JPS63184063A - 抗ストレプトリジンｏの新規測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、リポソーム膜用いる抗ストレプトリジン０（
以下、ＡＳＬＯと略す。）価の新規測定法に関する。

〔従来の技術及びその問題点〕

ＡＳＬＯ価の測定は、溶連菌感染の既往の証明の為に広
く用いられている検査である。ストレプトリジン０（以
下、ＳＬＯと略す。）は連鎖球菌の産生ずる溶血性毒素
であって、抗原性を有している為に、Ａ群溶連菌の感染
が起こると種々の溶連菌体外毒素に対する抗体価が上昇
するので、それを見出すことにより溶連菌感染の既往を
証明できることになる。

ＡＳＬＯ価測定法として従来から行われている方法とし
ては、ウサギ、ヒツジ又はヒト０型赤血球を用いるラン
ノ・ランプール法及びマイクロタイター法がある。これ
らはいずれも抗原であるＳＬＯが検体血清中の抗体であ
るＡＳＬＯと反応してＳＬＯが有している溶血活性や細
胞破壊活性等の毒素活性を不活性化する所謂中和反応を
利用してＡＳＬＯ価の測定を行っている。しかしながら
、これらの方法では、必然的に動物やヒトの新鮮な赤血
球（極めて不安定である）を必要とする為、測定値間の
バラツキを生じ易く、また操作法も煩雑である。その上
、反応時間も比較的長い為、自動化は極めて困難である
。

一方、一種の沈降反応を利用した免疫比濁法による測定
法も開示されている（特開昭６１−２５０６２号公報等
。）。しかしながら、５ＬＯ−ＡＳＬＯの抗原抗体反応
による濁りは、他の抗原抗体反応のそれと比べて濁りの
度合が非常に小さい。その為、他の蛋白をも非特異的に
沈降させてしまうような所謂凝集促進剤等の添加物を加
える必要があシ、系の複雑化を伴い、自動化するには問
題が多く、また正確性にも欠ける。

〔発明の目的〕

本発明の目的は、赤血球のような不安定な物質を使用せ
ず、簡便で迅速且つ正確に測定ができ、自動化が可能な
ＡＳＬＯ価の新規測定法を提供することにある。

〔発明の構成〕

上記目的を達成する為、本発明は下記の構成から成る。

「標識物質を内包したリポソームと抗原であるストレプ
トリジンＯを用い、リポソーム膜がストレプトリジン０
によシ破壊されて放出される標識物質の量を測定するこ
とによシ抗ストレプトリジン０　（ＡＳＬＯ）価を測定
することを特徴とするＡＳＬＯ価の測定法。」 即ち、本発明者らは、自動化が可能なＡＳＬＯ価の簡便
、迅速且つ正確な測定法を求めて研究の途上、ＳＬＯが
その溶血活性、細胞破壊活性に基づきリポソームを破壊
する性質に着目、これをＡＳＬＯ価の測定に利用できな
いかと考え、鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成する
に到った。

本発明で用いられるリポソームとしては、従来からよく
知られている、リン脂質或は糖脂質と、コレステロール
及びその他の脂質との混合系のもの、或はこれらに更に
す、３５多糖（以下、ＬＰＳと略す。）又はＬＰＳ様化
合物を加えたもの等が挙げられる。リン脂質としては通
常用いられるジ・ξルミトイルフォスファチジルコリン
（ＤＰＰＣ）　、ノミリストイルフォスファチジルコリ
ン（ＤＭＰＣ）　、ジステアロイルフォスファチジルコ
リン（ＤＳＰＣ）等のアルキルエステル系のものや、例
えば、ジー０−へキサデシルフォスファチジルコリン、
ジーＯ−オクタデンルフォスファチノルコリン、ジドデ
シルフオスファチノルコリン等のようなアルキルエーテ
ル系のもの等いずれのものでもよいが、アルキルエーテ
ル系のものは一般に常温でも安定なリポソームを形成し
得るので、より好ましい。

