样品层析时，试纸条还包括过滤膜(3)，其中试纸条包含样品垫(1)、标记垫(2)、过滤膜(3)、层析膜(4)、吸水垫(5)和底板(6)，过滤膜(3)连接于样品垫(1)与标记垫(2)之间。

试纸条的层析膜(4)具有弱荧光特性或不含荧光剂，其荧光在大于550nm时很弱，以减少对低浓度G3BP检测的影响。

本发明的主要优点如下：

1)本发明采用量子点作为特异性抗体的荧光标记物，与有机荧光染料相比，具有发光强度高、激发光谱宽、发射光谱窄、荧光寿命长、表面修饰多功能化及稳定性好等优势。本发明优选了550～1500nm的量子点，且质控分子和特异性抗体修饰的量子点选用两种不同发射波长的量子点，以降低非特异性吸附，提高检测灵敏度。

2))本发明所述的定量检测G3BP的荧光免疫层析方法，减少非特异性吸附，增强特异性结合，进而提高检测灵敏度，有利于样品中G3BP含量极低时的准确定量。

3)本发明方法与常规胶体金免疫层析相比，具有标记稳定性好、非特异性低、灵敏度高、线性范围宽以及定量准确等优势。

4)本发明在底板(6)中增加设计了使试剂条与水平桌面形成坡度的底板基垫(7)，从而使样品层析速度加快，并减少上样孔(10)中的样品残留。

附图说明

图1：为荧光免疫层析试纸条的内部组装示意图，其中1为样品垫，2为标记垫，3为过滤膜，4为层析膜，5为吸水垫，6为底板；7为底板基垫。

图2：为荧光免疫层析试剂卡外部示意图，其中8为定量带，9为质控带，10为上样孔，11为视窗，12为卡壳。

具体实施方式

本发明公开了一种定量检测肿瘤标志物(G3BP)的荧光免疫层析试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明的技术方案为：

步骤1)用化学交联或生物分子间特异性作用将肿瘤标志物(G3BP)的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为550～1500nm；

步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为550～1500nm，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应肿瘤标志物(G3BP)的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板具低荧光特性；

步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现肿瘤标志物(G3BP)的定量检测。

本发明荧光免疫层析的原理和检测方法为：采用荧光免疫层析技术及双抗体夹心法原理定量检测样品(全血、血清或血浆)中的心肌肌钙蛋白T(G3BP)的含量。检测时，首先滴加缓冲液将层析膜润湿，然后将样品加入到上样孔中，样品流经标记垫时与量子点标记物相混合，并沿着层析膜向吸水垫方向毛细运动，分别流经层析膜上的定量带及质控带。若样品中含有G3BP，则与量子点表面的G3BP抗体相结合，当层析至定量带时，会被预先包被于该条带的抗体所捕获，从而构成双抗体夹心复合物。光源激发下，采用荧光定量仪可获取定量带和质控带的荧光信号强度，依据荧光定量仪获取的标准曲线，进而可分析出样品中含有G3BP的浓度。

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1：

以静电吸引方式将抗体修饰于量子点并采用直接预润免疫层析对G3BP的定量检测。

(一)量子点与抗体的修饰

正电荷氢核遇到另一个电负性强的原子时，产生静电吸引。通过巯基乙酸修饰的量子点表面带负电，与带正电的蛋白质表面区域可通过静电吸引连接起来，而不需要其他试剂。

将发射波长为600nm的量子点与1mg/mL的G3BP单克隆抗体混合,与80％的巯基乙酸溶液、pH9.8磷酸盐缓冲液室温下反应50min，加入1mol/L酪氨酸封闭，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到G3BP单克隆抗体修饰的量子点。同理得到兔IgG修饰的量子点。其中G3BP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为600nm，兔IgG修饰的量子点的荧光发射波长为560nm。

