PT1272225E - Sistema à base de lípidos para orientação de agentes de diagnóstico - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"SISTEMAS À BASE DE LÍPIDOS PARA ORIENTAÇÃO DE AGENTES DE DIAGNÓSTICO"

ÁREA DA INVENÇÃO A invenção refere-se à orientação de agentes de diagnóstico (aqui geralmente referidos como "etiquetas") utilizando composições à base de lípidos. A invenção refere-se à utilização de composições à base de lipidos para a preparação de uma composição de diagnóstico que é útil no diagnóstico de várias perturbações associadas ou resultantes de niveis acrescidos de actividade da PLA2 extracelular no tecido doente, por exemplo, cancro, estados infecciosos e inflamatórios.

CONTEXTO DA INVENÇÃO A imagiologia de diagnóstico é amplamente utilizada na medicina contemporânea. Requer a obtenção de uma intensidade de sinal apropriada de uma área de interesse para diferenciar certas estruturas de tecidos envolventes, independentemente da técnica utilizada. Como notado por Torchilin (1998), a imagiologia envolve a relação entre as três dimensões espaciais da região de interesse e uma quarta dimensão, o tempo, que se refere à farmacocinética do agente e ao período de tempo necessário para obter a imagem. As propriedades físicas que podem ser utilizadas para criar uma imagem incluem emissão ou absorção de radiação, momentos e relaxação magnéticos nucleares e transmissão ou reflexão de ultra -sons. De acordo com os princípios físicos aplicados, as técnicas de imagiologia presentemente utilizadas incluem γ-cintigrafia (envolvendo a aplicação de materiais radioactivos que emitem raios γ); 2 ressonância magnética (MR, fenómeno baseado na transição entre diferentes niveis de energia de núcleos atómicos sob a acção de um sinal de radiofrequência); tomografia computorizada (CT, a técnica que utiliza radiação ionizante com o auxilio de computadores para obter imagens cruzadas do corpo e imagens tridimensionais de áreas de interesse), e ultra-sonografia (US, a técnica que utiliza irradiação com ultra-sons e que se baseia nas diferentes velocidades com que os ultra-sons passam através de vários tecidos). As quatro técnicas de imagiologia diferem quanto aos seus princípios físicos, sensibilidade, resolução (espacial e temporal), capacidade para fornecer imagens sem intensificação mediada por agentes de contraste e alguns outros parâmetros, tais como custo e segurança. Habitualmente, a imagiologia de diferentes órgãos e tecidos para a detecção precoce e localização de numerosas patologias não pode ser bem sucedida sem agentes de contraste apropriados (ver mais à frente) em diferentes procedimentos de imagiologia.

Para melhorar a formação de imagens utilizam-se agentes de contraste. Estes agentes são as substâncias que conseguem absorver certos tipos de sinal (irradiação) muito mais fortemente do que tecidos envolventes. Os agentes de contraste são específicos para cada técnica de imagiologia (ver Tabela 1) e, devido à sua acumulação em certos sítios de interesse, esses sítios podem ser facilmente visualizados quando se aplica a técnica de imagiologia apropriada. 3

Tabela 1 Técnicas de imagiologia e concentração requerida de fracções de diagnóstico Técnica de imagiologia Fracção de diagnóstico Concentração requerida Gama-cintigrafia Radionuclidos de diagnóstico, como 111 In, 99mTc, 67Ga; IO"10 M 10'1UM Imagiologia de ressonância magnética (MR) Iões paramagnéticos, como Gd e Mn, e óxido de ferro 10'4M Imagiologia de tomografia computorizada (CT) Ultra-sonografia Iodo, bromo, bário Gás (ar, árgon, azoto) 10"2M de: Torchilin (1998) A concentração em tecidos que se deve atingir para se obter imagiologia bem sucedida varia de técnica para técnica e com as fracções de diagnóstico, ver tabela 1. Em muitos casos, a imagiologia mediada por agentes de contraste baseia-se na capacidade de alguns tecidos (isto é, tecidos ricos em macrófagos) para absorver as substâncias em partículas. Este processo depende da dimensão das partículas e baseia-se num equilíbrio ténue entre partículas suficientemente pequenas para entrarem nos capilares sanguíneos ou linfáticos mas suficientemente grandes para ficarem retidas no tecido. Em qualquer uma das técnicas de imagiologia utilizam-se duas vias principais de administração do agente de contraste: sistémica e via circulação local. Cada uma tem as suas próprias vantagens e desvantagens. Ao variar as propriedades físico-químicas de um contraste, ou transportador de contraste, pode modular-se a velocidade do seu desaparecimento do sítio da injecção por administração local. Uma desvantagem da administração sistémica é o facto de aumentar a exposição de órgãos diferentes do alvo a um agente de contraste potencialmente tóxico. 4

Lipossomas

Para facilitar a acumulação de contraste na zona requerida, foram sugeridos vários sistemas de microparticulas como transportadores para agentes de contraste. Entre esses transportadores, os lipossomas, vesículas fosfolipídicas artificiais microscópicas, chamam especial atenção devido às suas propriedades facilmente controladas e boas características farmacológicas. Muitos lípidos individuais e suas misturas, quando suspensos numa fase aquosa, formam espontaneamente estruturas em bicamadas (lipossomas) nas quais as partes hidrófobas das suas moléculas estão viradas para dentro e as partes hidrófilas estão expostas à fase aquosa que as rodeia. Existem vários tipos diferentes de lipossomas; cada tipo tem características específicas e pode ser preparado por métodos específicos. A classificação usual de lipossomas baseia-se na sua dimensão e número de bicamadas concêntricas que formam uma única vesícula (tais como vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares, LUV, pequenas vesículas unilamelares (SUV)) . Os métodos de produção de LUVs podem ser facilmente escalados de forma crescente e utilizados para a produção industrial de grandes lotes de lipossomas com uma dimensão previsível e uma distribuição de dimensões estreita.

Desde há quase duas décadas que os lipossomas têm sido reconhecidos como transportadores promissores para fármacos e agentes de diagnóstico pelos seguintes motivos: (1) os lipossomas são completamente biocompatíveis; (2) podem encerrar praticamente qualquer fármaco ou agente de diagnóstico no seu compartimento interno de água ou na própria membrana, dependendo das propriedades físico-químicas do fármaco; (3) agentes farmacêuticos incorporados em lipossomas estão protegidos do efeito de inactivação de 5 condições externas e, ao mesmo tempo, não provocam reacções secundárias indesejáveis; (4) os lipossomas também fornecem uma oportunidade única de distribuir agentes farmacêuticos para o interior de células ou mesmo para o interior de compartimentos celulares individuais. Para diferentes finalidades de distribuição in vivo, a dimensão, carga e propriedades de superfície dos lipossomas podem ser facilmente alteradas simplesmente por adição de novos ingredientes à mistura de lípidos antes da preparação dos lipossomas e/ou por variação dos métodos de preparação.

Infelizmente, os lipossomas fosfolipídicos, se introduzidos na circulação, são muito rapidamente sequestrados (a semi-eliminação dá-se num período de tempo habitual de 30 minutos) pelas células do sistema reticuloendotelial (RES). As células do fígado são as principais responsáveis e o sequestro é relativamente dependente da sua dimensão, carga e composição dos lipossomas. Monócitos do sangue periférico em circulação também podem proceder à endocitose de lipossomas e, mais tarde, infiltrar tecidos e distribuir lipossomas que foram submetidos a endocitose em certas áreas patológicas do corpo.

Até recentemente, o potencial dos lipossomas como transportadores de fármacos tem sido limitado pela rápida eliminação dos lipossomas da corrente sanguínea. Por exemplo, os lipossomas convencionais podem ser maioritariamente eliminados da corrente sanguínea num período de 1-2 horas após a administração intravenosa.

Foi proposta uma variedade de abordagens para prolongar o tempo de circulação dos lipossomas. Duas destas foram bem sucedidas no prolongamento do tempo de semi-vida dos 6 lipossomas na corrente sanguínea por períodos de tempo até 40-50 horas. Numa abordagem, descrita na Patente U.S. N° 4 837 028, os lipossomas são formulados com o gangliósido GMi e, predominantemente, lípidos rígidos. Noutra abordagem geral, revelada na Patente U.S. N° 5 013 556, os lipossomas são revestidos com uma camada de cadeias de polietilenoglicol (PEG). A imagiologia dos órgãos mais ricos em macrófagos do RES, fígado e baço, foi a primeira efectuada com lipossomas contendo contraste, pois os órgãos do RES são os alvos naturais de lipossomas e acumulam-nos eficientemente por administração intravenosa. A imagiologia de diagnóstico do fígado e baço destina-se habitualmente à descoberta de tumores e metástases nesses órgãos, bem como de certas irregularidades do fluxo sanguíneo e processos inflamatórios. Foi descrita a utilização de pelo menos três técnicas diferentes de imagiologia para este fim, nomeadamente imagiologia de γ, MR e CT.

Imagiologia de tumores com lipossomas de contraste

Uma área de aplicação potencial importante de lipossomas contendo contraste é a imagiologia de tumores. O mecanismo principal da acumulação de lipossomas em tumores dá-se via extravasamento, através de capilares de tumores com fugas, para o espaço intersticial. Tal como em muitos outros casos, a eficácia dessa acumulação pode ser acentuadamente aumentada utilizando lipossomas revestidos com PEG de circulação prolongada. Já foram utilizados com êxito agentes de imagiologia à base de lipossomas para imagiologia de tumores de γ, MR, CT e sonográfica. Lipossomas etiquetados com índio 111 para imagiologia 7 tumoral (VesCan®, Vestar, Inc.) já estão na Fase II-III de ensaios clínicos.

Formulações de lipossomas também podem ser utilizadas para a visualização de sítios com inflamação e infecção. A utilização de agentes de imagiologia em micropartículas para a visualização de sítios com infecção e inflamação baseia-se na capacidade das micropartículas para sofrerem extravasamento a partir da circulação e se acumularem naqueles sítios, de modo semelhante ao que já descrevemos para tumores e tecidos que sofreram enfarte.

Os dois grandes problemas relacionados com a utilização de lipossomas para fins de imagiologia de diagnóstico, nomeadamente baixa eficácia de lipossomas de contraste em imagiologia de tumores, têm sido muitas vezes explicados pela rápida eliminação dos lipossomas do sangue e a sua incapacidade para se acumularem no tecido doente. Estes dois obstáculos são abordados na presente invenção.

DESCRIÇÃO BREVE DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a sistemas de intensificação de imagens que são particularmente úteis no diagnóstico de doenças caracterizadas por actividade localizada da actividade da PLA2 extracelular.

Como relatado por Kaiser (1999), a PLA2 parece ser produzida por células malignas. A coloração imuno-histoquímica de vários tecidos cancerígenos, incluindo cancro do pâncreas, mama e estômago, foi positiva para a PLA2. Verificou-se existir expressão e secreção aumentadas de PLA2 em células de cancro gástrico estimuladas por IL-6, e seis de 16 linhas de células de carcinoma humano 8 segregaram espontaneamente PLA2 para o sobrenadante da cultura (Kaiser, 1999). Assim, parece estar bastante assente que níveis acrescidos de actividade da PLA2 extracelular estão associados a tecido cancerígeno. A actividade aumentada da PLA2 em tecidos tumorais combinada com a observação de que os lipossomas se acumulam em tumores via extravasamento, através de capilares de tumores com fugas, para o espaço intersticial é a base da utilização de lipossomas para a imagiologia intensificada de tumores revelada aqui.

Adicionalmente, a actividade da PLA2 extracelular está aumentada em certas regiões doentes, como tecidos inflamatórios e infectados. De modo semelhante ao que foi notado relativamente a sítios de tecidos cancerígenos, foi observado que sistemas em micropartículas são extravasados da circulação e acumulam-se em tecidos infectados, inflamados e que sofreram enfarte (Torchilin, 1998). Contudo, é importante notar que é possível distinguir entre infecção e tumor utilizando, por exemplo, lipossomas de 67Ga carregados positivamente, que se acumulam em tumores e não se acumulam em sítios de infecção (Ogihara (1986) J. Nucl. Med. 2_7, 1300-7) .

Esta invenção fornece um desses sistemas de distribuição de etiquetas na forma de transportadores à base de lípidos, por exemplo, lipossomas ou micelas, composto por éter-lípidos formadores de bicamadas lipídicas, como glicerofosfolípidos contendo uma ligação alquilo na posição 1 e uma ligação acilo na posição sn-2 da coluna vertebral do glicerol, e que têm enxertadas cadeias poliméricas ou polissacarídicas. Adicionalmente, o sistema transportador 9 pode conter componentes estabilizadores das bicamadas lipidicas, por exemplo, lipopolímeros, glicolípidos e esteróis, que conduzem a um tempo de circulação vascular aumentado e, em consequência, a uma acumulação no tecido alvo doente. Quando os transportadores atingem o sitio alvo da etiqueta, por exemplo, células cancerígenas, a hidrólise catalisada pela PLA2 da ligação acilo liberta a etiqueta, tipicamente liso-éter-lípidos e derivados com ligação éster. Em contraste com enzimas de clivagem de alquilo, que estão quase ausentes em células cancerígenas, a actividade da PLA2 extracelular está aumentada em tecido cancerígeno. Adicionalmente, a actividade da PLA2 extracelular está aumentada em regiões doentes, como tecido inflamatório. A presente invenção proporciona a utilização de um sistema à base de lípidos compreendendo um derivado lipídico e uma etiqueta, em que o derivado lipídico tem (a) um grupo alifático com um comprimento de pelo menos 7 átomos de carbono e um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono e (b) uma fracção hidrófila, em que o referido derivado lipídico é, suplementarmente, um substrato para a PLA2 extracelular no sentido em que o radical orgânico pode ser removido por clivagem hidrolítica, ao passo que o grupo alifático permanece substancialmente não afectado, de modo que o derivado lipídico de onde o radical orgânico foi removido por clivagem é libertado na forma de um derivado lisolipídico que não é um substrato para a lisofosfolipase, cujo sistema inclui lipopolímeros ou glicolípidos de modo a apresentar cadeias hidrófilas na superfície do sistema, para a preparação de uma composição de diagnóstico destinada a detectar e/ou quantificar doenças ou estados associados a um aumento localizado da actividade da PLA2 extracelular em tecidos de mamífero. 10

Assim, a presente invenção aproveita a descoberta surpreendente de que lipossomas (e micelas) incluindo derivados lipidicos que podem ser especificamente e apenas parcialmente clivados por fosfolipases extracelulares e que, ao mesmo tempo, incluem lipopolímeros ou glicolipidos, têm as propriedades de circularem na corrente sanguínea durante um período de tempo suficientemente longo de modo a atingirem tecido alvo onde a actividade da PLA2 extracelular está aumentada, sem serem reconhecidos pelos sistemas reticuloendoteliais de mamíferos e sem penetrarem em paredes celulares, de modo que os derivados lipidicos dos lipossomas são especificamente clivados por PLA2 extracelular para libertarem ingredientes intensificadores de imagens na localização desejada.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Fig. 1. Curvas de capacidade calorífica obtidas utilizando calorimetria diferencial de varrimento. (a) Lipossomas multilamelares, MLV (curva superior) e unilamelares, LUV (curva inferior), constituídos por l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 1 mM. (b) Lipossomas MLV (curva superior) e LUV (curva inferior) constituídos por dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC).

Fig. 2. Perfil do tempo reaccional característico, a 41 °C, para a hidrólise pela fosfolipase A2, PLA2, (A. piscivorus piscivorus) de lipossomas unilamelares de 1-O-DPPC compostos por 90% de 1-O-DPPC e 10% de l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(poli-etilenoglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). A reacção de hidrólise da PLA2 é monitorizada por fluorescência intrínseca (linha contínua) da enzima e espalhamento de luz estática de 90° (linhas tracejadas) da suspensão lipídica. 11

Após a adição da PLA2, aos 800 segundos, à suspensão de lipossomas equilibrada segue-se um tempo de retardamento caracteristico antes de ocorrer um aumento súbito da actividade catalítica. As amostras para HPLC foram recolhidas antes de adicionar a enzima e 20 minutos após o tempo de retardamento observado.

