CN114930171A - 具有竞争性测定对照的侧流测试条 - Google Patents

Abstract

本发明涉及包括阳性对照的侧流测试条和包括其的诊断装置，该诊断装置用于确定样本中一种或多种目标分析物的存在与否。例如，本发明涉及包括阳性对照的侧流测试条和包括其的诊断装置，阳性对照识别在被测试的生物样本中丰富的对照分析物，例如血液中的人血清白蛋白(HSA)。在一些实例中，本发明的侧流测试条可包括阳性对照和一个或多个内部对照。

Description

具有竞争性测定对照的侧流测试条

技术领域

本申请要求2019年5月27日提交的澳大利亚临时申请2019901798的优先权，其全部内容通过引用整体并入本文。

技术领域

本发明涉及包括阳性对照的侧流测试条和包括其的诊断装置，该诊断装置用于确定样本中一种或多种目标分析物的存在与否。例如，本发明涉及包括阳性对照的侧流测试条和包括其的诊断装置，阳性对照识别在被测试的生物样本中丰富的对照分析物，例如血液中的人血清白蛋白(HSA)。在一些实例中，本发明的侧流测试条可包括阳性对照和一个或多个内部对照。

背景技术

侧流测定(LFA)已经在体外诊断市场中使用了超过25年，并且被广泛认为是廉价的、易于使用的、快速的和定性的测试，其可用于即时的或基于现场的场景。

LFA利用液体样本沿多孔膜材料如硝化纤维素的迁移。当样本流过用捕获试剂固定的离散区域或线时，捕获和检测一种或多种目标分析物。可以使用各种捕获试剂，尽管抗体是普遍的选择。其中使用抗体的LFA 通常称为侧流免疫测定(LFIA)。

LFA可用于使用夹心测定形式检测大的复杂分析物或用于使用竞争性形式检测小分子或半抗原。在夹心测定中，通常用一系列吸收垫材料组装条带，吸收垫材料引导样本和测定试剂流动穿过一系列离散区域，在其间目标分析物被加标(即标记)并且随后被捕获和检测。样本最初被施加到条的吸收样本垫上，其用作样本的过滤器和储存器。通过条的缀合物释放垫从样本垫吸取流体，其中样本中的一种或多种目标分析物通过与比色、荧光、磁性或放射性报道分子相互作用而被标记。为了实现标记，报道分子与分析物特异性配体(通常是抗体)偶联，其与相应的目标分析物快速形成复合物以形成标记的复合物。将样本(包括其中含有的标记复合物)从缀合物释放垫吸至测试条的测试区，其中一个或多个互补配体在一个或多个测试线上固定于测试条上以结合标记复合物。剩余的样本继续从测试区穿过条到达高吸收性接收垫。任何标记复合物在一个或多个测试区域的存在提供了样本中一种或多种目标分析物存在的可测量指示。取决于标记的选择，测试可以通过肉眼来解释，例如，由此一个或多个“可见”测试线的存在提供一种或多种目标分析物的存在的定性指示，或使用例如检测荧光的扫描仪。

LFA测试条通常还包括内部对照，以在样本中未检测到分析物的情况下确认测试的成功进行。在传统的侧流测定中，在测试线下游流动的未结合标记被固定在对照线的抗物种(例如抗小鼠)抗体捕获。对照线的出现提供了证据，证明在阴性测试结果的情况下，测试已正确运行，作为用户的阳性加固，否则不会出现条带。它还提供了在运输和储存期间测试行程上的生物组分保持活性的一些指示。在某些情况下，例如当测试预定用于家庭使用时，基于LFA的诊断测试可受益于更多信息的对照以改进测试结果的验证。因此，需要具有改进的对照的LFA测试条。

因为在本申请的每个权利要求的优先权日之前存在这些物质中的任一个或全部形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识，所以包括在本说明书中的对文献、行为、材料、装置、制品等的任何讨论不应认为这些物质中的任一个或全部形成现有技术基础的一部分或者是与本发明相关的领域中的公知常识。

发明内容

在传统的侧流中，在测试线下游流动的未结合标记在对照线的抗物种(例如抗小鼠)抗体捕获。对照线处可检测信号的出现提供了证据，证明在阴性测试结果的情况下，侧流测试已正确运行，作为用户的阳性加固，否则不会出现条带。对照还提供了在运输和储存期间侧流测试条上的生物组分保持活性的一些指示。在某些情况下，例如当测试预定用于家庭使用时，该测试可以受益于更阳性的对照。例如，代替简单地捕获未结合的标记，阳性对照可特异性识别生物样本中存在的生物标记。

本发明人已经开发了具有基于竞争测定的阳性对照设计的侧流测试条，其允许用户更可靠地确定侧流测定是否正确地工作。在这点上，本发明部分地基于以下认识：商业上可获得的侧流测试包括内部或阳性对照，当测试分析物以中等至高浓度存在时，内部或阳性对照对“钩状效应”或“前带效应”敏感。传统的内部对照依赖于在测试线下游流动的未结合标记，以在对照线被抗物种(例如抗小鼠)抗体捕获。类似地，传统的内部对照依赖于在测试线下游流动的对照分析物，以在对照线被合适的抗体捕获。在每种情况下，对照线处可检测信号的出现提供了证据，证明在阴性测试结果的情况下，侧流测试已正确运行，作为用户的阳性加固，否则不会出现条带。然而，当测试分析物以中等至高浓度存在时(由于“钩出”)，这种对照可能不能提供侧流测试性能的准确证据，从而导致用户认为侧流测试在实际上没有侧流测试时失败。

本发明提供了包括对“钩状效应”不敏感的对照的侧流测试条和装置。这通过包括“阳性对照”来实现，“阳性对照”依赖于竞争测定来检测样本(或包含其的流动缓冲液)中对照分析物的存在或不存在。包括阳性对照并依赖于竞争测定的对照设计增加了对照的动态范围，从而允许更精确地确认测试结果，特别是当测试分析物以大量存在时。

此外，本发明人已经开发了一种侧流测试条，其除了包括如上所述的“阳性对照”之外，还包括“内部对照”。包含内部对照允许使用者确认待测试的液体样本(例如，其可以是单独的测试样本或流动缓冲液和测试样本的混合物)在侧流过程中已经穿过测试条，并且测试条的所有组分按预期运行。总体上，这种双重对照设计使得使用者能够确定(i)在使用过程中是否存在足够的对照分析物(并且因此存在足够的测试样本)(借助于阳性对照)，(ii)在侧流过程中测试样本(或包括测试样本的流动缓冲液)已经穿过测试条，并且测试条的所有组分按预期运行，而不管是否存在对照分析物(借助于内部对照)以及(iii) 确认测定试剂的完整性(其可能由于暴露于湿度、光和/或氧气而受损或损害(例如，如在包装密封破裂的情况下)或其可能随时间降解(例如，在过期后)，这可能导致抗物种对照的功能性损失。因此，在阳性测试结果的情况下，内部对照作为用户的阳性强化。

因此，在一个方面，本发明提供了一种侧流测试条，其包括：

a)能够结合第一对照分析物的第一可移动的标记物质；

b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分；

其中第一固定的捕获试剂模拟第一对照分析物的至少一种结合性质，使得第一固定的捕获试剂能够结合可移动的标记物质。

在另一方面，本发明提供了一种侧流测试条，其包括：

a)模拟第一对照分析物的至少一种结合性质的第一可移动的标记物质；

b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分；

其中第一固定的捕获试剂能够结合至可移动的标记物质或结合至第一对照分析物。

在一个实例中，第一对照分析物是人血清白蛋白(HSA)。然而，本领域技术人员将理解，第一对照分析物可以是测试样本中存在的，优选大量存在的任何分析物。根据其中第一对照分析物是HSA并且第一可移动的标记物质与其结合的实例，第一可移动的标记物质可以是附着或缀合至可检测标记的抗HSA抗体，并且第一固定的捕获试剂可以是HSA。根据另第一对照分析物是HSA并且第一可移动的标记物质模拟其结合性质的另一个实例，第一可移动的标记物质可以是附着或缀合到可检测标记物的HSA，并且第一固定的捕获试剂可以是配置为结合HSA的抗体。

根据其中侧流测试条包括单个对照部分(即，第一对照部分)的本发明的方面，在使用期间第一对照部分处的可检测信号的不存在或减少可指示已正确地执行侧流测定。这是因为，当测试样本流过测试条到达第一测试部分时，包括在其中的第一对照分析物与第一可移动的标记物质或第一固定的捕获试剂竞争性结合，如果合适，从而防止或减少第一可移动的标记物质与第一固定的捕获试剂的结合。相反，在第一对照分析物不存在或不能结合第一固定的捕获试剂的情况下，例如，在仅流动缓冲液已经通过侧流测试条或对照分析物降解的情况下，第一可移动的标记物质将在侧流过程中自由结合第一固定的捕获试剂。这将在第一对照部分产生可检测信号。

在一些实例中，侧流测试条可以进一步包括：

c)第二可移动的标记物质；以及

d)第二对照部分，其包括第二固定的捕获试剂，

其中第二固定的捕获试剂能够结合第二可移动的标记物质。

第二可移动的标记物质可以是附着或缀合于可检测标记的第二对照分析物。在一个实例中，第二可移动的标记物质是附着或缀合至可检测标记的鸡IgY，并且第二固定的捕获试剂配置成结合至其，例如针对鸡IgY产生的抗物种捕获抗体。然而，本领域技术人员将理解，可以使用其它免疫球蛋白作为第二对照分析物。优选地，第二对照分析物是免疫球蛋白，其在结构上不同于哺乳动物IgG抗体并且与已知的干扰物 (例如在人中)没有交叉反应性，例如补体、类风湿因子或Fc受体。第二对照分析物也可以基于针对第二对照分析物产生的抗物种捕获抗体是可商购的来选择。例如，在鸡IgY的情况下，针对鸡IgY产生的几种抗物种捕获抗体是可商购的，例如山羊抗鸡IgY、驴F(ab’)₂抗鸡IgY，兔F(ab’)₂抗鸡IgY和单克隆小鼠抗鸡IgY。

根据其中第二可移动的标记物质是附着或缀合至可检测标记的鸡IgY的实例，第二固定的捕获试剂可以是抗鸡IgY抗体。例如，山羊抗鸡IgY、驴F(ab’)₂抗鸡IgY、兔F(ab’)₂抗鸡IgY和单克隆小鼠抗鸡 IgY。然而，当选择不同的第二对照分析物时，第二固定的捕获试剂将配置成结合该特定分析物。

如本文所述的包括第二可移动的标记物质和第二对照部分的本发明的侧流测试条提供关于是否已正确地进行侧流测定的另外水平的确定性。在使用中，在第二对照部分的信号检测可以指示样本(任选地包括在运行缓冲液中或包括运行缓冲液)在侧流过程中已经穿过测试条，而不管第一对照分析物是否存在。例如，本发明的侧流测试条可以配置成使得在使用中：

(i)在第二对照部分检测到信号，而在第一对照部分检测不到信号或检测到信号减少(其中减少的信号是相对于第二对照部分的信号水平)指示侧流过程正确进行并且第一对照分析物存在于样本中(“通过”)；

(ii)在第一对照部分和第二对照部分检测到信号表明侧流过程正确进行，但第一对照分析物不存在于样本中(“失败”)；

(iii)在第一对照部分而不是在第二对照部分检测到信号表明第一对照分析物存在于样本中，但是侧流过程没有正确地进行，例如，样本没有到达第二对照部分和/或第二可移动的标记物质或第二固定的捕获试剂没有如预期的那样进行(“失败”)；