(二)试剂盒的构建

以1∶1的比例混合两种量子点标记物，并加入牛血清白蛋白(1.0％)、1.0％吐温20，随后均匀喷涂在标记垫上，30℃干燥后密封，6℃下保存。

组装定量检测G3BP的荧光免疫层析试纸条，由样品垫(1)、标记垫(2)、过滤垫(3)、层析膜(4)、吸水垫(5)组成，顺次粘贴于黑色底板(6)上。其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为待检样品收集区；标记垫中含有G3BP抗体修饰的量子点以及兔IgG修饰的量子点；层析膜上包含定量带(7)和质控带(8)，定量带和质控带的间隔R为：2mm≤R≤10mm，且定量带(7)固定有区别于标记垫中G3BP抗体的另一抗原表位G3BP抗体，质控带(8)包被了羊抗兔抗体，位于定量带的两侧；润湿垫与层析膜毛细搭接1～2mm；连接垫分别与润湿垫和吸水垫毛细作用接触，起缓冲连接作用。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于卡壳(12)内，加入干燥剂封装，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒。

(三)样品的检测

A)将G3BP抗原标准品用正常人血清作为稀释液分别配制为80ng/mL高浓度；

B)将步骤A)中浓度的G3BP标准品溶液逐倍稀释为：0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、20.0ng/ml；

C)在层析膜上滴加30μL的缓冲液，该缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH8.6的磷酸缓冲液，层析反应30s；

D)分别将步骤B)中配制的全血溶液(120μL)滴加于上样孔(9)中，正向层析反应10min；

E)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线；

F)同步骤C)和步骤D)操作，对待测样品进行检测，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤E)中的标准曲线分析该样品中G3BP的含量；

G)输出检测报告。

(四)结果分析

结果表明，其最低检测限为0.02ng/mL，最低定量限为0.12ng/mL，且批内与批间重复性均较好，相关系数R2＞0.998，对炎症的诊断具有参考价值。

实施例2

以共价交联方式将抗体修饰于量子点并采用直接预润免疫层析对G3BP的定量检测。

(一)量子点与抗体的修饰

将发射波长为600nm的量子点与1mg/mL的G3BP单克隆抗体混合，并在新鲜配制的三乙烯基交联剂(1mg/mL)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，1mg/mL)作用下室温反应4.5h，加入1mol/L酪氨酸封闭，并用色谱柱或层析柱分离纯化，得到G3BP单克隆抗体修饰的量子点。同理得到兔IgG修饰的量子点。其中G3BP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为600nm，兔IgG修饰的量子点的荧光发射波长为560nm。

(二)试剂盒的构建

以1∶1的比例混合两种量子点标记物，并加入牛血清白蛋白(1.0％)、1.0％吐温20，随后均匀喷涂在标记垫上，30℃干燥后密封，6℃下保存。

组装定量检测G3BP的荧光免疫层析试纸条，由样品垫(1)、标记垫(2)、过滤垫(3)、层析膜(4)、吸水垫(5)组成，顺次粘贴于黑色底板(6)上。其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为待检样品收集区；标记垫中含有G3BP抗体修饰的量子点以及兔IgG修饰的量子点；层析膜上包含定量带(7)和质控带(8)，定量带和质控带的间隔R为：2mm≤R≤10mm，且定量带(7)固定有区别于标记垫中G3BP抗体的另一抗原表位G3BP抗体，质控带(8)包被了羊抗兔抗体，位于定量带的两侧；润湿垫与层析膜毛细搭接1～2mm；连接垫分别与润湿垫和吸水垫毛细作用接触，起缓冲连接作用。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于卡壳(12)内，加入干燥剂封装，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒。

(三)样品的检测

A)将G3BP抗原标准品用正常人血清作为稀释液分别配制为80ng/mL高浓度；

B)将步骤A)中浓度的G3BP标准品溶液逐倍稀释为：0.1ng/ml、0.5ng/ml、1.0ng/ml、5.0ng/ml、20.0ng/ml；

C)在层析膜上滴加30μL的缓冲液，该缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH8.6的磷酸缓冲液，层析反应30s；

D)分别将步骤B)中配制的全血溶液(120μL)滴加于上样孔(9)中，正向层析反应10min；

E)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线；

F)同步骤C)和步骤D)操作，对待测样品进行检测，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤E)中的标准曲线分析该样品中G3BP的含量；