リポソームに内包される標識物質としては、例えばアル
カリフォスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコ
ース−６−リン酸脱水素酵素等の酵素類、例えば、ＮＡ
Ｄ　、　ＮＡＤＰ　、　ＦＡＤ等の補酵素類、例エバ、
ルミノール、ル／フェリン等の発光性化合物、例えば、
カルボキシフルオレセイン等の螢光性化合物、例えば、
２，７−ビス（２−アルソノフェニルアゾ）　−１，８
−ジヒドロキシナフタレン−３，６−ノスルホン酸等の
色素類、例えばグルコース等の糖類、例えば、重クロム
酸カリ、重クロム酸ナトリウム、　ＮａＣｔ等のイオン
性化合物、例えば、ニトロキシド化合物等のラジカル性
化合物等が挙げられるがこれらに限定されるものではな
く、リポソームに封入可能で、ＡＳＬＯ測定に於てマー
カーとなり得るものであればいずれにても良い。

本発明で用いられるリポソームの調製法としては、従来
からよく知られているポルチクスイング法、超音波法、
界面活性剤法、逆相蒸発法（ＲＥＶ法）、エタノール注
入法、エーテル注入法、プレーベシクル（Ｐｒｅ−Ｖｅ
ｓｉｃｌｅ）法、フレンチプレスエクストルージョン（
Ｆｒｅｎｃｈ　Ｐｒｅｓｓ　Ｅｘｔｒｕｓｉｏｎ）法、
Ｃａ２＋融合法、アニーリング（Ａｎｎｅａｌｉｎｇ）
法、凍結融解融合法、凍結乾燥法、毀■準エマルジョン
法等の方法や、最近、Ｓ、Ｍ、　Ｇｒｕｎｅｒら［Ｂｉ
ｏ（ｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２４　＋２８３３（１９８５
））によシ報告された５ｔａｂｌｅ　Ｐｌｕｒｉｌａ−
ｍｅｌｌａｒ　Ｖｅｓｉｃｌｅ法（５ＰＬＶ法）などの
方法、更には、内包量の大きな６巨大リポソーム（Ｇｉ
ａｎｔ　Ｌｉｐｏｓｏｍｅ）”と言われているり４ソー
ムを調製する方法など、自体公知のリポソームの調製法
は全て挙げられる。

また、ＬＰＳ又はＬＰＳ様化合物を含むリポソームの調
製法は、本発明者らが先に特許出願した特願昭６２−１
２３５４２号明細書に記載の方法に準じてこれを行えば
よい。尚、ＬＰＳ様化合物とは、ＬＰＳそのものに何ら
かの化学修飾を施した化合物で、例えばその糖鎖部分を
酸化したもの、アセチル化。

サクシニル化、フタロイル化等の化学的処理を行ったも
のや、ＬＰＳと高い親和性をもつポリミキシンや塩基性
感光色素であるカルボシアニン型色素との複合体などを
言う。

本発明の測定法に於て用いられるリポソーム。

標識物質、　ＳＬＯ等の使用量を最終反応液（反応停止
液を使用する測定法に於ては、反応停止液を添加する前
の反応液）中の濃度として示すと下記の如くなる。リポ
ソームの量はリン脂質量として通常５〜５００　ｎ　ｍ
ｏｌ／　ｍｌ　、好ましくは３０〜１００１００ｎ／ｍ
ｌである。ＩＪ　、４ソームに内包される標識物質の量
は標識物質の種類により異なり、−律ではないが、例え
ばアルカリフォスファターゼ（以下、ＡＰと略す。）の
場合は、通常０．０２〜０．６　ｕｎｉｔ／ｍＡ’　、
好ましくは０１〜０．２　ｕｎ　ｉ　ｔ／　ｒｒｔｌで
ある。ＳＬＯの量は、リポソームの種類によシ変動する
為、特に限定されるものではないが、通常、０．５〜１
００μη讐の範囲が好ましく用いられる。また、本発明
の測定法に於て、標識物質として酵素を用いる場合に使
用される基質量は、使用される酵素や基質の種類によシ
異なり一律ではないが、例えばＡＰを用いる場合には、
基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸の基質溶液中の濃
度として通常０．５〜１０　ｍＭ　、好ましくは２〜５
鯛である。

