WO2005073718A1 - 胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法 - Google Patents

胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2005073718A1
WO2005073718A1 PCT/JP2004/018722 JP2004018722W WO2005073718A1 WO 2005073718 A1 WO2005073718 A1 WO 2005073718A1 JP 2004018722 W JP2004018722 W JP 2004018722W WO 2005073718 A1 WO2005073718 A1 WO 2005073718A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
fluorescent dye
ribosome
screening method
nsaids
Prior art date
Application number
PCT/JP2004/018722
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Toru Mizushima
Yutaka Mizushima
Original Assignee
Ltt Bio-Pharma Co., Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ltt Bio-Pharma Co., Ltd. filed Critical Ltt Bio-Pharma Co., Ltd.
Priority to EP04807081A priority Critical patent/EP1710574A4/en
Priority to US10/597,483 priority patent/US20080113014A1/en
Priority to JP2005517386A priority patent/JPWO2005073718A1/ja
Publication of WO2005073718A1 publication Critical patent/WO2005073718A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5076—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving cell organelles, e.g. Golgi complex, endoplasmic reticulum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5014—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing toxicity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/5432—Liposomes or microcapsules
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention evaluates and selects a compound or a salt thereof, which is safe for gastric mucosa and has few so-called side effects of gastrointestinal disorders, particularly an anti-inflammatory compound or a salt thereof, or a gastric mucosal protective substance. And a screening method.
  • non-steroidal anti-inflammatory drugs are drugs that exert excellent anti-inflammatory effects, but have side effects such as gastrointestinal ulcers, especially when gastric tract disorders and other side effects are significant. Is a major problem in clinical practice. That is, the use of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) is cited as the most major cause of gastric ulcer and gastritis at present.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2003-207507
  • the present invention provides a screen for selecting a compound or a salt thereof, which is safe for gastric mucosa and has few side effects of gastrointestinal disorders, and particularly a non-steroidal anti-inflammatory compound or a salt thereof. It is an object to provide a method.
  • one basic aspect of the present invention specifically includes
  • the fluorescent dye is selected from luciferin, rhodamine or a fluorescein derivative
  • the present invention provides, as still another aspect,
  • test compound is a compound having an anti-inflammatory effect
  • the screening method according to (7), wherein the compound having an anti-inflammatory action is a non-steroidal anti-inflammatory compound or a steroidal compound;
  • test compound is a compound having a protective effect on gastric mucosa
  • the present invention provides:
  • the present invention further provides a ribosome having a cell membrane model used in the screening method described above as another embodiment.
  • the phospholipid used as a cell membrane model is selected from phosphatidylcholine, phosphatidinoregylglycerolone, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidinoleethanolamine or cardiolipin.
  • the screening method provided by the present invention makes it possible to detect the membrane damage of a drug by using a simple cell membrane model. Therefore, by using the screening method provided by the present invention, it is possible to easily measure the membrane toxicity of a test compound, in particular, the membrane toxicity of a compound having a nonsteroidal anti-inflammatory effect (NSAIDs). As a result, it has the advantage of being able to develop clinically extremely useful NSAIDs that are safe for the gastric mucosa and have no gastric mucosal damage.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory effect
  • FIG. 1 is a graph showing the correlation between the cytotoxicity (necrosis) of 10 types of NSAIDs, which was determined by the decrease in cell viability, and the membrane toxicity of the ribosome model of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the correlation between the cytotoxicity (apoptosis) of 10 types of NSAIDs, which was observed in the decrease in cell viability, and the membrane toxicity of the ribosome model of the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram showing a part of the results of Example 2 of the present invention.
  • FIG. 4 is a view showing a part of the results of Example 2 of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the leakage rate of calcein when indomethacin and teprenone are used in combination in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph showing the leakage rate of calcein when diclofenac and teprenone are used in combination in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 7 is a graph showing the leakage rate of calcein when celecoxib and teprenone are used in combination in Example 3 of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the leakage rate of luciferin when ibuprofen and teprenone are used in combination in Example 3 of the present invention.
  • a ribosome composed of a phospholipid is used as a ribosome encapsulating a fluorescent dye having cell membrane permeability.
  • NSAIDs' membrane damage is thought to be mainly due to the disruption of the membrane barrier property in the lipid part of the cell membrane, so that ribosomes composed of phospholipids are created and the ribosomes are created.
  • Fluorescent dyes are encapsulated in the tube, and the ribosomes are allowed to react with NSAIDs.
  • the degree of membrane damage of NSAIDs can be determined.
  • fluorescent dyes examples include luciferin, rhodamine, and fluorescein derivatives. Among them, calcein can be preferably used. Force lucein is a fluorescent dye that is widely used for measuring cytotoxic activity, stains viable cells, and has no cytotoxicity.
  • Examples of the phospholipid constituting the ribosome membrane include phosphatidinorecolin, phosphatidylglycerol, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, and cardiolipin. it can.
  • One of these phospholipids may constitute the ribosome membrane, or a plurality thereof may constitute the ribosome membrane.