(iv)在第一或第二对照部分没有检测到信号表明侧流过程没有正确地进行，例如，第一对照分析物不存在于样本中和/或样本没有到达第二对照部分和/或第二可移动的标记物质或第二固定的捕获试剂没有如预期的那样进行(“失败”)。

该或每种可检测标记可以是乳胶颗粒、纳米颗粒聚集体、胶体金、磁性颗粒、荧光染料或量子点。在一个实例中，该或每种可检测标记是乳胶颗粒，例如戊二醛活化的乳胶颗粒。在另一个实例中，该或每种可检测标记是纳米颗粒聚集体。在另一个实例中，该或每个可检测标记是胶体金。在另一个实例中，该或每个可检测标记是磁性颗粒。在另一个实例中，该或每种可检测标记是荧光染料。在又一个实例中，该或每个可检测标记是量子点。

在一个实例中，第一和第二可移动的标记物质包括相同的可检测标记。在另一个实例中，第一和第二可移动的标记物质包括不同的可检测标记。

在使用中，并且在测试样本中不存在第一对照分析物的情况下，第一可移动的标记物质与第一固定的捕获试剂结合。第一可移动的标记物质与第一固定的捕获试剂的结合将在第一对照部分产生可检测的信号。这表明侧流测定没有正确地进行，例如，因为(i)第一对照分析物已经降解或(ii)施加到测试条的侧流运行缓冲液中测试样本不足或没有测试样本(例如，使用者没有施加足够的测试样本)。然而，当第一对照分析物存在于测试样本中时，与不存在第一对照分析物时的结合水平(否则将发生)相比，第一可移动的标记物质以降低的水平与第一固定的捕获试剂结合。这是因为第一对照分析物竞争性结合第一可移动的标记物质，使得较少或没有第一可移动的标记物质可用于结合第一固定的捕获试剂。这表明侧流测定已经适当地进行并且测试样本已经流过侧流测试条到达对照部分。

在另一方面，本发明提供了一种侧流测试条，其包括：

a)与第一对照分析物和第二对照分析物结合的可移动的标记物质；

b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分，其中第一固定的捕获试剂配置成特异性结合第一对照分析物；

c)和包括第二固定的捕获试剂的第二对照部分，其中第二固定的捕获试剂配置成特异性结合第二对照分析物；

其中第一对照分析物是通常存在于测试样本中的分析物，并且其中第二对照分析物是通常不存在于测试样本中的分析物。

在使用中，并且在测试样本中不存在第一对照分析物的情况下，在第一对照部分固定的可移动的标记物质的量大约等于在第二对照部分固定的可移动的标记物质的量。例如，在测试样本中不存在第一对照分析物的情况下，在第一对照部分固定的可移动的标记物质的量和在第二对照部分固定的可移动的标记物质的量以约1:1至约2:1的比例存在。例如，在测试样本中不存在第一对照分析物的情况下，在第一对照部分固定的可移动的标记物质的量和在第二对照部分固定的可移动的标记物质的量以约1:1的比例存在。例如，在测试样本中不存在第一对照分析物的情况下，在第一对照部分固定的可移动的标记物质的量和在第二对照部分固定的可移动的标记物质的量以约1.5:1的比例存在。例如，在测试样本中不存在第一对照分析物的情况下，在第一对照部分固定的可移动的标记物质的量和在第二对照部分固定的可移动的标记物质的量以约2.1的比例存在。

在使用中，并且在测试样本中存在第一对照分析物的情况下，固定在第一对照部分的可移动的标记物质的量小于固定在第二对照部分的可移动的标记物质的量。例如，在测试样本中存在第一对照分析物的情况下，在第一对照部分固定的可移动的标记物质的量和在第二对照部分固定的可移动的标记物质的量以小于1:1的比例存在。

与第一和第二对照分析物结合的可移动的标记物质可以是任何标记物质，例如可检测的标记物质。例如，标记物质可以是乳胶颗粒、纳米颗粒聚集体、荧光染料或量子点。在一个实例中，标记的物质是乳胶颗粒，例如戊二醛活化的乳胶颗粒。在另一个实例中，标记的物质是纳米颗粒聚集体。在另一个实例中，标记的物质是荧光染料。在又一个实例中，标记的物质是量子点。

在一个实例中，第一对照分析物是人血清白蛋白(HSA)。然而，本领域技术人员将理解，第一对照分析物可以是测试样本中存在的，优选大量存在的任何分析物。

在一个实例中，第二对照分析物是鸡IgY。然而，本领域技术人员将理解可以使用其它免疫球蛋白。优选地，第二对照分析物是免疫球蛋白，其在结构上不同于哺乳动物IgG抗体并且与已知的干扰物(例如在人中)没有交叉反应性，例如补体、类风湿因子或Fc受体。第二对照分析物也可以基于针对第二对照分析物产生的抗物种捕获抗体是可商购的来选择。例如，在鸡IgY的情况下，针对鸡IgY产生的几种抗物种捕获抗体是可商购的，例如山羊抗鸡IgY、驴F(ab’)₂抗鸡IgY，兔F(ab’)₂抗鸡IgY和单克隆小鼠抗鸡IgY。

根据其中第一对照分析物是HSA的实例，第一固定的捕获试剂是抗人血清白蛋白抗体。然而，当选择不同的第一对照分析物时，第一固定的捕获试剂将配置成结合该特定分析物。

根据其中第二对照分析物是鸡IgY的实例，第二固定的捕获试剂是抗鸡IgY抗体。例如，山羊抗鸡IgY、驴F(ab’)₂抗鸡IgY、兔F(ab’)₂抗鸡IgY和单克隆小鼠抗鸡IgY。然而，当选择不同的第二对照分析物时，第二固定的捕获试剂将配置成结合该特定分析物。

根据描述包括两个对照部分的侧流测试条的本发明的任何方面，第一和第二对照部分可配置成使得第二对照部分定位在第一对照部分的下游，或反之亦然。

在本发明的前述方面的每一个中，可移动的标记物质可以位于定位在对照部分上游的一个或多个标记保持部分。或者，可移动的标记物质可在使用前例如使用样本滴管置于一个或多个标记保持部分上。在又一个实例中，可移动的标记物质可在测试样本施加到测试条上之前，例如在其样本接收部分处添加到测试样本中并与测试样本混合。

本文所述的任何方面的侧流测试条还可包括一个或多个测试部分，每个测试部分包括固定的捕获试剂，固定的捕获试剂配置成特异性地结合测试分析物并由此将测试分析物固定到测试部分。该或每个测试部分的捕获试剂可以是固定在侧流测试条的相应测试部分上的抗体。可基于待固定的测试分析物选择合适的抗体。

该测试部分或每个测试部分可以位于侧流测试条上的该对照部分或每个对照部分的上游。

在一些实例中，测试分析物的标记可以作为侧流过程的一部分进行。例如，侧流测试条可包括一种或多种可移动的捕获试剂，其配置成结合样本中的测试分析物，其中可移动的捕获试剂包括可检测的标记。配置为结合测试分析物的可移动的捕获试剂可以定位在各个测试部分的上游的测试条的标记保持部分。在一些实例中，配置成结合测试分析物的可检测地标记的可移动捕获试剂可定位在与可移动的标记物质相同的标记保持部分处。在使用中，在侧流过程中在测试分析物和可移动的捕获试剂之间形成的标记的复合物可以固定在相应的测试部分，并通过可检测的标记进行检测。

在其它实例中，测试分析物的标记可以与侧流过程分开进行。例如，测试分析物的标记可以发生在侧流过程的上游，例如，作为测试样本(可能包括测试分析物)和标记的可移动捕获试剂之间的孵育步骤的一部分，标记的可移动捕获试剂配置成如本文所述结合测试分析物。测试样本可以以溶质形式制备。在测试分析物和标记的可移动捕获试剂之间形成的任何标记复合物可以相对均匀地分布在整个测试样本中。然后可以在本发明的侧流测试条的样本接收部分处接收包括标记的复合物的测试样本，并在毛细作用下从中穿过以在侧流过程中到达测试部分或每个测试部分。根据该实施例，侧流测试条不必包括配置成结合测试分析物的标记的可移动的捕获试剂。标记的可移动的捕获试剂可以单独提供。

如本文所述，本发明的侧流测试条可包括样本接收部分，样本接收部分配置成接触来自受试对象的测试样本，例如尿液或血液、或样本的组成部分。样本接收部分可以在标记保持部分、测试部分和测试条的所述或每个对照部分的上游。

可以与侧流测试条一起使用的测试样本可以是任何生物样本。在一个实施中，测试样本是人样本。在一个实施中，测试样本是粘液样本。在一个实例中，测试样本是血液样本或其组成部分。在一个实施中，测试样本是尿样。

在其它实例中，测试样本可以从植物、动物或环境来源获得。根据其中从动物获得测试样本的实例，测试样本可以是粘液样本、血液样本或其组成部分或尿液样本。根据其中测试样本是基于植物的实例，测试样本可以是植物组织例如叶、种子、果实或根，或从植物组织获得的一种或多种组分例如油，蛋白、DNA、 RNA或其组合。根据其中测试样本是环境样本的实例，样本可以是水样本或从土壤样本获得的洗出液。

本发明还提供了一种设备，该设备配置成用于接收本文描述的侧流测试条并且在使用过程中配置成用于经由显示器向用户呈现与在对应的对照部分处的对照分析物的识别以及测试样本中的测试分析物的识别相关的信息。该设备可以配置成允许在使用之后将用过的侧流测试条从其壳体中移除并且随后用新的测试条替换。

在一个实例中，设备以手持装置的形式提供。

在一个实例中，设备可包括读取器，以识别相应对照部分处的对照分析物和测试部分处的测试分析物。例如，读取器可以包括一个或多个光电检测器，其能够监测对照部分和测试部分处的光反射或光输出。

通常，可以被监测或检测的对照部分和测试部分处的信号可以包括光信号，例如光反射信号和/或荧光信号或其他。作为固定在第一和/或第二对照部分以及反射光和/或荧光的测试部分的可检测标记的结果，可以产生光信号。该设备可以包括光源，该光源将光照射到测试部分和测试部分上以引起光反射和/ 或发荧光。例如，监视或检测这种光信号的存在和/或水平可以包括确定信号的绝对或相对强度。信号的绝对或相对强度将取决于固定在测试部分和测试部分上的可检测标记的数量和类型。

本发明还提供了通过侧流测定检测测试样本中的测试分析物的方法，该方法包括：

(a)使本发明的侧流测试条或包括其的设备与生物样本接触；

(b)检测测试部分处的测试分析物的存在和/或水平；

(c)基于测试部分处的对照分析物的存在或不存在来确定侧流测定是否正确地进行；以及

(d)在(c)的基础上，确定(b)的结果是否准确。

如本文所述，可通过测定对照部分处可检测信号的存在和/或水平来测定对照部分处对照分析物的存在与否。同样，样本中测试分析物的存在或不存在可以通过测定测试部分可检测信号的存在和/或水平来确定。因此，本文对检测对照分析物和/或测试分析物的水平和/或量的任何讨论应解释为包括测定相关信号的存在和/或水平。