本発明で用いられる緩衝液は、リン酸緩衝液、ホウ酸緩
衝液、グツＰ緩衝液（ＨＥＰＥＳ　、　ＰＩＰＥＳ　、
迎Ｓ等）、Ｔｒｉｓ緩衝液等、通常用いられる緩衝液が
全て使用可能である。また、添加剤として牛血清アルブ
ミン（ＢＳＡ）　、ゼラチン等の蛋白質や、糖、キレー
ト剤、還元剤などを適宜添加する等は任意である。但し
、ＳＬＯは水溶液中では比較的不安定であるので、ＳＬ
Ｏを安定化する為に、ＳＬＯ溶液に用いられる緩衝液中
にはＢＳＡ　、ゼラチン等の蛋白質を添加しておくこと
が好ましい。その添加量は特に限定されないが、通常、
緩衝液中に０．０５〜２．Ｏｗ／ｖチ程度添加される。

本発明の測定法について、例えば、ＡＰを標識物質とし
て内包したリポソームを用い、基質としてｐ−ニトロフ
ェニルリン酸を用いた場合を例に挙げて述べると以下の
如くなる。

即ち、先ず、検体とＳＬＯを混合して１〜１ｏ分間程度
ブレインキュベートし、これてリポソームを加えた後、
或は検体とＳＬＯとリポソームとを混合した後、５〜３
０分間インキュベートし、次いでこれに基質であるｐ−
ニトロフェニルリン酸を加えて、更に５〜３０分間イン
キュベートした後、反応停止剤（例えば、ＮａＯＨ、Ｋ
ＯＨ等）を加えて反応を停止させ、４１０　ｎｍの吸光
度を測定する。或は、検体に全試薬（即ち、ＳＬＯとリ
ポソームと基質）を同時に作用させ、５〜３０分間イン
キュベートした後、反応停止剤を加えて反応を停止させ
、４１０　ｎｍの吸光度を測定する。

上記いずれの方法で行うも可であるが、操作が簡便で短
時間に測定が出来るという点では後者の方法が優れてい
る。

標識物質として酵素を用いる場合には、最終反応液を所
定時間予備加温した後に、或は検体、リポソーム溶液及
びＳＬＯ溶液の混液を所定時間予備加温し、更にそれに
基質を加えた後に、単位時間当りの吸光度の変化量を測
定することによっても、ＡＳＬＯの測定を行うことがで
きる。

本発明の測定法は用手法に限らず、自動分析装置を用い
た測定法にも充分利用可能であり、容易に且つ迅速に測
定を行うことができる。尚、自動分析装置を用いて測定
を行う場合の試薬の組合せ等については特に制約はなく
、機種に合せて、或は他の要因を考慮に入れて、最もよ
いと思われる試薬の組合せを適宜選定して用いればよい
。

以下に参考例、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
するが、本発明はこれら参考例、実施例によシ何ら限定
されるものではない。