Fig. 3. Cromatogramas de HPLC que ilustram o efeito da hidrólise, pela fosfolipase A2, de lipossomas compostos por 90% de 1-O-DPPC e 10% de 1-O-DPPE-PEG350. Os cromatogramas mostram a quantidade de 1-O-DPPC (100%, linha continua) antes da fosfolipase A2 (A. piscivorus piscivorus) ter sido adicionada à suspensão de lipossomas e a quantidade de 1-O-DPPC (75%, linha tracejada) após o retardamento-jacto.

Fig. 4. Libertação controlada pela PLA2 do fármaco modelo e/ou agente de contraste calceina fluorescentes a partir de lipossomas compostos por l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sri-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 25 M suspenso num tampão HEPES 10 mM (pH = 7,5) em função do tempo. Adicionou-se fosfolipase A2 (A. piscivorus piscivorus) 25 nM no instante 900 segundos, a temperatura era 37 °C. A percentagem de calceina libertada é determinada como % Libertação = 100 (IF<t)-Ib) / (It-Ib) , em que IF<t> é a fluorescência medida no instante t após a adição da enzima, IB é a fluorescência de fundo e It é a fluorescência total medida após a adição de Triton X-100, que conduz à libertação completa de calceina ao romper os lipossomas.

Fig. 5. Libertação controlada pela PLA2 da calceina fluorescente através da membrana alvo de membranas não hidrolisáveis (ver Fig. 11b) em função do tempo para lipossomas compostos por l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-s.n- 12

glicero-3-fosfocolina (1-0-DPPC) 25 μΜ suspenso num tampão HEPES 10 mM (pH = 7,5). Adicionou-se fosfolipase A2 25 nM no instante 0 segundos e a temperatura era 37 °C. A percentagem de calceina libertada é determinada como descrito na Fig. 4.

Fig. 6. Perfil de hemólise de glóbulos vermelhos normais na presença de lipossomas compostos por 100% de 1-O-DPPC (quadrados), 90% de 1-O-DPPC e 10% de 1-O-DPPE-PEG350 (triângulos); 90% de 1-O-DPPC e 10% de 1-O-DPPE-PEG2000 (circulos) e ET-I8-OCH3 (losangos). As concentrações que originam 5% de hemólise (H5) situaram-se bem acima de 2 mM para lipossomas compostos por 100% de 1-O-DPPC e para lipossomas compostos por 90% de 1-O-DPPC com 10% de DPPE-PEG350. O ensaio de hemólise foi efectuado como descrito por Perkins et al., 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1327, 61-68. Em resumo, cada amostra foi diluida em série com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e 0,5 ml de cada suspensão diluida foram misturados com 0,5 ml de glóbulos vermelhos (RBC) humanos lavados [4% em PBS (v/v)]. As amostras e padrões foram colocados numa incubadora a 37 °C e foram agitados durante 20 horas. Os tubos foram centrifugados a baixa velocidade (2000 χ G) durante 10 minutos e 200 μΐ de sobrenadante foram quantificados por absorvância a 550 nm. Definiu-se 100 por cento de hemólise como a quantidade máxima de hemólise obtida com o detergente Triton X-100. O perfil de hemólise apresentado na Fig. 6 mostra um valor baixo de hemólise (inferior a 5 por cento) para lipossomas de 1-O-DPPC 2 mM e para lipossomas de 1-O-DPPC com 10% de 1-O-DPPE-PEG350.

Fig. 7. Perfis do tempo reaccional caracteristico, a 41 °C, para a hidrólise pela PLA2 (A. piscivorus piscivorus) de 13 lipossomas unilamelares incorporados com 0, 5 e 10% de lipopolímeros de 1-O-DPPE-PEG350. A reacção de hidrólise pela PLA2 é monitorizada por fluorescência intrínseca (linha contínua) da enzima e espalhamento de luz estática de 90° (linhas tracejadas) da suspensão. Após a adição da PLA2 à suspensão de lipossomas equilibrada segue-se um tempo de retardamento característico antes de ocorrer um aumento súbito da actividade catalítica.

Fig. 8. Libertação controlada pela PLA2 do fármaco modelo e/ou agente de contraste calceína fluorescentes através da membrana alvo de membranas de D-O-SPC não hidrolisáveis em função do tempo para micelas compostas por 1-O-DPPE-PEG350 (linha ponteada), DSPE-PEG750 (linha tracejada), 1-O-DPPE-PEG2000 (linha contínua) 25 μΜ suspenso num tampão HEPES 10 mM (pH = 7,5). Adicionou-se a fosfolipase A2 (25 nM) no instante 1200 segundos e a temperatura era 41 °C. A percentagem de calceína libertada é determinada como descrito na Fig. 4. A hidrólise catalisada pela PLA2 de 1-O-DPPE-PEG350 induziu a libertação mais rápida e mais elevada.

Fig. 9. Cromatogramas de HPLC que ilustram o efeito da hidrólise, pela fosfolipase A2, de micelas compostas por DSPE-PEG750 (0,150 mM) . Os cromatogramas mostram a quantidade de ácido esteárico gerado antes (linha contínua) da fosfolipase A2 {A. piscivorus piscivorus) ter sido adicionada à suspensão de micelas e a quantidade (linha tracejada) de DSPE-PEG750 após o retardamento-jacto. A linha ponteada mostra ácido esteárico puro (0,4 mM) . A percentagem de hidrólise foi calculada com base na área integrada do padrão de ácido esteárico (115850 unidades) e na área integrada da amostra (45630 unidades). Calculou-se 14 a concentração de ácido esteárico na amostra, sendo (45630/115850 χ 0,4 mM) 0,157 mM, o que significa que 100% do DSPE-PEG750 foi hidrolisado em liso-SPE-PEG750 e ácido esteárico.

Fig. 10. Descreve o principio da orientação, libertação e absorção por enzimas extracelulares do fármaco e/ou agente de contraste lipossómicos. (I) Tecido patológico com capilares com fugas (II) Transportador lipossómico do fármaco e/ou agente de contraste (III) Célula e membrana celular alvos (IV) Libertação e absorção localizadas, por fosfolipase A2 extracelular, de fármaco e/ou agente de contraste.

Fig. 11 (a) . Ilustração esquemática do principio de orientação do fármaco e/ou agente de contraste lipossómicos, envolvendo a acumulação dos transportadores lipossómicos de fármaco e/ou fármaco de agente de contraste em tecido doente poroso, a libertação subsequente do fármaco e/ou agente de contraste e o transporte através da membrana alvo via actividade da PLA2 extracelular. (I) Tecido patológico com capilares com fugas (II) Lipossoma transportador de agentes de contraste para agentes de contraste conjugados com lipidos, estabilizado por polímero (III) Célula e membrana celular alvos (IV) Agentes de contraste conjugados com lipidos (monoéter-lípido), pró-intensificador (lípido), pró-activador (lípido). 15 (V) Fármacos (derivados éter-lisolípido e ácido gordo), intensificadores (lisolípido + ácido gordo), activadores da PLA2 (lisolípido + ácido gordo)

Fig. 11(b). Ilustração esquemática de um sistema modelo biofísico de base molecular em que os fosfolípidos dos lipossomas transportadores de fármaco e/ou agente de contraste, via a hidrólise catalisada pela PLA2, actuam como pró-desestabilizadores no sítio do transportador do fármaco e/ou agente de contraste e como pró- intensificadores no sítio do alvo. Também se inclui a possibilidade de estender o princípio de modo a incluir agentes de contraste conjugados com lípidos à base de lípidos. (I) Lipossoma transportador de fármaco e/ou agente de contraste estabilizado com polímero (II) Membrana lipossómica alvo não degradável (III) Éter-lípidos não hidrolisáveis (IV) Pró-intensificador (lípido), agentes de contraste conjugados com lípidos (monoéter-lípido), pró-activador (lípido) (V) Intensificadores (lisolípido + ácido gordo), fármacos (derivados éter-lisolípido e ácido gordo), activadores da PLA2 (lisolípido + ácido gordo)

Fig. 12(a). Libertação controlada pela PLA2 do fármaco modelo e/ou calceína fluorescentes através da membrana alvo em função do tempo para diferentes composições dos lipossomas transportadores. A temperatura é 37 °C. Em comparação com transportadores de DPPC desprotegidos, a taxa de libertação do fármaco modelo e/ou agente de contraste é dramaticamente aumentada para os 16 transportadores revestidos com polímero, DPPC + 2,5% molar de DPPE-PEG2000. Obtém-se um aumento suplementar da taxa de libertação se o transportador também contiver um fosfolípido de cadeia curta, DCPC, que actua como activador local da enzima. A percentagem de calceína libertada é determinada como % Libertação = 100 (IF<t>_Ib) / (It_Ib) , em que IF (t > é a fluorescência medida no instante t após a adição da enzima, IB é a fluorescência de fundo e It é a fluorescência total medida após a adição de Triton X-100, que conduz à libertação completa de calceína ao romper os lipossomas-alvo. (b) Libertação controlada pela PLA2 do fármaco modelo e/ou agente de contraste calceína fluorescentes através da membrana alvo em função do tempo para diferentes temperaturas. À medida que a temperatura é aumentada a taxa de libertação aumenta, devido a actividade acrescida da enzima induzida por alterações estruturais no substrato da bicamada lipídica do lipossoma transportador. No presente ensaio obtém-se uma libertação máxima de cerca de 70% em todos os casos. A inserção mostra o instante de libertação de 50% de calceína, t5o%, em função da temperatura. A concentração dos lipossomas alvo e transportador são 25 μΜ, e adiciona-se PLA2 numa concentração de 25 nM num tampão HEPES com pH = 7,5.

Fig. 13. Libertação total, após 20 minutos, do fármaco modelo e/ou agente de contraste calceína fluorescentes através da membrana alvo em função da adição de quantidades crescentes de lisopalmitoil-fosfolípido e ácido palmítico, separadamente e numa mistura 1:1. A concentração das membranas-alvo é 25 μΜ num tampão HEPES com pH =7,5, a uma temperatura de 39 °C. 17

Fig. 14. Libertação controlada pela PLA2 do fármaco modelo e/ou agente de contraste calceína fluorescentes a partir de lipossomas compostos por 90% molar de l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) e 10% molar de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietileno-glicol)-350] (1-0-DPPE-PEG350) 25 μΜ suspenso num tampão HEPES 10 mM (pH = 7,5) em função do tempo. Adicionou-se fosfolipase A2 (A. piscivorus piscivorus) a 50 nM (linha direita), 1 nM (linha continua) e 0,02 nM (linha ponteada) no instante 300 segundos, a temperatura era 35,5 °C. A percentagem de calceina libertada é determinada como descrito na Fig. 4.

Fig. 15. Espectro de emissão de 1% molar de bis-py-DPC incorporado em lipossomas carregados negativamente (0,100 mM) antes (linha continua) e após (linha tracejada) a adição de PLA2 (Agkistrodon piscivorus piscivorus) 100 nM a uma suspensão de lipossomas equilibrada a 41 °C.

Fig. 16. Perfil do tempo reaccional caracteristico, a 41 °C, para a hidrólise catalisada por fosfolipase de rato de lipossomas carregados negativamente. A reacção catalítica foi iniciada por adição de fluido peritoneal sem células a 2,5 ml da suspensão de lipossomas com temperatura controlada por termostato equilibrada durante 60 segundos antes da adição do fluido peritoneal. A reacção de hidrólise é monitorizada por fluorescência de monómeros (linha contínua) e fluorescência de exímeros (linha tracejada) de bis-py-DPC. Após a adição de fluido peritoneal não diluído, aos 60 segundos, à suspensão de lipossomas equilibrada, observa-se um aumento súbito da fluorescência de monómeros e, simultaneamente, um decréscimo da fluorescência de exímeros à medida que o 18 substrato de bis-py-DPC é hidrolisado. A inserção mostra o perfil do tempo reaccional dos primeiros 120 segundos.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Uma das caracteristicas importantes da presente invenção consiste em perceber que certos derivados lipidicos serão clivados por PLA2 extracelular, de um modo bem definido, em localizações extracelulares especificas de tecido de mamífero. Verificou-se que a PLA2 extracelular é capaz de clivar derivados monoéter/monoéster-lípido de modo a orientar a etiqueta para tecidos doentes relevantes.

Derivados lipidicos

Assim, os sistemas intensificadores de imagens (lipossomas ou micelas) a serem utilizados na presente invenção baseiam-se num derivado lipídico com (a) um grupo alifático com um comprimento de pelo menos 7 átomos de carbono e um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono e (b) uma fracção hidrófila, em que os referidos agentes de contraste conjugados com lípidos são, suplementarmente, um substrato para a fosfolipase A2 extracelular, no sentido em que o radical orgânico pode ser removido por clivagem hidrolítica, ao passo que o grupo alifático permanece substancialmente não afectado, de modo que o agente de contraste conjugado com lípidos é libertado na forma de um derivado lisolípido que não é um substrato para a lisofosfolipase, cujo sistema inclui lipopolímeros ou glicolípidos de modo a apresentar cadeias hidrófilas na superfície do sistema.

Apesar dos termos "lípido" e "lisolípido" (no contexto dos fosfolípidos) serem termos bem conhecidos do experimentado na área, deve sublinhar-se que, na presente descrição e 19 reivindicações, se pretende que o termo "lipido" signifique triésteres de glicerol com a fórmula seguinte: cn;-o~ra ch~o~rb

/HJ em que RA e RB são fracções de ácidos gordos (Ο9_30-alquil/alquileno/alquildieno/alquiltrieno/alquiltetraeno-C(=0)-) e Rc é um ácido fosfatidico (P02-0H) ou um derivado do ácido fosfatidico. Assim, os grupos RA e RB estão ligados à coluna vertebral glicerol via ligações éster.

Pretende-se que o termo "lisolípido" signifique um lipido em que o grupo de ácido gordo RB está ausente (por exemplo, é removido por clivagem hidrolitica), isto é, um derivado glicerol com a fórmula acima em que RB é hidrogénio mas em que os outros substituintes estão substancialmente não afectados. A conversão de um lipido num lisolípido pode ocorrer sob a acção de uma enzima, especificamente sob a acção de PLA2 celular bem como extracelular.

Pretende-se que os termos "derivado lipídico" e "derivado lisolipídico" abranjam possíveis derivados dos possíveis compostos acima pertencentes aos grupos "lipido" e "lisolípido", respectivamente. Exemplos de derivados lipídicos e derivados lisolipídicos biologicamente activos são apresentados em Houlihan et al., Med. Res. Rev., L5, 3, 157-223. Assim, como será evidente, a extensão "derivado" deve ser entendida no sentido mais lato. 20

No entanto e na presente candidatura, derivados lipidicos e lisolipidos devem cumprir certos critérios funcionais (ver acima) e/ou requisitos estruturais. É particularmente relevante notar que os derivados lipidicos adequados são aqueles que têm (a) um grupo alifático com um comprimento de pelo menos 7, preferivelmente pelo menos 9 átomos de carbono e um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono e (b) uma fracção hidrófila. Será evidente que o grupo alifático e o radical orgânico corresponderão às duas fracções de ácidos gordos num lipido normal e que a fracção hidrófila corresponderá à parte de fosfato de um (fosfo)lipido ou respectivo bioisóstero.

Assim, uma vez que a ideia geral subjacente à presente invenção consiste em explorar o nivel acrescido de actividade da PLA2 extracelular em áreas localizadas do corpo de um mamifero, em particular tecido doente, os derivados lipidicos que podem ser utilizados na presente invenção devem ser substratos para a PLA2 extracelular, isto é, os derivados lipidicos devem ser capazes de sofrer clivagem hidrolitica e enzimática do radical orgânico correspondente ao ácido gordo na posição 2 de um lipido. Sabe-se que a PLA2 extracelular pertence à classe das enzimas (EC) 3.1.1.4. Assim, quando se refere a PLA2 (extracelular) deve entender-se que se trata de todas as enzimas extracelulares desta classe, por exemplo, lipases, que podem induzir clivagem hidrolitica do radical orgânico correspondente ao ácido gordo na posição 2 de um lipido. Uma vantagem particular do sistema intensificador de imagens à base de lipidos (como lipossomas e micelas) é o facto da actividade da PLA2 extracelular estar significativamente aumentada para substratos organizados, em comparação com substratos monoméricos. 21

Tendo em vista o requisito da capacidade de sofrer hidrólise pela PLA2 extracelular, é claro que o radical orgânico (por exemplo, um grupo alifático) está preferivelmente ligado via uma funcionalidade éster que pode ser clivada pela PLA2 extracelular, preferivelmente de modo que o grupo removido por clivagem seja um ácido carboxilico.