  • the present invention is to measure the degree of damage to the ribosome membrane when a test compound is reacted with the ribosome membrane composed of phospholipids. If possible, the gastric mucosa should be replaced with a ribosome membrane using phospholipids.
  • one question is whether there is a correlation between gastric mucosa and ribosome membranes using phospholipids. According to the study by the present inventors, for example, it was confirmed that the cytotoxicity of NSAIDs in terms of the decrease in cell viability due to necrosis / apoptosis and the membrane toxicity by a ribosome model are well matched.
  • the direct cytotoxicity of NSAIDs was caused by the membrane toxicity of NSAIDs. That is, for the 10 NSAIDs that have been clinically used so far, the cytotoxicity seen in the decrease in cell viability (cytotoxicity seen in the decrease in cell viability due to necrosis Z apoptosis) The degree of membrane damage by the ribosome model was compared. As a result, as shown in Figs. 1 and 2, the cytotoxicity and the membrane toxicity corresponded extremely well, and it was confirmed that the cause of the direct cytotoxicity was caused by the membrane toxicity of NSAIDs. Was done.
  • the cytotoxicity of NSAIDs can be determined by the determination of membrane toxicity using ribosome, which is a cell membrane model provided by the present invention.
  • the present inventor has previously found that the cause of gastric ulcer-induced side effects is direct cytotoxicity of NSAIDs, and considered that a cell membrane model without direct cytotoxicity is safe for gastric mucosa. Advocates. And, as mentioned above, this direct cytotoxic cause
  • NSAIDs are membrane-toxic
  • a screening method for NSAIDs that is safe for gastric mucosa using the cell membrane model provided by the present invention can be specifically performed as follows. That is, the ribosome, which is a fluorescent dye, for example, a phospholipid force that encapsulates luciferin, is reacted with NSAIDs to be screened at various concentrations, and leakage of luciferin from ribosomes (ie, ribosome membrane The degree of injury (leakage due to injury) can be measured by measuring the fluorescence at 520 nm.
  • the ribosome which is a fluorescent dye, for example, a phospholipid force that encapsulates luciferin
  • indomethacin, diclofenac, celecoxib, or ibuprofen which is known as a membrane-damaging NSAIDs, and teprenone, an anti-ulcer drug having a gastric mucosal protective action
  • ibuprofen which is known as a membrane-damaging NSAIDs
  • teprenone an anti-ulcer drug having a gastric mucosal protective action
  • the above-described screening method is mainly a method for screening NSAIDs, but the screening method provided by the present invention is not limited to NSAIDs, and is a drug safe for gastric mucosa, ie, gastric mucosal damage. It goes without saying that compounds with no sex can be widely screened.
  • Egg yolk-derived phosphatidylcholine (10 mol, 7.7 mg) was dissolved in a mixed solution of black-mouthed form / methanol (1: 2) and dried. Then, it was dissolved in 1.5 mL of getyl ether, and mixed with 1 mL of 100 mM aqueous lucein-sodium hydroxide-containing aqueous solution (pH 7.4). Subsequently, the getyl ether was removed to obtain a ribosome solution containing luciferin.
  • NSAIDs known indomethacin, ibuprofen, ketoprofen, diclofenac, flurbiprofen, mefenamic acid, flufenamic acid, celecoxib, etodolac and dimesulide, which are clinically used, were obtained and obtained in Example 1 above.
  • concentrations were added to the ribosome solution and reacted at 30 ° C for 10 minutes.
  • leakage of luciferin from the ribosome was measured.
  • indomethacin diclofenac> flurbiprofen> ibuprofen> It is said that the order is ketoprofen.
  • the degree of leakage of luciferin from ribosomes is also the order, and by evaluating the degree of leakage of luciferin (membrane damage) from liposomes, the evaluation of nonsteroidal anti-inflammatory compounds safe for gastric mucosa It was well understood that was done.
  • the NSAIDs shown in FIG. 4 ie, mefenamic acid, flufenamic acid, celecoxib,
  • the strength of gastric mucosal cytotoxicity is in the order of celecoxib> mefenamic acid> flufenamic acid>dimesulide> etodolac.
  • the degree of leakage of the ribosome force, luscein is also in that order, and as in the results shown in Fig. 3, by evaluating the degree of leakage of the force lucein from the liposome (membrane damage), the gastric mucosa It was well understood that safe non-steroidal anti-inflammatory compounds could be evaluated.
  • Window Window 3: NSAIDs in the stomach of the stomach stomach Kusabusa ffl) ⁇ Leakage of lucine from the liposome due to combined use
  • NSAIDs Known indomethacin, diclofenac, celecoxib, and ibuprofen, which are clinically used, were selected as NSAIDs, and leakage of luciferin from liposomes in combination with gastric mucosal protective substances was examined.
  • the concentration of NSAIDs to be added was a concentration that markedly causes cell membrane damage.
  • Indomethacin was added at 6 mM, diclofenac at 4 mM, celecoxib at 0.08 mM, and ibuprofen at 20 mM.
  • Teprenone as gastric mucosa protective agents (trade name Selbex (R)), no additive (control), 10 7, 10 6, 10 5, and 10 4 M were respectively used in combination.
  • test solution was added to the ribosome solution obtained in Example 1 at each test concentration, reacted at 30 ° C for 10 minutes, and the fluorescence of the reaction solution at 520 nm was measured. Damage) was measured.
  • Figure 5 shows the leakage rate of lucein when 6 mM indomethacin and teprenone were used in combination at different doses.Force S, the leakage of calcein was suppressed depending on the combined use of teprenone. It turns out that there is.
  • FIG. 6 shows the leakage rate of luciferin when diclofenac 4 mM and teprenone were used in combination at different doses
  • FIG. 7 shows celecoxib 0.08 mM and teprenone at the same dose
  • Fig. 8 shows the leakage rate of lucine when different doses of ibuprofen were used together with different doses of teprenone. In each case, the leakage of force lucine was suppressed depending on the dose of teprenone used in combination.
  • the concentrations of the four NSAIDs to be added were 4 and 8 mM for indomethacin, 2 and 10 mM for diclofenac, 0.05 and 0.1 lmM for celecoxib, and 40 and 60 mM for ibuprofen.
  • the same experiment was performed with a change in force. When used in combination with force teprenone, leakage of force lucein from the ribosome (membrane damage) was suppressed.
  • NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory action