根据本发明的方法，其中所使用的侧流测试条包括单个对照部分，即，如本文所述的第一对照部分，在侧流测定完成之后在第一测试部分处检测到无信号可指示存在第一对照分析物，并且因此指示存在测试样本。另一方面，在侧流测定完成后检测第一测试部分的信号表明不存在第一对照分析物，因此不存在测试样本。

在一些实例中，例如对于液体样本，可将测试样本直接施加到测试条。然而，在其它实例中，测试样本可以包括在运行缓冲液中并与之混合，并且将混合物施加到测试条上。

根据本发明的方法，其中所使用的侧流测试条包括如本文所述的第一对照部分和第二对照部分，以下可适用

(v)检测到第二测试部分的信号和第一测试部分的无信号或信号减少(其中第一测试部分的信号相对于第二测试部分的信号减少)表明侧流过程正确进行并且第一对照分析物存在于施加到测试条的样本中 (“通过”)；

(vi)在第一测试部分和第二测试部分检测到信号表明侧流过程正确进行，但施加到测试条上的样本中不存在第一对照分析物，即测试样本不存在(运行缓冲液仅施加到测试条上)或测试样本中的第一对照分析物降解(“失败”)；

(vii)在第一测试部分而不是在第二测试部分检测到信号表明第一对照分析物存在于施加到测试条上的样本中，但是侧流过程没有正确地进行。在第二对照部分缺少信号表明样本没有到达第二对照部分和/ 或第二可移动的标记物质或第二固定的捕获试剂没有如预期的表现(“失败”)；

(viii)在第一或第二测试部分没有检测到信号表明侧流过程没有按预期进行。在第一和第二对照部分缺少信号表明第一对照分析物不存在于施加到测试条上的样本中和/或施加到测试条上的样本没有到达第二对照部分和/或第二可移动的标记物质或第二固定的捕获试剂没有如预期的那样起作用(“失败”)。

可以设想，本文描述的设备和方法可以被修改以适应任何测试分析物的检测。

根据本文所公开的任何方面的设备可根据需要包括单个测试条或多个测试条。在存在多个测试条的情况下，如本文所公开的设备的特征可存在于每个测试条中或可分布在多个测试条上。当存在多个测试条时，这些测试条可以串联或平行配置。当平行时，每个测试条可以相同或不同。例如，这里公开的设备的特征可以平行地分布在多个测试条上。本文公开的装置可以包括两个或更多个平行的测试条，其中测试条中的一个可以是本文公开的设备的测试条，并且一个或多个测试条中的另一个可以配置成使用例如 WO2005/059547中描述的竞争测定来检测目标分析物。

根据本发明的一个或多个方面的设备可以以试剂盒的形式提供。在一个实例中，试剂盒可包括根据本发明的一个或多个方面的侧流测试条或设备和使用说明书。测试试剂盒可以进一步包括侧流测定运行缓冲液。

附图说明

以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本发明的某些方面。通过参考附图中的一个或多个并结合本文给出的具体实施例的详细描述，可以更好地理解本发明。

图1示出了根据本发明的一个实施例的测试条的顶视图构造，其包括单个“阳性”对照部分。

图2示出了图1的测试条的顶视图构造以及使用时通过和失败结果的示意性表示。

图3示出了根据本发明的一个实施例的测试条的顶视图构造，其包括第一对照部分(“阳性对照”)和第二对照部分(“内部对照”)。

图4示出了图3的测试条的顶视图构造以及使用时通过和失败结果的示意性表示。

图5示出了根据本发明的一个实施例的测试装置的斜视图。

图6示出了图5的测试装置沿图5的线A-A的剖视图。

图7示出了在图6的测试装置中使用的读取设备的示意图。

图8是使用金纳米颗粒作为可检测标记的HSA夹心测定的图示。

图9提供了显示在侧流测定中用金标记检测HSA蛋白的代表性数据。如图所示，在缓冲液中可以证明 5ng/mL的检测限(蓝色直方图)。阳性对照线(红色直方图)证明了金标记的成功功能化

图10提供了使用抗HSA多克隆抗体作为对照线的捕获试剂以检测HSA作为阳性对照的侧流测定的结果。当HSA以高于100μg/mL的浓度存在时，钩状效应是明显的。

图11提供了使用抗-α-人IgG抗体作为对照线的捕获试剂以检测作为阳性对照的人IgG的侧流测定的结果。这说明差分吸光度测量如何提供测试样本存在/不存在的数字信号。

图12说明Supernova颗粒在测试线(上图)和金纳米颗粒(下图)的非特异性累积。使用CAMAG扫描仪测量测试条上的荧光强度和吸光度。

图13说明了在(A)不存在含有HSA的测试样本，和(B)存在含有HSA的测试样本的情况下，在C1 和C2对照线中，通过强度荧光信号测定的HSA包被的金纳米颗粒的结合水平。提供C1作为参考，没有固定捕获试剂，C2具有固定的抗HSA抗体。

图14示出了C2对照线的信号随粘液样本负荷增加的相对变化的剂量依赖性曲线。

图15说明了本发明的活性竞争性对照测定法与和侧流测定相容的其他颗粒类型良好地起作用，例如 200nm蓝色胶乳颗粒。示出了在竞争性测定形式中与HSA或人IgG缀合的200nm蓝色胶乳颗粒的归一化响应。滴管中分析物的最终浓度使用人血清中分析物的正常范围计算，假定仅1μL样本稀释于400μL裂解缓冲液中。使用具有660nm激发波长的CAMAGTLC扫描仪4测量信号。

图16是通过戊二醛活化将蛋白共价偶联到胺官能化的蓝色胶乳颗粒上的示意图。

图17说明了来自偶联至HSA的戊二醛活化的200nm蓝色胶乳颗粒的两个批次(批次A和批次B)的 HFT信号响应。“HSA”样本含有在裂解缓冲液中稀释的0.5％v/v人血清。“无HSA”样本仅含有裂解缓冲液。

图18是HFT测试条设计的一个实施例的示意图，该测试条设计具有两个流感病毒核蛋白测试线(T1 和T2)和两个对照线(C1和C2)，其中C1处的捕获试剂是小鼠抗HSA抗体，C2处的捕获试剂是山羊抗鸡IgY抗体。

图19显示了使用图19的HFT测试条与空白样本(没有人粘液)和人鼻拭子样本获得的代表性曲线图。注：对于C1和C2，在时间点S1(共轭波检测后大约2分钟)，信号被归一化为100％。

图20是示出对照线(C1和C2)处的结果的解释的示意图。如图所示，指示成功的拭子样本的荧光曲线是仅在C2处检测到的信号。任何其它荧光分布图都表示测试错误。

图21提供了来自两个不同批次的共偶联HSA+IgY胶乳颗粒的志愿者人鼻拭子样本(n＝36)和仅含缓冲液的样本(n＝37)的示例性数据集。

具体实施方式

侧流测试通常需要通过内部对照线进行确认。在传统的侧流中(非基于增生的测定)，在测试线下游流动的未结合标记在对照线的抗物种(例如抗小鼠)抗体捕获。对照线处可检测信号的出现提供了证据，证明在阴性测试结果的情况下，侧流测试已正确运行，作为用户的阳性加固，否则不会出现条带。对照还提供了在运输和储存期间侧流测试条上的生物组分保持活性的一些指示。在某些情况下，例如当测试预定用于家庭使用时，该测试可以受益于更阳性的对照。例如，代替简单地捕获未结合的标记，阳性对照可特异性识别生物样本中存在的生物标记。然而，如上所述，本发明人已经认识到，当测试分析物以中等至高浓度存在时，传统的内部或阳性对照物易受“钩状效应”或“前带效应”的影响，从而导致用户认为侧流测试在实际上没有侧流测试时失败。

本发明提供了包括对“钩状效应”不敏感的对照的侧流测试条和装置。这部分地通过包含“阳性对照”来实现，“阳性对照”依赖于竞争测定来检测样本(或包括其的流动缓冲液)中对照分析物的存在或不存在。这种阳性对照设计可以允许更精确地确认测试结果，特别是当测试样本和/或包括在其中的测试分析物以大量存在时。发明人已经证明了使用人血清白蛋白(HSA)作为阳性对照分析物的这种方法的有效性，因为它是人粘液中最丰富的蛋白。本发明人发现样本中HSA的浓度高到使其成为不适合用于依赖于夹心测定形式的侧流测定的对照分析物。这是因为(如本文所述)对照测试线和金/胶乳颗粒表面暴露于如此大量的HSA，以致两个表面都被蛋白快速包被，从而使抗体不能形成夹心(即“钩状效应”)。作为夹心测定形式的替代，本发明人采用所谓的竞争性测定，其中标记的粒子(例如金或乳胶纳米颗粒)在不存在目标分析物的情况下直接结合至对照线处的传感器表面。而目标分析物的存在触发了竞争，导致在对照线的信号逐渐减少或不存在信号。发现该方法在高水平HSA存在下工作良好，从而减轻“钩状效应”。

依赖于竞争性测定的阳性对照方法的一个潜在问题是当阴性测试结果真正出现时，缺乏提供给用户的正反馈(即，在对照线上缺乏可检测信号)。因此，本发明人设计了一种侧流测定，其将基于测试样本中存在的对照分析物(例如HSA)的阳性对照物与另一下游内部对照物组合，以帮助告知用户(i)测试已正确制造，(ii)检测器颗粒是功能性的，和(iii)测试已运行至完成。这种类型的下游内部对照通常依赖于直接结合与来自相应宿主物种的抗体缀合的检测颗粒的抗物种捕获抗体。例如，抗小鼠捕获抗体可以是侧流测定中的合适的测定对照，所述侧流测定使用与其检测颗粒缀合的小鼠抗体。然而，本发明人已经发现抗小鼠捕获抗体在所有情况下由于以下两个原因可能不是合适的测定对照：(i)荧光检测器颗粒通常含有与内部对照颗粒竞争的小鼠抗体，和(ii)小鼠血清通常作为阻断剂加入侧流测试中，这将迅速使抗小鼠捕获线饱和。为此，本发明人引入了基于鸡IgY抗体的内部对照作为对照分析物。本发明人已经发现，鸡IgY对于开发内部对照具有几个优点：(i)它易于以高产率从鸡蛋中生产和提取，(ii)它在结构上不同于哺乳动物IgG抗体，因此与已知的人干扰物如补体，风湿因子或Fc受体没有交叉反应性，和(iii) 针对鸡IgY的几种抗物种捕获抗体是可商购的。此外，本发明人还发现，在两个对照分析物(例如HSA和鸡IgY)共同偶联到同一批次的金或乳胶颗粒上的实施例中，每个颗粒能够结合到任一对照系。

一般技术和定义

除非另有明确定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均应被视为具有与本领域(例如，免疫学、分子生物学、免疫组织化学、生物化学或药理学)普通技术人员通常理解的相同含义。

本领域技术人员将理解，除了具体描述的那些之外，本发明易于变化和修改。应当理解，本发明包括所有这样的变化和修改。本发明还包括本说明书中单独或共同提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个的所述步骤或特征的任何和所有组合。

本发明的范围不受本文描述的具体实施方案的限制，这些实施方案旨在仅用于举例说明的目的。如本文所述，功能等同的产品、组合物和方法显然在本发明的范围内。

本发明的任何特定方面或实施例或实施例的每个特征可以比照适用于本发明的任何其他方面或实施例或实施例。

在整个说明书中，除非另有特别说明或上下文另有要求，引用单个步骤、物质组成、步骤组或物质组成组应被认为包括一个和多个(即一个或更多个)那些步骤、物质组成、步骤组或物质组成组。

