ES2280355T3

ES2280355T3 - Sistema de administracion de medicamentos basados en lipidos para su utilizacion en la piel.

Info

Publication number: ES2280355T3
Application number: ES01921261T
Authority: ES
Inventors: Kent Jorgensen; Jesper Davidsen; Charlotte Vermehren; Sven Frokjaer; Ole G. Mouritsen
Original assignee: Liplasome Pharma ApS
Current assignee: Liplasome Pharma ApS
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: US20070134153A1; DE60126072D1; DK1272161T3; AU2001248302A1; JP2003530339A; JP2003530338A; EP1272225B1; DE60122304T2; ATE382333T1; ES2295149T3; US7368254B2; CY1106462T1; ES2270991T3; US7166297B2; WO2001076555A2; WO2001076556A2; EP1272161A2; WO2001076556A3; ATE336267T1; DE60126072T2

Abstract

Utilización de un sistema de administración de fármacos basado en lípidos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento localizado de la actividad de la FLA2 extracelular en tejido cutáneo o subcutáneo de un mamífero, en forma de liposomas, para la administración de una sustancia farmacológicamente activa que se selecciona de entre los lisoderivados lipídicos, comprendiendo dicho sistema un compuesto de actividad interfacial, y dicha sustancia farmacológicamente activa está presente en los sistemas basados en lípidos en forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la FLA2 extracelular en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológicamente activa se libera en forma de un lisoderivado lipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa.

Description

Sistema de administración de medicamentos basados en lípidos para su utilización en la piel.

Sector de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas o cosméticas basadas en lípidos, para su utilización en el tratamiento, prevención o alivio de enfermedades o afecciones de la piel o membranas mucosas de mamíferos, que están asociadas con niveles incrementados de actividad de la fosfolipasa A_{2} (FLA_{2}) extracelular en el tejido o son resultado de los mismos.

Antecedentes de la invención

La piel, como órgano, tiene interés desde puntos de vista biológicos, médicos y cosméticos. Existen un gran número de enfermedades de la piel que bien son específicas del órgano, por ejemplo, psoriasis y eczemas, o bien son manifestaciones de enfermedades generales, tales como reacciones alérgicas generales. Muchas de estas enfermedades limitadas a la piel o las membranas mucosas de humanos o animales podrían ser curadas o aliviadas por medio de una aplicación tópica local de formulaciones farmacéuticas, con la condición de que la aplicación dé como resultado la absorción del componente activo. Muchas formulaciones se aplican tópicamente a la piel a efectos de modificar la apariencia del individuo, para proteger al individuo del ambiente, o para producir un cambio biológico en la piel u otros tejidos con propósitos terapéuticos, preventivos o cosméticos. Sin embargo, la piel forma una de las barreras del cuerpo más efectiva frente a sustancias externas y por ejemplo, debido a la impermeabilidad de la piel, muchos agentes terapéuticos se deben aplicar oral o parenteralmente aunque la piel sea el órgano diana.

Existen muchos documentos sobre diferentes tentativas para aumentar la permeabilidad de piel intacta por medio de las manipulaciones adecuadas (Karzel K., Liedtke, R. K. (1989) Arzneim. Forsch./Drug Res. 39, 1487-1491). Por ejemplo: la inyección de chorro (Siddiqui & Chien (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst. 3, 195-208.), la utilización de campos eléctricos (Burnette & Ongpipattanakul (1987) J. Pharm. Sci. 76, 765-773) o los potenciadores de penetración químicos, tales como disolventes y tensoactivos, que son particularmente importantes de mencionar. En el trabajo de Aungst y otros (1986, Int. J. Pharm. 33, 225-234) se da una larga lista de aditivos que han sido utilizados para potenciar la penetración de un agente soluble en agua dentro de la piel. Esta lista engloba sustancias no iónicas (entre las que se incluyen alcoholes de cadena larga, tensoactivos, fosfolípidos zwitteriónicos, etc.), aniónicas (especialmente ácidos grasos), aminas catiónicas de cadena larga, sulfóxidos, así como diferentes derivados amínicos; se mencionan además glicinatos anfotéricos y betaínas. A pesar de todo, el problema de la penetración del agente dentro de la piel aún no ha sido solucionado del todo, o no de forma satisfactoria.