Suplementarmente, uma caracteristica importante da presente invenção é o facto do grupo alifático (o grupo correspondente ao ácido gordo na posição 1 de um lipido) do derivado lipidico, isto é, o derivado lisolipidico após clivagem pela PLA2 extracelular, estar substancialmente não afectado pela acção da PLA2 extracelular. Por "substancialmente não afectado" pretende-se significar que a integridade do grupo alifático está preservada e que menos de 1% molar, preferivelmente menos de 0,1% molar, do grupo alifático (o grupo alifático na posição 1) ser clivado pela acção da PLA2 extracelular.

Adicionalmente, o derivado lisolipidico resultante da clivagem hidrolitica do radical orgânico não deve, ele próprio, ser um substrato para a lisofosfolipase. Sabe-se que a lisofosfolipase pertence à classe das enzimas (EC) 3.1.1.5. Assim, quando se refere a lisofosfolipase deve entender-se que se trata de todas as enzimas desta classe que catalisam a reacção liso(fosfo)lipido + água que dá origem a fosfoglicerol + ácido gordo. Pretende-se que o termo "não ser um substrato para a lisofosfolipase" signifique que a lisofosfolipase tem uma actividade inferior a 1% para o substrato em comparação com o éster-lípido correspondente, isto é, actividade enzimática virtualmente nula. 22

Exemplos adequados desses derivados lisolipídicos são aqueles que não sofrerão clivagem hidrolítica por acção de lisofosfolipases. Assim, os derivados lisolipídicos são, em particular, não lisolípidos e derivados lisolipídicos que têm uma ligação éster na posição 1 do lisolípido ou na posição de um derivado lisolipídico que corresponde à posição 1 de um lisolípido.

Uma classe preferida de derivados lipídicos a serem incorporados nos sistemas intensificadores de imagens da invenção pode ser representada pela fórmula seguinte: CHrX-R* 1 CH-Y-R2

I CHrZ-Râ em que: X e Z são independentemente seleccionados entre 0, CH2, NH, NMe, S, S (0) e S(0)2, preferivelmente entre 0, NH, NMe e CH2, em particular 0; Y é -0C(0)-, em que Y está então ligado a R2 via quer o átomo de oxigénio quer o de carbono do carbonilo, preferivelmente via o átomo de carbono do carbonilo; R1 é um grupo alifático de fórmula Y1Y2; R2 é um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono, tal como um grupo alifático com um comprimento de pelo menos 7, preferivelmente pelo menos 9 átomos de carbono, preferivelmente um grupo de fórmula Y1Y2; 23 em que Y1 é HCH2)ni-(CH=CH)n2-(CH2)n3-(CH=CH)n4-(CH2)n5-(CH=CH) n6-(CH2) n7-(CH=CH) n8r-(CH2) n9, e a soma de nl+2n2 + n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 é um inteiro desde 9 até 29; nl é zero ou um inteiro desde 1 até 29, n3 é zero ou um inteiro desde 1 até 20, n5 é zero ou um inteiro desde 1 até 17, n7 é zero ou um inteiro desde 1 até 14 e n9 é zero ou um inteiro desde 1 até 11; cada um dos n2, n4, ηβ e n8 é, independentemente, zero ou 1; Y2 é CH3 ou C02H; em que cada Y3-Y2 pode estar independentemente substituído com halogéneo ou Ci-4-alquilo, mas preferivelmente Y1-Y2 não está substituído, R3 é seleccionado entre ácido fosfatídico (P02-0H) , derivados do ácido fosfatídico e bioisósteros do ácido fosfático e respectivos derivados (entre outros derivados do ácido fosfatídico aos quais está covalentemente ligado ou polímero hidrófilo ou polissacárido).

Tal como mencionado acima, especificações preferidas implicam que Y seja -OC(O)-, em que Y está ligado a R2 via o átomo de carboxilo. As especificações mais preferidas implicam que X e Z sejam O e que Y seja -OC(O)-, em que Y está ligado a R2 via o átomo de carboxilo. Isto significa que o derivado lipídico é um composto do tipo l-monoéter-2-monoéster-fosfolípido.

Outro grupo preferido de derivados lipídicos é aquele em que o grupo X é S.

Numa especificação, R1 e R2 são grupos alifáticos de fórmula Y3Y2 em que Y2 é CH3 ou C02H, mas preferivelmente CH3, e em que Y1 é - (CH2) ni (CH=CH) n2 (CH2) n3 (CH=CH) n4 (CH2) n5 (CH=CH) n6 (CH2) n7 (CH=CH) n9 (CH2) n9; a soma de nl + 2n2+n3 + 2n4 + 24 n5+2n6+n7+2n8+n9 é um inteiro desde 9 até 23/ isto é, o grupo alifático, Y3Y2, tem entre 10-24 átomos de carbono de comprimento, nl é igual a zero ou é um inteiro desde 1 até 23, n3 é igual a zero ou é um inteiro desde 1 até 20, n5 é igual a zero ou é um inteiro desde 1 até 17, n7 é igual a zero ou é um inteiro desde 1 até 14, n9 é igual a zero ou é um inteiro desde 1 até 11, e cada um dos n2, n4, n6 e 8 é, independentemente, igual a zero ou 1.

Numa especificação, um ou mais dos grupos alifáticos R1/R2 ou os grupos R3 incluem uma etiqueta, por exemplo, halogéneos (bromo, iodo) ou átomos de bário que são particularmente adequados para imagiologia de tomografia computorizada (CT), ou estão enriquecidos com isótopos instáveis, por exemplo, 1:LC, que é particularmente útil para fins de varrimento de PET.

Numa especificação, os grupos alifáticos, como R1 e R2, são preferivelmente saturados bem como não ramificados, isto é, preferivelmente não têm ligações duplas entre átomos de carbono adjacentes, em que cada um dos n2, n4, n6 e n8 é então igual a zero. Em conformidade, Y1 é preferivelmente (CH2) ni · Mais preferivelmente (nesta especificação), cada um dos R1 e R2, independentemente, é (CH2)niCH3 e muito preferivelmente (CH2)i7CH3 ou (CH2)i5CH3. Em especificações alternativas, os grupos podem ter uma ou mais ligações duplas, isto é, podem ser insaturados, e um ou mais dos n2, n4, ηβ e n8 podem ser iguais a 1. Por exemplo, quando o hidrocarboneto insaturado tem uma ligação dupla, n2 é igual a 1, cada um dos n4, ηβ e n8 é igual a zero e Y1 é (CH2) niCH=CH (CH2) n3. nl é igual a zero ou é um inteiro desde 1 até 21 e n3 também é zero ou é um inteiro desde 1 até 20, em que pelo menos um dos nl ou n3 não é igual a zero. 25

Numa especificação particular, os derivados lipidicos são aqueles que são monoéter-lipidos em que X e Z são 0, R1 e R2 são independentemente seleccionados entre grupos alquilo, (CH2)nCH3, em que n é 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 2 9, preferivelmente 14, 15 ou 16 , em particular 14; Y é -0C(0)- , em que Y está então ligado a R2 via o átomo de carbono do carbonilo.

Relativamente à fracção hidrófila (muitas vezes conhecida como "grupo principal") que corresponde a R , crê-se ser possivel utilizar uma grande variedade de grupos correspondentes ao ácido fosfatidico (PCq-OH) , derivados do ácido fosfatidico e bioisósteros do ácido fosfático e respectivos derivados. Como será evidente, o requisito crucial de R3 é que os grupos devem permitir a clivagem enzimática do grupo R2 (na realidade, R2-C (=0) ou R2-0H) pela PLA2 extracelular. De facto, "bioisósteros do ácido fosfatidico e respectivos derivados" implica que esses grupos - como ácido fosfatidico - devem permitir a clivagem enzimática pela PLA2 extracelular. fosfatidilserina R3 é tipicamente seleccionado entre ácido fosfatidico (P02-OH) , fosfatidilcolina (P02-0-CH2CH2N (CH3) 3) , fosfatidil-etanolamina (P02-0-CH2CH2NH2) , N-metilfosfatidiletanolamina (P02-0-CH2CH2NCH2) , fosfatidilserina, fosfatidilinositol e fosfatidilglicerol (P02-0-CH2CH0HCH20H) . Outros derivados possíveis do ácido fosfatidico são aqueles em que ácidos dicarboxílicos, como os ácidos glutárico, sebácico, succínico e tartárico, estão acoplados ao azoto terminal de fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserina, fosfatidil-inositol, etc. 26

Na especificação particular em que uma fracção do derivado lipidico também é um lipopolímero ou glicolipido, um polímero hidrófilo ou polissacárido está tipicamente ligado de forma covalente à parte fosfatidilo do derivado lipidico.

Polímeros hidrófilos que podem ser adequadamente incorporados nos derivados lipídicos da invenção de modo a formarem lipopolímeros são aqueles que são facilmente solúveis em água, podem ser covalentemente ligados a um lípido formador de vesículas e são tolerados in vivo sem efeitos tóxicos (isto é, são biocompatíveis). Polímeros adequados incluem polietilenoglicol (PEG), poliláctico (também denominado poliláctido), ácido poliglicólico (também denominado poliglicólido), um copolímero ácido poliláctico-poliglicólico, álcool polivinílico, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, poli-hidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida e celuloses derivatizadas, como hidroximetilcelulose ou hidroxietilcelulose.

Polímeros preferidos são aqueles que têm um peso molecular desde cerca de 100 Dalton até cerca de 10 000 Dalton e, mais preferivelmente, desde cerca de 300 Dalton até cerca de 5 000 Dalton. Numa especificação particularmente preferida, o polímero é polietilenoglicol com um peso molecular desde cerca de 100 até cerca de 5 000 Dalton e, mais preferivelmente, com um peso molecular desde cerca de 300 até cerca de 5 000 Dalton. Numa especificação particularmente preferida , o polímero é polietilenoglicol de 750 Dalton (PEG(750)) Os polímeros também podem ser definidos pelo número de monómeros presentes; uma especificação preferida da presente invenção utiliza 27 polímeros com pelo menos cerca de três monómeros, tais como polímeros de PEG consistindo em três monómeros (aproximadamente 150 Dalton).

Quando o glicolípido ou lipopolímero é representado por uma fracção do derivado lipídico, esse derivado lipídico (derivado lipídico com uma cadeia de polímero ou polissacárido) constitui tipicamente 1-80% molar, tal como 2-50% molar ou 3-25% molar, do sistema à base de lípidos total desidratado. No entanto e para composições micelares, a fracção pode ser ainda mais elevada, tal como entre 1-100% molar, como 10-100% molar, do sistema à base de lípidos total desidratado.

Polímeros preferidos a serem covalentemente ligados à parte fosfatidilo (por exemplo, via o azoto terminal da fosfatidiletanolamina) são polietilenoglicol (PEG), poliláctido, ácido poliglicólico, copolímero de poliláctido-ácido poliglicólico e álcool polivinílico.

Deve entender-se que R2 deve ser um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono (como um grupo alifático com um certo comprimento (pelo menos 7, preferivelmente 9 átomos de carbono)), sendo possível um grau elevado de variabilidade, por exemplo, R2 não tem de ser necessariamente um resíduo de cadeia longa, mas pode representar estruturas mais complexas.

Em geral, crê-se que R2 pode ser bastante inerte para o ambiente onde pode ser libertado pela PLA2 extracelular ou R2 pode apresentar uma etiqueta adequada para a aplicação de diagnóstico. Alternativamente, R2 pode desempenhar um papel farmacêutico activo, tipicamente como substância 28 medicamentosa auxiliar ou como modificador da eficiência do derivado lisolipidico e/ou quaisquer outras (segundas) substâncias medicamentosas presentes no ambiente. No último caso, o sistema à base de lípidos pode ter um efeito terapêutico, bem como as propriedades úteis relativamente ao método de diagnóstico. Nesta especificação, o grupo R2 pode ser um resíduo de cadeia longa, por exemplo, um resíduo de ácido gordo (o ácido gordo incluirá um carbonilo do grupo Y). Isto foi descrito em pormenor acima. Exemplos interessantes de R2 como substâncias medicamentosas auxiliares nestes subgrupos são ácidos poli-insaturados, por exemplo, oleato, linoleico, linolénico, bem como derivados de araquidonoílo (incluindo o carbonilo de Y), por exemplo, prostaglandinas, como prostaglandina Εχ, uma vez que os derivados do ácido araquidónico são reguladores conhecidos da acção hormonal, incluindo a acção de prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos. Exemplos de R2 como modificadores da eficiência são aqueles que intensificam a permeabilidade da membrana celular alvo e também intensificam a actividade da PLA2 extracelular ou os agentes de contraste conjugados com lípidos ou quaisquer segundas substâncias medicamentosas. Exemplos respectivos são ácidos gordos de cadeia curta (C8-12) ·

Assim, a presente invenção também se refere à utilização do sistema à base de lípidos para fins simultâneos de diagnóstico e terapêuticos.

Deve entender-se que os vários exemplos de possíveis grupos R são referidos pelo nome de uma espécie discreta, em vez do nome do radical. Suplementarmente, deve entender-se que os possíveis exemplos podem incluir o grupo carbonilo ou grupo oxi da ligação através da qual o radical orgânico 29 está ligado ao esqueleto lipídico (correspondente a "Y" na fórmula acima). Isto será obviamente apreciado pelo experimentado na área.

Apesar de não ter sido especificamente indicado na fórmula geral para os exemplos adequados de derivados lipidicos a serem utilizados na presente invenção, deve entender-se que a fracção glicol dos derivados lipidicos pode estar substituída, por exemplo, para modificar a taxa de clivagem pela PLA2 extracelular ou simplesmente para modificar as propriedades dos lipossomas compreendendo os derivados lipidicos.

Um grupo particular de compostos úteis para o sistema à base de lípidos consiste em derivados lipidicos com a fórmula seguinte: Λίϋ V t CH-Y-R2 CH2-2-R3 em que: X e Z são independentemente seleccionados entre 0, CH2, NH, NMe, S, S (0) e S (0)2, preferivelmente entre 0, NH, NMe e CH2, em particular 0; Y é -0C(0)-, em que Y está então ligado a R2 via quer o átomo de oxigénio quer o de carbono do carbonilo, preferivelmente via o átomo de carbono do carbonilo; R1 é um grupo alifático de fórmula ΥΧΥ2; 30 R2 é um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono; em que Y1 é -(ΟΗ2)ηΐ-(ΟΗ=ΟΗ)η2-(ΟΗ2)η3-(ΟΗ=ΟΗ)η4-(ΟΗ2)η5-(CH=CH)n5-(CH2)n7-(CH=CH)n8r-(CH2)n9, e a soma de nl + 2n2 + η3+2η4+η5+2ηβ+η7+2η8+η9 é um inteiro desde 9 até 29; nl é zero ou um inteiro desde 1 até 29, n3 é zero ou um inteiro desde 1 até 20, n5 é zero ou um inteiro desde 1 até 17, nl é zero ou um inteiro desde 1 até 14 e n9 é zero ou um inteiro desde 1 até 11; cada um dos n2, n4, n6 e n8 é, independentemente, zero ou 1; Y2 é CH3 ou C02H; em que cada Yx-Y2 pode estar independentemente substituído com halogéneo ou Ci-4-alquilo, mas preferivelmente Υχ-Υ2 não está substituído, R3 é seleccionado entre derivados do ácido fosfatídico aos quais está ligado um polímero hidrófilo ou polissacárido. O polímero hidrófilo ou polissacárido é tipicamente e preferivelmente seleccionado entre polietilenoglicol, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de poli(ácido láctico)-poli (ácido glicólico), álcool polivinílico, polivinil-pirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, poli-hidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidi-metilacrilamida e celuloses derivatizadas, em particular de polietilenoglicol, poli (ácido láctico), poli(ácido glicólico), copolímeros de poli (ácido láctico)-poli(ácido glicólico) e álcool polivinílico.