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

　胃粘膜に対して安全であり、消化管傷害の副作用が少ない化合物またはその塩、とくに非ステロイド系抗炎症化合物またはその塩を選択するスクリーニング方法を提供することであり、蛍光色素、特にカルセインを内封するとともに、フォスファチジルコリン、フォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール等のリン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソームを使用し、当該リポソームと試験化合物を反応させ、リポソームからの蛍光色素の漏出の程度を評価することを特徴とする、胃粘膜に安全な化合物、特に非ステロイド系抗炎症化合物のスクリーニング方法である。

Description

明 細 書
胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、胃粘膜に対して安全である、いわゆる消化管障害の副作用が少ない化 合物またはその塩、特に抗炎症化合物またはその塩、あるいは胃粘膜保護作用物 質を評価 ·選択するスクリーニング方法等に関する。
背景技術
[0002] 抗炎症薬のなかでも非ステロイド系抗炎症薬 (NSAIDs)は、優れた抗炎症作用を発 揮する薬物であるが、消化管障害等の副作用が大きぐとくに胃潰瘍を誘発させる副 作用が臨床の現場で大きな問題となっている。すなわち、現在において最も主要な 胃潰瘍、胃炎の原因としては、非ステロイド系抗炎症薬 (NSAIDs)の使用があげられ ている。
[0003] し力 ながらその一方で、高齢化社会の進展に伴い、 NSAIDsの投与を必要とする 患者も今後増え続けることが予想される。事実、高齢者の増加とともに、腰痛症、骨 粗鬆症、慢性関節リウマチなどの症状の緩和に NSAIDsの使用が増加傾向にある。 したがって、 NSAIDsによる胃潰瘍の誘発を抑えた、胃粘膜傷害の副作用が無い NSAIDs,すなわち胃粘膜に安全な NSAIDsを開発することは、重要なことであるとい る。
[0004] 本発明者は、先に NSAIDsが有する胃潰瘍誘発の副作用の原因が、 NSAIDsの直接 細胞傷害性作用であることを発見し、直接細胞傷害性のない NSAIDsは、胃粘膜に 対し安全で有用な薬になるという考え方を提案してきている (特許文献 1)。
特許文献 1：特開 2003 - 207507号公報
[0005] すなわち、細胞膜におけるシクロォキシゲナーゼの作用を阻害し、胃粘膜防御因 子であるプロスタグランジンを減少させること、かつネクローシスおよび/またはアポト 一シス誘導阻害活性を有する直接細胞傷害性作用の無い NSAIDsが、胃潰瘍誘発 等の副作用を有しない化合物であるとの考え方に基づき、胃粘膜細胞傷害性と、胃 粘膜でシクロォキシゲナーゼの作用の阻害性の両者を指標にしたスクリーニング方 法を提案してきている。
[0006] 本発明者は、その考え方をベースにさらに研究を重ねた結果、 NSAIDsの直接細胞 障害性作用の原因が NSAIDsの膜傷害性にあることを新規に見出し、さらに、その膜 傷害性を簡便に検出し得る細胞膜モデルの作成に成功した。したがって、かかる細 胞膜モデルを用いて、 NSAIDsの膜傷害性の有無を判定することにより、胃粘膜に対 して安全な NSAIDsを検索することが可能となる。
また、この細胞膜モデルを使用すれば、 NSAIDsのみならず、胃粘膜に対して安全 な薬物、すなわち胃粘膜保護作用物質を広く検索することが可能となる。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] し力 て本発明は、胃粘膜に対して安全であり、消化管障害の副作用が少ない化 合物またはその塩、とくに非ステロイド系抗炎症化合物またはその塩を選択するスクリ 一二ング方法を提供することを課題とする。
課題を解決するための手段
[0008] 力かる課題を解決するため、本発明の一つの基本的態様は、具体的には；
(1)蛍光色素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソ ームを使用し、当該リボソームと試験化合物を反応させ、リボソームからの内封された 蛍光色素の漏出の程度を評価することを特徴とする、胃粘膜に安全な化合物のスク リーユング方法；
(2)細胞膜モデルとして使用するリン脂質力 フォスファチジルコリン、フォスファチジ ノレグリセローノレ、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチ ジノレエタノールァミンまたはカルジォリピンから選択されるものである上記（1)に記載 のスクリーニング方法；
(3)蛍光色素の漏出の程度を当該蛍光色素の励起波長の蛍光を測定することにより 行う上記（1)または（2)に記載のスクリーニング方法；
(4)蛍光色素が力ルセイン、ローダミンまたはフルォレセイン誘導体から選択されるも のである上記（1)ないし（3)に記載のスクリーニング方法；