如本文所用，单数形式“一(a)”、“和(and)”和“所述(the)”包括复数方面，除非上下文另外明确指出。例如，提及“细菌”包括多种这样的细菌，提及“过敏原”是指一种或多种过敏原。

术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并且应理解为提供对两种含义或任一种含义的明确支持。

在整个说明书中，词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变化形式将被理解为意指包括所陈述的要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组，但不排除任何其他要素、整数或步骤，或要素、整数或步骤的组。

侧流测试条和装置

根据本发明的任何一个或多个实施例的侧流测试条可以由允许液体样本通过毛细作用从中流动并且已知适合用于侧流装置中的任何材料形成。这些材料已经广泛用于商业上可获得的诊断测试，例如流感测试和妊娠/受孕测试，并且是本领域技术人员已知的。一种这样的示例性材料可以是硝化纤维膜。

侧流测试条可包括标记保持部分和第一对照部分。一个或多个测试条还可以包括样本接收部分，测试部分和/或第二对照部分。标记保持部分，第一对照部分，测试部分，样本接收部分和第二对照部分中的每一个的尺寸可以根据需要进行调整。例如，可以根据所使用的侧流测试条的具体尺寸和/或可以使用测试条的设备的尺寸来调整每个测试条的精确尺寸。

标记保持部分和第一对照部分可以配置在侧流测试条上，使得在使用中，取自受试对象的生物样本或包括该样本的LFA电泳缓冲液(统称为“样本”)在第一对照部分之前接触标记保持部分。样本可以在标记保持部分之前接触样本接收部分。样本可以在接触测试部分之后接触第一对照部分。根据其中侧流测试条包括第二对照部分的实例，样本可以在接触第一对照部分之后接触第二对照部分。或者，样本可在接触第一对照部分之前但在接触测试部分之后接触第二对照部分。可选择的结构是可能的，包括存在多个条的结构。

如本文所用，术语“下游”和“上游”，当指测试条各部分的位置时，应理解为是指相对于样本通过或沿着测试条的流动方向。

根据本发明的一个或多个实施例的侧流测试条还可包括流体接收器，其可用于将样本抽吸通过或沿着一个或多个测试条。

如本文所述，本发明的侧流测试条可包括一种或多种可移动的标记物质和一种或多种可固定的捕获试剂，所述捕获试剂配置成直接或间接地(例如，经由附着的或缀合的结合配偶体)特异性结合可移动的标记物质之一。术语“可移动的”用于表示标记的物质能够与生物样本或包括其的LFA电泳缓冲液一起从标记保持部分适当地移动到第一和/或第二对照部分。可移动的标记物质可以在使用测试条之前通过本领域已知的任何合适的方法沉积在标记保持部分。相反地，关于本发明的测试条的捕获试剂所使用的术语“固定的”是指试剂附着到侧流测试条(例如，在对照部分或测试部分处)，使得在测定过程期间通过或沿着测试条的流体的侧向流动不会使试剂移位。捕获试剂可以通过本领域已知的任何合适的方法固定。

如本文所述，侧流测试条可包括能够结合第一对照分析物或模拟第一对照分析物的至少一种结合性质的第一可移动的标记物质。第一可移动的标记物质还能够直接或间接地与第一固定的捕获试剂结合。本发明的侧流测试条还可包括能够结合第二固定的捕获试剂的第二可移动的标记物质。或者，本发明的侧流测试条可包括结合至第一对照分析物和第二对照分析物两者的单一可移动的标记物质。在前述的每一种中，所述或每一种可移动的标记物质可以位于侧流测试条的标记保持部分上。

合适的可移动的标记物质的实例包括但不限于标记的抗体，标记的蛋白，乳胶珠或纳米颗粒。根据其中第一对照分析物是HSA并且第一可移动的标记物质能够结合第一对照分析物的一个实例，合适的第一可移动的标记物质可以是抗HSA抗体。在第一测试部分的同源第一固定的捕获试剂可以是HSA。根据另第一对照分析物是HSA并且第一可移动的标记物质模拟第一对照分析物的至少一种结合性质的另一个实例，合适的第一可移动的标记物质可以是HSA。在第一测试部分的同源第一固定的捕获试剂可以是抗HSA抗体。尽管某些实施例在本文中参照作为第一对照分析物的HSA进行了描述，但是本领域技术人员将理解，第一对照分析物可以是测试样本中存在的并且优选是丰富的任何分析物。合适类型的分析物的实例包括但不限于天然或合成来源的分子、分子组或化合物(例如，药物、激素、酶、生长因子抗原、抗体、半抗原、凝集素、脱辅基蛋白、辅因子等)，其能够使用合适的捕获试剂结合并固定在测试条上。当第二可移动的标记物质存在于本发明的测试条上时，第二可移动的标记物质可以是通常不存在于测试样本中的分析物(第二对照分析物)。第二可移动的标记物质可以是例如鸡IgY。根据该实施例，第二固定的捕获试剂可以是针对鸡IgY的抗物种捕捉抗体。然而，本领域技术人员将理解可以使用其它免疫球蛋白代替鸡IgY。优选地，第二对照分析物是免疫球蛋白，其在结构上不同于哺乳动物IgG抗体并且与已知的干扰物(例如在人中) 没有交叉反应性，例如补体、类风湿因子或Fc受体。第二对照分析物也可以基于针对第二对照分析物产生的抗物种捕获抗体是可商购的来选择。例如，在鸡IgY的情况下，针对鸡IgY产生的几种抗物种捕获抗体是可商购的，例如山羊抗鸡IgY、驴F(ab’)₂抗鸡IgY，兔F(ab’)₂抗鸡IgY和单克隆小鼠抗鸡IgY。

本发明还提供了侧流测试条，其包括与第一对照分析物和第二对照分析物结合的可移动的标记物质。根据该实施例，可移动的标记物质可以是例如与第一对照分析物(例如HSA)和第二对照分析物(例如鸡 IgY)缀合的乳胶珠或纳米颗粒。示例性的第一对照分析物和第二对照分析物在本文中参考其它实施例进行描述，并且应当加以必要的修正而适用于本发明的该实施例和任何其它实施例或实施例，除非另有具体说明。根据其中第一对照分析物是HSA而第二对照分析物是鸡IgY的一个实例，第一可移动的捕获试剂可以是抗HSA抗体而第二固定的捕获试剂可以是针对鸡IgY产生的抗物种捕获抗体。然而，同源对照分析物和同源捕获试剂的选择可以根据需要改变。

在上述每个实施例中，固定在对照部分的捕获试剂可以是任何一种或多种试剂，所述试剂具有直接或间接通过缀合到其上的对照分析物结合到测试条上的可移动的标记物质的能力，从而形成结合对或复合物。此类结合对，结合配偶体或复合物的一些实例包括但不限于抗体和抗原(其中抗原可以是例如肽序列或蛋白序列)；互补核苷酸或肽序列；聚合酸和碱；染料和蛋白结合剂；肽和蛋白结合剂；酶和辅因子，以及配体和受体分子，其中术语受体是指能够识别特定分子构型如表位或决定簇位点的任何化合物或组合物。

如本文所用，术语“结合配偶体”是指能够识别并结合另一分子或组合物的特定结构方面的任何分子或组合物。这种结合配偶体和相应分子或组合物的实例包括但不限于抗原/抗体、半抗原/抗体、凝集素/ 碳水化合物，脱辅基蛋白/辅因子和生物素/(链霉)抗生物素蛋白。

在一些实例中，本发明的侧流测试条还包括一种或多种经配置以结合样本中的所关注测试分析物的固定的捕获试剂。配置成结合感兴趣的测试分析物的一种或多种捕获试剂可以被固定在侧流测试条的测试部分。测试分析物可以是样本中感兴趣的任何分析物。待使用本发明的侧流测试条检测的合适的待测分析物包括但不限于针对感染物(例如诸如流感、HIV、HTLV、幽门螺杆菌、肝炎、麻疹、流行性腮腺炎或风疹) 的抗体、来自感染物的抗原、可卡因、苯甲酰爱康宁、benzodizazpine、四氢大麻酚、烟碱、乙醇茶碱、苯妥英、对乙酰氨基酚、锂、地西泮、去甲替林、司可巴比妥、苯巴比妥、甲基苯丙胺、茶碱、睾酮、雌二醇、雌三醇、17-羟基孕酮、孕酮、甲状腺素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体激素、人绒毛膜促性腺激素、转化生长因子α、表皮生长因子、胰岛素样生长因子I和II、生长激素释放抑制因子、IGA和性激素结合球蛋白；以及其它分析物，包括抗生素(例如青霉素)、葡萄糖、胆固醇、咖啡因、可替宁、皮质类固醇结合球蛋白、PSA或DHEA结合糖蛋白。

本领域技术人员将理解，本发明的一个或多个实施例的测试条可配置成用于多种不同类型的测试样本。样本的选择部分取决于待测的测试分析物。本领域技术人员将理解，样本应被选择为可能存在测试分析物的样本。此外，样本的选择将受第一对照分析物的对照，所述第一对照分析物将充当阳性对照，反之亦然。样本可以是流体样本。测试样本可以是生物样本。可根据本发明的一个或多个实施例的侧流测试条使用的生物样本包括例如血液、血清、血浆、尿液、阴道排出物和/或羊水和粘液。医学上相关的物质(例如分析物)可以在血液(包括抗体、抗原、药物、激素、酶、代谢物、肽等)，泪液，汗液和其它分泌物和渗出物如粘液中找到。在一个实施中，测试样本是粘液样本。测试样本还可以包括或包含在侧向流动测定(LFA)流动缓冲液中，以帮助样本流过或沿着测试条流动。

当然，诊断领域的普通技术人员将认识到，本发明的侧流测试条可以配置成用于人类医学之外的应用中，包括例如兽医、农业、农艺和环境应用。根据这些其他应用领域，本领域技术人员将能够基于所依赖的测试样本以及适当的捕获试剂来选择适当的对照分析物。例如，本发明的侧流测试条可配置成检测从植物，动物或环境来源获得的测试样本中的测试分析物。根据其中从动物获得测试样本的实例，测试样本可以是以上关于人描述的任何生物样本，如粘液样本，血液样本或其组成部分，或尿样。根据其中测试样本是基于植物的实例，测试样本可以是植物组织例如叶、种子、果实或根，或从植物组织获得的一种或多种组分例如油，蛋白、DNA、RNA或其组合。根据其中测试样本是环境样本的实例，样本可以是水样本或从土壤样本获得的洗出液。

本领域技术人员将理解，可移动的物质可以通过本领域已知的任何合适的方法标记。例如，标记可以直接缀合到可移动物质上，或者标记可以通过接头缀合到可移动物质上。标记的附着可以通过共价键、吸附过程、疏水和/或静电键，如在螯合物等中，或这些键和相互作用的组合和/或可以包括连接基团。在一些实例中，可移动物质是对照分析物所附着的可检测标记。

可以使用本领域已知的任何合适的可检测标记。合适的标记的实例包括但不限于颗粒标记，放射性标记，荧光标记，酶标记和成像剂。例如，标记可以包括乳胶或金。标记可以是乳胶珠(任何颜色，包括两种或多种可区分的颜色)或可以是纳米颗粒。可以使用任何合适的纳米颗粒。例如，纳米颗粒可以是磁性颗粒、硒纳米颗粒、银纳米颗粒、金纳米颗粒或碳纳米颗粒。标记的物质可以是乳胶颗粒，戊二醛活化的乳胶颗粒或纳米颗粒聚集体。荧光标记可以包括一个或多个量子点。在侧流测试条包含多个荧光分子的情况下，可以选择相应的分子以在不同的波长下发荧光，例如，在被光激发时，以使得能够对样本中的两种或更多种分析物进行差异检测。标记可以是反射性的。在侧流测试条包含多个反射分子的情况下，可以选择相应的分子来反射不同波长的光以使得能够对样本中的两种或更多种分析物进行差异检测。