Subgrupos particulares são aqueles em que X e Z são O, R1 e R2 são independentemente seleccionados entre grupos alquilo, (CH2)nCH3, em que n é 11, 12, 13, 14, LO \—1 16, 17 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ou 2 9 31 preferivelmente 14 ou 16/ Y é -0C(0)-, em que Y está então ligado a R2 via o átomo de carbono do carbonilo.

Um grupo especifico de compostos consiste em poli(óxido de etileno)-l-0-palmitil-sn-2-palmitoilfosfatidiletanol-amina, DPPE-PEG, e poli(óxido de etileno)-l-0-estearil-sn-2-estearoilfosfatidiletanolamina, DSPE-PEG, com um peso molecular de PEG desde 100 até 10000 Dalton, em particular entre 300-5000 Dalton.

Derivados lipidicos formulados como lipossomas e micelas O termo "sistema intensificador de imagens à base de lipidos" abrange estruturas macromoleculares que incluem, como constituinte principal, lipidos ou derivados lipidicos. Respectivos exemplos adequados são lipossomas e micelas. Presentemente crê-se que os lipossomas oferecem o âmbito mais amplo de aplicações, e essas são descritas muito pormenorizadamente a seguir. Apesar de se crer que os lipossomas, correntemente, constituem o sistema a base de lipidos preferido, crê-se que os sistemas micelares também oferecem especificações interessantes na presente invenção.

Numa variante importante que pode ser vantajosamente combinada com as especificações descritas aqui, o derivado lipidico está incluido nos lipossomas como único constituinte ou então - o que é mais comum - em combinação com outros constituintes (outros lipidos, esteróis, etc.). Assim, os sistemas à base de lipidos descritos aqui estão preferivelmente na forma de lipossomas, em que os lipossomas são constituídos por camadas compreendendo o derivado lipidico e a etiqueta. 32

Pretende-se que o termo "etiqueta", quando utilizado aqui, signifique uma espécie que é capaz de ser administrada ao corpo de mamíferos e de ser detectada por meios extra-corporais para a imagiologia de tecidos vivos. A etiqueta pode ser seleccionada entre etiquetas radioactivas, como radioisótopos e compostos etiquetados com radioisótopos/ compostos opacos de forma radioactiva; compostos fluorescentes, etc. Etiquetas mais específicas são 11:LIn, 99mTc, 67Ga, 1XC; Gd, Mn, óxido de ferro, árgon, azoto, iodo, bromo e bário.

Etiquetas adequadas para gama-cintigrafia são radionuclidos de diagnóstico, como 711Ιη, 99mTc, 67Ga. Para fins práticos, os radionuclidos são complexados, por exemplo, com agentes quelantes, como ácido dietilenotri-aminopentacético (DTPA), hexametilpropilenaminoxima (HMPAO), ácido di-isopropiliminodiacético (DISIDA), ou mesmo proteinas, tais como albumina do soro humano (HSA). Alternativamente, o DTPA ou compostos quelantes semelhantes podem ser derivatizados pela incorporação de um grupo hidrófobo, que pode proceder à ancoragem da fracção quelante na superfície dos lipossomas durante ou após a preparação dos lipossomas.

Etiquetas adequadas para raios X são verografina, ioxaglato, io-hexol, iopromida, iomeprol, iopamidol, iopentol, iodixanol, ioversol, diferentes meios de contraste não iónicos, etc., que podem ser incorporados em lipossomas e utilizados para imagiologia de raios X planar do fígado e baço e para imagiologia de CT.

Etiquetas adequadas para imagiologia de ressonância magnética (MR) são iões paramagnéticos, tais como Gd e Mn, e óxido de ferro acoplado a várias moléculas 33 transportadoras. Por exemplo, foi demonstrado que o complexo gadolínio-ácido dietilenotriaminopentacético (Gd-DTPA) é um agente de contraste eficaz para imagiologia de MR do figado, baço e metástases hepáticas.

Etiquetas adequadas para imagiologia de tomografia computorizada (CT) são iodo, bromo, bário, etc.

Outros exemplos de etiquetas adequadas são muitas vezes ditados pelo método seleccionado de imagiologia ou detecção; exemplos desses estão descritos em pormenor no "Handbook of medicai imaging", volumes 1, 2, 3, SPIE Press, Washington E.U.A., 2000, editores Beutel, Konden e van Metter. Os "lipossomas" são conhecidos como estruturas que se auto-constituem compreendendo uma ou mais bicamadas lipidicas, cada uma das quais envolve um compartimento aquoso e compreende duas monocamadas opostas de moléculas lipidicas antipáticas. Os lípidos antipáticos (aqui, inter alia, derivados lipidicos) compreendem uma região do grupo principal polar (hidrófila) (correspondente ao substituinte R3 nos derivados lipidicos) covalentemente ligada a um ou dois grupos alifáticos não polares (hidrófobos) (correspondentes a R1 e R2 nos derivados lipidicos) . Em geral, crê-se que os contactos energeticamente desfavoráveis entre os grupos hidrófobos e o meio aquoso induzem um rearranjo das moléculas lipidicas de modo que os grupos principais polares ficam orientados para o meio aquoso enquanto os grupos hidrófobos se reorientam para o interior da bicamada. Forma-se uma estrutura energeticamente estável na qual os grupos hidrófobos estão eficazmente protegidos de entrarem em contacto com o meio aquoso. 34

Como se entenderá do exposto acima, os sistemas à base de lipidos, por exemplo, lipossomas, são particularmente úteis para a incorporação de etiquetas.

Os lipossomas podem ter uma única bicamada lipidica (lipossomas unilamelares, "ULVs") ou múltiplas bicamadas lipidicas (lipossomas multilamelares, "MLVs") e podem ser preparados por uma variedade de métodos (para uma revisão ver, por exemplo, Deamer e Uster, "Liposomes", Mareei Dekker, N.I., 1983, 27-52). Estes métodos incluem os métodos de Bangham para preparar lipossomas multilamelares (MLVs); os métodos de Lenk, Fountain e Cullis para preparar MLVs com uma distribuição de soluto interlamelar substancialmente igual (ver, por exemplo, as patentes U.S. 4 522 803, U.S. 4 588 578, U.S. 5 030 453, U.S. 5 169 637 e U.S. 4 975 282), e o método de evaporação de fase reversa de Papahadj opoulos et al. (patente U.S. 4 253 871) para preparar lipossomas oligolamelares. Os ULVs podem ser produzidos a partir de MLVs por métodos tais como sonicação (ver Papahadjopoulos et al., Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) ou extrusão (patentes U.S. 5 008 050 e U.S. 5 059 421). O lipossoma desta invenção pode ser produzido pelos métodos de qualquer uma destas revelações.

Podem utilizar-se várias metodologias, como sonicação, homogeneização, aplicação de Prensa French e moagem, para preparar lipossomas de menor dimensão a partir de lipossomas maiores. Pode utilizar-se extrusão (ver patente U.S. 5 008 050) para reduzir a dimensão de lipossomas, isto é, para produzir lipossomas com um tamanho médio pré-determinado, forçando os lipossomas a passar, sob pressão, através de poros de filtros com uma dimensão definida e seleccionada. Também pode utilizar-se filtração com fluxo 35 tangencial (ver patente WO 89/08846) para tornar a dimensão dos lipossomas mais regular, isto é, para produzir lipossomas com uma população de lipossomas com menos heterogeneidade de tamanhos e com uma distribuição de dimensões mais homogénea e definida. A dimensão dos lipossomas também pode ser determinada por algumas técnicas, como espalhamento de luz quase eléctrico, e com equipamento, por exemplo, aparatos de dimensionamento de partículas Nicomp®, bem acessível aos técnicos habitualmente experimentados. É bastante interessante notar que os derivados lipidicos da presente invenção podem constituir a parte maioritária de um sistema à base de lípidos mesmo que este sistema seja um sistema lipossómico. Este facto baseia-se na semelhança estrutural (mas não funcional) entre os derivados lipidicos da presente invenção e lipidos. Assim, crê-se que os derivados lipidicos da presente invenção podem ser os únicos constituintes dos lipossomas, isto é, até 100% molar dos lipossomas totais desidratados podem ser constituídos pelos derivados lipidicos. Isto contrasta com os monoéter-lisolipidos conhecidos, que apenas podem constituir uma parte minoritária dos lipossomas.

Tipicamente, como será descrito em pormenor abaixo, os lipossomas incluem vantajosamente outros constituintes que podem ou não exercer um efeito farmacêutico, mas que tornarão a estrutura lipossómica mais estável (ou, alternativamente, mais instável) ou protegerão os lipossomas de eliminação, desse modo aumentando o tempo de circulação e, assim, melhorando a eficiência global de um agente farmacêutico incluindo o lipossoma. 36

Dito isto, crê-se que os derivados lipídicos particulares constituirão, tipicamente, entre 15-100% molar, tal como 50-100% molar, preferivelmente entre 75-100% molar, em particular 90-100% molar, com base no lipossoma total desidratado.

Os lipossomas podem ser unilamelares ou multilamelares. Alguns lipossomas preferidos são unilamelares e têm diâmetros inferiores a cerca de 200 nm, mais preferivelmente desde mais de cerca de 50 nm até menos de cerca de 200 nm.

Os lipossomas são tipicamente preparados - como é conhecido na área - por um método que compreende os passos seguintes: (a) dissolver o derivado lipidico num solvente orgânico; (b) remover o solvente orgânico da solução do derivado lipidico do passo (a) , e (c) hidratar o produto do passo (b) com um solvente aquoso, de modo a formar lipossomas. O método compreende suplementarmente um passo que consiste em adicionar uma etiqueta ao solvente orgânico do passo (a) ou à fase aquosa do passo (c) . Alternativamente, podem introduzir-se em lipossomas etiquetas ionizáveis formando primeiramente os lipossomas, estabelecendo um potencial electroquimico, por exemplo, por intermédio de um gradiente de pH, através da bicamada lipossómica mais externa e depois adicionando a etiqueta ionizável ao meio aquoso externo ao lipossoma (ver, por exemplo, as patentes U.S. 5 077 056 e WO 86/01102).

Subsequentemente, o método pode compreender um passo que consiste em submeter os lipossomas produzidos no passo (c) 37 a extrusão através de um filtro para produzir lipossomas com uma certa dimensão, por exemplo, 100 nm.

Sistemas em partículas à base de lípidos, isto é, lipossomas e micelas, com dimensões abrangendo uma gama ampla podem ser preparados de acordo com as técnicas mencionadas acima. Dependendo da via de administração, dimensões adequadas para aplicações farmacêuticas situar-se-ão normalmente na gama de 20-10 000 nm, em particular na gama de 30-1000 nm. Dimensões situadas na gama de 50-200 nm são normalmente preferidas por se crer que, em geral, os lipossomas com dimensões nesta gama circulam durante mais tempo no sistema vascular de mamíferos do que lipossomas maiores, que são mais rapidamente reconhecidos pelos sistemas reticuloendoteliais ("RES") de mamíferos e, assim, mais rapidamente eliminados da circulação. Uma circulação vascular mais prolongada aumenta a probabilidade do sistema à base de lípidos atingir o sítio pretendido, por exemplo, tumores ou inflamações.

Crê-se que, para um sistema intensificador de imagens como definido aqui nas especificações que está adaptado para ser administrado via injecção intravenosa e intramuscular, os lipossomas devem ter, preferivelmente, uma dimensão média das partículas de cerca de 100 nm. Assim e geralmente, a dimensão das partículas deve situar-se na gama de 50-200 nm.

Suplementarmente, para um sistema intensificador de imagens adaptado para ser administrado via injecção subcutânea, os lipossomas devem ter, preferivelmente, uma dimensão média das partículas desde 100 até 5000 nm; em consequência, os lipossomas podem ter uma ou múltiplas camadas. 38

Uma das vantagens de incluir os derivados lipidicos em lipossomas reside no facto da estrutura dos lipossomas, em particular quando estabilizada como se descreve a seguir, permitir um tempo de circulação vascular muito mais longo do que os derivados lipidicos e etiqueta na forma de compostos discretos. Suplementarmente, os derivados lipidicos e a etiqueta tornar-se-ão mais ou menos inertes ou mesmo "invisíveis" quando "empacotados" em lipossomas onde estão incluídos lipopolimeros ou glicolipidos. Isto também significa que qualquer potencial efeito desvantajoso, por exemplo, efeito hemolitico, pode ser suprimido.

Os lipossomas devem preferivelmente actuar como constituintes inertes até reagirem na área de interesse, por exemplo, áreas ou tecidos cancerígenos, infectados ou doentes de modo inflamatório. Como se descreverá a seguir, os lipossomas podem incluir alguns constituintes diferentes. Em particular, um sistema intensificador de imagens de acordo com a invenção pode conter, suplementarmente, um componente que controla a libertação da etiqueta, agentes controladores da actividade da PLA2 extracelular ou intensificadores da permeabilidade, por exemplo, lipidos de cadeia curta e lipopolimeros/ glicolipidos.

Dois grupos muito importantes de compostos a serem incluídos em lipossomas como modificadores são os compostos estabilizadores lipopolimeros e glicolipidos, tais como lipopolimeros (por exemplo, poli(óxido de etileno)-dipalmitoilfosfatidiletanolamina, DPPE-PEG, poli(óxido de etileno)-diestearoilfosfatidiletanolamina, DSPE-PEG) com pesos moleculares de PEG desde 100 até 10000 Dalton. Foi 39 mostrado que os lipopolímeros funcionam como estabilizadores do lipossoma, isto é, o lipopolimero aumenta o tempo de circulação e - o que é altamente interessante no presente contexto - funciona como activador da PLA2 extracelular. 0 efeito estabilizador será descrito a seguir.

Crê-se que as superfícies externas dos lipossomas ficam revestidas com proteínas do soro, como opsoninas, nos sistemas circulatórios de mamíferos. Crê-se que a eliminação dos lipossomas pode ser inibida modificando a superfície externa dos lipossomas de modo que a ligação a estas de proteínas do soro é geralmente inibida. Crê-se que se podem obter modificações eficazes das superfícies, isto é, alterações nas superfícies externas dos lipossomas que resultam em inibição da opsonização e captação pelo RES, incorporando em bicamadas lipossómicas lípidos cujos grupos principais polares foram derivatizados por ligação de uma fracção química que pode inibir a ligação de proteínas do soro a lipossomas, de modo que o comportamento farmacocinético dos lipossomas nos sistemas circulatórios de mamíferos é alterado e a actividade da PLA2 extracelular é intensificada, como descrito para os lipopolímeros acima.

Foram concebidas preparações lipossómicas que evitam a captação rápida pelo RES e que, desse modo, têm um tempo de semi-vida aumentado na corrente sanguínea. Os lipossomas STEALTH® (Liposome Technology Inc., Menlo Park, Califórnia) incluem lípidos enxertados em polietilenoglicol (PEG) numa quantidade de cerca de 5% molar do lipossoma total desidratado. A presença de polímeros na superfície exterior dos lipossomas diminui a captação de lipossomas pelos órgãos do RES. As membranas lipossómicas podem ser 40 construídas de modo a resistir aos efeitos destrutivos do surfactante aí contido. Por exemplo, uma membrana lipossómica que contém, como constituintes, lípidos derivatizados com um polímero hidrófilo (isto é, solúvel em água) tem, normalmente, estabilidade acrescida. O componente polimérico da bicamada lipídica protege o lipossoma da captação pelo RES e, assim, o tempo de circulação dos lipossomas na corrente sanguínea é aumentado.