であり、特に好ましくは、 (5)蛍光色素として力ルセインを使用する上記（1)ないし（3)に記載のスクリーニング 方法；
(6)力ルセインの漏出の程度を、 520nmの蛍光を測定することにより行う上記（5)に 記載のスクリーニング方法である。
[0009] 本発明はさらに別の態様として、
(7)試験化合物が、抗炎症作用を有する化合物である上記（1)ないし (6)のずれか に記載のスクリーニング方法；
(8)抗炎症作用を有する化合物が、非ステロイド系抗炎症化合物またはステロイド系 化合物である上記（7)に記載のスクリーニング方法；
(9)試験化合物が、胃粘膜保護作用を有する化合物である上記（1)ないし (6)のい ずれかに記載のスクリーニング方法；
でもある。
[0010] さらに本発明は、また別の態様として、
(10)上記した（7)または（8)に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜に安全な 抗炎症性化合物またはその塩；
(11)上記した（9)に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜保護作用物質； である。
[0011] さらに本発明は、別の態様として上記したスクリーニング方法に使用する細胞膜モ デルを有するリボソームを提供するものでもあり、具体的には、
(12)胃粘膜傷害作用を有する化合物をスクリーニングするために使用する、蛍光色 素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリボソーム；
(13)蛍光色素が力ルセイン、ローダミンまたはフルォレセイン誘導体から選択される ものである上記（12)に記載のリボソーム；
(14)細胞膜モデルとして使用するリン脂質が、フォスファチジルコリン、フォスファチ ジノレグリセローノレ、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファ チジノレエタノールァミンまたはカルジォリピンから選択されるものである上記（12)に 記載のリボソーム；
である。 発明の効果
[0012] 本発明が提供するスクリーニング方法は、簡便な細胞膜モデルを使用することによ り、薬物の膜傷害性を検出することが可能となる。したがって、本発明が提供するスク リーニング方法を使用することにより、試験化合物の膜傷害性、特に非ステロイド系抗 炎症作用を有する化合物（NSAIDs)の膜傷害性を簡単に測定することができ、その 結果、胃粘膜に安全であり、胃粘膜障害の無い、臨床的に極めて有用な NSAIDsを 開発し得る利点を有してレ、る。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]10種類の NSAIDsに関して、その細胞生存率の低下で見た細胞傷害性 (ネクロ 一シス）と、本発明のリボソームモデルによる膜傷害性の相関関係を示す図である。
[図 2] 10種類の NSAIDsに関して、その細胞生存率の低下で見た細胞傷害性（アポト 一シス）と、本発明のリボソームモデルによる膜傷害性の相関関係を示す図である。
[図 3]本発明の実施例 2の結果について、その一部を示す図である。
[図 4]本発明の実施例 2の結果について、その一部を示す図である。
[図 5]本発明の実施例 3におけるインドメタシンとテプレノンを併用した場合のカルセィ ンの漏出率を示した図である。
[図 6]本発明の実施例 3におけるジクロフエナックとテプレノンを併用した場合のカル セインの漏出率を示した図である。
[図 7]本発明の実施例 3におけるセレコキシブとテプレノンを併用した場合のカルセィ ンの漏出率を示した図である。
[図 8]本発明の実施例 3におけるイブプロフェンとテプレノンを併用した場合の力ルセ インの漏出率を示した図である。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 本発明で使用する細胞膜モデルとしては、細胞膜透過性を有する蛍光色素を内封 したリボソームとして、リン脂質で構成されたリボソームを使用するものである。すなわ ち、 NSAIDsの膜傷害性は、細胞膜の脂質部分における膜のバリアー性を破壊するこ とが主な作用であると考えられることから、リン脂質で構成されたリボソームを作成し、 そのリボソームに蛍光色素を内封してやり、力、かるリボソームと NSAIDsを反応させるこ とにより、リボソームからの蛍光色素の漏出の程度を評価すれば、 NSAIDsの膜傷害 性の程度が判明できることとなる。
[0015] そのような蛍光色素としては、力ルセイン、ローダミンまたはフルォレセイン誘導体 等をあげること力 Sできる。そのなかでも力ルセイン（calcein)を好ましく使用することが できる。力ルセインは、細胞傷害活性の測定に汎用されている蛍光色素であり、生細 胞を染色し、細胞毒性の無い蛍光色素である。
