JPS63275955A - 免疫分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の目的］ （産業上の利用分野） 本発明は試料中に存在する特定の抗原又は抗体を定量分
析するための免疫分析法の改良に関する。

（従来の技術） 試料中に存在する特定の抗原又は抗体の定量分析には、
例えばラジオイムノアッセイ（以下、ＲＩＡと記す）が
用いられる。しかし、ＲＩＡでは放射性元素を用いるた
め、専用の瓢器を設置し、資格を有するオペレータが操
作を行わなければならず、しかも光棄物の処理等にも注
意を要するという問題がある。

また、その伯の分析方法として、例えば免疫電気泳動が
知られている。しかし、免疫電気泳動では測定に長時間
を要するうえ、感度が低く、被検物質がごく微倒しか含
まれていない場合には適用することができないという問
題がある。

そこで、本発明者らは先に特願昭５８−２２４５０９号
において、表面に親水性の抗体又は抗原を固定化し、内
部に親水性の標識物質を封入したリポソーム試薬を開示
した。この試薬を用いた免疫分析方法は以下のようなも
のである。すなわち、抗原又は抗体が存在する試料中に
前記リポソーム試薬を加え、これと別に補体を加えると
、抗原−抗体反応及びそれに伴う神体の作用によってリ
ポソームが破壊され、封入されていた標識物質（例えば
蛍光性化学物）が流出する。この流出した標識物質の母
と、試料中の被検物質の量との間には相関関係があるの
で、流出した標識物質を所定の分析方法（例えば蛍光分
析）によって定量することにより、被検物質を定量する
ことができる。この試薬を用いれば、ＲＩＡのような問
題が生じることはなく、免疫分析の簡便化が期待できる
。

しかし、このリポソーム試薬を用いて血清やタンパク質
含有試料の分析を行う場合、目的の抗原−抗体反応以外
に非特異反応が起り、これに起因してリポソームが破壊
されることがわかってきた。

これは、試料中のタンパク質ヤ微」化学物質とリポソー
ムとの反応によるものと考えられる。このため、従来は
血清やタンパク質含有試料を希釈して分析を行っていた
。

例えば、リポソームに抗ヒトαフェトプロティン抗体（
以下、抗ヒ１〜ＡＦＰ抗体と記す）を固定化した試薬を
用いてヒト血清中のＡＦＰを分析する場合、非特異反応
の影響を除去するために、ヒト血清を１００倍希釈して
いた。ところが正常人の血清中にはＡＦＰが１０−８１
ｍ、ｅ以下しか含有されていない。したがって、正常人
の血清を１００倍希釈すると、ＡＦＰ１度１０−”ｇ／
ｍＡ以下に対応する測定（例えば蛍光分析）となり、精
密な定量が困難となるという問題がおった。

（発明が解決しようとする問題点）　　。

本発明は上記問題点を解決するためになされたものであ
り、精密かつ簡便な分析が行える免疫分析法を提供する
ことを目的とするものである。

［発明の構成］ （問題点を解決するための手段） 本発明の免疫分析法は、リン脂質及び糖脂質のうち少な
くともいずれか一方を組成とするリポソームと、該リポ
ソーム中に封入された標識物質と、前記リポソームに架
橋法により固定化された抗体もしくは抗体の一部又は抗
原とからなる免疫分析試薬からなる免疫分析法において
、前記リポソームへの抗体もしくは抗体の一部又は抗原
の架橋法における感作（固定化）に改良を加えたことを
特徴とする。即ち抗体等の感作に用いられるリポソーム
側の官能基のうち検体（例えば血漿、血清２体腔液、尿
等）及び／又は補体（例えばモルモット血清）との接触
によって惹起される非特異的溶解の原因とある部分を予
め分解除去することである。

（作　用） 本発明の免疫分析法によれば、抗体もしくは抗体の一部
又は抗原をリポソームにおいて、その表面上に補体関与
の非特異溶解を惹起する官能基は残余しないので例えば
試料となる血清中の蛋白質や微量物質との非特異的反応
が起ることがない。