Polímeros hidrófilos adequados para utilização nos lipopolímeros são aqueles que são rapidamente solúveis em água, podem ser covalentemente ligados a um lípido formador de vesículas e são tolerados in vivo sem efeitos tóxicos (isto é, são biocompatíveis). Polímeros adequados incluem polietilenoglicol (PEG), poliláctico (também denominado poliláctido), ácido poliglicólico (também denominado poliglicólido), um copolímero de ácido poliláctico-poliglicólico e álcool polivinílico. Polímeros preferidos são aqueles que têm um peso molecular desde cerca de 100 ou 120 Dalton até cerca de 5 000 ou 10 000 Dalton e, mais preferivelmente, desde cerca de 300 Dalton até cerca de 5 000 Dalton. Numa especificação particularmente preferida, o polímero é polietilenoglicol com um peso molecular desde cerca de 100 até cerca de 5 000 Dalton e, mais preferivelmente, com um peso molecular desde cerca de 300 até cerca de 5 000 Dalton. Numa especificação particularmente preferida, 0 polímero é polietilenoglicol de 750 Dalton (PEG (750)) . Os polímeros também podem ser definidos pelo número de monómeros presentes; uma especificação preferida da presente invenção utiliza polímeros com pelo menos cerca de três monómeros, tais como polímeros de PEG consistindo em três monómeros 41 (aproximadamente 150 Dalton). Outros polímeros hidrófilos que podem ser adequados para utilização na presente invenção incluem polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, poli-hidroxipropilmetacrilamida, poli-metacrilamida, polidimetilacrilamida e celuloses derivatizadas, como hidroximetilcelulose ou hidroxietil-celulose.

Glicolípidos são lípidos aos quais está covalentemente ligada uma cadeia de polissacárido hidrófilo. Será apreciado que os glicolípidos podem ser utilizados como lipopolímeros, apesar dos lipopolímeros exibirem, presentemente, os resultados mais promissores.

Crê-se, geralmente, que o teor de lipopolímeros se situará vantajosamente na gama de 1-50% molar, tal como 2-25%, em particular 2-15% molar, com base no lipossoma total desidratado.

As bi- ou multicamadas dos lipossomas também podem conter outros constituintes, como outros lípidos, compostos esterólicos, polímero-ceramidas como estabilizadores e compostos orientadores, etc.

Os lipossomas compreendendo derivados lipídicos podem (em princípio) consistir exclusivamente nos derivados lipídicos. No entanto, para modificar os lipossomas, também podem ser incluídos "outros lípidos". Os outros lípidos são seleccionados pela sua capacidade para adoptarem conformações de empacotamento compatíveis com os componentes derivados lipídicos da bicamada, de modo que todos os constituintes lipídicos fiquem fortemente empacotados e que a libertação dos derivados lipídicos a 42 partir da bicamada seja inibida. Factores à base de lípidos que contribuem para conformações de empacotamento compatíveis são bem conhecidos dos técnicos habitualmente experimentados e incluem, sem limitação, comprimento da cadeia acilo e grau de insaturação, bem como a dimensão e carga do grupo principal. Em conformidade, outros lípidos adequados, incluindo várias fosfatidiletanolaminas ("PE's"), como fosfatidiletanolamina do ovo ("EPE") ou dioleilfosfatidiletanolamina ("DOPE"), podem ser seleccionados por técnicos habitualmente experimentados sem experimentação excessiva. Os lípidos podem ser modificados de vários modos, por exemplo, por derivatização do grupo principal com ácidos dicarboxílicos, como ácidos glutárico, sebácico, succínico e tartárico; preferivelmente, o ácido dicarboxílico é ácido glutárico ("GA"). Em conformidade, lípidos adequados derivatizados no grupo principal incluem fosfatidiletanolamina-ácidos dicarboxílicos, como dipalmitoilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("DPPE-GA"), palmitoiloleilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("POPE-GA") e dioleilfosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("DOPE-GA"). Muito preferivelmente, o lípido derivatizado é DOPE-GA. 0 teor total de "outros lípidos" situar-se-á tipicamente na gama de 0-30% molar, em particular 1-10% molar, com base no lipossoma total desidratado.

Em geral, o composto esterólico incluído no lipossoma pode afectar a fluidez das bicamadas lipídicas. Em conformidade, interacções do esterol com grupos hidrocarboneto envolventes inibem geralmente a emigração destes grupos a partir da bicamada. Um exemplo de um composto esterólico (esterol) a ser incluído no lipossoma é colesterol, sendo 43 contudo possível uma variedade de outros compostos esterólicos. Em geral, crê-se que o teor de composto esterólico, se estiver presente, se situará na gama de 0-25% molar, em particular 0-10% molar, como 0-5% molar, com base no lipossoma desidratado total.

Polímero-ceramidas são estabilizadores que melhoram o tempo de circulação vascular. Exemplos são derivados polietilenoglicol de ceramidas (PEG-ceramidas) , em particular aqueles em que o peso molecular do polietilenoglicol se situa entre 100 e 5000. Em geral, crê-se que o teor de polímero-ceramidas se situará na gama de 0-30% molar, em particular 0-10% molar, com base no lipossoma desidratado total.

Ainda outros ingredientes podem constituir 0-2% molar, em particular 0-1% molar, com base no lipossoma desidratado total.

De acordo com uma especificação da presente invenção, a bicamada lipídica de um lipossoma contém lípidos derivatizados com polietilenoglicol (PEG), de modo que as cadeias de PEG se estendem desde a superfície interna da bicamada lipídica para o espaço interior encapsulado pelo lipossoma, e estendem-se desde o exterior da bicamada lipídica para o ambiente envolvente (ver, por exemplo, a patente U.S. 5 882 679 e Figs. 10 e 11) . É conhecida na área uma variedade de métodos de acoplamento para preparar um lípido formador de vesículas derivatizado com um polímero hidrófilo e biocompatível, como polietilenoglicol (ver, por exemplo, as patentes U.S. 5 213 804, U.S. 5 013 556). 44

Os componentes lipídicos derivatizados dos lipossomas de acordo com a presente invenção podem incluir, adicionalmente, uma ligação lípido-polímero instável, como uma ligação peptidica, éster ou dissulfureto, que pode ser clivada em condições fisiológicas selectivas, como na presença de enzimas peptidases ou esterases ou de agentes redutores. A utilização dessas ligações para acoplar polímeros a fosfolipidos permite atingir niveis sanguíneos elevados desses lipossomas durante várias horas após a administração, seguido de clivagem das ligações reversíveis e remoção do polímero da bicamada lipossómica exterior. Em seguida, os lipossomas sem polímero são sujeitos a captação rápida pelo sistema RES (ver, por exemplo, a patente U.S. 5 356 633).

Adicionalmente, os lipossomas de acordo com a presente invenção podem conter moléculas não poliméricas ligadas ao exterior do lipossoma, tais como haptenos, enzimas, anticorpos ou fragmentos de anticorpos, citoquinas e hormonas (ver, por exemplo, a patente U.S. 5 527 528) e outras proteínas pequenas, polipéptidos e fracções polissacarídicas de açúcares simples, ou moléculas não proteicas que conferem ao lipossoma uma característica particular enzimática ou de reconhecimento da superfície. Ver a candidatura PCT publicada WO 94/21235. Moléculas de superfície que orientam preferencialmente o lipossoma para órgãos ou tipos de células específicos são aqui referidas como "moléculas orientadoras" e incluem, por exemplo, anticorpos e fracções de açúcares, por exemplo, gangliósidos ou outros à base de manose e galactose, que orientam o lipossoma para células específicas contendo antigenes específicos (receptores de fracções de açúcares). São conhecidas na área técnicas de acoplamento de moléculas 45 de superfície a lipossomas (ver, por exemplo, a patente U.S. 4 762 915). 0 lipossoma pode ser desidratado, armazenado e depois reconstituído de modo a ser retida uma porção substancial do seu conteúdo interno. Em geral, a desidratação lipossómica requer a utilização de um protector de secagem hidrófilo, como um açúcar dissacarídico, nas superfícies interna e externa das bicamadas lipossómicas (ver a patente U.S. 4 880 635). Em geral, crê-se que este composto hidrófilo evita o rearranjo dos lípidos presentes no lipossoma, de modo que o tamanho e conteúdo são mantidos durante o procedimento de secagem e durante a re-hidratação subsequente. Qualidades apropriadas desses protectores de secagem consistem em serem fortes aceitadores de ligações de hidrogénio e possuírem características estereoquímicas que conservam o espaçamento intramolecular dos componentes da bicamada lipossómica. Alternativamente, pode omitir-se o protector de secagem se a preparação lipossómica não for congelada antes da desidratação, permanecendo na preparação água suficiente subsequentemente à desidratação.

Lipossomas de derivados lipidicos como sistemas transportadores de etiquetas O sistema à base de lípidos pode ser utilizado para o diagnóstico de uma variedade de doenças, por exemplo e tipicamente, as seleccionadas entre cancro, por exemplo, um cancro do cérebro, mama, pulmão, cólon ou ovário, ou uma leucemia, linfoma, sarcoma, carcinoma e estados inflamatórios.

Como mencionado acima, os lipossomas que incluem os derivados lipidicos da presente invenção também incluem uma 46 etiqueta. A etiqueta pode ser covalentemente ligada às moléculas dos derivados lipidicos ou então - o que acontece mais frequentemente - pode ser incorporada no sistema à base de lipidos, por exemplo, no interior de uma micela ou lipossoma ou na parte membranar de uma micela ou lipossoma. Numa especificação particular, o sistema intensificador de imagens à base de lipidos descrito acima está na forma de lipossomas compreendendo a etiqueta. Numa especificação suplementar, o sistema à base de lipidos pode incluir uma segunda substância medicamentosa (ingredientes farmaceuticamente activos) que pode exercer um efeito farmacêutico individual ou sinergético em combinação com o derivado lipidico e derivados lisolipídicos, de modo que o sistema à base de lipidos tem um efeito dual, nomeadamente a distribuição orientada de uma etiqueta bem como de um fármaco ou mistura de fármacos.

Dito isto, a presente invenção também fornece um sistema intensificador de imagens que está na forma de lipossomas e onde está incorporada uma segunda substância medicamentosa.

Uma possível "segunda substância medicamentosa" é qualquer composto ou composição de matéria que pode ser administrado a mamíferos, preferivelmente humanos. Esses agentes podem ter actividade biológica em mamíferos. Segundas substâncias medicamentosas que podem estar associadas a lipossomas incluem, mas não se limitam a estas: agentes antivirais, como aciclovir, zidovudina e os interferões; agentes antibacterianos, como aminoglicósidos, cefalosporinas e tetraciclinas; agentes antifúngicos, como antibióticos derivados do polieno, imidazolos e triazolos; agentes antimetabólicos, como ácido fólico, e análogos de purina e pirimidina; agentes antineoplásticos, como os antibióticos 47 da família das antraciclinas e alcaloides vegetais; esteróis, como colesterol; hidratos de carbono, por exemplo, açúcares e amidos; aminoácidos, péptidos, proteínas, como proteínas de receptores celulares, imunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmissores e glicoproteínas; corantes; compostos midriáticos; broncodilatadores; anestésicos locais, e afins. Segundas substâncias medicamentosas particularmente interessantes são seleccionadas entre (i) agentes antitumorais, como derivados da antraciclina, cisplatina, paclitaxel, 5-fluorouracilo, exisulinde, ácido cis-retinóico, sulfureto de sulindaco e vincristina, (ii) antibióticos e antifúngicos e (iii) agentes anti-inflamatórios, como esteróides e não esteróides. Em particular, os esteróides também podem exercer um efeito estabilizador nos lipossomas. A presente invenção também se refere à utilização de qualquer um dos sistemas intensificadores de imagens à base de lípidos descritos aqui como composição e medicamento de diagnóstico combinados e à utilização de qualquer um dos sistemas intensificadores de imagens à base de lípidos descritos aqui para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento de doenças ou estados associados a um aumento localizado da actividade da fosfolipase A2 extracelular em tecido de mamífero. Essas doenças ou estados são tipicamente seleccionados entre cancro, por exemplo, um cancro do cérebro, mama, pulmão, cólon ou ovário, ou uma leucemia, linfoma, sarcoma, carcinoma e estados inflamatórios.

Preparações farmacêuticas e utilizações de diagnóstico 48

Também é fornecida aqui uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável, o derivado lipídico e uma etiqueta. "Transportadores farmaceuticamente aceitáveis", tal como o termo é aqui utilizado, consistem naqueles meios geralmente aceitáveis para serem utilizados em conjunção com a administração de lípidos e lipossomas, incluindo formulações lipossómicas de fármacos, a mamíferos, incluindo humanos.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis são geralmente formulados de acordo com alguns factores que o técnico habitualmente experimentado pode determinar e tomar em consideração, incluindo sem limitação: os agentes de contraste conjugados com lipidos particulares e/ou segunda substância medicamentosa utilizados, a preparação lipossómica, a sua concentração, estabilidade e biodisponibilidade pretendida; a doença, perturbação ou estado a ser tratado com a composição lipossómica; o sujeito, a sua idade, estatura e estado geral de saúde, e a via de administração pretendida para a composição, por exemplo, nasal, oral, oftálmica, subcutânea, intramamária, intraperitoneal, intravenosa ou intramuscular. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis típicos utilizados na administração parentérica de fármacos incluem, por exemplo, D5W, uma solução aquosa contendo 5% por peso por volume de dextrose, e soro fisiológico. Transportadores farmaceuticamente aceitáveis podem conter ingredientes adicionais, por exemplo, aqueles que reforçam a estabilidade dos ingredientes activos incluídos, como conservantes e antioxidantes. 49 0 lipossoma ou derivado lipídico é tipicamente formulado num meio de dispersão, por exemplo, um meio aquoso farmaceuticamente aceitável.

Para aplicações de diagnóstico normal, administra-se, preferivelmente de forma intravenosa, uma quantidade da composição compreendendo a etiqueta tipicamente desde cerca de 0,1 até cerca de 1000 mg de derivado lipídico por kg do corpo do mamífero. A composição farmacêutica é preferivelmente administrada parentericamente por injecção, infusão ou implantação (intravenosa, intramuscular, intra-articular, subcutânea ou afins) em formas galénicas, formulações ou, por exemplo, dispositivos de distribuição adequados ou implantes contendo transportadores e adjuvantes não tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis. A formulação e preparação dessas composições são bem conhecidas dos experimentados na área da formulação farmacêutica. Podem encontrar-se formulações específicas no manual intitulado "Remington's Pharmaceutical Sciences".

Assim, as composições farmacêuticas de acordo com a invenção podem compreender o sistema à base de lípidos na forma de uma injecção esterilizada. Para preparar essa composição, os agentes de contraste conjugados com lípidos adequados são dispersos num veículo líquido parentericamente aceitável que, convenientemente, pode compreender agentes de suspensão, solubilizadores, estabilizadores, de ajustamento do pH e/ou agentes de dispersão. Entre os veículos aceitáveis que podem ser empregues contam-se água, água ajustada para um pH adequado 50 por adição de uma quantidade apropriada de ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou um tampão adequado, 1,3-butanodiol, solução de Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. A formulação aquosa também pode conter um ou mais conservantes, por exemplo, p-hidroxibenzoato de metilo, etilo ou n-propilo.

Quando for desejado o diagnóstico de um tumor ou neoplasma, a distribuição eficaz de uma etiqueta encapsulada num lipossoma via a corrente sanguinea requer que o lipossoma seja capaz de penetrar na camada endotelial continua (mas "com fugas") e membrana basal subjacente que envolve os vasos que fornecem sangue a um tumor. Verificou-se que lipossomas de menores dimensões são mais eficazes no que se refere ao extravasamento para tumores através da barreira de células endoteliais e membrana basal subjacente que separa um capilar de células tumorais.

Tal como o termo é aqui utilizado, "tumores sólidos" são aqueles que crescem num sitio anatómico diferente da corrente sanguinea (em contraste com tumores originários no sangue, como leucemias) . Os tumores sólidos requerem a formação de pequenos vasos sanguíneos e capilares para nutrirem o tecido tumoral em crescimento.