[0016] また、リボソーム膜を構成するリン脂質としては、フォスファチジノレコリン、フォスファ チジルグリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスフ ァチジルエタノールァミン、カルジォリピン等を挙げることができる。これらのリン脂質 は一種類を用いてリボソーム膜を構成してもよぐまた複数種用いてリボソーム膜を構 成してもよい。
[0017] したがって、本発明はリン脂質から構成されるリボソーム膜に対し、試験化合物を反 応させた場合におけるそのリボソーム膜の損傷程度の度合を測定することを手段とす るものであり、言うなれば、胃粘膜を、リン脂質を使用したリボソーム膜に置き換えて 試験しょうとするものである。
したがって、胃粘膜とリン脂質を使用したリボソーム膜との間の相関性が存在するか どうかが一つの問題となる。本発明者の検討によれば、例えば、 NSAIDsにおけるネク ローシス/アポトーシスによる細胞生存率の低下でみた細胞傷害性と、リボソームモ デルによる膜傷害性は良く一致していることが確認された。
[0018] また、本発明者の検討によれば、 NSAIDsの直接細胞傷害性の原因が、 NSAIDsの 膜傷害性にあることは以下の事実から証明された。すなわち、これまでに臨床的に使 用されている 10種類の NSAIDsに関して、その細胞生存率の低下で見た細胞傷害性 (ネクローシス Zアポトーシスによる細胞生存率の低下でみた細胞傷害性）と、上記し たリボソームモデルによる膜傷害性の程度を対比した。その結果、図 1および 2に示 すように、その細胞傷害性と膜傷害性は極めて良く対応しており、直接細胞傷害の 原因が、 NSAIDsの膜傷害性に存在するものであることが確認された。すなわち、細 胞傷害性の高レ、NSAIDsは、膜傷害性も高レ、ものであり、細胞傷害性が弱レ、NSAIDs は、膜傷害性も弱いという対応が確認された (相関係数: 0. 91)。 [0019] 以上のように、本発明が提供する細胞膜モデルであるリボソームを使用する膜傷害 性の判定により、 NSAIDsの細胞傷害性を判定することができることとなる。ところで、 本発明者は先に、胃潰瘍誘発の副作用の原因が、 NSAIDsの直接細胞傷害性である ことを見出し、直接細胞傷害性のない細胞膜モデルは、胃粘膜に安全であるという考 え方を提唱している。そして、上記したように、この直接細胞傷害性の原因が、
NSAIDsの膜傷害性にあるという事実からみれば、本発明が提供する細胞膜モデルを 用いた膜傷害性の度合を測定することにより、胃粘膜に安全な NSAIDsをスクリーニン グすることが可能となるのである。
[0020] 本発明が提供する細胞膜モデルを用いた、胃粘膜に安全な NSAIDsのスクリーニン グ方法は、具体的には以下のようにして行うことができる。すなわち、蛍光色素である 、例えば力ルセインを内封するリン脂質力 構成されるリボソームと、スクリーニングす るべき NSAIDsを種々の濃度で反応させ、リボソームからの力ルセインの漏出（すなわ ちリボソーム膜の傷害による漏出）の程度を、 520nmの蛍光を測定することにより行う こと力 Sできる。
[0021] 本発明が提供する細胞膜モデルを用いた、胃粘膜に安全な化合物のスクリーニン グ方法の妥当性は、蛍光色素を内封するリン脂質力 構成されるリボソームと、例え ば、膜障害性のある NSAIDsと共に、粘膜保護作用物質を添加させることにより、リポ ソームに内封された蛍光色素の漏出が抑制される事実からも、立証された。
[0022] すなわち後記する実施例から判明するように、例えば、膜障害性のある NSAIDsとし て知られているインドメタシン、ジクロフエナック、セレコキシブあるいはイブプロフェン と、胃粘膜保護作用のある抗潰瘍薬であるテプレノン (商品名：セルベックス (登録商 標））を併用して、本発明の蛍光色素である力ルセインを内封したリボソームと反応さ せると、併用したテプレノンの用量に依存して、リボソームからの力ルセインの漏出が 抑制された。
[0023] この事実は、胃粘膜保護作用物質であるテプレノンが細胞膜の傷害性を防止する ことによって NSAIDsの膜傷害作用を軽減させていることに他ならない。したがって、 本発明が提供する細胞膜モデルを用いた膜傷害性の度合を測定することにより、胃 粘膜に安全な化合物、特に NSAIDsをスクリーニングすることができることを証明して いるのである。
[0024] なお、上記したスクリーニング方法は、主に NSAIDsのスクリーニング方法であるが、 本発明が提供するスクリーニング方法は、 NSAIDsにのみ限定されず、胃粘膜に対し て安全な薬物、すなわち胃粘膜障害性のない化合物を広くスクリーニングすることが できることはいうまでもない。
実施例
[0025] 以下に本発明を、具体的実施例により説明する。
実施例 1：力ルセイン内封リボソームの作成
卵黄由来のフォスファチジルコリン（10 mol、 7. 7mg)を、クロ口ホルム/メタノー ノレ（1 : 2)混合液に溶解後、乾燥させた。その後 1.5mLのジェチルエーテルに溶解さ せ、 lmLの lOOmM力ルセイン-水酸化ナトリウム含有水溶液（pH7. 4)と混合した。 次いでジェチルエーテルを除去し、力ルセインを内封したリボソーム溶液を得た。