従って、被検物質の過剰な希釈を行う必要がなく、精密
な定量分析が可能となり、操作も簡便となる。

（実施例） 本発明に用いる免疫分析試薬は、例えば以下のような方
法により製造することができる。

まず、所望の脂質と架橋剤とを溶媒中で反応させること
により、脂質分子に官能基を導入して官能性脂質とする
。この官能基がリポソーム上における抗体もしくは抗体
の一部又は抗原を固定化するための官能基とし作用する
。次に、得られた官能性脂質と、必要であればコレステ
ロール及び他の脂質の適当量をフラスコに入れ、溶媒を
加えて溶解、混合させた後、溶媒を吸引除去して乾燥す
る。この結果、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成されてい
る。続いて、フラスコ内に標識物質を含有する水溶液を
加え、密栓して震盪することにより、リポソームの懸濁
液を調製する。

一方、リポソームに固定化される抗体もしくは抗体の一
部又は抗原には、必要ならば架橋剤との反応により架橋
基を導入した後、必要に応じて還元剤で処理して修飾す
る。

次いで、前記リポソーム！ｉ？！濁液と抗体もしくは抗
体の一部又は抗原とを適当な緩衝液中で反応させて、リ
ポソームに抗体もしくは抗体の一部又は抗原を固定化さ
せる。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソームはリ
ン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一方を組成
とするものである。尚、上述したように必要に応じてリ
ン脂質、糖脂質に対してコレステロールを１０乃至５０
０モル％を加えてもよく、これによって安定なリポソー
ムを得ることができる。また、リン脂質、糖脂質中の脂
肪酸炭素鎖は炭素原子数が１２乃至１８であることが好
ましく、更には偶数であることがより好ましい。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソーム内に
封入される標識物質としては、親水性で、リポソーム外
に流出した際に定量可能な物質が選択される。このよう
な物質としては、例えば、高濃度では自己消光により蛍
光を示さないが、低部ｆｌｕ（１０−３Ｍ以下）で非常
に強い蛍光を発するカルボキシフルオレセイン、カルセ
イン、ローダミンＢのような蛍光性物資；リポソーム外
で酸化反応により発光するルミノールやルシフェリンの
ような発光性物質；可視域又は紫外域に特異的な吸収帯
を有する吸光性化合物（水溶生色素等）二酸化酵素の作
用により分解され、酸素消費又は過酸化水素生成をもた
らすグリコース、シュークロース等の糖類：テトラペン
チルアンモニウムのような比較的大きなイオン性化合物
：ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の
ような酵素類；メチルビオロゲンなどのラジカル化合物
等が挙げられる。これらの化学物は、検出方法、感度及
びリポソームの安定性等の因子を考慮した上で適宜選択
される。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソーム上に
固定化される抗体もしくは抗体の一部又は抗原は、蛋白
質又はペチプド（例えばＩＣＩＧ。

ＩＣＩＥ、ＩＣＩＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭ等の免疫グロブリ
ン；トランスアミナーゼ、乳酸脱水素酸素、タレアチン
ホスキナーゼ等の酵素類；α−フェトプロティン、癌胎
児性抗原（ＣＥＡ）等の癌マーカ；インスリン、成長ホ
ルモンなどのペチプドホルモン等）、糖質（例えば各種
ルイス抗原、）ｔルスマン抗原、微生物細胞壁多糖）、
核酸関連物質（例えばポリヌクレオチド、ヌクレオチド
、ヌクレオシド等）、脂質（例えばリボ蛋白質、カルシ
オリピン等）、その他低分子物質（ステロイドホルモン
、チロキシン、各種薬物等）から測定対象に応じて任意
に選ぶことができる。この時望ましくは、単独で抗体を
誘導することが困難な低分子抗原（ハプテン）以外は各
抗原に対応するＩＣＩＧ又はＩＱＭ等の抗体又は抗体の
一部をリポソーム上に固定化することが望ましい。

本発明に用いる免疫分析試薬において、リポソームに固
定化用官能基を導入するために脂質分子との反応が行わ
れる架橋剤、また必要に応じて抗体もしくは抗体の一部
または抗原に架橋基を導入するための架橋剤としては、
たとえば、Ｎ−サクシンイミジル３−（２−ピリジルジ
チオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）　、Ｎ−サクシンイ
ミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（Ｓ
ＭＰ８＞、Ｎ−サクシンイミジル４−（１）−マレイミ
ドフェニル）アセテート（ＳＭＰＡ）、Ｎ−サクシンイ
ミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）プロピオネート
（ＳＭＰＰ）　、Ｎ−＜ｒ−マレイミドブチリルオキシ
）サクシンイミド（ＧＭＢＳ）、＼−（εマレイミドカ
プロイルオキシ）サクシンイミド（６ＭＣ３）　、ジサ
クシンイミジルスベレート（ＤＳＳ＞　、グルタルアル
デヒド（ＧＡ）　、フタルアルデヒド、テレフタルアル
デヒド、フタル酸、テレフタル酸、 ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ　−ＣＯＯＮ　　（ｎ　＝１〜
ＩＯ＞の化学式で表わされる脂肪族ジカルボン酸等が挙
げられる。