〔実施例〕

参考例１、　リン脂質としてジーＯ−ヘキサデシルフォ
スファチジルコリンを用いたリポソームの調製 ジー０−ヘキサデシルフォスファチノルコリンのクロロ
ホルム溶Ｗ　（２０ｍＭ　）　３２５μｌ、コレステロ
ールノクロロホルム溶液（２０ｍＭ　）　３２５μｌＪ
及ヒジパルミトイルフオスフアチジルグリセロールのり
ｏｏホルム／メタノール（９５：５）溶液（６ｍＭ　）
８５μｌを試験管に入れて混合し、ロータリーエバポレ
ーターで溶媒を留去した。デシケータ−中で２時間乾燥
させた後、クロロホルムとジエチルエーテルを夫々０．
５　ｍｌずつ加え、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）溶
液〔シグマ社製５０００　ｕｎｉｔ／　２．５　ｍｌの
０．０１Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（Ｎ−２−ヒＰ口キシエチル
ピペラジン−Ｎ′−エタンスルホン酸）緩ｉｉ溶液、ｐ
Ｈ７，４〕８０μｇを添加してポルテックスミキサーで
激しく攪拌した。４３〜４８℃の水浴中、ロータリーエ
バポレーターで濃縮して有機溶媒を留去し、０．ＯＩＭ
　ＨＥＰＥＳ緩衝液１　ｍｌを加えてポルテックスミキ
サーで均一に分散するまで攪拌した。これを遠沈管シて
移し、４℃、３４０００ｒｐｍで４０分間×５回超遠心
処理を繰り返して上清を除き、ペレットに０、　ＯＩ　
Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液２　ｒｕｇを加えて懸濁させ、４
℃で保存した。

参考例２．　　ＬＰＳ−リポソームの調製参考例１に於
ける脂質溶液に、新たにリポ多糖（ＬＰＳ）　０．５　
ｍ９をりｏロホルム／メタノール（１：１）１　ｒｒｔ
ｌに懸濁させた液を加えた以外は参考例１．と全く同様
にして、ＡＰを内包したＬＰＳ−リポソームを調製した
。

参考例３．　　ＬＰＳ−ＤＰＰＣ−リポソームの調製ジ
パルミトイルフォスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）のク
ロロホルム溶液（２０ｍＭ　）　２　扉１　（！：コＶ
　ステｏ　−ルのクロロホルム溶液（２０ｒｒｕＭ）　
２ｒｎｌヲ丸底フラスコに入れて混合し、ロータリーエ
バポレーターで溶媒を留去した。更に真空ポンプで、約
２時間デシケータ−中で真空乾燥を行い、脂質の薄膜を
フラスコ壁面に作製した。この薄膜をＬＰ　Ｓ　０．６
　ｍ９７ｍ１を含むｎ−オクチルグルコシド（２００ｍ
Ｍ　）　０．６　ａｔ及び０．　ＯＩ　Ｍ　ＨＥＰＥＳ
緩衝液（ｐＨ７，４）を加えて水和させ、ポルテックス
ミキサーで均一に分散するまで攪拌した。その後ＡＰ水
溶液（２０００ｕｎｉｔ／ｍ／！　）　２５０μｌを添
加して、しばらく攪拌混合した後、５０℃で０．　ＯＩ
　Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析した。約２時間後
、リポソームの懸濁液を遠沈管に移し、４℃、３５００
０ｒｐｍで４０分間×５回超遠心処理を繰り返して上清
を除き、ベレットに０、ＯＩ　Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液５
　ｍ／！を加えて懸濁させ、４℃で保存した。

参考例４．　　ＬＰＳ−卵黄レシチン−リポソームの調
製 参考例３に於けるＤＰＰＣを卵黄レシチン（１，４ｗｔ
％　）に代え、透析時の温度を５０℃から室温に代えだ
以外は参考例３と全く同様にして、ＡＰを内包したリポ
ソームを調製した。

参考例５．　　ＬＰＳ−ＤＰＰＣ−卵黄レシチン−リポ
ソームの調製 参考例３に於けるＤＰＰＣを卵黄レシチン（１，４ｗｔ
％）１、５　ｍｌ及びＩ）ＰＰＣ（２０ｍＭ）　０．５
　ｍｌに代え、ＡＰ水溶液量を２５０μｌから１．５　
ｍｌに代えた以外は参考例３と全く同様にして、ＡＰを
内包したリポソームを調製した。