Las formulaciones de liposomas, como el modo de administración de muchos fármacos, han sido el foco de atención de una investigación extensiva. Existe una evidencia creciente que para la administración tópica, los liposomas presentan varias ventajas sobre otras formulaciones. Entre estas ventajas se incluyen efectos secundarios reducidos relacionados con una elevada absorción sistémica del fármaco administrado, una acumulación aumentada del fármaco administrado en la diana deseada, y la capacidad de administrar una gran variedad de fármacos, tanto hidrofílicos como hidrofóbicos, dentro de la piel. Se han administrado a la piel compuestos entre los que se incluyen analgésicos, anticuerpos, hormonas y ADNs de peso molecular elevado. Aunque la mayoría de aplicaciones da como resultado el direccionamiento hacia la epidermis más externa (Patente U.S.A. No. 6.180.353), la utilización de portadores lipoidales, liposomas, aún parece que es un método muy prometedor para aumentar la permeabilidad de la piel (Egbaria & Weiner, Adv. Drug Delivery Rev. 5, 287 (1990)).

De forma interesante, se han descrito en la técnica muchos ejemplos de componentes lipídicos o derivados lipídicos activos farmacéuticamente.

La patente U.S.A. No. 5.827.836 da a conocer glicerofofoetanolaminas sustituidas con retinoílo. Se expone que los compuestos y las sales de los mismos muestran actividades antitumorales, antisoriáticas y antiinflamatorias. Una posible clase de compuestos tiene un sustituyente éter graso en la posición 1, un sustituyente de éster retinoide (retinoílo) en la posición 2 y un sustituyente de fosfoetanolamina en la posición 3. Se menciona que algunos de los compuestos se pueden presentar en una formulación de liposomas.

La patente U.S.A. No. 4.372.949 da a conocer un agente carcinoestático e inmunoestimulador que contiene un lisofosfolípido y un fosfolípido. Ejemplos de compuestos son 3-fosforilcolina que tiene un sustituyente aciloxi-C_{5-22} o alcoxi-C_{5-22} en la posición 1, y un sustituyente hidrógeno, hidroxi, aciloxi C_{1-5} o alcoxi C_{1-5} en la posición 2. Se menciona que los agentes se pueden dispersar en forma de micelas o vesículas lipídicas.

La patente U.S.A. No. 5.484.911 da a conocer conjugados de nucleósido 5'-difosfato de éter lipídicos que muestran actividad antiviral. Los compuestos pueden tener un sustituyente éter/tioéter graso en la posición sn-1 y un sustituyente éster de ácido graso en la posición sn-2. Los compuestos se diseñan para que penetren en la membrana de la célula, en la que después se libera el fármaco nucleósido por medio de la escisión por las fosfatasas intracelulares. Se sugiere además que los éteres lipídicos liberados adicionalmente se pueden escindir posteriormente por medio de la FLA_{2} intracelular. Se sugiere que los conjugados se pueden presentar en forma de micelas que se pueden absorber más fácilmente por macrófagos.

La patente U.S.A. No. 4.622.392 da a conocer compuestos citotóxicos de tipo conjugado nucleótido-lípido.

Xia y Hui dan a conocer la síntesis química de una serie de fosfolípidos éter a partir de D-manitol y sus propiedades como agentes citotóxicos tumorales.

Las patentes U.S.A. Nos. 5.985.854, 6.077.837, 6.136.796 y 6.166.089 describen profármacos con penetración aumentada dentro de células, que son particularmente útiles para el tratamiento de una afección o enfermedad en un humano relacionadas con actividad enzimática intracelular por encima de lo normal. Los profármacos pueden ser ésteres-sn-2 de lisofosfolípidos. Estos fármacos se diseñan para que sean escindidos por la FLA_{2} intracelular.

Cevc y otros (Biochem Biophys Acta (1998) 1368, págs. 201-215; patente U.S.A. No. 6.165.500) describen una formulación de liposomas (Transfersomes®) que da como resultado partículas de liposoma muy flexibles que, debido a su flexibilidad, tienen la capacidad de penetrar incluso a través de la piel intacta de un mamífero.

Descripción breve de la invención

La presente invención se dirige a sistemas de administración de fármacos que son particularmente útiles en el tratamiento o alivio de enfermedades o afecciones en la piel o en las membranas mucosas de mamíferos, que están asociadas con niveles incrementados de actividad de la fosfolipasa A_{2} extracelular (fosfatidilcolina 2-acilhidrolasa) (FLA_{2}) en el tejido.