で示され、温和な条件下で反応するチオール化及び分子
間（架橋）共１９体生成のためのへテロ−２官能試薬で
ある。

５ＰＤＰを架橋剤として用いる場合、リポソーム側に残
存する２−ピリジルジチオ基（Ｐ’ＤＴ＞が検体との非
特異反応を惹起する。５ＰＤＰは、予めホスファチジル
エタノールアミン（ＰＥ）のようなアミノ基を有するリ
ン脂質と反応させることによりそのサクシイミド側でＰ
Ｅと結合する。

これが官能基を導入したリン脂質：２−ピリジルジチオ
ホスファデジルエタノールアミン（ＰＤＴ・ＰＥ）であ
る。

上記リン脂質等を原料としてリポソームを形成後、抗体
笠の感作を行うがこの時抗体等には必要に応じて予めス
ルフィド（ＳＨ）基を導入しておくと、抗体側のＳＨ基
とリポソーム側のＰＤＴ基の間で交換反応が起り、抗体
がリポソームにジスルフィド結合で感作されると共に、
２−チオピリジン（Ｑ−８Ｈ）が遊離してくる。遊離し
た２−チオピリジンは遠心分離により除くことができる
。

抗体感作時、反応効率上リポソーム側にＰＤＴ・ＰＥを
過剰に入れておく必要かおる。即ち全脂質量の０．１〜
１０％望ましくは２．５％位が必要とされる。しかしな
がら導入されたＰＤＴ−ＰＥＷが全て抗体等の感作に利
用されるわけではなく、その大部分は未反応のまま抗体
等の感作後も存在する。この残余ＰＤＴが補体関与の非
特異溶解を惹起せしめる（第４図）。

そこで本発明省らは５ＰＤＰを用いる抗体感作法を以下
のように改良することにより、本体関与非特異反応の少
ない安定なリポソームを調製することができた。

即ち、ＰＥに導入された、ＰＤＴ基を予め還元剤例えば
ジチオスレイトール（ＤＴＴ＞、システィン（ＧＳ）、
グルタチオン（ＧＳＨ）、２−メカブトエタノール（２
−ＭＥｔ−Ｈ）、メルカプトエチルアミン等で還元し、
２−チオピリジン（ＴＰ）を遊離せしめ、脂質側の官能
基をＳＨとする。

尚、この反応はリポソーム形成後でも脂質段階でも行う
ことができる。また、官能基を導入していないＰＥでリ
ポソーム形成後５ＰＤＰ化し、還元処理を行っても構わ
ない。このとき、抗体等は従来法通り予め５ＰＤＰ化に
おくが、その後の還元処理をしないでも良い（第５図）
。

この場合、リポソーム側に残ったーＳＨ基は必要に応じ
てヨウ素等で酸化することができる。

５ＰＤＰを用いるリポソームへの抗体等の改良的感作方
法は上記例のみならず、他にもいくつか応用することが
できる。そのうち、２，３例を挙げると １）抗体等のアミノ基に従来通り５ＰＤＰを導入した後
、還元して一３Ｈ基を出させた後再び５ＰＤＰｆｆｉ理
を行い、抗体等にサクシイミド基を導入する。この活性
化された抗体等とＰＥを含むリポソームを接触せしめる
ことにより、リポソームに抗体等を感作する方法（第６
図）。

２）１）とは逆にリポソーム側のＰＥに従来通り５ＰＤ
Ｐを導入した後、還元し、再び５ＰＤｌｉ理することに
よりサクシイミド基を導入し、このサクシイミ基に入っ
たリポソームと無処理の抗体等を接触せしめることによ
り、リポソーム上に抗体等を感作する方法（第７図）。

尚、この場合、感作後残存するサクシイミド基がＰＤＴ
と同様に非特異反応を惹起するおそれがあるがその場合
にはグリシン等アミン化合物で容易にブロックすること
が可能である。