De acordo com a presente invenção, a etiqueta escolhida é encerrada num lipossoma de acordo com a presente invenção; os lipossomas são formulados de modo a terem uma dimensão que se sabe permitir-lhes penetrar nas barreiras endotelial e da membrana basal. A formulação lipossómica resultante pode ser administrada parentericamente a um sujeito necessitado desse tratamento, preferivelmente por administração intravenosa. Os tumores caracterizados por um 51 grande aumento da permeabilidade da rede vascular na região do crescimento do tumor são particularmente adequados para serem tratados pelos presentes métodos. Os lipossomas acabarão por sofrer degradação devido à acção de lipases no sitio tumoral, ou podem ser tornados permeáveis, por exemplo, por radiação térmica ou de ultra-sons. Em seguida, a etiqueta é libertada numa forma solubilizada, apta a ser transportada e biodisponivel. Mesmo que a etiqueta não seja libertada, o mero facto do lipossoma estar concentrado no tecido de interesse torna o diagnóstico exequível. Suplementarmente, um pequeno aumento da temperatura, como é frequentemente observado em tecido doente, pode aumentar ainda mais a estimulação da PLA2 extracelular. A doença ou estado a ser diagnosticado caracteriza-se por ter um nível elevado de PLA2 num mamífero que é muitas vezes causado por tecido maligno, por exemplo, seleccionado do grupo que consiste em cancro do cérebro, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do ovário, linfoma, sarcoma e carcinoma. Tipicamente, o tecido maligno é o tumor primário. Alternativamente, o tecido maligno consiste em células metastáticas originárias do tumor primário.

Quando se desejar a abordagem selectiva específica para sítios de uma inflamação, a distribuição eficaz de uma etiqueta por lipossomas requer que o lipossoma tenha um tempo de semi-vida no sangue longo e que seja capaz de penetrar na camada contínua de células endoteliais e membrana basal subjacente que envolve os vasos sanguíneos adjacentes ao sítio da inflamação. Verificou-se que lipossomas de menores dimensões são mais eficazes quanto ao extravasamento através da barreira de células endoteliais e 52 para regiões inflamadas associadas. No entanto, a capacidade limitada de transporte de etiquetas de preparações convencionais de lipossomas pequenos tem limitado a sua eficácia para esses fins.

De acordo com a presente invenção, a etiqueta escolhida é encerrada num lipossoma de acordo com a presente invenção; os lipossomas são formulados de modo a terem uma dimensão que se sabe permitir-lhes penetrar nas barreiras endotelial e da membrana basal. A formulação lipossómica resultante pode ser administrada parentericamente a um sujeito a ser diagnosticado, preferivelmente por administração intravenosa. As regiões inflamadas caracterizadas por um grande aumento da permeabilidade da rede vascular na região da inflamação são particularmente adequadas para serem abordadas selectivamente pelos presentes métodos.

Sabe-se que a actividade da PLA2 extracelular é anormalmente elevada em áreas do corpo de um mamifero afectadas com cancro, inflamação, etc. A presente invenção proporcionou um modo de explorar este facto, crendo-se que a actividade da PLA2 extracelular deve ser pelo menos 25% mais elevada nas áreas afectadas do corpo (determinada no ambiente extracelular) em comparação com uma área normal comparativa. No entanto, é possível que o nível de actividade da PLA2 extracelular seja frequentemente muito mais elevado, por exemplo, pelo menos 100%, por exemplo, pelo menos 200%, tal como pelo menos 400%. Isto significa que o diagnóstico de um mamífero pode ser conduzido apenas com uma influência mínima em tecido com um nível "normal" de actividade da PLA2 extracelular. 53 A etiqueta pode ser adaptada de modo a ser detectável e, opcionalmente, quantificável por um método de detecção seleccionado do grupo que consiste em tomografia por emissão de positrões (PET), raios X, gama-cintigrafia, imagiologia de ressonância magnética (MR), imagiologia de tomografia computorizada (CT) e ultra-sonografia. A invenção será ilustrada pelos exemplos seguintes.

EXEMPLOS

Os exemplos ilustram a preparação e teste de preparações lipossómicas. A preparação de composições para utilização de diagnóstico pode ser feita como descrito aqui.

Exemplo 1

Preparação de lipossomas

Prepararam-se lipossomas unilamelares completamente hidratados com uma distribuição estreita de tamanhos a partir de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-su-glicero-3-fosfo-colina (1-0-DPPC) e di-hexadecanoil-su-glicero-3-fosfo-colina (DPPC). Obteve-se a DPPC da Avanti Polar Lipids e sintetizou-se a l-O-DPPC no nosso laboratório. Em resumo, dissolveram-se em clorofórmio quantidades pesadas de DPPC ou 1-0-DPPC. Removeu-se o solvente com uma corrente suave de N2 e secaram-se os filmes lipidicos durante a noite sob pressão reduzida, para remover quantidades vestigiais de solvente. Prepararam-se vesículas multilamelares dispersando os lípidos secos numa solução tampão contendo: KC1 150 mM, HEPES 10 mM (pH = 7,5), NaN3 1 mM, CaCl2 30 μΜ e EDTA 10 μΜ. As vesículas multilamelares foram extrudadas dez vezes através de dois filtros empilhados de policarbonato com dimensão de poros de 100 nm, como 54 descrito por Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168.

Obtiveram-se curvas de capacidade calorífica utilizando um calorímetro diferencial de varrimento N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp., Provo) do tipo de compensação de potência com um volume da célula de 0,34 ml. Antes do varrimento, a suspensão de lipossomas foi equilibrada durante 50 minutos no calorímetro à temperatura inicial. Utilizou-se uma taxa de varrimento de +10 °C/hora. A concentração de lípidos era 1 mM. A transição gel-para-fluido dos lipossomas multilamelares (MLV) caracteriza-se por uma transição abrupta de primeira ordem, como reflectido no pico estreito das curvas de capacidade calorífica mostradas nas Figs. la e lb (curvas superiores) para 1-O-DPPC e DPPC. O pico estreito reflecte o comportamento de transição de lipossomas multilamelares e contrasta com a transição mais larga gel-para-fluido observada em lipossomas unilamelares (LUV) (Pedersen et al., 1996, Biophys. J. 7_1, 554-560), como mostrado nas Figs. la e lb (curvas inferiores) para os lipossomas unilamelares extrudados de 1-O-DPPC e DPPC.

Exemplo 2

Perfil reaccional da fosfolipase A2 e medições do tempo de retardamento

Isolou-se fosfolipase A2 de veneno de cobra purificado (PLA2 de Agikistrodon piscivorus piscivorus) de acordo com o procedimento de Maraganore et al., J. Biol. Chem. 259, 13839-13843. Esta enzima PLA2 pertence à classe das enzimas secretoras de baixo peso molecular de 14 kD que exibem semelhança estrutural com a fosfolipase A2 extracelular humana, indicando um mecanismo molecular comum da hidrólise 55 catalisada pela fosfolipase na interface lípido-membrana (Wery et al., Nature 352, 7 9-82/ Honger et al. Biochemistry 35, 9003-9006; Vermehren et al., Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36). Prepararam-se lipossomas unilamelares completamente hidratados com uma distribuição estreita de dimensões a partir de l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-s.n-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) e de 1-O-DPPC com 5 e 10% molar de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-s.n-glicero-3-fosfo-etanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) ou 5 e 10% molar de l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (1-0-DPPE-PEG2000) como descrito acima. As condições de ensaio para o perfil do tempo reaccional da PLA2 mostrado na Fig. 2 e o tempo de retardamento e hidrólise percentual apresentados na Tabela 1 foram: lipossomas unilamelares 0,15 mM, PLA2 150 nM, KC1 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN3 1 mM, CaCl2 30 μΜ e EDTA 10 μΜ.

Tabela 1. Tempo de retardamento e percentagem de 1-O-DPPC hidrolisado a 41 °C, determinados por HPLC. A concentração de lipidos foi 0,150 mM num tampão HEPES 10 mM (pH = 7,5).

Composição Tempo de retardamento 1-O-DPPC (%) (segundos) 100% de 1-O-DPPC 583 79 95% de l-O-DPPC/5% de 1-O-DPPE-PEG350 128 73 90% de l-O-DPPC/10% de 1-O-DPPE-PEG350 26 75 95% de l-O-DPPC/5% de 1-0-DPPE-PEG2000 450 56 90% de l-O-DPPC/10% de 1-0-DPPE-PEG2000 20 89 A reacção catalítica foi iniciada por adição de 8,9 μΐ de uma solução-mãe (150 nM) de PLA2 42 μΜ a 2,5 ml da 56 suspensão de lipossomas (0,150 mM) com temperatura controlada por termostato equilibrada durante 800 segundos antes da adição da PLA2. O comportamento de retardamento-jacto caracteristico da PLA2 relativamente aos lipossomas é sinalizado por um aumento súbito da fluorescência intrínseca da PLA2 a 340 nm após excitação a 285 nm, seguido de um decréscimo concomitante do espalhamento de luz de 90° da suspensão lipidica (Hçnger et al., Biochemistry 3_5, 9003-9006). Recolheram-se amostras, para análise por HPLC, da quantidade de 1-O-DPPC não hidrolisada remanescente e, consequentemente, da quantidade de 1-0-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-l-O-PPC) gerada antes da adição de PLA2 e 1200 segundos após o tempo de retardamento observado. Alíquotas de 100 μΐ foram recolhidas da suspensão lipidica e foram rapidamente misturadas com 1 ml de solução de clorofórmio/metanol/ácido acético (2:4:1), de modo a arrefecer rapidamente a reacção enzimática. Lavou-se a solução com 1 ml de água e utilizaram-se para HPLC 20 μΐ da fase orgânica pesada. Os cromatogramas de HPLC da Fig. 3 mostram as quantidades de 1-O-DPPC antes e após (t = 2050 segundos) a adição de PLA2 (t = 800 segundos) à suspensão de lipossomas. A análise de HPLC foi efectuada utilizando uma coluna Diol de 5 μιη, uma fase móvel composta por clorofórmio/metanol/água (730:230:30, v/v) e um detector evaporativo de espalhamento de luz. A renovação da hidrólise lipidica catalisada pela PLA2 de 1-O-DPPC em liso-l-O-PPC foi medida por HPLC (ver Tabela 1). A fluorescência intrínseca da enzima e o espalhamento de luz de 90° foram medidos em função do tempo, como mostrado na Fig. 2.

Exemplo 3 57

Libertação induzida pela fosfolipase A2 de um fármaco modelo e/ou agente de contraste solúveis em água encapsulados

Prepararam-se lipossomas multilamelares de 1-0-DPPC na presença de calceína fluorescente, numa concentração de auto-arrefecimento rápido de 20 mM, por hidratação de um filme de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-colina, numa solução tampão de HEPES a pH=7,5, durante uma hora a 10 °C acima da temperatura de transição de fase. Formaram-se lipossomas unilamelares por extrusão dos lipossomas multilamelares dez vezes através de dois filtros empilhados de policarbonato de 100 nm. Os lipossomas unilamelares foram rapidamente arrefecidos para uma temperatura inferior à temperatura de transição, e os lipossomas de 1-O-DPPC contendo calceina foram separados da calceina livre utilizando uma coluna cromatográfica com empacotamento de Sephadex G-50.

As condições de ensaio para a libertação de calceína induzida pela PLA2 consistiram em lipossomas unilamelares de 1-O-DPPC 25 μΜ, PLA2 25 nM, KC1 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5 ou 8,0), NaN3 1 mM, CaCl2 30 μΜ e EDTA 10 μΜ. Adicionou-se a PLA2, no instante 900 segundos, a 2,5 ml da suspensão de lipossomas de 1-O-DPPC com temperatura controlada por termostato equilibrada durante pelo menos 20 minutos a 37 °C antes da adição da PLA2. A percentagem de calceína libertada é determinada como: % Libertação = 100 χ (If<t)-Ib) / (It“Ib) / em que IF(t) é a fluorescência medida no instante t após a adição da enzima, IB é a fluorescência de fundo e IT é a fluorescência total medida após a adição de Triton X-100, que conduz à libertação completa de calceína ao romper os lipossomas de 1-O-DPPC. A PLA2 induziu uma 58 libertação total de 90 por cento da calceína encerrada nos lipossomas de 1-O-DPPC, como mostrado na Fig. 4.

Exemplo 4

Aumento da permeabilidade controlada pela fosfolipase A2 de uma membrana modelo alvo

Prepararam-se lipossomas multilamelares alvo com uma membrana modelo na presença de calceína fluorescente, numa concentração de auto-arrefecimento rápido de 20 mM, por hidratação de um filme de 1,2-0-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC), numa solução tampão HEPES a pH=7,5, durante uma hora a 10 °C acima da temperatura de transição de fase (Tf=5 5 °C) . Prepararam-se lipossomas unilamelares por extrusão dos lipossomas multilamelares alvo dez vezes através de dois filtros empilhados de policarbonato de 100 nm. Os lipossomas unilamelares foram rapidamente arrefecidos para uma temperatura inferior à temperatura de transição, e os lipossomas contendo calceína foram separados da calceína livre utilizando uma coluna cromatográfica com empacotamento de Sephadex G-50. Os lipossomas transportadores unilamelares compostos por 1-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina foram preparados como descrito acima. Determina-se a libertação de calceína dos lipossomas alvo medindo a intensidade fluorescente a 520 nm após excitação a 492 nm.

As concentrações dos lipossomas de D-O-SPC e 1-O-DPPC foram 25 μΜ. Adicionou-se PLA2 (25 nM) de veneno de cobra (Agkistrodon piscivorus piscivorus) para iniciar a reacção hidrolítica conducente à formação de l-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-l-O-PPC) e de produtos de hidrólise de ácidos gordos. Uma vez que a 59 calceína é libertada dos lipossomas de D-O-SPC, devido à incorporação do liso-l-O-PPC não formador de bicamadas e de produtos de hidrólise de ácidos gordos na membrana lipidica alvo, observa-se um aumento linear da fluorescência a 520 nm após excitação a 492 nm quando a calceina é diluida no meio tampão envolvente, como mostrado na Fig. 5. A percentagem do fármaco modelo e/ou agente de contraste calceina libertados é determinada como descrito acima (ver Exemplo 3).

Exemplo 5

Ensaio de hemólise

Prepararam-se lipossomas unilamelares completamente hidratados com uma distribuição estreita de dimensões a partir de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-colina (1-O-DPPC) e a partir de 1-O-DPPC com 5% molar de 1-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) ou com 5% molar de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (1-O-DPPE-PEG2000). Os lipidos foram hidratados em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Incluiu-se no ensaio, como referência, l-0-octadecil-2-0-metil-sn-glicero-3-fosfo- colina (ET-I8-OCH3) . O ensaio de hemólise foi efectuado como descrito por Perkins et al., Biochim. et Biophys. Acta 1327, 61-68. Em resumo, cada amostra foi diluida em série com PBS e 0,5 ml de cada suspensão diluida de lipossomas de 1-O-DPPC foram misturados com 0,5 ml de glóbulos vermelhos (RBC) humanos lavados [4% em PBS (v/v)]. Para os controlos, misturaram-se 0,5 ml da suspensão de glóbulos vermelhos com 0,5 ml de 60 solução tampão (controlo negativo da hemólise) ou com 0,5 ml de água (controlo positivo da hemólise) . As amostras e padrões foram colocados numa incubadora a 37 °C e foram agitados durante 20 horas. Os tubos foram centrifugados a baixa velocidade (2000 χ G) durante 10 minutos, para formar grânulos de RBCs. Quantificaram-se 200 1 do sobrenadante por absorvância a 550 nm utilizando um espectrofotómetro de varrimento Perkin-Elmer 320. Definiu-se 100 por cento de hemólise como a quantidade máxima de hemólise obtida a partir do detergente Triton X-100. O perfil de hemólise apresentado na Fig. 6 mostra um valor baixo de hemólise (inferior a 5 por cento) para lipossomas de 1-O-DPPC 2 mM. A Figura 6 também mostra que concentrações baixas de ET-18-OCH3 induzem um grau significativo de hemólise.