任何合适的对照部分和测试部分可以使用任何合适的固定的捕获试剂。根据本发明的一个或多个实施例使用的捕获试剂可以是具有结合感兴趣的分析物(对照分析物或测试分析物)并由此形成结合复合物的能力的多种试剂中的任一种。此类结合对或复合物的一些实例包括但不限于抗体和抗原(其中抗原可以是例如肽序列或蛋白序列)；互补核苷酸或肽序列；聚合酸和碱；染料和蛋白结合剂；肽和蛋白结合剂；酶和辅因子，以及配体和受体分子，其中术语受体是指能够识别特定分子构型如表位或决定簇位点的任何化合物或组合物。

根据其中可移动的标记物质能够结合对照分析物的实例，例如，可移动的标记物质是针对对照分析物的抗体或附着于其上，固定于测试条上的同源捕获试剂(即，固定的捕获试剂)可以是相应的对照分析物或模拟对照分析物的至少一种结合性质的其类似物或衍生物。另一方面，如果可移动的标记物质是对照分析物或模拟对照分析物的至少一种结合性质的类似物或其衍生物(或附着于其上)，则固定在测试条上的同源捕获试剂(即固定的捕获试剂)可以是能够结合可移动的标记物质或对照分析物的物质，例如针对对照分析物的抗体。因此，合适的固定的捕获试剂可包括但不限于对照分析物或其类似物，其模拟待测对照分析物或抗对照分析物的抗体的至少一种结合性质。在侧流测试条的测试部分的上下文中，固定的捕获试剂将配置成特异性结合测试分析物，例如针对测试分析物的抗体。

如本文所用，术语“特异性结合”，“特异性结合”或类似术语可指不显著结合(例如，高于背景结合水平)除所需组分或分析物之外的任何样本组分的捕获试剂。因此，例如，如果实际上存在HSA，“特异性结合HSA”的捕获试剂可能不显著或根本不结合样本中除HSA以外的任何其它分析物或组分。

技术人员将意识到“抗体”通常被认为是包括由多个免疫球蛋白链组成的可变区的蛋白，例如包括V_L的多肽和包括V_H的多肽。抗体通常还包括恒定区，其中一些可排列为恒定结构域或恒定片段或可结晶片段 (Fc)。V_H和V_L相互作用形成包括抗原结合区的Fv，所述抗原结合区能够特异性结合一种或几种密切相关的抗原。通常，来自哺乳动物的轻链是κ轻链或λ轻链，来自哺乳动物的重链是α、δ、ε、γ或μ。抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)，类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1 和IgA2)或亚类。术语“抗体”还包括人源化抗体，人抗体和嵌合抗体。如本文所用，术语“抗体”还包括全长，完整或完整抗体分子以外的形式，如Fab、F(ab')2和Fv，它们能结合表位决定簇。这些形式可称为抗体“片段”。根据本发明，预期这些抗体形式根据需要保留选择性结合分析物的一些能力，其实例包括但不限于以下：

(1)Fab，含有抗体分子的单价结合片段并且可以通过用木瓜蛋白酶酶切全抗体以产生完整轻链和一条重链的一部分而产生的片段；

(2)Fab'，抗体分子的片段，其可以通过用胃蛋白酶处理全抗体，然后还原以产生完整的轻链和重链的一部分而获得；每抗体分子获得两个Fab'片段；

(3)(Fab')2，可通过用未经随后还原的酶胃蛋白酶处理全抗体获得的抗体的片段；F(ab)2是通过两个二硫键结合在一起的两个Fab'片段的二聚体；

(4)Fv，定义为含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区的基因工程片段；

(5)单链抗体(“SCA”)，定义为含有轻链可变区，重链可变区的基因工程分子，其通过合适的多肽接头连接为遗传融合的单链分子；此类单链抗体可以是多聚体的形式，例如双抗体，三抗体和四抗体等，其可以是或可以不是多特异性的(参见例如WO 94/07921和WO98/44001)；以及

(6)单结构域抗体，通常是缺乏轻链的可变重链结构域。

因此，根据本发明用作捕获试剂的抗体可包括分离的重链、轻链、Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、缺乏任何重链的可变轻链结构域、缺乏轻链的可变重链结构域和Fv。这些片段可通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学分离产生。

术语“全长抗体”、“完整抗体”或“全抗体”可互换使用，是指相对于抗体的抗原结合片段，基本上完整形式的抗体。具体地，全抗体包括包括具有重链和轻链的那些包括Fc区。恒定结构域可以是野生型序列恒定结构域(例如，人野生型序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。在一些情况下，完整抗体可具有一种或多种效应子功能。

根据本发明用作捕获试剂的抗体可以是人源化抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指衍生自非人抗体(通常为鼠抗体)的抗体，其保留或基本上保留亲本抗体的抗原结合特性，但在人中免疫原性较低。

因此，第一和第二对照部分的固定的捕获试剂可以是抗体。例如，当第一对照分析物是HSA时，第一对照部分的固定的捕获试剂可以是抗体，该抗体配置成结合人血清白蛋白HSA特异性的表位。例如，当第二对照分析物或第二可移动物质是鸡IgY时，第二对照部分的固定的捕获试剂可以是结合鸡IgY上的表位或区域的抗体。第二对照部分的固定的捕获试剂可以是例如能够结合鸡IgY的抗鸡IgY抗体。

根据本发明使用的合适的抗体是可商购的或本领域已知的。此外，用于测定抗体的结合特异性和亲和力的方法是本领域已知的，使得技术人员可以容易地鉴定适用于根据本发明内容使用的结合试剂。

在一些实施例中，本发明的侧流测试条可存在于装置或设备(统称为“装置”)中或配置成与装置或设备一起使用。根据本发明的装置可以是作为单个单元操作的装置。例如，该装置可以以手持装置的形式提供。该装置可以是一次性使用的装置。或者，该装置可以是部分或全部可重复使用的。虽然在一些实施例中，该设备可以在实验室中实现，但是该设备可以被设计为“即时的”装置，用于家庭使用或在诊所中使用等。在其他实施例中，该设备可以在工作场所中实现，例如用于进行质量对照或隔离目的。该装置可以提供快速测试装置，其中相对快速地向用户提供目标条件的标识，例如在10分钟以下、5分钟以下或1 分钟以下。

该装置可包括单个测试条或多个测试条。例如，包括本发明的多个测试条的装置可包括2、3、4、5、 6、7、8、9、10、15、20或更多个测试条。测试条可以平行或串联排列。该装置还可以配置成使得测试条可以在使用之后被替换。

根据本发明的装置还可以包括显示器，其配置成向用户呈现关于化验结果的信息。

例如，根据本发明的装置可以包括读取器以识别第一对照部分处的HSA和/或第二对照部分处的鸡IgY。读取器还可以配置成识别测试部分处的测试分析物。读取器可以包括能够在第一和/或第二对照部分监视光信号的一个或多个光电检测器。读取器还可以包括一个或多个能够监视测试部分处的光信号的光电检测器。

如本文所述，可被监测或检测的第一和/或第二对照部分处的信号和测试部分处的信号可包括光信号，例如光反射信号和/或荧光信号等。光信号在第一和/或第二对照部分或测试部分的反射光和/或荧光的可检测标记的结果，可以产生光信号。该装置可以包括光源，该光源将光照射到第一和/或第二对照部分上以引起光反射和/或发荧光。例如，监视或检测这种光信号的存在和/或水平可以包括确定信号的绝对或相对强度。信号的绝对或相对强度将取决于固定在第一和/或第二对照部分和测试部分的可检测标记的数量和类型。例如，根据本文所述的其中本发明的测试条包括结合至第一对照分析物和第二对照分析物的可移动的标记物质的实施例，第一对照部分处的低信号与第二对照部分处的中等或高信号组合的检测可指示样本中第一对照分析物例如HSA的高水平。另一方面，如果第一对照部分处的信号约等于第二对照部分处的信号，则这可指示不存在测试样本。应当理解，在第一和第二对照部分的信号的精确比较可以取决于在第一和第二对照部分固定的捕获试剂的特定亲和力、数量和其它性质。

方法和用途

根据本发明的任何一个或多个实施例的侧流测试条或包括所述测试条的装置可用于检测测试样本中的分析物的方法中。更具体地，在检测测试样本中的分析物的方法中使用侧流测试条或装置可允许确定本文公开的测试条在侧流测定中是否正确地工作，以及当执行该方法时是否获得有效的测试结果。方法可以在家庭环境、实验室环境、临床环境或其它环境中进行。方法可包括使用本文所公开的实施例的侧流测试条或装置。

根据本发明的侧流测试条包括单个对照部分(即，第一对照部分)的方面，在使用期间第一对照部分处的可检测信号的不存在或减少可指示侧流测定已被正确地执行。这是因为，当测试样本流过测试条到达第一测试部分时，其中包括的第一对照分析物与第一可移动的标记物质或适当的第一固定的捕获试剂竞争性结合(取决于哪一个配置成与第一对照分析物结合)，从而防止或减少第一可移动的标记物质与第一固定的捕获试剂的结合。在第一对照部分的可检测信号的减少可以相对于在样本中不存在第一对照分析物的情况下存在于第一对照部分的可检测信号的水平或预期水平来确定。相反，当样本中不存在第一对照分析物或第一对照分析物不能与第一固定的捕获试剂结合时(例如，在只有流动缓冲液通过侧流测试条或对照分析物降解的情况下)，在侧流过程中第一可移动的标记物质将自由地与第一固定的捕获试剂结合。这将在第一对照部分产生可检测信号。

根据本发明的进一步包括第二可移动的标记物质和第二对照部分(即，双重对照)的侧流测试条的方面，在使用期间，在第二对照部分处的信号检测可指示样本(任选地包括在运行缓冲液中或包括运行缓冲液)在侧流过程期间已行进通过测试条，而不管第一对照分析物是否存在。这样，在第一对照部分(阳性对照)没有检测到信号的情况下，第二对照部分(内部对照)向用户提供正反馈。因此，具有第一和第二可移动物种的双重对照的本发明的侧流测试条可以配置成使得在使用中：

(i)在第二对照部分检测到信号并且在第一对照部分没有信号表明侧流过程正确进行并且第一对照分析物存在于样本中(“对照通过”)；

(ii)在第一对照部分和第二对照部分检测到信号表明侧流过程正确进行，但第一对照分析物不存在于样本中(“对照失败”)；

(iii)在第一对照部分而不是在第二对照部分检测到信号表明第一对照分析物存在于样本中，但是侧流过程没有正确地进行，例如样本没有到达第二对照部分和/或一种或多种测试条组分没有正确地进行 (“对照失败”)；

(iv)在第一或第二对照部分没有信号的检测表明侧流过程没有正确地进行，例如，第一对照分析物不存在于样本中和/或样本没有到达第二对照部分和/或一种或多种测试条组分没有正确地进行(“对照失败”)。