３）抗体フラグメント（Ｆ　（ａｂ’　））を感作する
場合には、抗体ヒンジ部の一３Ｈを利用することができ
る。即ち、常法により抗体からＦ　ａｂ’を調製し、５
ＰＤＰを作用させることによりヒンジ部のＳＨＩにサク
シイミド基が導入される。但しこの時、抗体フラグメン
ト（Ｆ　（ａｂ’　））側のアミノ基は適当な保書基で
ブロックしておく必要がある。

このようにして調製したサクシイミド基のついたＦ　ａ
ｂ’　とＰＥを入れたリポソームを接触させることによ
りリポソームにＦａｂ’　を感作することができる（第
８図）。

尚、この場合、予めＦａｂ’　に導入したアミノ基保調
基はリポソーム感作後、必要に応じてはずすことができ
るものを用いると良い。

本発明による改良された感作リポソームを用いる免疫分
析法は、以下のように実施される。即ちまず被検液を含
む試料（検体）に上記改良された感作リポソームよりな
る免疫分析試薬を加え、これと別に補体を加える。尚、
この際被検物質に対する第２抗体を加え被検物質を挟み
こむ方法を用いてもよい。この結果、被検物質とリポソ
ーム上に固定化された抗体もしくは抗体の一部又は抗原
との抗原−抗体反応及びそれに伴う補体の作用により、
リポソームが破壊されて封入されている標識物質（例え
ば蛍光性化合物）が流出する。この流出した標識物質の
母と、試料中の被検物質の弓との間には相関関係がある
ので、流出した標識物質を適当な分析方法（例えば蛍光
分析）によって定量することにより、被検物質を定量す
ることができる。

そして、実際の定量分析においては、予め既知の濃度の
被検物質を用いて検但線を作成しておき、これをもとに
して同一条件で未知の濃度の被検物質との反応により定
量分析を行う。

本発明に用いる免疫分析試薬と被検物質との十分な反応
に要する時間は、被検物質の種類、リポソームの特性２
反応条件、更にはりポソームに固定化された抗体もしく
は抗体の一部又は抗原の種類、純度、固定化形態等によ
って異なる。このため、個々の場合に応じて予め特定の
濃度に調製された被検物質と同種の物質を含む試料を用
いて予備測定を行うことにより、免疫分析試薬と被検物
質との最適反応時間を設定することが望ましい。

本発明に用いる免疫分析試薬によって定量が可能な被検
物質は、腫瘍マーカー（ＡＦＰ（α−フェトプロティン
）、ＢＦＰ（ｌ性フェトプロティン＞、ＣＥＡ（癌胎児
性抗原）、ＰＯＡ（肝癌胎児性抗原）等）、免疫グロブ
リン（ＩｇＧ。

ＩＱＥ、ＩＣＩＤ、ＩＣＩＡ、ＩＣＩＭ等）、ホルモン
（インシュリン、Ｔ３等）及び薬物等が埜げられ、その
対象は広範囲にわたる。

（実験例） 以下に本発明の詳細な説明する。

実験例１　ヒトフェリチンの測定 本実験例において用いた試薬のうち、ジパルミトイルホ
スファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ＞、ジパルミ
トイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）　、コレステ
ロール及びジチオトレイトール（ＤＴＴ＞はシグマ社製
のものを用いた。また、Ｎ−サイクシンイミジル３−（
２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）及び
セファデックスＧ−２５フアインはファルマシア社製の
ものを用いた。他の試薬は市販品（特級）を精製せずに
使用した。尚、水は全てインオン交換水を用いた。

■官能性リン脂質：　ＤＰＰＥ−ジチオピリジルプロピ
オン酸アミド（ＤＰＰＥ−ＤＴＰ＞の調製密栓付三角フ
ラスコにＤＰＰＥ７０ｍｆｆを分取し、クロロホルム／
メタノール（５：１）混合溶媒２５ｒｌに溶解した。次
に、トリエタノールアミン６０μ！及びＳＰＤＰ５０ｍ
ＦＩを添加し、窒素置換した後、室温で１時間反応させ
てジチオピリジルプロピオン酸アミド（ＤＴＰ）を導入
した。続いて、ロータリーエバポレータにより溶媒を除
去した。次いで、乾燥物をクロロホルム／メタノール（
１０：１）混合溶媒に溶解した後、シリカゲルカラムを
用いて精製し、ＤＰＰＥ−ＤＴＰの分画を回収した。更
に、ロータリーエバポレータにより約５ｍ１）まで濃縮
した。ＤＰＰＥ−ＤＴＰの収率は８０乃至９５％であっ
た。これを窒素封入して一２０’Ｃで保存した。