[0026] 実施例 2 :種々の公知の NSAIDsとの反応によるリボソームからの力ルセインの漏出
NSAIDsとして、臨床的に使用されている公知のインドメタシン、イブプロフェン、ケト プロフェン、ジクロフエナック、フルルビプロフェン、メフエナム酸、フルフエナム酸、セ レコキシブ、エトドラクおよび二メスリドを選択し、上記実施例 1で得たリボソーム溶液 中に種々の濃度で添加し、 30°Cにて 10分間反応させた。反応液の 520nmの蛍光 を測定することにより、リボソームからの力ルセインの漏出（膜傷害）を測定した。 その結果を、図 3 (インドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフヱナックお よびフルルビプロフェンにつての結果）および図 4 (メフヱナム酸、フルフエナム酸、セ レコキシブ、エトドラクおよび二メスリドについての結果）にまとめて示した。
[0027] 図 3に示した NSAIDsであるインドメタシン、イブプロフェン、ケトプロフェン、ジクロフ ェナックおよびフルノレビプロフェンにつては、胃粘膜細胞傷害性の強さは、インドメタ シン〉ジクロフエナック〉フルルビプロフェン〉イブプロフェン〉ケトプロフェンの順で あるとされている。リボソームからの力ルセインの漏出の程度もその順であり、リポソ一 ムからの力ルセインの漏出（膜傷害性)の程度を評価することにより、胃粘膜に安全な 非ステロイド系抗炎症化合物の評価ができていることが良く理解された。
[0028] また、図 4に示した NSAIDsであるメフエナム酸、フルフエナム酸、セレコキシブ、エト ドラクおよび二メスリドについては、胃粘膜細胞傷害性の強さは、セレコキシブ >メフ ェナム酸 >フルフエナム酸 >二メスリド >エトドラクの順であるとされてレ、る。リボソーム 力 の力ルセインの漏出の程度もその順であり、図 3に示した結果と同様に、リポソ一 ムからの力ルセインの漏出（膜傷害性）の程度を評価することにより、胃粘膜に安全な 非ステロイド系抗炎症化合物の評価ができていることが良く理解された。
[0029] 窗列 3 :禾重々の么 の NSAIDs 胃 草保謝乍 ffl ) 》f并用した によるリポソ ームからの力ルセインの漏出
NSAIDsとして、臨床的に使用されている公知のインドメタシン、ジクロフヱナック、セ レコキシブおよびイブプロフェンを選択し、胃粘膜保護作用物質との併用によるリポソ ームからの力ルセインの漏出を検討した。
[0030] 方法：
添加する NSAIDsの濃度としては、細胞膜傷害を顕著に生じさせる濃度とし、インドメ タシンについては 6mMを、ジクロフエナックについては 4mMを、セレコキシブについ ては 0· 08mMを、イブプロフェンについては 20mMを添加した。
胃粘膜保護作用物質としてテプレノン (商品名：セルベックス (登録商標)）を用い、 無添加（コントロール）、 10—7、 10—6、 10— 5、および 10— 4Mをそれぞれ併用した。
上記実施例 1で得たリボソーム溶液中にそれぞれの試験濃度で添加し、 30°Cにて 10分間反応させ、反応液の 520nmの蛍光を測定することにより、リボソームからの力 ノレセインの漏出 (膜傷害)を測定した。
[0031] 結果：
図 5—図 8にその結果を示した。
図 5は、インドメタシン 6mMとテプレノンをその用量を変化させて併用した場合の力 ルセインの漏出率を示したものである力 S、併用するテプレノンの用量に依存してカル セインの漏出が抑制されているのが判明する。
[0032] また、図 6は、ジクロフヱナック 4mMとテプレノンをその用量を変化させて併用した 場合の力ルセインの漏出率を示したものであり、図 7は、セレコキシブ 0. 08mMとテ プレノンをその用量を変化させて併用した場合の力ルセインの漏出率を示したもので あり、図 8は、イブプロフェン 20mMとテプレノンをその用量を変化させて併用した場 合の力ルセインの漏出率を示したものである力 いずれの場合にあっても、併用する テプレノンの用量に依存して力ルセインの漏出が抑制されていた。
[0033] なお、添加する 4種類の NSAIDsの濃度について、インドメタシンについては 4およ び 8mM、ジクロフエナックについては 2および 10mM、セレコキシブについては 0. 0 5および 0. lmM、イブプロフェンについては 40および 60mMと変化させて同様の 実験を行った力 テプレノンと併用することでリボソームからの力ルセインの漏出（膜 傷害）が抑制されていた。
産業上の利用可能性
[0034] 以上記載のように、本発明により、極めて簡便な細胞膜モデルを使用することにより 、試験化合物、特に非ステロイド系抗炎症作用を有する化合物 (NSAIDs)の膜傷害 性を検出することが可能となる。したがって、本発明のスクリーニング方法を使用する ことにより、 NSAIDsの膜傷害性を簡単に測定することができることから、胃粘膜に安 全な、胃粘膜傷害の無い、臨床的に極めて有用な NSAIDsをはじめとする化合物を 開発し得る利点を有してレ、る。