実施例１゜ 参考例１で得たリポソーム懸濁液１０μｌに各種濃度の
ＡＳＬＯ溶液２０μＡ！％ＳＬＯ溶液（濃度１　ｍｙ／
ｍｌ　）２０μｌ及び２　ｍＭ　ｐ−ニトロフェニルリ
ン酸二ナトリウム溶液４００μｌを加え、３７℃で３０
分間インキュベーンヨンを行った後、０．　Ｉ　Ｎ　Ｎ
ａＯＨ溶液１，５尻ｌを加えて反応を停止し、４１０　
ｎｍの吸光度を測定した。結果を第１図に一〇−で示す
。

実施例２゜ 参考例２で得たＬＰＳ　−ＩＪポソーム懸濁液１０μｌ
を用いた以外は実施例２と全く同様にして測定を行い、
第１図に−・−で示す如き結果を得た。

実施例３゜ 各種濃度のＡＳＬＯ溶液２０μｌに参考例３で得たリポ
ソーム懸濁液２０　μｉを加えて５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ
Ｃトリス（ヒＰ口キシメチル）アミノメタン〕−ＨＣｌ
　緩衝液（ｐＨ７，８）で２００　μｉｔに希釈したも
のに、ＳＬＯの所定濃度溶液を２０μｌ加え、更に２ｍ
Ｍのｐ−ニトロフェニルリン酸溶液４００μｌを加えた
。３７℃で２０分間インキュベーションを行った後、０
．ｌＮＮａＯＨ溶液２ｒｎｌを加えて反応を停止し、４
１０　ｎｍの吸光度を測定した。ＡＳＬＯ価（Ｔｏｄｄ
単位）と相対吸光度（ＡＳＬＯ無含有試料により得られ
る吸光度を１００とした時の値）（（８）との関係を第
２図に示す。

尚、第２図に於て、−・−は１〜／ｍｌのＳＬＯ溶液を
使用した場合の、−〇−は０．５ｍ９／ｒｙｌのＳＬＯ
溶液を使用した場合の、−合一は０．２５■／ＷＬｌの
ＳＬＯ溶液を使用した場合の結果を夫々示す。

実施例４ 参考例４で得たリポソーム懸濁液１０μｌを５０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ　−ＨＣＬ緩衝液（ｐＨ７，８、０，１％ＢＳ
Ａ−ゼラチン含有）で２０倍希釈したもの２００μｌに
、同じ緩衝液で希釈したＳＬＯのｐ−ニトロフェニルリ
ン酸二ナトリウム溶液４００μｌ　（ＳＬＯ量：２μ？
）を加え、３７℃で３０分間インキュベーションを行っ
た後、０．　Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ溶液２　ｒｎｌを加えて
反応を停止し、４１０　ｎｍの吸光度を測定した。結果
を第３図（、）に示す。

実施例５゜ リポソーム溶液及びＳＬＯの基質溶液の、希釈緩衝液中
のＢＳＡ量を変えた以外は実施例４と全く同様にして測
定を行った。結果を第３図（ｂ）　、　（Ｃ）及び（ｄ
）に示す。尚、（ｂ）は０．２５％ＢＳＡ含有の場合を
、（Ｃ）は０．５％ＢＳＡ含有の場合を、（ｄ）は１．
０チＢＳＡ含有の場合の結果を夫々示す。

この結果から明らかな如く、希釈緩衝液中のＢＳＡ量に
よって本発明の測定法は特に影響を受けないことが判る
。

実施例６゜ 日立７０５０型自動分析装置を使用してＡＳＬＯ価の測
定を行った。

先ず検体５μｅと第１試薬Ｒ１［参考例５で得たリポソ
ーム懸濁液２　ｔｔｌを５０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣ
１緩衝液（０，１７％ＢＳＡ・ゼラチン含有）で３５０
μｌに希釈したもの〕３５０μｌとを混合してブランク
補正を行い、５分後に第２試薬Ｒ２（ＳＬＯ量＝０５μ
２．基質濃度：　２　ｍＭ　）　２５０１１１を加え、
更に５分後、４１５ｎｍ　（７００ｎｍ）での１分間当
りの吸光度変化量を測定した。本法でのＡＳＬＯ価の検
量線を第４図に示す。第４図に於て、横軸はＡＳＬＯ価
（Ｔｏｄｄ単位）、縦軸は検体の代わりに生理食塩水を
用いた場合の反応液を対照として測定した、４１５　ｎ
ｍに於ける１分間当りの吸光度変化量を示す。また、本
法と従来法（ランク・ランプール法）との相関を第５図
に示す。