De este modo, la presente invención se refiere a la utilización de sistemas de administración de fármacos basados en lípidos en forma de liposomas, para la administración de una sustancia farmacológicamente activa seleccionada de entre los lisoderivados lipídicos, comprendiendo dicho sistema un compuesto de actividad interfacial, y dicha sustancia farmacológicamente activa está presente en el sistema basado en lípidos en forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la FLA_{2} extracelular en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológicamente activa se libera en forma de un lisoderivado lipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento localizado de la actividad extracelular de la FLA_{2} en tejido cutáneo o subcutáneo de un mamífero.

La presente invención además se refiere a la utilización de un sistema de administración de fármacos basado en lípidos en forma de liposomas, para la administración de una segunda sustancia farmacológica, comprendiendo dicho sistema un compuesto de actividad interfacial, y dicha segunda sustancia farmacológica se incorpora en el sistema, incluyendo dicho sistema derivados lipídicos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, en la que además el derivado lípido es un sustrato para FLA_{2} extracelular en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, para que de como resultado un fragmento de ácido orgánico o un fragmento de alcohol orgánico y un fragmento de lisolípido, no siendo dicho fragmento de lisolípido un sustrato para la lisofosfolipasa, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento localizado de la actividad extracelular de la FLA_{2} en tejido cutáneo o subcutáneo de un mamífero.

Descripción de los dibujos

La figura 1. Curvas de capacidad calorífica obtenidas utilizando calorimetría de barrido diferencial. (a) Liposomas multilamelares, MLV (la curva superior) y unilamelares, LUV (la curva inferior) hechos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 1 mM. (b) liposomas MLV (la curva superior) y LUV (la curva inferior) hechos de dipalmitoílfosfatidilcolina (DPPC).

La figura 2. Perfil característico de tiempo de reacción a 41ºC para la hidrólisis con fosfolipasa A_{2}, FLA_{2}, (A. piscivorus piscivorus) de liposomas unilamelares compuestos de 1-O-DPPC. La reacción de hidrólisis con FLA_{2} se monitoriza por fluorescencia intrínseca (línea continua) del enzima y dispersión de la luz estática ("static light scattering") a 90º (líneas discontinuas) de la suspensión del lípido. 800 s después de añadir la FLA_{2} a la suspensión de liposomas equilibrada tiene lugar, después de un tiempo de latencia característico, un aumento de la actividad catalítica. Se extrajeron muestras para HPLC antes de la adición del enzima y 20 minutos después del tiempo de latencia observado.

La figura 3. Cromatogramas de HPLC que ilustran el efecto de la hidrólisis con fosfolipasa A_{2} de liposomas compuestos de 1-O-DPPC. Los cromatogramas muestran la cantidad de 1-O-DPPC (100%, línea continua) antes de que se añadiera la fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a la suspensión de liposomas y la cantidad de 1-O-DPPC (21%, línea discontinua) después de desencadenarse la actividad.

La figura 4. Liberación controlada por FLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, de liposomas compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina 25 \muM (1-O-DPPC) suspendidos en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH=7,5), en función del tiempo. Se añadieron 25 nM de fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a los 900 s, la temperatura era de 37ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina como % de Liberación = 100(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida en el tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, y I_{T} la fluorescencia total medida después de la adición de Triton X-100, que conduce a la liberación completa de calceína por rotura de los liposomas.

La figura 5. Liberación controlada por FLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana de membranas no hidrolizables (véase la figura 9), en función del tiempo para liposomas compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 25 \muM suspendidos en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH=7,5). Se añadieron 25 nM de fosfolipasa A_{2} a los 0 s y la temperatura era de 37ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina como se describe en la figura 4.

La figura 6. Perfiles característicos de tiempo de reacción a 41ºC para la hidrólisis por FLA_{2} (A. piscivorus piscivorus) de liposomas unilamelares incorporados con 0 y un 5% de lipopolímeros 1-O-DPPE-PEG350 cargados negativamente. La reacción de hidrólisis por FLA_{2} se monitoriza por fluorescencia intrínseca (línea continua) del enzima y dispersión de la luz estática ("static light scattering") a 90º (líneas discontinuas) de la suspensión. Después de añadir FLA_{2} a la suspensión de liposomas equilibrada tiene lugar, después de un tiempo de latencia característico, un aumento de la actividad catalítica.