如本文所述，本发明的另一个方面提供了一种侧流测试条，其包括：a)与第一对照分析物和第二对照分析物结合的可移动的标记物质；b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分，其中第一固定的捕获试剂配置成特异性结合标记物质上的第一对照分析物；c)和包括第二固定的捕获试剂的第二对照部分，其中第二固定的捕获试剂配置成特异性结合标记物质上的第二对照分析物；其中第一对照分析物是通常存在于测试样本中的分析物，如HSA，并且其中第二对照分析物是通常不存在于测试样本中的分析物，如IgY。

在使用过程中，并且在第一对照分析物存在于测试样本中的情况下，由于与样本中的第一对照分析物的竞争性结合，可移动的标记物质在第一对照部分较少能够或不能结合第一固定的捕获试剂。因此，可移动的标记物质继续通过测试条向第二对照部分迁移，在那里它可以在第二对照部分结合第二固定的捕获试剂。这导致其中在第二对照部分处可检测到指示侧流过程正确进行的信号，并且在第一对照部分处可检测到指示第一对照分析物存在于样本中的信号减少(相对于第二对照部分处的信号)或无信号(“对照通过”) 的曲线。

在使用过程中，以及在第一对照分析物在测试样本中不存在(或降解)的情况下，可移动的标记物质能够以相对相等的比例结合到第一对照部分的第一固定的捕获试剂上，以及结合到第二对照部分的第二固定的捕获试剂上。即，在第一对照部分没有竞争性结合。这导致其中在第一和第二对照部分以相对相等的量(例如，1:1比率)可检测到信号的曲线，表明侧流过程正确地进行，但第一对照分析物在测试样本中不存在或降解(“对照失败”)。

如果在以上任一情况下，测试样本没有正确地迁移通过侧流测试条到达第二对照部分和/或如果一种或多种测试条组分没有正确地发挥作用，例如，如果在第二对照部分的可移动的标记物质和捕获试剂不能结合，则在第二对照部分没有可检测的信号，表明侧流过程没有正确地进行(“对照失败”)。

基于在使用本文所述的侧流测试条期间获得的结果，可以确定测试条在侧流测定中是否正确地工作，以及当对测试样本进行诊断方法以检测测试分析物时是否获得有效的测试结果。

试剂盒

根据本发明的侧流测试条或装置可以试剂盒的形式提供。这样的试剂盒可以包括一个或多个测试条或装置(其可以用于相同或不同的分析物)和使用说明书。使用说明书可提供如何将样本施加到测试条或装置上的说明，等待结果形成所需或建议的时间量，以及如何读取和解释测试结果的细节。这种指令还可以包括标准，例如用于比较测试结果的标准表、图表或图片。这些标准可以任选地包括使用测试装置定量分析物所必需的信息，例如将信号强度或信号线数目与样本中存在的分析物的量相关联的标准曲线。可替代地或另外地，试剂盒可以包括本发明的一个或多个实施例的装置以及适用于在该装置中使用的一个或多个测试条。在这方面，该装置可以配置成允许在使用之后将用过的测试条从条，并且随后将新的测试条放置到壳体中。

示例性实施例描述

示例性实施例1

根据本发明的一个实施例的侧流测试条示于图1中(测试条10)。测试条10是由化学处理的硝化纤维素构成的侧流测试条，其位于防水基底上，该防水基底配置成(i)使用竞争性结合测定来检测测试样本中作为阳性对照的HSA的存在，和(ii)检测测试样本中感兴趣的测试分析物的存在和/或量。测试样本可以是通常含有HSA的任何人生物样本，例如人粘液或血液或其组分。可将生物样本加入到LFA流动缓冲液(生物样本和/或LFA流动缓冲液统称为“样本”)中以帮助其迁移通过或沿着测试条10。

参考图1和2，测试条10是侧流测试条，其包括沿测试条长度顺序排列的不同区域，包括在取样端 100的样本接收区域101、标记保持区域102、对照区域103、测试区域104和接收器105。区域101-105 包括位于防水基底106上的化学处理的硝化纤维素。区域101-105和衬底106的布置是这样的，当与样本接收区域101接触时，液体样本被吸收到采样接收区域101中，并且至少部分样本在毛细作用下顺序地穿过样本接收区域101、标记保持区域102、测试区域104、对照区域103，并且最终积聚在接收器105处。

在该实施例中，标记保持区域102包括标记缀合的对照抗体(即，可移动的标记物质)。标记缀合的对照抗体是抗HSA抗体，其被设计成特异性结合样本中的HSA(如果存在的话)或在抗体尚未结合来自样本的HSA的情况下特异性结合固定在对照区域103的HSA。因此，当样本通过标记保持区域102时，HSA (如果存在于样本中)结合标记缀合的抗HSA抗体以形成标记的对照结合复合物。另一方面，如果样本中不存在HSA，则标记缀合的抗HSA抗体不结合地通过测试条10。样本继续沿测试条10移动，通过测试区域104、对照区域103，并最终移动到水槽105。如果样本中存在HSA，标记的对照结合复合物的形成将阻止标记缀合的抗HSA抗体与固定在对照区域103的HSA结合。另一方面，如果样本不含HSA或如果HSA在样本中降解，则含有移动的标记缀合的抗HSA抗体的样本将穿过测试条10，并且在样本中不结合HSA的情况下，将在对照区域103结合固定的捕获试剂(即HSA)。

尽管该实施例包括标记偶联的抗-HSA抗体作为标记保持区域102的可移动的标记物质和HSA作为对照区域103的固定的捕获试剂，如果标记偶联的HSA用作标记保持区域102的可移动的标记物质和抗-HSA抗体用作对照区域103的固定的捕获试剂，则竞争性阳性对照也将起作用。

为了检测感兴趣的测试分析物，标记物保持区102还可以包括可移动的标记物缀合的抗体，该抗体被设计成特异性结合感兴趣的测试分析物，例如流感病毒核蛋白(流感NP)，如果存在于样本中以形成复合物(下文称为“标记的流感NP复合物”)。因此，当样本通过标记保持区域102时，其中存在的流感NP结合抗流感NP抗体以形成标记的流感NP复合物。含有标记的流感NP复合物的样本继续穿过测试条到达测试区域104，测试区域104含有能够以高特异性和亲和力结合流感NP的固定化化合物，例如抗体。接触时，测试区域104中的固定化化合物与标记的流感NP复合物中的流感NP结合，形成标记的流感NP夹心。如上所述，样本继续通过测试条10以接触对照区域103。

在该实施例中，标记缀合的抗体用不同类型的荧光量子点(QD)标记，其配置成在UV光激发后在不同的特定发射峰波长(例如，分别为525和800nm的第一和第二波长)发荧光。当然，在可选实施例中，可以使用其它类型的标记来代替量子点，例如乳胶珠或金颗粒等，和/或可以使用其它特定的发射峰波长。

如图2A所示，对照部分103上的可检测信号表明对照部分103上存在与HSA结合的标记缀合的抗HSA 抗体，并表明待测样本不含HSA。相反，在对照部分103缺乏可检测信号表明在对照部分103不存在与HSA 结合的标记缀合的抗HSA抗体，即，因为标记缀合的抗HSA抗体与样本中的HSA竞争性结合，因此表明被测试的样本确实含有HSA(图2B)。

除了配置成使用竞争性结合测定来检测测试样本中的HSA的对照部分103处的“阳性对照”之外，本发明的侧流测试条的某些实施例还可以包括测试区处的下游“内部对照”，以帮助告知用户(i)测试条已被正确制造，(ii)检测器颗粒是功能性的，以及(iii)FLA测试已运行至完成。参考图3和4，测试条 10是侧流测试条，其包括根据参考图1和2描述的实施例沿着测试条的长度顺序布置的不同区域，不同之处在于对照区域103包括第一对照部分103a(“阳性对照”)和第二对照部分103b(“内部对照”)。

在该实施例中，标记保持区域102包括第一标记缀合的对照抗体(即，第一可移动的标记物质)和第二标记缀合的对照抗体(即，第二可移动的标记物质)。第一标记偶联的抗体是抗-HSA抗体，其被设计成与样本中的HSA(如果存在的话)特异性结合，或者在抗体尚未与来自样本的HSA结合的情况下与固定在第一对照部分103a的HSA特异性结合。第二标记偶联的抗体是设计成特异性结合固定在第二对照部分103b 的抗鸡IgY抗体的鸡IgY抗体。因此，当样本通过标记保持区域102时，HSA(如果存在于样本中)结合标记缀合的抗HSA抗体以形成标记的对照结合复合物，其与标记缀合的鸡IgY抗体一起携带通过测试条10。另一方面，如果样本中不存在HSA，则标记缀合的抗HSA抗体与标记缀合的鸡IgY抗体一起不结合地通过测试条10。样本继续沿测试条10移动，通过测试区域104、对照区域103，并最终移动到水槽105。如果样本中存在HSA，标记的对照结合复合物的形成将阻止标记缀合的抗HSA抗体与固定在第一对照部分103a 的HSA结合。另一方面，如果样本不含HSA或如果样本中的HSA被降解，则含有动员的标记缀合的抗HSA 抗体的样本将穿过测试条10，并且在样本中不结合HSA的情况下，将在第一对照部分103a处结合固定的捕获试剂(即HSA)。此外，如果样本能够一直迁移到水槽105(即，流动到完成)并且如果测试条10的所有组分都是功能性的，则标记缀合的鸡IgY抗体将在第二对照部分103b处结合到固定的捕获试剂(即，抗鸡IgY抗体)。然而，如果样本没有迁移到第二对照部分103b那么远，或者如果任何内部对照组分例如可移动的标记物质或固定的捕获试剂没有功能，那么标记缀合的鸡IgY抗体将不与第二对照部分103b处的固定的捕获试剂(即抗鸡IgY抗体)结合。

根据前面的实施例，标记保持区域102还可以包括可移动的标记缀合的抗体，该抗体被设计成特异性地结合感兴趣的测试分析物，例如流感病毒核蛋白(流感NP)，如果存在于样本中以形成复合物(下文称为“标记的流感NP复合物”)。因此，当样本通过标记保持区域102时，其中存在的流感NP结合抗流感NP 抗体以形成标记的流感NP复合物。含有标记的流感NP复合物的样本继续穿过测试条到达测试区域104，测试区域104含有能够以高特异性和亲和力结合流感NP的固定化化合物，例如抗体。接触时，测试区域 104中的固定化化合物与标记的流感NP复合物中的流感NP结合，形成标记的流感NP夹心。如上所述，样本继续通过测试条10以接触对照区域103。

在该实施例中，标记缀合的抗体用不同类型的荧光量子点(QD)标记，其配置成在UV光激发后在不同的特定发射峰波长处发荧光(例如，第一和第二波长分别为525、625和800nm)。当然，在可选实施例中，可以使用其它类型的标记来代替量子点，例如乳胶珠、磁性颗粒或金颗粒等，和/或可以使用其它特定的发射峰波长。

如图4A中示意性说明的，第一对照部分103a处的可检测信号指示在第一对照部分103a处与固定的 HSA结合的标记缀合的抗HSA抗体的存在，指示被测试的样本不含HSA(例如，因为样本不存在于LFA运行缓冲液中或被降解)。此外，在第二对照部分103b处的可检测信号指示在第二对照部分103b处与固定的抗鸡IgY抗体结合的标记缀合的鸡IgY抗体的存在，其指示正确地进行侧流测定。总起来说，由于样本中缺乏对照分析物HSA，该对照指示“失败”。