Claims

請求の範囲
[I] 蛍光色素を内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリポソ ームを使用し、当該リボソームと試験化合物を反応させ、リボソームからの内封された 蛍光色素の漏出の程度を評価することを特徴とする、胃粘膜に安全な化合物のスク リーユング方法。
[2] 細胞膜モデルとして使用するリン脂質力 フォスファチジルコリン、フォスファチジル グリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジ ルエタノールァミンまたはカルジォリピンから選択されるものである請求項 1に記載の スクリーニング方法。
[3] 蛍光色素の漏出の程度を当該蛍光色素の励起波長の蛍光を測定することにより行 う請求項 1または 2に記載のスクリーニング方法。
[4] 蛍光色素が力ルセイン、ローダミンまたはフルォレセイン誘導体から選択されるもの である請求項 1ないし 3のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[5] 蛍光色素として力ルセインを使用する請求項 1ないし 3のいずれかに記載のスクリー ユング方法。
[6] 力ルセインの漏出の程度を、 520nmの蛍光を測定することにより行う請求項 5に記 載のスクリーニング方法。
[7] 試験化合物が、抗炎症作用を有する化合物である請求項 1ないし 6のいずれかに 記載のスクリーニング方法。
[8] 抗炎症作用を有する化合物が、非ステロイド系抗炎症化合物またはステロイド系化 合物である請求項 7に記載のスクリーニング方法。
[9] 試験化合物が、胃粘膜保護作用を有する化合物である請求項 1ないし 6のいずれ かに記載のスクリーニング方法。
[10] 請求項 7または 8に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜に安全な抗炎症性 化合物またはその塩。
[II] 請求項 9に記載のスクリーニング方法で得られる胃粘膜保護作用物質。
[12] 胃粘膜傷害作用を有する化合物をスクリーニングするために使用する、蛍光色素を 内封するとともに、リン脂質で構成された細胞膜モデルを有するリボソーム。
[13] 蛍光色素が力ルセイン、ローダミンまたはフルォレセイン誘導体から選択されるもの である請求項 12に記載のリボソーム。
[14] 細胞膜モデルとして使用するリン脂質力 フォスファチジルコリン、フォスファチジル グリセロール、フォスファチジルセリン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジ ルエタノールァミンまたはカルジォリピンから選択されるものである請求項 12に記載 のリボソーム。
PCT/JP2004/018722 2004-01-28 2004-12-15 胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法 WO2005073718A1 (ja)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP04807081A EP1710574A4 (en) 2004-01-28 2004-12-15 SCREENING METHOD FOR A SAFE CONNECTION FOR MAGNIFYING SKIN
US10/597,483 US20080113014A1 (en) 2004-01-28 2004-12-15 Method for Screening for Compounds Safe for Gastric Mucosa
JP2005517386A JPWO2005073718A1 (ja) 2004-01-28 2004-12-15 胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2004-019439 2004-01-28
JP2004019439 2004-01-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2005073718A1 true WO2005073718A1 (ja) 2005-08-11

Family

ID=34823717

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2004/018722 WO2005073718A1 (ja) 2004-01-28 2004-12-15 胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20080113014A1 (ja)
EP (1) EP1710574A4 (ja)
JP (1) JPWO2005073718A1 (ja)
WO (1) WO2005073718A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008128826A (ja) * 2006-11-21 2008-06-05 Shiseido Co Ltd 皮膚バリア機能回復剤評価方法及び評価キット