La figura 7. Liberación controlada por FLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana de D-O-SPC no hidrolizable en función del tiempo, para micelas compuestas de 1-O-DPPE-PEG350 (línea de puntos), DSPE-PEG750 (línea discontinua), 1-O-DPPE-PEG2000 (línea continua) 25 \muM suspendidas en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH=7,5). Se añadió fosfolipasa A_{2} (25 nM) a los 1200 s y la temperatura era de 41ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina como se ha descrito en la figura 4. La hidrólisis catalizada por FLA_{2} de 1-O-DPPE-PEG350 indujo la liberación más rápida y más elevada.

La figura 8. Cromatogramas de HPLC que ilustran el efecto de la hidrólisis por fosfolipasa A_{2} de micelas compuestas DSPE-PEG750 (0,150 mM). Los cromatogramas muestran la cantidad de ácido esteárico generado antes (línea continua) de la adición de fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a la suspensión de micelas y la cantidad (línea discontinua) de DSPE-PEG750 después desencadenarse la actividad. La línea de puntos muestra el ácido esteárico puro (0,4 mM). El porcentaje de hidrólisis se calculó sobre la base del área integrada del estándar de ácido esteárico (115850 unidades) y el área integrada de la muestra (45630 unidades). La concentración de ácido esteárico en la muestra se calculó en 0,157 mM (45630/115850 x 0,4 mM), lo que significa que se hidrolizó el 100% de DSPE-PEG750 a liso-DSPE-PEG750 y ácido esteárico.

La figura 9. Describe el principio de direccionamiento, liberación y absorción del liposoma de profármaco flexible por enzimas extracelulares.

(I) Estrato de córnea con poros pequeños

(II) Liposoma de profármaco flexible

(III) Célula y membrana celular dianas

(IV) Profármaco (es decir, monoéter-lipídico), potenciador (lípido), proactivador (lípido)

(V) Fármacos (es decir, derivados de éter-lisolípido y ácido graso) potenciadores (lisolípido + ácido graso) proactivadores de FLA_{2} (lisolípido + ácido graso)

La figura 10. Ilustración esquemática de un principio de direccionamiento de fármacos liposómicos que implica el transporte de los portadores de fármacos liposómicos flexibles dentro del tejido enfermo y la posterior liberación del fármaco y el transporte a través de la membrana diana por medio de la actividad de la FLA_{2} extracelular.

(I) liposoma flexible portador del profármaco

(II) membrana de liposomas diana no degradable

(III) éteres lipídicos no hidrolizables

(IV) Potenciador (lípido), profármaco (es decir, monoéter-lipídico), proactivador (lípido)

(V) Potenciadores (lisolípido + ácido graso), fármacos (es decir, derivados de éter-lisolípidos y ácido graso), proactivadores de FLA_{2} (lisolípido + ácido graso)

La figura 11 (a) Liberación controlada por FLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana en función del tiempo para diferentes composiciones de los liposomas portadores. La temperatura es de 37ºC. En comparación con los portadores de DPPC neutros, la velocidad de liberación del fármaco modelo se aumenta dramáticamente para los portadores cargados negativamente, DPPC + 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (DPPE-PEG2000) 2,5% molar. Se obtiene un aumento adicional de la velocidad de liberación, si el portador contiene además un fosfolípido de cadena corta, didecanoílfosfatidil-colina (DCPC), que actúa como un proactivador local para el enzima. El porcentaje de calceína liberada se determina como % de Liberación = 100 (I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida a tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, y I_{T} la fluorescencia total medida después de la adición de Triton X-100, lo que conduce a la liberación completa de calceína por rotura de los liposomas diana. (b) Liberación controlada por FLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana como función del tiempo para diferentes temperaturas. Al aumentar la temperatura, la velocidad de liberación se incrementa debido a la actividad aumentada del enzima, inducida por cambios estructurales en el sustrato de la bicapa lipídica del liposoma portador. En el presente ensayo, se consigue una liberación máxima de, aproximadamente, el 70% en todos los casos. En el inserto se muestra el tiempo de 50% de liberación de calceína, t_{50%}, como función de la temperatura. La concentración de los liposomas diana y portadores es de 25 \muM, y la FLA_{2} se añade a una concentración de 25 nM en una solución tampón de HEPES de pH=7,5.

La figura 12. Liberación total después de 20 min de la calceína, fármaco modelo fluorescente, a través de la membrana diana como función de la adición, separadamente, de cantidades crecientes de liso-palmitoíl fosfolípido y ácido palmítico, y en una mezcla 1:1. La concentración de las membranas diana es de 25 \muM en una solución tampón de HEPES de pH=7,5 a una temperatura de 39ºC.