如图4B所示，在第一对照部分103a缺少可检测信号表明在第一对照部分103a缺少与固定的HSA结合的标记缀合的抗HSA抗体，即，因为标记缀合的抗HSA抗体被样本中存在的游离HSA竞争性结合。这表明被测试的样本含有HSA。此外，在第二对照部分103b处的可检测信号指示在第二对照部分103b处与固定的抗鸡IgY抗体结合的标记缀合的鸡IgY抗体的存在，其指示正确地进行侧流测定。总起来说，该对照曲线表示对照“通过”，因为在样本中检测到对照分析物HSA，并且LFA正确完成。

如图4C中示意性说明的，第一对照部分103a处的可检测信号指示在第一对照部分103a处与固定的 HSA结合的标记缀合的抗HSA抗体的存在，指示被测试的样本不含HSA(例如，因为样本不存在于LFA运行缓冲液中或被降解)。在第二对照部分103b缺少可检测的信号表明标记缀合的鸡IgY抗体不与在第二对照部分103b固定的抗鸡IgY抗体结合，这表明侧流测定没有正确和/或完成。总而言之，由于LFA没有正确地进行到完成，所以该对照配置文件指示对照“失败”。

如图4D所示，在第一对照部分103a缺少可检测信号表明在第一对照部分103a缺少与固定的HSA结合的标记缀合的抗HSA抗体，即，因为标记缀合的抗HSA抗体被样本中存在的游离HSA竞争性结合。这表明被测试的样本含有HSA。在第二对照部分103b缺少可检测的信号表明标记缀合的鸡IgY抗体不与在第二对照部分103b固定的抗鸡IgY抗体结合，这表明侧流测定没有正确和/或完成。总而言之，由于LFA没有正确地进行到完成，所以该对照配置文件指示对照“失败”。

在参照图3和4描述的可选实施例中，第一对照分析物(即，HSA)和第一对照分析物(即，鸡IgY) 与位于测试条10的标记保持部分102处的相同可移动的标记物质(即，纳米颗粒)共偶联。根据该实施例，每个纳米颗粒能够结合第一和第二对照部分103a，103b中的任一个。测试条10的其余部件的构造与前面针对图3和4所述的相同。

在该实施例中，标记保持区域102包括与第一对照分析物(即HSA)和第一对照分析物(即鸡IgY) 缀合的单一可移动的标记物质。第一对照部分103a具有固定于其上的抗HSA抗体，第二对照部分103b具有固定于其上的抗鸡IgY抗体。以这种方式，可移动的标记物质能够结合到第一和第二对照部分103a，103b。当样本通过测试条时，HSA(如果存在于样本中)与固定在第一对照部分103a的抗HSA抗体结合，从而防止或减少可移动的标记物质与其结合。剩余的可移动的标记物质被携带通过测试区域103，在测试区域103 中鸡IgY抗体与固定在第二对照部分103b的抗鸡IgY抗体结合。这导致其中可检测信号从第二对照部分103b发射的对照轮廓，并且如果可检测信号从第一对照部分103a发射，则它以比从第二对照部分103b发射的电平低的电平发射。如图4所示，该对照曲线表明存在含有对照分析物的生物样本，侧流过程正确完成(对照“通过”)。另一方面，如果样本中不存在HSA，可移动的标记物质通过测试条10未结合地移动，其中与之偶联的HSA和鸡IgY抗体可用于分别在第一和第二对照部分103a，103b结合固定的捕获试剂。当样本到达对照区域103时，可移动的标记物质在第一和第二对照部分103a，103b以大约相等的比例与固定的捕获试剂结合。如图4所示，该对照曲线表明含有对照分析物的生物样本不存在(即，在FLA运行缓冲液中)，但侧流过程正确进行至完成(对照“失败”)。如果在上述任一情形中，在第二对照部分103b 处缺少可检测的信号(如图4C和4D所示)，这表明标记缀合的鸡IgY抗体在第二对照部分103b处不结合固定的抗鸡IgY抗体，这表明侧流测定没有正确进行和/或完成(对照“失败”)。

在替代实施例中，本发明的测试条10可与例如手持式装置的装置组合使用，以帮助检测样本中的测试分析物。在图5和6中示出了根据本发明的实施例的装置(测试装置1)。测试装置1是配置成与图1-4 所示的测试条10一起使用的手持装置，以(i)在进行LFA夹心测定之后检测样本中测试分析物的存在或不存在，和(ii)使用本文所述的测试条的对照来验证测试结果。

测试装置1包括细长侧流测试条10和外壳11。测试条10部分地容纳在外壳11中，其中测试条10的取样端100从外壳11的端面112中的开口111突出，允许样本直接接收在其上。测试条10的取样端100 可由帽12覆盖。测试装置1还包括通过外壳11的顶面113中的开口13可见的LCD显示器36，用于显示测试结果。

参考图7，现在更详细地描述本实施例的测试设备1的读取装置。读设备包括具有处理器31、电源(电池)32、开关33、UV LED 34、多波长光电检测器35和显示器36的印刷电路板。LED 34配置成发射入射在对照部分103a和103b以及测试部分104上的UV光谱(约300至400nm)中的光，以引起位于其上的任何量子点标记的激发。与处理器31结合的多波长光电检测器35配置成检测从量子点以不同的不同波长发射的光的不同强度(如果需要)。

在使用中，将帽12从测试条的取样端100移除，并将液体样本引导到样本接收区101上。盖12可以被替换，并且在大约1或2分钟之后，给予足够的时间进行侧流过程，开关33可以被按下，引起从电源 32到LED 34的电流，导致从LED 34发射UV光，该UV光入射到测试条10的对照部分103a，103b和测试部分104上。UV光导致可作为标记复合物的一部分固定在对照部分103a，103b和测试部分104上的任何或所有量子点的激发，导致在各自波长峰处的光发射。结合多波长光电检测器35，处理器31配置成确定发射峰的大小，并由此识别(a)样本混合物是否已经到达对照部分103a，103b并且标记是否有效，并且如果是，则基于在部分104处检测到的光发射强度来识别(b)样本中存在的标记的测试分析物的存在和任选的量。

虽然上面描述了手动开关33，但是在替换实施例中，切换可以是自动的。例如，当样本通过可配置成在装置中的流体致动开关时，可将开关构造成在盖子12更换到外壳11上时或由于流体致动而发生。

可以仔细校准LED以确保LED的光发射从一个装置到下一个装置是一致的，从而确保量子点的激发程度是一致的。可替代地或另外地，校准机构可以整合到装置中。可以将已知量的量子点固定在测试条上，例如固定在另一测试条上，所述量子点配置成在另一波长下发荧光。根据从已知量的量子点检测到的荧光强度，处理器可以调节其对来自标记复合物上的量子点的光发射的解释。可替代地或另外地，可以使用多个LED来激发量子点以抑制任何恶意LED的整体效果。

如果在使用过程中识别出没有足够量的样本到达对照区，或者如果识别出如图2和4所示和如上所述的“失败”对照轮廓，则处理器31配置成使显示器36呈现“无效测试”字。在这方面，处理器31与多波长光电检测器35组合，配置成确定对照区域103处的发射峰的大小，并由此识别(i)样本是否已经到达对照区域103，和/或(ii)标记是否有效，和/或(iii)生物样本是否存在和未降解。

如果在使用期间识别出存在足够量的样本并且标记有效，则处理器31配置成提供样本是否包含测试分析物的确定。

由于本实施例的装置是手持装置，因此该装置可用于实验室、诊所、家中或工作场所。

该装置配置成允许通过开口111将用过的测试条从外壳10中取出，并且允许通过相同的开口111将新的测试条放置到外壳10中。在可选实施例中，该装置可以完全是一次性装置。

实施例

实施例1-用于侧流测试条的改进的阳性对照的开发

基于HSA的阳性对照

侧流测试通常需要通过内部对照线进行确认。在传统的侧流(即，不积聚)中，在测试线下游流动的未结合标记被抗物种(例如，抗小鼠)抗体捕获。对照线的出现提供了证据，证明在阴性测试结果的情况下，测试已正确运行，作为用户的阳性加固，否则不会出现条带。它还提供了在运输和储存期间测试行程上的生物组分保持活性的一些指示。在某些情况下，例如当测试预定用于家庭使用时，测试可以使用更多信息的阳性对照。阳性对照特异性地识别生物样本中存在的生物标记，而不是简单地捕获未结合的标记。

家用流感测试(HFT)，也用于家用和OTC销售，执行阳性对照。HFT对照线的最丰富的蛋白和候选靶标记是人血清白蛋白(HSA)和免疫球蛋白(IgG，IgA)。IgA在最初评估后被丢弃，因为该群体的不可忽略部分是IgA缺陷的。

HSA是人粘液中最丰富的蛋白，因此在HFT上进行评价。以夹心测定形式筛选多种抗体。将抗HSA抗体固定在硝化纤维条上和金纳米颗粒上。在粘液样本的存在下，两种抗体都识别HSA蛋白，从而形成功能性夹心(图8)。测定形式与流感测定相同，其中核蛋白被捕获在两种抗体之间。采用这种形式，缓冲液中添加人血清白蛋白(HSA)的检测限为5ng/mL(图9)。抗HSA抗体与金纳米颗粒的成功结合通过在测试中包括抗物种对照线来证实。

该初始实验的结果表明动态范围不适用于试验对照试验：报道的鼻涕中HSA蛋白的值在几mg/mL的范围内，并且远高于测定的饱和度(参见图10)。信号实际上在1μg/mL时达到最大值，而在较高浓度时逐渐降低(由于“钩状效应”)。将测试线和颗粒表面暴露于如此大量的HSA，以致两个表面都被蛋白快速包被，从而使抗体不能形成夹心(图10)。

基于该发现，选择了不同的目标进行评价，并可能在HFT上实施：将α-人IgG抗体固定在测试条的C2 对照线上。Supernova颗粒(即纳米颗粒聚集体)和抗人IgG金纳米颗粒的组合同时沉积在缀合物释放垫上。在没有样本的情况下，金应该流过对照线而没有结合。如果成功地应用了粘液样本，金颗粒将从样本中螯合免疫球蛋白并在对照线聚集。差异吸光度测量(即，与作为参照的生物不活性硝化纤维素部分相比，由金颗粒吸收的光的测量)提供样本存在/不存在的数字信号(图11)。

虽然该测定形式显示在人粘液中发现的IgG范围内，但偶尔观察到粘液样本中对Supernovas的显著干扰(图12)。

使用CAMAG TLC扫描仪测量测试条上的荧光强度和吸光度。由于Supernova颗粒的非特异性结合，可以在两种流感检测线上观察到不同的峰(图12)。相同条带的吸光度扫描显示金纳米颗粒在流感检测线处非特异性地吸收。认为金纳米颗粒上的抗人抗体与免疫球蛋白亚群相互作用，对固定在流感检测线上的抗核蛋白IgG具有亲和力。来源于这些非特异性相互作用的背景反应的可变性将严重影响HFT测定的灵敏度。

因此决定重新探索HSA与再访测定形式的使用。在测定开发中众所周知的是，图8中描述的夹心形式可以递送非常好的灵敏度。由于这个原因，夹心测定是许多基于侧流的诊断的选择的测定形式。然而，另一种方法是开发所谓的竞争性测定，其中标记的颗粒在没有目标分析物的情况下直接结合到传感器表面。因此，目标分析物的存在触发竞争，导致信号逐渐减少或信号不存在。