この反応によりＤＰＰＥに導入されたジチオピリジル基
が固定化用官能基となる。

■リポソームの調製 使用した脂質は全てクロロホルム又はクロロホルム／メ
タノール（２／１）混合媒液に溶解した。

５ｍＨのＤＰＰＣ２００，、ｃｌ、１ＱｍＨのコレステ
ロール１００．１及び１＋ｎＨのＤＰＰＥ−ＤＴＰ（■
で１ワられた官能性リン脂質＞５０ｕｌを１０ｍ１容母
のナシ型フラスコに入れ、更にクロロホルム２ｍ）を加
えてよく混合した。次に、約４０°Ｃの水浴中でロータ
リーエバポレータにより溶媒を除去した。再びクロロホ
ルム２ｍｌを加えて十分に撹拌した後、■度ロータリー
エバポレータにより溶媒を除去した。この操作を数回繰
り返すと、フラスコ壁面に脂質薄膜が形成された。続い
て、フラスコをデシケータ中に移して真空ポンプで約１
時間吸引し、溶媒を完全に除去した。

次いて、ｏ、２ｘ１のカルボキシフルオレセイン（イー
ストマン・コダック社製、ｐＨ７．４：以下、ＣＦと記
す＞１００，ＣＩを添加し、フラスコ内部を窒素で置換
した後、密栓して約６０’Ｃの水浴中′　　に約１分間
浸漬した。つづいて、ＶＯｒｔｅＸミキサーを用い、フ
ラスコ！面の脂質薄膜が完全に消失するまでフラスコを
激しく震盪した。この操作によりリポソーム懸濁液が調
整された。ざらにリポソーム懸濁液に０．１Ｍの）−Ｉ
　Ｅ　Ｐ　Ｅ　Ｓ緩衝液（０．　８５％Ｎａ（Ｊ！金含
有ｐＨ７．５ｉＸ下、ＨＢＳと記す）を少量添加した後
、全てを遠心チューブに移し、４℃において１５，ＯＯ
Ｏｒｐｍで２０分間遠心する操作を数回繰返した。リポ
ソームは湿重量で２５１Ｔ１ｇとれた。

■リポソーム還元 得られたリポソーム２５１１’Ｊｆｆ（湿重量）に１，
５ｍｙのジヂオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する。

ＨＢＳｌｍｆｆｌを加え、懸濁後ゆっくり撹拌しつ２０
℃，２０分間還元処理を行った。その後、リポソームを
遠心分離（１５，０００ｒｐｍ　、　２　０分間）しＨ
ＢＳで３回繰り返し洗浄を行い、過剰のＤＴＴ、並びに
分解物を除去した。

■抗ヒトフェリチン抗体の修飾 １１Ｑ／ｍＡの抗ヒトフェリチン抗体２ｍＪをＨＢＳで
希釈し、１０ｍＭのＳＰＤＰエタノール溶液１０μ象を
添加して窒素置換した後、室温で３０分間反応させ、抗
ヒトフェリチン抗体にジヂオピリジル基を導入した。次
に、予めＨ　Ｂ　Ｓで平衡化したセファデックスＧ−２
５フフインカラム（ゲル体積約１　５ｒｌ　）を用いた
ゲル濾過により未反応のＳＰＤＰを除去して精製し、蛋
白質分画のみを回収した。

■抗ヒトフェリチン抗体感作リボンームの調製■で得ら
れた還元リポソームのパックと■で得られた修飾抗ヒト
フェリチン抗体（Ａ２８０＝　１．５＞５００μ矛を混
合撹拌し、窒素置換した後、密栓して２０℃でゆっくり
振とうしながら１晩反応ざぜた。次に、ＨＢＳで洗浄し
て未反応の抗体を除去した。

このようにして得られたリポソーム試薬に、ゼア−）ン
ベロナ−ルバッ７７ノ−（ｐｔ１７．４Ｕ下ＧＶＢ−　
＞２ｍｌ及び”１０％ＮａＮ３２０ｕｌを添加して十分
に撹拌した後、窒素置換して４℃で保存した。