La figura 13. Liberación controlada por FLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, de liposomas compuestos de un 90% molar de 1-O-DPPC y un 10% molar de lípido de 1-O-DPPE-PEG350 cargado negativamente, 25 \muM, suspendidos en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH=7,5), como función del tiempo. Se añadieron 50 nM (línea fina), 1 nM (línea continua) y 0,02 nM (línea de puntos) de fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a los 300 s, la temperatura era de 35,5ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina como se ha descrito en la figura 4.

La figura 14. Espectro de emisión de bis-pyr-DPC 1% molar incorporado dentro de liposomas cargados negativamente (0,100 mM) antes (línea continua) y después de (línea discontinua) la adición de 100 nM de FLA_{2} (Agkistrodon piscivorus piscivorus) a la suspensión de liposomas equilibrada a 41ºC.

La figura 15. Perfil característico de tiempo de reacción a 41ºC de la hidrólisis catalizada por fosfolipasa de rata de liposomas cargados negativamente. La reacción catalítica se inició mediante la adición de fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada equilibrada durante 60 s, anteriormente a la adición del fluido peritoneal. La reacción de hidrólisis se monitoriza por fluorescencia del monómero (línea continua) y fluorescencia del excímero (línea discontinua) de bis-pyr-DPC. A los 60 s, después de la adición de fluido peritoneal no diluido a la suspensión de liposomas equilibrada, se observa un súbito aumento en la fluorescencia del monómero, y simultáneamente una disminución de la fluorescencia del excímero al hidrolizarse el sustrato de bis-pyr-DPC. El inserto muestra el perfil del tiempo de reacción de los primeros 120 s.

Descripción detallada de la invención

La función principal de la piel es proteger al individuo del ambiente. La piel de mamífero es un órgano complejo que comprende tres capas bien definidas, la capa de epidermis más externa seguida de la dermis y el subcutis. En los casos en los que se utiliza en la presente descripción, se pretende que el término "piel" sea sinónimo del término "tejido cutáneo y subcutáneo". La principal barrera físico-química de la piel se localiza en la capa de la piel cornificada más externa, el estrato córneo. El estrato córneo es la estructura de la piel más especializada. Es el producto final del proceso de diferenciación de la epidermis. La mayoría de las células de la epidermis comprenden queratinocitos en varios estados de diferenciación. Los queratinocitos más interiores, las células basales, residen sobre una membrana basal en contacto con la dermis, que es el tejido conectivo de la piel, y son los únicos queratinocitos que tienen capacidad de división. Una fracción de las células basales abandona continuamente la membrana basal y pasa por un proceso de diferenciación que hace que las células se conviertan finalmente en componentes del estrato córneo. En este proceso los queratinocitos pasan por muchos cambios adaptativos. Hay un contenido incrementado de citoesqueleto que comprende citoqueratinas específicas de la epidermis. Los filamentos intermedios de células contiguas se unen en una unidad funcional por un número incrementado de desmosomas. El cambio más dramático tiene lugar durante la transición desde la capa de células vivas más exterior, el estrato granuloso, al estrato córneo no viable en un proceso denominado habitualmente queratinización. El resultado de la diferenciación son las células no viables del estrato córneo, los corneocitos. Las células de corneocitos individuales se mantienen unidas por estructuras mecánicamente resistentes, los desmosomas, y forman la barrera microporosa físico-química de la piel. Los poros en el estrato córneo y las estructuras que se extienden debajo normalmente son tan estrechos, que la piel solamente permite el paso de entidades inferiores a 400 Da, pero las vesículas de lípido que son capaces de atravesar poros inferiores a 30 nm son capaces de penetrar en la piel (Cevc y otros (Biochem Biophys Acta (1998) 1368, págs. 201-215, Patente U.S.A. No. 6.180.353).

Sin embargo, a efectos de proporcionar la sustancia activa a las células diana relevantes, la permeabilidad es solamente una parte del reto. Tan importante como hacer que la sustancia entre dentro del cuerpo es la cuestión de asegurar que las células relevantes se exponen predominantemente al componente activo farmacéuticamente. La presente invención da a conocer nuevos sistemas de administración de fármacos que aseguran que el componente o componentes activos farmacéuticamente se puedan administrar específicamente a las células diana de la piel.