在竞争性对照测定形式的开发中，我们将抗HSA抗体固定在硝化纤维素上并将HSA包被的金纳米颗粒引入测定系统中。然后当样本到达测试条时观察到通过干/湿转变的吸光度的相对变化，随后当颗粒流过测试条时观察到信号产生。没有固定捕获试剂的C1对照线(图13A中的蓝线)处的信号显示对应于湿/干转换和共轭波通过的信号增加。值得注意的是，负信号具有单调衰减，直到其达到背景值。相反，在不存在样本的情况下，在C2对照线上积累的金颗粒在从样本加载起5分钟内提供稳定的响应(30个读数)(图 13A)。因此，信号曲线从湿/干转换增加到最终平衡水平，类似于在具有 h-IgG对照线的样本存在下观察到的信号曲线(图12)。

相反地，在样本存在的情况下，C1和C2都表现出类似的信号分布，其可以通过向背景水平不断减小的单调波形来描述。人粘液中的HSA水平如此升高，使得C2测试线完全钝化并且没有观察到金颗粒的结合。

在图14中提供了C2对照线的信号随粘液样本负荷增加的相对变化的剂量依赖性曲线。

令人惊奇的是，当没有施加样本时，信号分布的形态显著不同，并且甚至在C1处不存在参考信号的情况下也可以区分。基于该观察结果，假设该传感机制可以从差分转换到绝对测量，从而消除了C1测试线上的一个LED，因此简化了装置设计。

针对小样本体积验证了测定的稳健性。大于5μL的粘液体积导致在C2处不能检测到金信号。在较低的音量下，信号然后快速地收敛到“背景”信号。还对来自4个不同供体的粘液样本验证了该测定，证实了传感机制是稳健的和可再现的。

蓝色胶乳粒子

这种竞争性检测方法可以扩展到进一步提高对照检测的实用性，特别是在家庭使用环境中。这些中的一些描述如下。

1)已经表明，该活性竞争性测定对照方法不限于胶体金，并且可以与其它与侧流测定相容的颗粒类型，例如200nm蓝色胶乳颗粒非常好地起作用(参见图15)。可使用绿色LED(λabs：530nm)测量归因于胶体金的吸光度，而可使用红色LED(λabs：630nm)测量归因于蓝色乳胶颗粒的吸光度。这两种选择都可以结合到原厂流感检测中。

2)在典型的侧流测试中，这些检测器颗粒将被干燥到结合物释放垫上并组装在测试条本身内。本发明人已经开发了一种替代形式，称为堆积方法，由此将检测器颗粒放置在样本滴管中的释放垫上。在这种形式中，当：(i)将处理溶液(裂解缓冲液)加入到滴管中，和(ii)将含有人拭子样本的喷嘴拧到滴管上。这产生了与样本混合的检测器颗粒的均匀溶液，这改善了测定的一致性和灵敏度。这还具有除去缀合物释放垫并因此简化整个测试条的流体学的附加益处。

3)本发明人已经证明了用于将HSA物理吸附或共价连接到具有各种表面官能团(例如羧基，胺或裸聚苯乙烯)的200nm蓝色胶乳颗粒的几种固定方法。优选的方法基于Wood和Gadow(1983)《临床化学临床生物化学杂志》(J Clin Chem Clin Biochem)，21：789-797的方法，并且包括两步法：(i)用在水中的5％v/v戊二醛活化胶乳颗粒表面上的胺基(伯胺基或仲胺基)，随后(ii)通过在低离子强度磷酸盐缓冲液中孵育过夜共价连接HSA(参见图16)。

戊二醛活化方法具有以下优势：

о在竞争性测定形式中，含HSA的样本和不含HSA的样本之间的优异区分(参见图10)

о从喷雾的增生垫向裂解缓冲液中的良好释放

о在2-8摄氏度下在储存缓冲液中维持颗粒稳定性

о与许多其他选项相比成本最低的方法(例如，廉价的接头，所需的蛋白过量较少，>90％的原始胶乳原料产率)

о与预期样本基质(即人鼻拭子)的相互作用低

共偶联HSA+IgY胶乳颗粒

竞争性检测方法的一个潜在问题是当出现阴性测试结果时缺乏提供给用户的正反馈。在侧流测定中，通常在主要目标分析物的捕获线下游包括内部对照。这有助于告知用户测试已正确制造，探测器颗粒功能正常以及测试已完成。这通常涉及直接结合与来自相应宿主物种的抗体缀合的检测颗粒的抗物种捕获抗体。例如，抗小鼠捕获抗体在使用与它们的检测颗粒缀合的小鼠抗体的侧流测定中是合适的内部对照。

在家用流感试验中，抗小鼠捕获抗体将不是合适的内部对照，原因有两个：(i)荧光检测器颗粒含有与内部对照颗粒竞争的小鼠抗体，和(ii)将小鼠血清作为封闭剂加入到测试中，这将迅速使抗小鼠捕获线饱和。

相反，已经开发了基于鸡IgY抗体的内部对照(参见图18)。鸡IgY具有几个优点：(i)它易于以高产率从鸡蛋中生产和提取，(ii)它在结构上不同于哺乳动物IgG抗体，因此与已知的人干扰物如补体，风湿因子或Fc受体没有交叉反应性，和(iii)针对鸡IgY的几种抗物种捕获抗体是可商购的，例如山羊抗鸡IgY、驴F(ab’)2抗鸡IgY、兔F(ab’)2抗鸡IgY和单克隆小鼠抗鸡IgY。

具有第二对照测定的另一个优点是不太明显。如果两种蛋白(即HSA和鸡IgY)共同偶联到同一批次的乳胶颗粒上，则每个颗粒能够结合到任一对照线上。这可以通过在与戊二醛活化的胶乳颗粒孵育之前混合两种蛋白来实现。现在可以出现两种情况(见图19)：

1)在测试样本中不存在游离HSA的情况下，蛋白缀合的检测剂颗粒以恒定比例与抗HSA(C1)或抗鸡IgY(C2)捕获线结合。该比率与从堆积垫释放多少颗粒或应用于测试的总体积无关。

2)在测试样本中存在游离HSA的情况下，由于在抗HSA捕获线的结合少得多并且在抗鸡IgY捕获线的结合稍高(由于在C1结合的颗粒少并且因此可用于在C2结合)，该比率有很大的变化。

因此，仅当C1/C2的比值低于阈值且C2值高于阈值时，即在C2处检测到足够数量的功能粒子时，才获得有效的测试结果(参见图20和图21)。

实施例2

通过在微量小瓶中混合50μL流感病毒核蛋白溶液(在PBS中稀释)和450μL裂解缓冲液制备每种低阳性甲型流感或低阳性乙型流感样本。微量小瓶还包含吸收垫，在其上干燥以下颗粒：(i)与抗甲型流感和乙型流感核蛋白共偶联的荧光Supernova颗粒，和(ii)与HSA和鸡IgY共偶联的蓝染胶乳颗粒。然后将125μL该混合物加入HFT测试装置的样本端口。

通过在微量小瓶中加入50μL的PBS和450μL裂解缓冲液来类似地制备仅含缓冲液的样本。

通过用鼻拭子擦拭健康志愿者并将拭子尖端浸入450μL裂解缓冲液中，类似地制备志愿者鼻拭子样本。

荧光免疫测定的计算值(S5值)，内部对照(对照值)和最终测试结果总结在表1中。

从表1可以明显看出，所有36个样本给出了荧光免疫测定和内部对照测定的预期结果。同一样本中荧光Supernova颗粒和乳胶颗粒的存在似乎不影响任一测定。

表1：设计的低阳性(甲型流感或乙型流感)样本、仅缓冲液样本和志愿者鼻拭子样本的数据集。

Claims (22)

1.一种侧流测试条，其包括：

a)能够结合第一对照分析物的第一可移动的标记物质；

b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分；

其中，所述第一固定的捕获试剂模拟所述第一对照分析物的至少一种结合性质，使得所述第一固定的捕获试剂能够结合所述可移动的标记物质。

2.一种侧流测试条，其包括：

a)模拟第一对照分析物的至少一种结合性质的第一可移动的标记物质；

b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分；

其中，所述第一固定的捕获试剂能够结合所述可移动的标记物质或结合所述第一对照分析物。

3.根据权利要求1或2所述的侧流测试条，进一步包括：

c)第二可移动的标记物质；以及

d)包括第二固定的捕获试剂的第二对照部分，

其中，所述第二固定的捕获试剂能够结合所述第二可移动的标记物质。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的侧流测试条，其中，在使用中，在测试样本中不存在所述第一对照分析物的情况下，所述第一可移动的标记物质与所述第一固定的捕获试剂结合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的侧流测试条，其中，在使用中，在测试样本中存在所述第一对照分析物的情况下，与不存在所述第一对照分析物的情况下的所述结合水平相比，所述第一可移动的标记物质以降低的水平与所述第一固定的捕获试剂结合。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的侧流测试条，其中，所述第一对照分析物通常存在于测试样本中。

7.一种侧流测试条，其包括：

a)与第一对照分析物和第二对照分析物结合的可移动的标记物质；

b)包括第一固定的捕获试剂的第一对照部分，其中所述第一固定的捕获试剂配置成特异性结合所述第一对照分析物；

c)和包括第二固定的捕获试剂的第二对照部分，其中所述第二固定的捕获试剂配置成特异性结合所述第二对照分析物；

其中，所述第一对照分析物是通常存在于测试样本中的分析物，并且其中所述第二对照分析物是通常不存在于所述测试样本中的分析物。

8.根据权利要求7所述的侧流测试条，其中，在使用中，在测试样本中不存在所述第一对照分析物的情况下，在所述第一对照部分固定的所述可移动的标记物质的所述量大约等于在所述第二对照部分固定的所述可移动的标记物质的所述量。

9.根据权利要求8所述的侧流测试条，其中，固定在所述第一对照部分的所述可移动的标记物质的所述量与固定在所述第二对照部分的所述可移动的标记物质的所述量以约1:1至2:1的比例存在。

10.根据权利要求7所述的侧流测试条，其中，在使用中，在测试样本中存在所述第一对照分析物的情况下，固定在所述第一对照部分的所述可移动的标记物质的所述量小于固定在所述第二对照部分的所述可移动的标记物质的所述量。

11.根据权利要求10所述的侧流测试条，其中，固定在所述第一对照部分的所述可移动的标记物质的所述量和固定在所述第二对照部分的所述可移动的标记物质的所述量以小于1:1的比例存在。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的侧流测试条，其中，所述标记物质是胶乳颗粒、胶体金、磁性颗粒或纳米颗粒聚集体。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的侧流测试条，其中，所述标记物质是戊二醛活化的胶乳颗粒。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的侧流测试条，其中，所述第一对照分析物是人血清白蛋白(HSA)。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的侧流测试条，其中，所述第一固定的捕获试剂是抗人血清白蛋白抗体。

16.根据权利要求3至15中任一项所述的侧流测试条，其中，所述第二对照分析物是鸡IgY。

17.根据权利要求3至16中任一项所述的侧流测试条，其中，所述第二固定的捕获试剂是抗鸡IgY抗体。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的侧流测试条，其中，所述测试样本是生物样本。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的侧流测试条，其中，所述测试样本是人样本。

20.根据权利要求18或19所述的侧流测试条，其中，所述测试样本是粘液样本。

21.根据权利要求18或19所述的侧流测试条，其中，所述测试样本是血液样本。

22.一种装置，其包括根据权利要求1至21中任一项所述的侧流测试条。

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