■リボンーム還元前後におけるヒト血清由来非特異溶解
の比較 ■て得られたりポンーム（還元前）及び■で得られたリ
ポソーム（いずれも抗体感作後）を用いてヒト血清に起
因するリポソームの非特異溶解にに及ぼす還元処理の効
果を調べた。予め従来型リポソームで非特異溶解を惹起
した血清５種類（Ｎ（１１１、１２．１４，１７．２２
）及び対照として、非特異溶解のない血清（ＮＱ１５）
、をとりＧＶＢ”で１０倍に希釈した。次にそれぞれの
検体を１０μｍずつ９６穴マイクロプレートに分注した
。そこに１０μでの還元前又は還元後のリポソーム懸濁
ｉ！２（ＧＶＢ＋で１０（８希釈）を１口え、撹拌後３
７°Ｃ，１０分間反応させた。次に８０倍に希釈した補
体５０μ象をそれぞれに添加した。尚、ここで対照とし
て補体の代りにＧＶＢ十を添加した系も作った、３７℃
．３０分間反応後０．０１　ＭのＥＤＴＡ−へロナール
緩衝液１００μ（で反応を停止させ、各濃度のヒトフェ
リチン液について、流出したＣＦｆｆｉをＭＴＰ−３２
蛍光分光器（コロナ電気装）により、励起波長４９０ｎ
ｍ、蛍光波長５２０１ｍの条件で測定した。

この測定に基づいて、抗体固定化リポソームの補体に対
する安定性の影響を除去するために、次式により相対蛍
光強度を計算した。

ここで、Ｆｅ：実測した蛍光強度、Ｆｏ　：ＧＶＢ＋十
の蛍光強度、Ｆａ：脱イオン水を添加しリポソームを全
て破壊した時の蛍光強度である。尚、標準値として、１
０−７Ｍ及び１０−８Ｎ１１のＣＦ溶液の蛍光強度を用
いた。

このようにして得られたヒト血清によるリボン−ムの非
特異溶解に対する還元処理の効果を第１図（ａ）、（ｂ
ンに示した。

図から明らかなように、いずれの検体においてもリポソ
ームを還元すると非特異溶解が抑制されることが明らか
にへった。

■血清中フェリチン測定 ■で得られた抗ヒトフェリチン抗体感作リポソームを用
い、血清ベースでのフェリチンのドーズ・レスポンスを
調べた。

予め内因性フェリチンを除去した正常ヒトプール血清（
ＮＨ３）所定倭のフェリチンを添加後ＧＶＢ”て１０倍
希釈した。それを検体として用い、それぞれ１０μｍを
マイクロブレージに分注した。■で得られた感作リポソ
ーム（１０倍希釈）１０μｌを加えた後、撹拌して３７
℃、１０分間反応させた。次に１０倍希釈した抗ヒトフ
ェリチン抗体（ウサギ）を２５μｐ及び２０倍希釈した
補体を２５μｌ添加し、撹拌後再び３７℃、３０分間反
応させた。最後に０．０１　Ｍ　ＥＤＴＡ／ベロールバ
ッファ（ｐｔ１７．４＞　１００μでで反応を止め■と
同様にして蛍光強度の測定を行った。

その結果を第２図に示した。図中フェリチンは１　ｎ（
１／ｍ）　〜１，００Ｏｎ（］／ｍＪ！に亘って測定可
能であった。尚、各点はｎ＝５で測定した平均値で現し
であるが、それぞれの制度はＣＶ＝８％以下でめった。

■ＲＩＡとの相関 ■で得られた検量線を基に、患者血清２１検体を用いて
ＲＩＡとの相関を求めた。測定は■に順にて行った。そ
の結果を第３図に示した。患者血清においても７−＝　
０．９１とＲＩＡと良好な相関を示した。