En particular, la presente invención se dirige tanto a la importante cuestión de asegurar que las células relevantes se exponen predominantemente al componente activo farmacéuticamente, como al hecho de que solamente liposomas muy flexibles que contienen "sustancias con actividad interfacial" (véase más adelante) son capaces de pasar a través del estrato córneo y penetrar profundamente dentro de la piel o membranas mucosas de humanos o animales (a continuación, "piel"). Es importante comprender que la presente invención no se dirige a la aplicación de compuesto dentro de la corriente sanguínea a través de la piel.

Se ha descubierto que la actividad de la fosfolipasa A_{2} (FLA_{2}) extracelular aumenta en muchas de las enfermedades inflamatorias de la piel, especialmente en la soriasis y el eczema (Forster y otros (1985) Br J Dermatol 112:135-47; Forster y otros (1983) Br J Dermatol 108:103-5). Se ha descubierto además que la FLA_{2} extracelular es capaz de hidrolizar derivados lipídicos monoéter/monoéster para que se produzcan lisoderivados lipídicos monoéter que como tales, o en combinación con otros compuestos activos, mostrarán un efecto terapéutico. De este modo, la presente invención se basa en la noción de que el componente o componentes activos farmacéuticamente se pueden administrar específicamente a las células diana en la piel aprovechando la elevada actividad de la FLA_{2} en la parte del tejido que cobija las células diana. En una realización particular de la presente invención, un compuesto análogo lipídico específico se puede incorporar dentro del liposoma portador y actuar como un profármaco que se convierte en un fármaco activo por hidrólisis mediante la FLA_{2}. Un ejemplo posible podrían ser compuestos terapéuticamente activos (por ejemplo, derivados de ácido graso regulatorios y otros grupos lipofílicos, por ejemplo, derivados de vitamina, derivados de esteroides, etc., tales como análogos de colecalciferol y tocoferol) que están unidos mediante un enlace éster al fosfolípido en la posición sn-2 y, por lo tanto, el derivado lipídico ofrece un sustrato para la FLA_{2}.

La posibilidad de incluir la sustancia activa farmacéuticamente en los liposomas como "segundas sustancias farmacológicas" (véase a continuación) parece particularmente interesante en relación con aplicaciones dérmicas.

De este modo, la invención descrita en la presente descripción ofrece una solución tanto para la cuestión de la penetración en la piel y membranas mucosas intactas como para la cuestión del direccionamiento hacia células, tejidos o partes de los tejidos específicas que se caracterizan por un nivel incrementado de FLA_{2}.

Derivados lipídicos

Los sistemas de administración de fármacos (liposomas) para su utilización en la presente invención cuentan con un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la FLA_{2} extracelular en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológicamente activa se libera en forma de un lisoderivado lipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa.

Aunque los términos "lípido" y "lisolípido" (en el contexto de los fosfolípidos) son términos bien conocidos para un técnico en la materia, se debe poner énfasis en que, dentro la presente descripción y las reivindicaciones adjuntas, se pretende que el término "lípido" signifique triésteres de glicerol de fórmula siguiente:

\uelm{C}{\uelm{\para}{\uelm{CH
--- O --- R ^{B} }{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R ^{A} }}}}

H_{2} --- O --- R^{C}

en la que R^{A} y R^{B} son fragmentos de ácido graso (alquilo/alquileno/alquildieno/alquiltrieno/alquiltetraeno-C(=O)-C_{9-30}) y R^{C} es un ácido fosfatídico (PO_{2}-OH) o un derivado de ácido fosfatídico. De este modo, los grupos R^{A} y R^{B} están unidos a la columna de glicerol por medio de enlaces éster.

Se pretende que el término "lisolípido" signifique un lípido en el que el grupo ácido graso R^{B} está ausente (por ejemplo, escindido hidrolíticamente), es decir, un derivado de glicerol de la fórmula anterior en la que R^{B} es un hidrógeno, pero en la que los otros sustituyentes están sustancialmente no afectados. La conversión de un lípido a un lisolípido puede tener lugar bajo la acción de un enzima, específicamente bajo la acción de la FLA_{2} tanto celular como extracelular.

Se pretende que los términos "derivado lipídico" y "lisoderivado lipídico" cubran los posibles derivados de los posibles compuestos anteriores, dentro de los grupos "lípido y lisolípido", respectivamente. Se dan ejemplos de derivados lipídicos y lisoderivados lipídicos biológicamente activos en Houlihan, y otros, Med. Res. Rev., 15, 3, 157-223. De este modo, como resultará evidente, la extensión de "derivado" debería entenderse en el sentido más amplio.