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63184063A (ja) * 1986-09-24 1988-07-29 Wako Pure Chem Ind Ltd 抗ストレプトリジンｏの新規測定法
JPH07191033A (ja) * 1993-12-27 1995-07-28 Hitachi Electron Eng Co Ltd リポソームを用いた免疫測定法
JP2003207507A (ja) * 2001-10-29 2003-07-25 Takeda Chem Ind Ltd スクリーニング方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912208A (en) * 1987-06-29 1990-03-27 Abbott Laboratories Fluorophores for encapsulation into liposomes
WO1992007959A1 (en) * 1990-11-05 1992-05-14 Biowhittaker Inc. Homogeneous membrane lytic immunoassay method utilizing contact sensitive liposome formulations
JPH11171796A (ja) * 1997-12-08 1999-06-29 Ohta Pharmaceut Co Ltd テプレノン経口投与用製剤およびその製造方法
PT1272225E (pt) * 2000-04-12 2007-01-31 Liplasome Pharma As Sistema à base de lípidos para orientação de agentes de diagnóstico

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS63184063A (ja) * 1986-09-24 1988-07-29 Wako Pure Chem Ind Ltd 抗ストレプトリジンｏの新規測定法
JPH07191033A (ja) * 1993-12-27 1995-07-28 Hitachi Electron Eng Co Ltd リポソームを用いた免疫測定法
JP2003207507A (ja) * 2001-10-29 2003-07-25 Takeda Chem Ind Ltd スクリーニング方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2008128826A (ja) * 2006-11-21 2008-06-05 Shiseido Co Ltd 皮膚バリア機能回復剤評価方法及び評価キット

Also Published As

Publication number Publication date
EP1710574A1 (en) 2006-10-11
JPWO2005073718A1 (ja) 2008-01-10
EP1710574A4 (en) 2008-09-17
US20080113014A1 (en) 2008-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Nunes et al. NSAIDs interactions with membranes: a biophysical approach
Lin et al. An in situ intracellular self-assembly strategy for quantitatively and temporally monitoring autophagy
Prasuhn et al. Quantum dot peptide biosensors for monitoring caspase 3 proteolysis and calcium ions
Denisov et al. A mitochondria-targeted protonophoric uncoupler derived from fluorescein
Hu et al. Revisiting imidazolium receptors for the recognition of anions: Highlighted research during 2010–2019
Khanal et al. Phenylboronic-acid-modified nanoparticles: potential antiviral therapeutics
JP6057710B2 (ja) リンパ節イメージング用蛍光プローブ
Yang et al. ZW800‐PEG: A renal clearable Zwitterionic near‐infrared fluorophore for potential clinical translation
KR101927054B1 (ko) 시스-테트라하이드로스피로(사이클로헥산-1,1'-피리도[3,4-b]인돌)-4-아민 유도체
Suwalsky et al. Acetylsalicylic acid (aspirin) and salicylic acid interaction with the human erythrocyte membrane bilayer induce in vitro changes in the morphology of erythrocytes
Saraswat et al. Noncovalent conjugates of ionic liquid with antibacterial peptide melittin: an efficient combination against bacterial cells
Chen et al. Selective recognition of chloride anion in water
Thakur et al. Photophysical and photodynamical study of ellipticine: an anticancer drug molecule in bile salt modulated in vitro created liposome
JP5559529B2 (ja) 蛍光プローブ
Li et al. Activatable fluorescent-photoacoustic integrated probes with deep tissue penetration for pathological diagnosis and therapeutic evaluation of acute inflammation in mice
WO2005073718A1 (ja) 胃粘膜に安全な化合物のスクリーニング方法
Zhan et al. Endoplasmic reticulum peroxynitrite fluctuations in hypoxia-induced endothelial injury and sepsis with a two-photon fluorescence probe
Lv et al. Assembly of BODIPY-carbazole dyes with liposomes to fabricate fluorescent nanoparticles for lysosomal bioimaging in living cells
WO2010114901A1 (en) Method of controlled drug release from a liposome carrier
Chen et al. The effective taste masking of alkaloids by a water-soluble terphen [3] arene
JP5353509B2 (ja) 新規錯体化合物、並びにそれを用いた酸素濃度測定試薬および癌の診断薬
Ding et al. Lumiracoxib (novartis)
Barešic et al. Survival after severe acute chromic acid poisoning complicated with renal and liver failure
US20100285611A1 (en) Photobleaching resistant ph sensitive dye nanoreactors with dual wavelength emission
EP3464293B1 (en) Molecular probes for detection and imaging of pancreatic cancer

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS JP KE KG KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NA NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IS IT LT LU MC NL PL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2005517386

Country of ref document: JP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2004807081

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 10597483

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWW Wipo information: withdrawn in national office

Country of ref document: DE

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2004807081

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10597483

Country of ref document: US