G)输出检测报告。

(四)结果分析

结果表明，其最低检测限为0.02ng/mL，最低定量限为0.12ng/mL，且批内与批间重复性均较好，相关系数R2＞0.998，对炎症的诊断具有参考价值。

实施例3：以生物素-亲和素系统将抗体修饰于量子点并采用间接预润免疫层析对G3BP的定量检测

(一)量子点与抗体的修饰

首先采用pH8.60的碳酸氢钠缓冲液对1mL的G3BP单克隆抗体(1mg/mL)进行充分透析，加入80μl二甲亚砜(DMSO)新鲜配制的N-羟基琥珀酰亚胺生物素酯(NHSB，1mg/mL)，室温避光反应4h。加入1mol/L NH₄Cl，室温下振荡反应10min，然后将溶液置于透析袋中，过夜透析纯化，并采用超滤离心管浓缩，配制为所需浓度，所得即为生物素化G3BP单克隆抗体。

将链霉亲和素修饰的发射波长为800nm的量子点和生物素化的G3BP单克隆抗体按照1∶2∶12的比例混合反应45min，所得即为G3BP单克隆抗体修饰的量子点。依据实施例2方式可制得兔IgG修饰的量子点。其中抗G3BP抗体修饰的量子点的荧光发射波长为800nm，兔IgG修饰的量子点的荧光发射波长为600nm。

(二)试剂盒的构建

以1∶1的比例混合两种量子点标记物，并加入牛血清白蛋白(0.10％)、蔗糖(8.0％)以及0.1％吐温20表面活性剂，随后均匀喷涂在标记垫上，30℃干燥后密封，6℃下保存。

组装定量检测G3BP的荧光免疫层析试纸条，由样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)、吸水垫(5)组成，顺次粘贴于黑色底板(6)上。其中，样品垫为孔状隔膜，选择玻璃纤维，为待检样品收集区；标记垫中含有G3BP抗体修饰的量子点以及兔IgG修饰的量子点；层析膜上包含定量带(7)和质控带(8)，定量带和质控带的间隔R为：2mm≤R≤10mm，且定量带(7)固定有区别于标记垫中G3BP抗体的另一抗原表位G3BP抗体，质控带(8)包被了羊抗兔抗体，位于定量带的两侧；润湿垫与层析膜毛细搭接1～3mm；连接垫分别与润湿垫和吸水垫毛细作用接触，起缓冲连接作用。组装好后，按照要求切割为所需宽度，并置于卡壳(12)内，加入干燥剂封装，与缓冲液共同构建为荧光免疫层析试剂盒。