Dentro de la presente aplicación, sin embargo, los derivados lipídicos y lisolipídicos deben cumplir ciertos criterios funcionales (véase anteriormente) y/o requerimientos estructurales. Es particularmente relevante destacar que los derivados lipídicos adecuados son aquellos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7, preferentemente, como mínimo, 9 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico. Resultará evidente que el grupo alifático y el radical orgánico corresponderán a los dos fragmentos de ácido graso en un lípido normal y que el fragmento hidrofílico corresponderá al fragmento fosfato de un (fosfo)lípido o un bioisóstero del mismo.

De este modo, dado que la idea general subyacente en la presente invención es aprovechar el nivel incrementado de actividad de la FLA_{2} extracelular en áreas localizadas de tejido cutáneo y subcutáneo, los derivados lipídicos que se pueden utilizar en la presente invención deben ser sustratos para la FLA_{2} extracelular, es decir, los derivados lipídicos deben ser capaces de experimentar escisión hidrolítica y enzimática del radical orgánico que corresponde al ácido graso en la posición 2 de un lípido. Se conoce que la FLA_{2} extracelular pertenece a la clase de enzimas (EC) 3.1.1.4. De este modo, en referencia a la FLA_{2} (extracelular) deben entenderse todos los enzimas extracelulares de esta clase, por ejemplo, lipasas, que pueden inducir la escisión hidrolítica del radical orgánico que corresponde al ácido graso en la posición 2 de un lípido. Una ventaja particular del sistema de administración de fármacos basado en lípidos (como liposomas) es que la actividad de la FLA_{2} extracelular se incrementa significativamente frente a sustratos organizados en comparación con sustratos monoméricos.

En vistas del requerimiento de hidrolizabilidad por la FLA_{2} extracelular, resulta claro que el radical orgánico (por ejemplo, el grupo alifático) se une preferentemente por medio de una funcionalidad éster que se puede hidrolizar por la FLA_{2} extracelular, de modo que, preferentemente, el grupo que se escinde es un ácido carboxílico.

Además, una característica importante es que el grupo alifático (el grupo que corresponde al ácido graso en la posición 1 de un lípido) del derivado lipídico, es decir, el lisoderivado lipídico después de la hidrólisis por la FLA_{2} extracelular no está sustancialmente afectado por la acción de la FLA_{2} extracelular. Por "sustancialmente no afectado" se pretende decir que la integridad del grupo alifático se preserva y que menos del 1% molar, preferentemente, menos del 0,1 % molar, del grupo alifático (el grupo alifático en la posición 1) se hidroliza por la acción de la lisofosfolipasa.

Además, el lisoderivado lipídico resultante de la escisión hidrolítica del radical orgánico no debe ser en sí mismo un sustrato para la lisofosfolipasa. Se conoce que la lisofosfolipasa pertenece a la clase de enzimas (EC) 3.1.1.5. De este modo, en referencia a la lisofosfolipasa deben entenderse todos los enzimas de esta clase que catalizan la reacción liso(fosfo)lípido + agua que producen fosfoglicerol + ácido graso. Se pretende que el término "no es un sustrato para la lisofosfolipasa" signifique que la lisofosfolipasa tiene una actividad de menos del 1% frente al sustrato, en comparación con el correspondiente esterlípido, es decir, no tiene virtualmente actividad enzimática.

Ejemplos adecuados de estos lisoderivados lipídicos son aquellos que no experimentarán escisión hidrolítica por la acción de las lisofosfolipasas. De este modo, en particular, los lisoderivados lipídicos no son lisolípidos y lisoderivados lipídicos que tienen una unión éster en la posición 1 del lisolípido o en la posición de un lisoderivado lipídico que corresponde a la posición 1 de un lisolípido.

Una clase preferente de derivados lipídicos para su incorporación en los sistemas de administración de fármacos se puede representar por la fórmula siguiente:

\uelm{C}{\uelm{\para}{\uelm{CH
--- Y --- R ^{2} }{\uelm{\para}{CH _{2}  --- X ---
R ^{1} }}}}

H_{2} --- Z --- R^{3}

en la que

X y Z se seleccionan independientemente de entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2}, preferentemente de entre O, NH, NMe y CH_{2}, en particular O;

Y es -OC(O)-, Y está conectada a continuación con R^{2} bien por medio del oxígeno o bien el átomo de carbono del carbonilo, preferentemente por medio del átomo de carbono del carbonilo;