〔発明の効果〕

以上述べた如く、本発明は、リポソームを用いるＡＳＬ
Ｏ価の新規測定法を提供するものであり、本発明の方法
によれば、赤血球のような不安定な物質を使用する必要
がなく、簡便で、迅速且つ正確な測定を行うことができ
、自動化が可能な点に顕著な効果を奏する発明である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１及び実施例２で得られた検量線を示し
、横軸はＡＳＬＯ価（Ｔｏｄｄ単位）を表わし、縦軸は
４１０　ｎｍに於ける吸光度を表わす。但し、。 −〇−は実施例１の、−・−は実施例２の結果を夫々示
す。第２図は実施例３に於ける結果を示し、横軸はＡＳ
　ＬＯ価（Ｔｏｄｄ単位）、縦軸はＡＳＬＯ価０での吸
光度（４１０ｎｍ）を１００としたときの相対吸光度（
ＡＳＬＯ無含有試料によシ得られる吸光度を１００とし
だときの値戸（イ）を示す。図の−・−は１勿旬のＳＬ
Ｏ溶液を使用した場合の、−〇−は０．５Ｑ／ｍ／！の
ＳＬＯ溶液を使用した場合の、−☆−は０．２５　ｍ９
／ｍｌのＳＬＯ溶液を使用した場合の結果を夫々示す。 第３図（ａ）は実施例４、第３図（ｂ）　、　（ｅ）及
び（ｄ）は実施例５で得られた結果を夫々示し、（ｂ）
、は０．２５％ＢＳＡ含有の場合の、（ｃ）は０．５％
ＢＳＡ含有の場合の、（ａ）は１．０％ＢＳＡ含有の場
合の結果を夫々示す。図中、横軸はＡＳＬＯ価（Ｔｏｄ
ｄ単位）、縦軸は４１０　ｎｍに於ける吸光度を夫々示
す。第４図は実施例６で得られた検量線を示し、横軸は
ＡＳＬＯ価（Ｔｏｄｄ単位）、縦軸は検体の代わりに生
理食塩水を用いた場合の反応液を対照として測定した、
４１５　ｎｍに於ける１分間当りの吸光度変化量を示す
。第５図は本法（実施例６の方法）と従来法（ランク・
ランプール法）との相関図を示す。 特許出願人　　和光純薬工業株式会社 第１図 ＡＳＬＯ＠　　（Ｔｏｄｄ　単ａ） 第　２　図 ＡＳＬＯイｆｆＩ　　（Ｔｏｄｄ＊イ尤【）○ ：、　　　　　　　ヴ　４Ｆ２　　璽 Ｏ 汗 腎　　永　　輛 Ｋ　　　　　　　―　架　剖 ｒつ 腎　　七　翼 第４図 ＡＳＬＯイｆｂ　（Ｔｏｄｄ＊イａ＞ 第５図

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）標識物質を内包したリポソームと抗原であるスト
   レプトリジンＯを用い、リポソーム膜がストレプトリジ
   ンＯにより破壊されて放出される標識物質の量を測定す
   ることにより抗ストレプトリジンＯ（ＡＳＬＯ）価を測
   定することを特徴とする、ＡＳＬＯ価の測定法。
2. （２）標識物質が酵素、補酵素、発光性化合物、螢光性
   化合物、色素、糖類、イオン性化合物、ラジカル性化合
   物である、特許請求の範囲第１項記載の測定法。