Exemplo 6

Reforço da actividade da fosfolipase A2 por lípidos 1-O-DPPC enxertados em polímero

Prepararam-se lipossomas unilamelares completamente hidratados com uma distribuição estreita de dimensões a partir de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-colina (1-O-DPPC) e a partir de 1-O-DPPC com 5% ou 10% molar de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfo-etanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-350] (l-O-DPPE-PEG350) como descrito no exemplo 2. As condições de ensaio para as medições do tempo de retardamento da PLA2 consistiram em lipossomas unilamelares 0,15 mM, PLA2 150 nM, KC1 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN3 1 mM, CaCl2 30 μΜ e EDTA 10 μΜ. A reacção catalítica foi iniciada por adição de 8,9 μΐ de uma solução-mãe de PLA2 42 μΜ a 2,5 ml da suspensão de lipossomas com temperatura controlada por termostato equilibrada durante 800 segundos a 41 °C antes 61 da adição da PLA2. Determina-se o tempo decorrido antes do inicio da actividade enzimática rápida por um aumento abrupto da fluorescência intrínseca da PLA2 a 340 nm após excitação a 285 nm. Os resultados apresentados na Fig. 7 mostram um decréscimo significativo do tempo de retardamento quando se incorporam nos lipossomas de 1-0-DPPC 5 e 10% molar de I-O-DPPE-PEG350.

Exemplo 7

Preparação de micelas compostas por 1-O-DPPE-PEG350, DSPE-PEG750 e 1-0-DPPE-PEG2000

Prepararam-se micelas a partir de l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-s.n-glicero-3-f osf oetanolamino-N-[metoxi(poli-etilenoglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), dioctadecanoil-sn- glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-750] (DSPE-PEG750) ou l-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-2000] (1-0-DPPE-PEG2000). Em resumo, dissolveram-se em clorofórmio quantidades pesadas dos lípidos com polímero. Removeu-se o solvente com uma corrente suave de N2. Secaram-se os filmes lipídicos durante a noite sob pressão baixa, para remover quantidades vestigiais de solvente. Prepararam-se micelas dispersando os lípidos com polímero secos numa solução tampão contendo: KC1 150 mM, HEPES 10 mM (pH = 7,5), NaN3 1 mM, CaCl2 30 IIM e EDTA 10 M.

Exemplo 8

Aumento da permeabilidade de uma membrana modelo alvo controlada por hidrólise de micelas pela fosfolipase A2

Prepararam-se lipossomas multilamelares alvo com uma membrana modelo na presença de fármaco modelo e/ou agente 62 de contraste calceína fluorescentes, numa concentração de auto-arrefecimento rápido de 20 mM, por hidratação de um filme de 1,2-0-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC), numa solução tampão HEPES a pH=7,5, durante uma hora a 10 °C acima da temperatura de transição de fase (Tf=55 °C). Prepararam-se lipossomas unilamelares por extrusão dos lipossomas multilamelares dez vezes através de dois filtros empilhados de policarbonato de 100 nm. Os lipossomas unilamelares foram rapidamente arrefecidos para uma temperatura inferior à temperatura de transição, e os lipossomas contendo calceina foram separados da calceina livre utilizando uma coluna cromatográfica com empacotamento de Sephadex G-50. As micelas compostas por 1- 0- hexadecil-2-hexadecanoil-s.n-glicero-3-f osf oetanolamino-N- [metoxi(polietilenoglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) , diocta- decanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol) -750] (DSPE-PEG750) ou l-O-hexadecil-2- hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol ) -2 0 0 0 ] (1-0-DPPE-PEG2000) foram preparadas como descrito no exemplo 7. Determina-se a libertação de calceina do lipossoma alvo medindo a intensidade fluorescente a 520 nm após excitação a 492 nm.

As concentrações de micelas de D-O-SPC e lipidos com polimero foram 25 μΜ. Adicionou-se PLA2 (25 nM) de veneno de cobra (Agkistrodon piscivorus piscivorus) para iniciar a reacção hidrolitica conducente à formação imediata do liso- 1- O-PPE e dos produtos de hidrólise de ácidos gordos. Uma vez que a calceina é libertada dos lipossomas de D-O-SPC, devido à incorporação do polimero-liso-l-O-lipido não formador de bicamadas e de ácidos gordos na membrana lipidica alvo, observa-se um aumento linear da fluorescência a 520 nm após excitação a 492 nm quando a 63 calceína é diluída no meio tampão envolvente, como mostrado na Fig. 8. A percentagem de calceína libertada é determinada como descrito no exemplo 3. A hidrólise catalisada pela PLA2 de 1-O-DPPE-PEG350 induziu a taxa de libertação mais rápida, ao passo que o DPPE com a cadeia polimérica mais longa (PEG2000) ligada ao grupo principal induziu a taxa de libertação mais lenta.

Exemplo 9

Hidrólise de micelas compostas por DSPE—PEG750

A hidrólise de micelas compostas por DSPE-PEG750 foi seguida por análise da quantidade gerada de ácido esteárico. A reacção catalítica foi iniciada por adição de 8,9 μΐ de uma solução-mãe (150 nM) de PLA2 42 μΜ a 2,5 ml da suspensão de micelas com temperatura controlada por termostato de DSPE-PEG750 (0,150 mM) equilibrada a 45 °C durante 600 segundos antes da adição da PLA2. O comportamento de jacto característico da PLA2 relativamente às micelas é sinalizado por um aumento súbito da fluorescência intrínseca da PLA2 a 340 nm após excitação a 285 nm, seguido de um decréscimo concomitante do espalhamento de luz de 90° da suspensão lipídica (H0nger et al., Biochemistry 35^, 9003-9006). Recolheram-se amostras, para análise por HPLC, da quantidade de ácido esteárico gerada antes da adição de PLA2 e 100 segundos após o tempo de retardamento observado. Os cromatogramas de HPLC da Fig. 9 mostram a quantidade de ácido esteárico gerado 100 segundos após o tempo de retardamento observado (10 segundos) a 45 °C. A quantidade de ácido esteárico gerada (0,156 mM) por hidrólise igualou 100% de hidrólise dos lípidos com polímero DSPE-PEG750. A análise de HPLC foi efectuada utilizando uma coluna Diol de 5 μιη, uma fase 64 móvel composta por clorofórmio/metanol/água (730:230:30, v/v) e um detector evaporativo de espalhamento de luz (ver exemplo 2).

Exemplo 10

Exemplos-modelo

Os lipossomas revestidos com polímero podem actuar como sistemas versáteis de distribuição de etiquetas devido a um tempo de circulação vascular longo e a orientação passiva por vasos sanguíneos com fugas em tecido doente. Nos exemplos apresentados aqui descreve-se um sistema modelo experimental que ilustra um novo princípio para a distribuição melhorada e programável de fármaco e/ou agente de contraste, que aproveita a actividade elevada da fosfolipase A2 extracelular no tecido alvo doente. A fosfolipase A2 hidrolisa um pró-intensificador à base de lípidos presente no lipossoma transportador, produzindo liso-fosfolípido e ácido gordo livre, que se verifica conduzirem, de uma forma sinergética, a desestabilização intensificada de lipossomas e libertação do fármaco, ao mesmo tempo que a permeabilidade da membrana alvo é reforçada. O sistema proposto pode ser tornado termicamente sensível e oferece uma via racional para desenvolver sistemas de distribuição inteligentes de fármaco e/ou agente de contraste à base de lipossomas por incorporação no transportador de pró-intensificadores, pró-desestabilizadores ou pró-fármacos à base de lípidos específicos, que são automaticamente activados pela fosfolipase A2 apenas nos sítios alvo doentes, tais como tecido inflamado, infectado ou cancerígeno. 65 0 fármaco e/ou agente de contraste assume a farmacocinética alterada do transportador lipossómico e, em princípio, pode ser orientado para o tecido doente utilizando uma combinação de factores físico-químicos e patofisiológicos nos sítios do transportador lipossómico e da membrana alvo, respectivamente. Os lipossomas com glicolípidos ou lipopolímeros incorporados, como lípidos com polietilenoglicol (PEG), conhecidos como lipossomas, exibem uma estabilidade acrescida no sistema vascular, possivelmente devido a protecção estérica causada pelo revestimento de polímero. 0 tempo de circulação prolongado destes lipossomas em combinação com a porosidade vascular acrescida de tecido doente constituíram a base de resultados clínicos positivos para sistemas específicos, incluindo fármacos anti-cancerígenos, como doxorrubicina, bem como fármacos antibacterianos e anti-inflamatórios, e também sistemas de distribuição de agentes de contraste específicos para fins de imagiologia (por exemplo, agentes de imagiologia de MR à base de Mn) Niesman et ai., J. Liposome Res. _4, 939-957; Koenig e Brown, Invest. Radio 1. 20, 297; Basic et al., Magn. Reson. Med. 1_3, 44-61; Niesmam et al., Invest. Radiol. 2_5, 545-551.

Os lipossomas são sistemas lipídicos que se auto-constituem e, em consequência, a sua estabilidade é controlada, em grande extensão, por interacções físicas inespecíficas. Assim, é importante compreender o controlo molecular das propriedades físicas dos lipossomas para manipular e ajustar as propriedades lipossómicas no que se refere a fins de distribuição específica de fármacos. Como exemplo, explorou-se a transição de fase de lípidos gel-fluido induzida termicamente e conceberam-se sistemas optimizados para a libertação intensificada de fármacos devido a 66 hipertermia. Recentemente foram construídos lipossomas com PEG fusogénicos programáveis contendo o fármaco anti-cancerígeno mitoxantrona, utilizando uma libertação retardada no tempo de lípidos estabilizadores de bicamadas dos lipossomas, que se acumulam nos sítios tumorais por extravasamento. Seria desejável poder conceber um sistema de distribuição inteligente e versátil de fármaco e/ou agente de contraste com um mecanismo inserido de desencadeamento virtual dual que procedesse, simultaneamente, à (i) libertação intensificada do fármaco selectivamente no tecido alvo e ao (i i) transporte intensificado do fármaco e/ou agente de contraste para as células doentes. Este princípio está ilustrado esquematicamente na Fig. 11a.

Através dos exemplos apresentados aqui descreve-se o desenvolvimento de um sistema modelo biofísico experimental simples e operacional que suporta esse mecanismo dual a ser desencadeado nos sítios patológicos alvo. O modelo presume actividade elevada da fosfolipase A2 extracelular nos sítios doentes, como é o caso de tecido inflamado e cancerígeno, onde o nível da PLA2 extracelular pode estar ampliado por ordens de grandeza. Verificou-se que, por exposição à PLA2 extracelular, os fosfolípidos dos lipossomas com PEG sofrem hidrólise intensificada, em comparação com lipossomas desprotegidos convencionais. Isto conduz à desestabilização do lipossoma e a libertação intensificada do fármaco encapsulado. Por sua vez, os produtos da hidrólise, liso-fosfolípidos e ácidos gordos livres, actuam como intensificadores da absorção para a penetração do fármaco e/ou agente de contraste através da membrana alvo. Deste modo, os fosfolípidos do lipossoma transportador comportam-se como pró-desestabilizadores no 67 sitio do transportador e como pró-intensificadores no sitio da membrana alvo. Os pormenores moleculares deste principio estão ilustrados esquematicamente na Fig. 11b. O sistema modelo experimental consiste em lipossomas desprotegidos, um transportador lipossómico revestido com polímero e uma membrana modelo alvo. 0 transportador consiste num lipossoma unilamelar de 100 nm constituído por lípidos dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) com 2,5% molar de lipopolímero do tipo dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE)-PEG2000 · A membrana alvo consiste noutro lipossoma constituído por 1,2-O-dioctadecil-sn-glicerofosfatidilcolina (D-O-SPC), que é um fosfolípido no qual as ligações acilo das cadeias estearoílo são ligações éter. Em contraste com o DPPC, o D-O-SPC é inerte para a hidrólise catalisada pela PLA2, desse modo imitando a estabilidade de uma membrana de célula alvo intacta quanto à degradação pelas suas próprias enzimas. Este ensaio experimental, que permite a investigação simultânea, bem como separada, do efeito de desestabilizadores nos lipossomas transportadores e do efeito de intensificadores na membrana alvo, envolve encerrar um fármaco modelo e/ou agente de contraste de calceína fluorescentes solúveis em água, numa concentração de auto-arrefecimento rápido, no interior do lipossoma alvo não hidrolisável, em vez do lipossoma transportador. Em seguida, pode simular-se o nível intensificado da PLA2 extracelular na membrana alvo adicionando PLA2 extracelular para iniciar a reacção hidrolitica numa suspensão dos lipossomas transportador e alvo. A penetração de calceína através da membrana alvo de D-O-SPC é subsequentemente monitorizada pelo aumento da fluorescência. Para investigar o efeito da presença dos lípidos com PEG no lipossoma transportador, realizou-se uma experiência semelhante com 68 lipossomas de DPPC desprotegidos convencionais, que podem ser vantajosamente utilizados para a abordagem selectiva de órgãos do RES ricos em macrófagos, como o figado e baço. Suplementarmente, para comparar e distinguir o efeito intensificador da permeabilidade entre liso-fosfolipidos e ácidos gordos livres, realizaram-se experiências sem enzimas nas quais os liso-fosfolipidos e ácidos gordos livres foram adicionados, simultaneamente ou separadamente, aos lipossomas alvo.

Na Fig. 12. a mostram-se os resultados da libertação de calceina em função do tempo após a adição de PLA2 ao sistema. 0 decurso temporal da reacção da PLA2 particular utilizada tem um comportamento de retardamento-jacto caracteristico, com um denominado tempo de retardamento que pode ser convenientemente utilizado como medida da actividade enzimática. Observa-se um decréscimo dramático do tempo de retardamento e um aumento concomitante da taxa de libertação quando os lipossomas transportadores contêm os lipopolimeros, DPPE-PEG2ooo/ de acordo com descobertas prévias de degradação intensificada, pela PLA2 extracelular, de lipossomas revestidos com polímero.

Estes resultados sugerem que os produtos da hidrólise catalisada pela PLA2 dos lípidos DPPC do transportador lipossómico de DPPC, liso-fosfolípido e ácido gordo livre, que são produzidos numa mistura 1:1, são incorporados na membrana alvo, conduzindo a um grande aumento da permeabilidade da membrana. Sabe-se que estes produtos, que têm uma solubilidade muito baixa em água, devido às suas configurações moleculares não cilíndricas, induzem na membrana um campo de tensões com curvatura ou separação de fases lateral em pequena escala, que induzem defeitos na 69 membrana e permeabilidade acrescida. Isto é documentado pelos dados apresentados na Fig. 13, que mostram que a adição de liso-fosfolipido ou ácido gordo, separadamente, ao presente sistema alvo, na ausência de PLA2, conduz a uma taxa aumentada de libertação de calceina através da membrana alvo. Todavia, a descoberta crucial é que, se o liso-fosfolipido e ácido gordo livre forem adicionados simultaneamente numa mistura 1:1, se observa um aumento dramático da taxa de libertação, como mostrado na Fig. 13. Isto sugere fortemente que os dois intensificadores actuam de forma sinergética, desse modo sublinhando a possibilidade única de explorar a hidrólise catalisada pela PLA2 para obter os efeitos combinados de desestabilização do lipossoma transportador e intensificação do transporte do fármaco através da membrana alvo. 0 efeito sinergético é suplementarmente ampliado pelo facto da PLA2 extracelular ser activada pelos seus próprios produtos de hidrólise, revelando que os fosfolipidos degradáveis do lipossoma transportador são um tipo de pró-activadores.

Deve notar-se que o efeito, no presente sistema modelo de distribuição de fármaco e/ou agente de contraste, da utilização de lípidos como pró-intensificadores e pró-desestabilizadores via actividade da PLA2 extracelular é dinâmico e refere-se a uma escala temporal intrínseca. Esta escala de tempo é o tempo de permanência efectivo dos lipossomas transportadores perto da membrana alvo. Quanto mais rapidamente a enzima se tornar activa, mais rápida será a libertação do fármaco e/ou agente de contraste e maior será a absorção do fármaco e/ou agente de contraste durante o período de tempo que o transportador passar perto do alvo. Suplementarmente, quanto mais rapidamente a enzima actuar mais depressa ficará disponível para a hidrólise de 70 outros lipossomas contendo fármacos que se aproximam do sítio alvo doente. Depois de ter sido estabelecido que a actividade da PLA2 extracelular pode ser utilizada para controlar a libertação de fármacos, revelam-se várias vias racionais para aperfeiçoamentos inteligentes do sistema proposto de distribuição de fármaco e/ou agente de contraste, utilizando mecanismos bem conhecidos de alteração da actividade da PLA2 extracelular por manipulação das propriedades físicas da bicamada lipídica às quais se sabe que a enzima é sensível. Assim, a estratégia consiste em modificar certas propriedades físicas dos lipossomas transportadores sem alterar significativamente o seu tempo de circulação vascular. Ilustraremos este princípio geral demonstrando os efeitos de um factor físico-químico, a composição lipídica do transportador, e de um factor ambiental (termodinâmico), a temperatura local no sítio alvo.