(三)试剂盒的构建及样品的检测

A)将G3BP抗原标准品用正常人血清作为稀释液分别配制为100ng/mL高浓度；

B)将步骤A)中浓度的G3BP标准品溶液逐倍稀释为：0.05ng/ml、0.25ng/ml、0.5ng/ml、5.0ng/ml、50.0ng/ml；

C)在层析膜上滴加40μL的缓冲液，该缓冲液为包含牛血清白蛋白和吐温20的pH8.6的磷酸缓冲液，层析反应3min；

D)分别将步骤B)中配制的血清溶液(100μL)滴加于上样孔(9)中，层析反应10min；

E)置于荧光定量仪中获取荧光信号强度，并绘制相应的标准曲线；

F)同步骤C)和步骤D)操作，对样品进行检测，层析结束后，置于荧光定量仪内获取荧光信号强度，并依据步骤E)中的标准曲线分析该样品中G3BP的含量；

G)输出检测报告。

(四)结果分析

结果表明，其最低检测限为0.02ng/mL，最低定量限为0.05ng/mL，批内与批间重复性、稳定性良好，相关系数可达R²＞0.998，能够为炎症疾病的诊断提供参考价值。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种量子点荧光免疫层析法肿瘤标志物(G3BP)试剂盒及其检测方法，包括卡壳(12)、荧光免疫层析试纸条及缓冲液，其特征在于，所述卡壳(12)为荧光免疫层析试纸条的外部壳结构，包括上样孔(10)、视窗(11)、底板基垫(7)；所述荧光免疫层析试纸条包括样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)、吸水垫(5)、底板(6)和底板基垫(7)其中样品垫(1)、标记垫(2)、层析膜(4)和吸水垫(5)搭载于底板(6)之上，样品垫(1)位于上样孔(10)的下方，且连接于标记垫(2)，标记垫(2)连接于层析膜(4)，层析膜(4)上固定有两条质控带(9)和定量带(8)，且质控带(9)位于定量带(8)的两侧，层析膜(4)位于视窗(11)的下方，层析膜(4)连接于吸水垫(5)，底板基垫(7)位于底板(6)底部中上部(卡壳面视窗(11)方向端)；

所述标记垫上固定有抗体修饰的量子点和质控分子修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点按照以下方法制备：

步骤1)静电吸引法或用化学交联或生物分子间特异性作用将肿瘤标志物(G3BP)的特异性抗体连接到量子点表面，得到抗体修饰的量子点，所述抗体修饰的量子点的发射波长范围为500～1500nm；

步骤2)将步骤1)得到的抗体修饰的量子点固定在标记垫上，且标记垫上同时固定有质控分子修饰的量子点，所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为510～1500nm，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应肿瘤标志物(G3BP)的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体；

步骤3)以样品垫、标记垫、层析膜、吸水垫和底板构建成荧光免疫层析试纸条，其中所述层析膜为弱荧光层析膜，底板为弱或不含荧光特性；

步骤4)试纸条免疫层析后，检测定量带和质控带的荧光信号强度，并以质控带荧光信号强度校正定量带的荧光信号强度，进而实现肿瘤标志物(G3BP)的定量检测。

2.根据权利要求1所述质控分子修饰的量子点的发射波长与步骤1)得到的抗体修饰的量子点的发射波长不同，且波长范围为500～1500nm，在层析膜上分别设有定量带和质控带，其中质控带固定有能与所述质控分子特异性结合的生物分子，定量带固定有对应肿瘤标志物(G3BP)的与步骤1)所述特异性抗体不同抗原决定簇的特异性抗体。

3.根据权利要求1、2所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的量子点修饰标记方法有静电吸引法、常规交联剂连接法、生物素-亲和素法。

4.根据权利要求1、2、3所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的常规交联剂连接法，是将抗体与量子点相偶联,其中，化学交联剂包括三乙烯基交联剂、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、异丙醇中的一种或一种以上的组合，其中优选采用三乙烯基交联剂、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)交联法对量子点进行蛋白修饰。

5.根据权利要求1、2、3所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的静电吸引法、常规交联剂连接法、生物素-亲和素法，在本发明中，选用发射光波长为500～1500nm的量子点。

6.根据权利要求1～5，所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的量子点修饰标记形成量子点的化合物是从硒化铕、碲化铕、硫化铕氯化铕、硒化锌(ZnSe)、磷化铟(InP)或砷化铟(InAs)组中选择一种或一种以上的组合。

7.根据权利要求1～6所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的缓冲液为pH6.8～9.8的缓冲液，且该缓冲液可包含牛血清白蛋白、酪蛋白及表面活性剂，其中，表面活性剂可包括吐温20、吐温40、椰油基葡糖苷、月桂基葡糖苷、鲸蜡硬脂基葡糖苷、聚乙二醇中的一种或一种以上的组合，优选吐温20和pH8.6缓冲溶液。

8.根据权利要求1所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的底板基垫(7)，位于卡壳底部，具体位置在视窗(11)方向端超过卡壳正中间位置，使试剂条自上样孔(10)端到视窗(11)方向端与水平桌面形成由低到高的锐角坡度。

9.根据权利要求1、8所述的荧光免疫层析试剂盒及其检测方法，其特征在于，所述的底板基垫(7)尺寸、形状、颜色可以任意选择，优选宽度等于底板(6)宽度、长度1～10mm、高度1～10mm，优选颜色为白色、黑色。

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