［発明の効果］ 以上詳述したように本発明の免疫分析法によれば、被検
物質を含む血清等の試料を過剰に希釈することなく分析
することができ、゛情密かつ簡便に被検物質を定量でき
る等顕著な効果を奏するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図（ａ＞、（ｂ）は本発明実施例のりボソーム還元
前後におけるヒト血清由来非特異反応の比較を示すグラ
フ、第２図は本発明実施例による血中フェリチン測定の
検量線を示すグラフ、第３図は本弁明分析法とＲＩＡと
のフェリチン測定の相関を示すグラフ、第４図乃至第８
図はいずれも本実施例を説明するための反応式でおる。 代理人　弁理士　三　　澤　　正　　義（ａ）’ａ隋前 （ｂ）’！元惇 第１図 手続補正書 特訂庁長官　殿 １、事件の表示 昭和６２年特許願第１１１９４３＠ ２、発明の名称 免疫分析法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 （ほか２名） ４、代理人 ５、補正命令の日付　　自　　発 明細１の発明の詳細な説明の欄ｌ〈ゴテ１乃ワゝ＼６、
補正の対象 ７、補正の内容 （１）明細書第３頁第１２行目の「化学物」を「化合物
」に訂正する。 （２）同上第５頁第１５行目の１とある」を「どなる」
に訂正する。 （３）同上第６頁第１２行目の「作用」の前に「で」を
挿入する。 （４）同上第８頁第４行目の「蛍光性物資」を「蛍光性
物質」に訂正する。 （５）同上箱１２行目の「ような」の後に「補」を挿入
する。 （６）明細書第９頁第４行目の「ペチプド」を「ペプチ
ド」に訂正する。 （７）同上第１０頁第１行目の「ピリジルジチオ」を「
ピリジルジチオ」に訂正する。 （７）同上第１１頁第８行目の「サクシイミド側」を「
サクシイミド側」に訂正する。 （８）同上第１３頁第３行目のｒｓＰＤＰ化に」をｒｓ
ＰＤＰ化して」に訂正する。 （９）同上筒１３行目及び第１９行目の「サクシイミド
基」を「サクシンイミド基」にそれぞれ訂正する。 ｑ○）同上第２０行目の「サクシミイド基」を「サクシ
ンイミド基」に訂正する。 ０１１　　明細書第１４頁１第３行目、第１１行目及び
第１４行目の１サクシイミド基」を「サクシンイミト基
」にそれぞれ訂正する。 （Ｉ２）同上第１７頁第４行目の「ジヂオト」を「ジチ
オス」に訂正する。 ａ３　　同上第１０行目の「インオン」を「イオン」に
訂正する。 （１４）　　明細書第２０頁第１行目の「撹拌しつ」の
後に「つ」を挿入する。 （１５１同上第２１頁第１５行目のｒＧＶＢ”　ｊの後
に下記文章を挿入する。 記 ｒ　（ＧＶＢ−に０．５ｍ）ｌのｎｇｃ＋２水溶液及び
０．１５聞のＣａＣＩ　２水溶液を含有したもの）」（
１６）同上第２３頁第１１行目のｒ　（ＮＨ８）Ｊの後
に「に」を挿入する。 （１７）同上第１２行目ｒＧＶＢ″＋」をｒＧＶＢ”　
Ｊに訂正する。 （１８）同上第１３行目の「マイクロブレージ」を１マ
イクロプレート」に訂正する。 （１９）同上第１９行目の［シＯＴへ／ベロール］をｒ
ＥＤＴＡ／ベロナール」に訂正する。 （２０）明細書第２４頁第４行目から第５行目にかけて
記載の「現しであるが、」を「表しであるが、」に訂正
する。 （２１）同上第５行目の１制度」を「精度」に訂正する
。 （２２）同上第９行目から第１０行目にかけて記載の「
順にて」を「準じて」に訂正する。 以上

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）リン脂質及び糖脂質のうち少なくともいずれか一
   方を組成とするリポソームと、該リポソーム中に封入さ
   れた標識物質と、前記リポソームに架橋法により固定化
   された抗体もしくは抗体の一部又は抗原とからなる免疫
   分析試薬を用いる免疫分析法において、リポソーム表面
   における検体由来の非特異反応を防止せしめることを特
   徴とする免疫分析法。
2. （２）リポソーム表面における補体関与の非特異反応誘
   引物質が（リポソームの組成に由来し）リポソーム表面
   への抗体又は抗原感作に用いられるものであり、予め当
   該物質から上記非特異反応に関与する部分のみ除くこと
   によって、上記非特異反応を回避することを特徴とする
   特許請求の範囲第１項記載の免疫分析法。
3. （３）リポソームがリン脂質及び糖脂質のうち少なくと
   もいずれか一方とコレステロールとからなることを特徴
   とする特許請求の範囲第１項記載の免疫分析法。