Fosfolípidos de cadeia curta, como didecanoil-fosfatidilcolina (DCPC) , activam a PLA2 extracelular. Também se mostra na Fig. 12. a o efeito na penetração de calceína através das membranas alvo induzido por incorporação de uma pequena quantidade de DCPC nos lipossomas transportadores com PEG. A libertação é muito rápida devido a uma activação quase instantânea da enzima. Suplementarmente, descobrimos que a PLA2 extracelular é desactivada (dados não mostrados) quando se incorpora nos lipossomas uma grande quantidade de colesterol (« 20% molar). Em contraste, verificamos que uma pequena quantidade de colesterol (« 3% molar) activa a PLA2 extracelular. Estas descobertas significativas têm interesse particular, uma vez que foi relatado que o tempo de circulação no sangue de lipossomas com PEG é quase 71 idêntico, seja sem colesterol ou com grandes quantidades de colesterol.

Sabe-se que a temperatura exerce um efeito dramático e altamente não linear sobre a activação da PLA2 extracelular na região da transição de fase gel-fluido de bicamadas de fosfolipidos saturados. Este efeito não é causado por alterações na enzima, mas por alterações estruturais laterais dramáticas na bicamada lipidica. É possível aproveitar este efeito nos presentes sistemas de distribuição de fármaco e/ou agente de contraste, como sugerido pelos dados da Fig. 12.b. À medida que a temperatura se aproxima da temperatura de transição a 41 °C, a taxa de libertação de calceína é progressivamente aumentada, como quantificado pelo tempo de libertação de 50% de calceína, t50%, mostrado na inserção da Fig. 12.b.

Foi previamente sugerido que a hipertermia pode ser explorada para intensificar a libertação de fármacos e que o aquecimento local em áreas tumorais predefinidas pode ser utilizado para desestabilizar localmente lipossomas contendo fármacos, explorando o estado não estanque intensificado dos lipossomas na sua fase de transição. No novo sistema de distribuição modelo de fármaco e/ou agente de contraste proposto aqui, estas possibilidades de sensibilidade térmica são integradas e completamente exploradas via a sensibilidade térmica da PLA2 extracelular às propriedades físicas do lipossoma transportador. Em contraste com o caso em que o efeito térmico só pode ser atingido por um aumento local da temperatura utilizando fontes de aquecimento externas num sítio tumoral predeterminado com alguma dimensão mínima, a libertação controlada pela PLA2 será intensificada em todos os sítios em que a temperatura e concentração da PLA2 extracelular 72 estejam aumentadas, por exemplo, em tecido inflamado, independentemente da dimensão da região doente e sem requerer uma localização prévia do tecido doente.

Obtiveram-se DPPC, DCPC, D-O-SPC e DPPE-PEG2000 da Avanti Polar Lipids. 0 lipopolimero DPPE-PEG2000 tem 45 monómeros na cadeia polimérica do PEG. A PLA2 de veneno de cobra purificado (Agkistrodon piscivorus piscivorus) foi uma oferta generosa de Dr. R.L. Biltonen. Esta enzima PLA2 pertence à classe das enzimas secretoras de baixo peso molecular de 14 kD que exibem semelhanças estruturais com a fosfolipase A2 extracelular humana. Prepararam-se lipossomas multilamelares alvo na presença de calceina fluorescente, numa concentração de auto-arrefecimento rápido de 2 0 mM, hidratando um filme de D-O-SPC, numa solução tampão HEPES a pH=7,5, durante uma hora a 10 °C acima da temperatura de transição de fase, Tf=55 °C. Prepararam-se lipossomas unilamelares por extrusão dos lipossomas multilamelares dez vezes através de dois filtros empilhados de policarbonato de 100 nm. Os lipossomas unilamelares foram rapidamente arrefecidos para uma temperatura inferior à temperatura de transição, e os lipossomas contendo calceina foram separados da calceina livre utilizando uma coluna cromatográfica com empacotamento de Sephadex G-50. Os lipossomas transportadores unilamelares de DPPC, DCPC, e DPPE-PEG2000 foram preparados de um modo semelhante (Tf=41 °C) . Determina-se a libertação de calceina dos lipossomas alvo medindo a intensidade fluorescente a 520 nm após excitação a 492 nm. Todas as medições são feitas a temperaturas às quais os lípidos dos lipossomas transportador e alvo estão no estado de gel. 73

Exemplo 11

Ensaio de libertação dependente da concentração da fosfolipase A2

Prepararam-se lipossomas multilamelares de 1-0-DPPC com 10% molar de 1-O-DPPE-PEG350 na presença de calceína fluorescente, numa concentração de auto-arrefecimento rápido de 20 mM, por hidratação de um filme de 90% de 1-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina e 10% de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-s.n-glicero-3-f osf oetanolamino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-350] , numa solução tampão HEPES a pH=7,5, durante uma hora a 10 °C acima da temperatura de transição de fase. Formaram-se lipossomas unilamelares por extrusão dos lipossomas multilamelares dez vezes através de dois filtros empilhados de policarbonato de 100 nm. Os lipossomas unilamelares foram rapidamente arrefecidos para uma temperatura inferior à temperatura de transição, e os lipossomas contendo calceina foram separados da calceina livre utilizando uma coluna cromatográfica com empacotamento de Sephadex G-50.

As condições de ensaio para a libertação de calceina

induzida pela PLA2 consistiram em lipossomas unilamelares 25 μΜ, PLA2 50, 1 e 0,02 nM, KC1 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN3 1 mM, CaCl2 30 μΜ e EDTA 10 μΜ. Adicionou-se a PLA2 a 2,5 ml da suspensão lipidica com temperatura

controlada por termostato equilibrada durante pelo menos 300 segundos a 35,5 °C antes da adição da PLA2. A percentagem de calceína libertada é determinada como: % Libertação = 100 χ (IF(t)-Ib) / (It-Ib) , em que IF(t) é a fluorescência medida no instante t após a adição da enzima, IB é a fluorescência de fundo e IT é a fluorescência total medida após a adição de Triton X-100, que conduz à 74 libertação completa de calceína ao romper os lipossomas de 1-0-DPPC. A Figura 14 mostra que a libertação induzida de calceína foi a mais lenta quando se adicionou à suspensão de lipossomas PLA2 apenas a 0,02 nM.

Exemplo 12

Hemólise in vivo

Ensaio

Grupos de ratinhos (n = 5/grupo; peso 18-22 g) foram tratados i.v. com tampão (PBS), ET-18-OCH3 (50 mg/kg) e lipossomas compostos por 1-O-DPPC com 5% molar de 1-O-DPPE-PEG2000 (68,7 e 137,5 mg/kg). Passados 30 minutos após a injecção, recolheram-se 100 μΐ de sangue para tubos heparinizados directamente de ratinhos anestesiados com C02 e decapitados. O sangue foi centrifugado a 500 χ G durante 10 minutos e o plasma foi removido e armazenado a -20 °C até ser analisado.

Mediu-se o grau de hemólise por absorvância a 550 nm utilizando um espectrofotómetro de varrimento Perkin-Elmer 320. Misturaram-se 25 μΐ de plasma com 2,5 ml de PBS ou 2,5 ml de Triton X-100 10%. Definiu-se 100 por cento de hemólise como a quantidade máxima de hemólise obtida do plasma de ratinhos tratados com PBS misturado com Triton X-100 10%, e 0 por cento como plasma de ratinhos tratados com PBS misturado com PBS. O perfil de hemólise apresentado na tabela 2 mostra um valor baixo de hemólise para os ratinhos tratados com lipossomas 2 mM compostos por 1-O-DPPC com 5% molar de 1-0- 75 DPPE-PEG2000. Os ratinhos tratados com ET-I8-OCH3 morreram num periodo de 30 minutos.

Tabela 2. Hemólise percentual, ± erro padrão, após 30 minutos e número de ratinhos sobreviventes em cada grupo.

Tratamento PBS ET-18-OCH350 1-O-DPPC com 5% 1-O-DPPE-PEG2 000 mg/kg molar 68,7 mg/kg 137,5 mg/kg Hemólise 1,7 % (+ 0,2) ND morreram 4,0 % (+ 2,4) 6,6 % (+ 0,7) Sobrevivência 3/3 0/5 5/5 5/5 (30 minutos)

Tal como o termo é aqui utilizado, "tumores sólidos" são aqueles que crescem num sitio anatómico diferente da corrente sanguínea (em contraste com tumores originários no sangue, como leucemias). Os tumores sólidos requerem a formação de pequenos vasos sanguíneos e capilares para nutrirem o tecido tumoral em crescimento.

Exemplo 13

Hidrólise de lipossomas carregados negativamente pela fosfolipase A2 em fluido peritoneal de rato sem células

Preparou-se fluido peritoneal sem células de rato com inflamação aguda induzida por caserna injectando 5 ml de caseinato de sódio a 1% na cavidade peritoneal de um rato macho SRPD com um peso de 250-260 g. O rato foi sacrificado por sangria passadas 24 horas; o fluido inflamatório foi recolhido do peritoneu e foi centrifugado a 1500 G durante 20 minutos, para se obter fluido peritoneal sem células.

Prepararam-se lipossomas unilamelares completamente hidratados e carregados negativamente, com uma distribuição estreita de dimensões, a partir de 89% molar de di-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), 10% molar 76 de l-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanol-amino-N-[metoxi(polietilenoglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) e 1% molar de 1,2-bis-(pirenodecanoil)-sn-glicero-3-fosfo-colina (bis-py-DPC) . O bis-py-DPC é um substrato da PLA2 com dois fluoróforos de pireno adjacentes, que formam dímeros no estado excitado (eximeros) que emitem a 470 nm por excitação a 342 nm. A hidrólise catalisada pela fosfolipase separa os dois fluoróforos, que depois emitem a 380 nm (monómeros). A Fig. 15 mostra os espectros de emissão obtidos após excitação a 342 nm de bis-py-DPC incorporado em lipossomas com carga negativa (0,100 mM) antes e depois de adicionar PLA2 (Agkistrodon piscivorus piscivorus) 100 nM. A alteração observada no espectro de emissão após a hidrólise mediada pela fosfolipase é utilizada num ensaio continuo, medindo a emissão de eximeros a 470 nm simultaneamente com a emissão de monómeros a 380, por excitação a 342 nm. A Figura 16 mostra o perfil do tempo reaccional da hidrólise catalisada pela fosfolipase A2 de rato dos lipossomas carregados negativamente. A reacção catalítica foi iniciada por adição de fluido peritoneal sem células a 2,5 ml de uma suspensão de lipossomas com temperatura controlada por termostato equilibrada durante 60 segundos antes da adição da PLA2. O comportamento de retardamento-jacto caracteristico da fosfolipase é sinalizado por um aumento súbito da fluorescência de monómeros a 380 nm e um decréscimo subsequente da fluorescência de eximeros, como mostrado na inserção da Fig. 16.

As condições de ensaio para o perfil do tempo reaccional da PLA2 mostrado na Fig. 16 foram: lipossomas unilamelares de carga negativa 0,100 mM, 100 μΐ de fluido peritoneal sem 77 células não diluído, HEPES 10 mM (pH 7,5), CaCl2 5 mM e NaCl 150 mM.

REFERÊNCIAS

Torchilin, V. P. (1998) "Liposomes as carriers of contrast agents for in vivo diagnostics". Em: Lasic e

Papahadjopoulos (editores) "Medicai Applications of Liposomes" Elsevier Science, páginas 515-543.

Kaiser, E. (1999) "Phospholipase A2: its usefulness in laboratory diagnostics" Crit. Rev. Clin. Lab. Sei. 36(2): 65-163.

Lisboa, 15 de Novembro de 2006

Claims (12)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um sistema à base de lipidos compreendendo um derivado lipidico e uma etiqueta, cujo derivado lipidico tem (a) um grupo alifático com um comprimento de pelo menos 7 átomos de carbono e um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono e (b) uma fracção hidrófila, cujo derivado lipidico é suplementarmente um substrato para a PLA2 extracelular no sentido em que o radical orgânico pode ser removido por clivagem hidrolitica, ao passo que o grupo alifático permanece substancialmente não afectado, de modo que o derivado lipidico de onde o radical orgânico foi removido por clivagem é libertado na forma de um derivado lisolipidico que não é um substrato para lisofosfolipase, cujo sistema inclui lipopolimeros ou glicolipidos de modo a apresentar cadeias hidrófilas na superfície do sistema, para a preparação de uma composição de diagnóstico destinada a detectar e/ou quantificar doenças ou estados associados a um aumento localizado da actividade da PLA2 extracelular em tecidos de mamíferos.

2. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a etiqueta é seleccionada do grupo que consiste em 111In, 99mTc, 67Ga, 11C; Gd, Mn, óxido de ferro, árgon, azoto, iodo, bromo e bário.

3. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o derivado lipidico tem a fórmula seguinte: 2 CHj-X-R1 CH-v-a* I €8s-2-S4 em que: X e Z são independentemente seleccionados entre 0, CH2, NH, NMe, S, S(0) e S(0)2; Y é —OC (0)—, em que Y está então ligado a R2 via quer o átomo de oxigénio quer o de carbono do carbonilo; R1 é um grupo alifático de fórmula YXY2; R2 é um radical orgânico com pelo menos 7 átomos de carbono; em que Y1 é MCH2) nl^CH=CH) n2-(CH2) n3-(CH=CH) n4-(CH2) n5-(CH=CH) n6- (CH2) n7-(CH=CH) n8r_ (CH2) n9f e a soma de nl+2n2 + η3+2η4+η5+2ηβ+η7+2η8+η9 é um inteiro desde 9 até 29; nl é zero ou um inteiro desde 1 até 29, n3 é zero ou um inteiro desde 1 até 20, n5 é zero ou um inteiro desde 1 até 17, n7 é zero ou um inteiro desde 1 até 14 e n9 é zero ou um inteiro desde 1 até 11; cada um dos n2, n4, n6 e n8 é, independentemente, zero ou 1; Y2 é CH3 ou C02H; em que cada Y2-Y2 pode estar independentemente substituído com halogéneo ou Ci-4-alquilo, R3 é seleccionado entre ácido fosfatidico (P02-0H), derivados do ácido fosfatidico e bioisósteros do ácido fosfático e respectivos derivados.

4. Utilização de acordo com a Reivindicação 3, em que R2 é um grupo alifático com um comprimento de pelo menos 7 átomos de carbono.

5. Utilização de acordo com a Reivindicação 4, em que R2 é um grupo de fórmula YrY2. 3

6. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o pró-fármaco constitui 15-100% molar do sistema à base de lípidos total desidratado.

7. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o sistema à base de lipidos está na forma de lipossomas onde está incorporada uma segunda substância medicamentosa.

8. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a etiqueta está covalentemente ligada ao derivado lipidico.

9. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a doença ou estado caracterizado por ter um nível elevado de PLA2 num mamífero é causado por tecido maligno, por exemplo, seleccionado do grupo que consiste em cancro do cérebro, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do ovário, linfoma, sarcoma e carcinoma.

10. Utilização de acordo com a Reivindicação 9, em que o tecido maligno é o tumor primário.

11. Utilização de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9 ou 10, em que o tecido maligno consiste em células metastáticas originárias do tumor primário.

12. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a etiqueta é detectável e/ou quantificada por um método seleccionado do grupo que consiste em tomografia por emissão de positrões (PET), 4 raios X, gama-cintigrafia, magnética (MR), imagiologia (CT) e ultra-sonografia. Lisboa, 15 de Novembro de 2006 imagiologia de de tomografia ressonância computorizada