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, tales como un grupo alifático que tiene una longitud de, como mínimo, 7, preferentemente, como mínimo, 9 átomos de carbono, preferentemente un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2};

en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7}-(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 29; n1 es cero o un número entero de 1 a 29, n3 es cero o un número entero desde 1 a 20, n5 es cero o un número entero de 1 a 17, n7 es cero o un número entero de 1 a 14, y n9 es cero o un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8 son independientemente cero o 1; y Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; en la que cada uno de los Y^{1}-Y^{2} pueden estar sustituidos independientemente con halógeno o alquilo C_{1-4}, pero preferentemente Y^{1}-Y^{2} no está sustituido,

\newpage

R^{3} se selecciona de entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros al ácido fosfático y derivados de los mismos.

Como se ha mencionado anteriormente, realizaciones preferentes implican que Y es -OC(O)-, en el que Y está conectado a R^{2} por medio del átomo de carboxilo. Las realizaciones más preferentes implican que X y Z son O y que Y es -OC(O)-, en el que Y está conectado a R^{2} por medio del átomo de carboxilo. Esto significa que el derivado lipídico es un compuesto del tipo 1-monoéter-2-monoéster-fosfolípido.

Otro grupo de derivados lipídicos preferente es aquel en el que el grupo X es S.

En una realización, R^{1} y R^{2} son grupos alifáticos de fórmula Y^{1}-Y^{2} en la que Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H, pero preferentemente CH_{3}, y en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}(CH=CH)_{n2}(CH_{2})_{n3}(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}(CH=CH)_{n6}(CH_{2})_{n7}(CH=CH)_{n8}(CH_{2})_{n9}; la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 23; es decir, el grupo alifático, Y^{1}-Y^{2}, es de 10-24 átomos de carbono de longitud. n1 es igual a cero o es un número entero de 1 a 23; n3 es igual a cero o es un número entero de 1 a 20; n5 es igual a cero o es un número entero de 1 a 17; n7 es igual a cero o es un número entero de 1 a 14; n9 es igual a cero o es un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8, independientemente, es igual a cero o 1.

Aunque los grupos alifáticos puede estar insaturados e incluso sustituidos con halógenos (fluoro, cloro, bromo, yodo) y grupos C_{1-4} (es decir, generando grupos alifáticos ramificados), en una realización los grupos alifáticos tales como R^{1} y R^{2} están preferentemente saturados así como no ramificados, es decir, preferentemente no tienen dobles enlaces entre átomos de carbono adyacentes, siendo entonces cada uno de los n2, n4, n6 y n8 igual a cero. Por consiguiente, Y^{1} es preferentemente (CH_{2})_{n1}. Más preferentemente (en esta realización), cada uno de los R^{1} y R^{2} son independientemente (CH_{2})_{n1}CH_{3}, y más preferentemente, (CH_{2})_{17}CH_{3} o (CH_{2})_{15}CH_{3}. En realizaciones alternativas, los grupos pueden tener uno o más dobles enlaces, es decir, estos pueden ser insaturados, y uno o más de los n2, n4, n6 y n8 pueden ser igual a 1. Por ejemplo, en los casos en los que los hidrocarburos insaturados tienen un doble enlace, n2 es igual a 1, cada uno de los n4, n6 y n8 son igual a cero y Y^{1} es (CH_{2})_{n1}CH=CH(CH_{2})_{n3}. n1 es igual a cero o es un número entero de 1 a 21, y n3 es también cero o un número entero de 1 a 20, siendo como mínimo uno de los n1 o n3 no igual a cero.

En una realización particular, los derivados lipídicos son lípidos monoéter en los que X y Z son O, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente de entre grupos alquilo, (CH_{2})_{n}CH_{3}, en los que n es 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29, preferentemente 14, 15 o 16, en particular 14; Y es -OC(O)-, estando a continuación Y conectado a R^{2} por medio del átomo de carbono de carbonilo.

Con respecto al fragmento hidrofílico (conocido habitualmente como el "grupo de cabeza") que corresponde a R^{3}, se cree que se pueden utilizar una gran variedad de grupos que corresponden a ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros de ácido fosfático y derivados de los mismos. Como resultará evidente, el requerimiento crucial de R^{3} es que los grupos deben permitir la hidrólisis enzimática del grupo R^{2} (en realidad R^{2}-C(=O) o R^{2}-OH) por la FLA_{2} extracelular. De hecho, los "bioisósteros del ácido fosfatídico y derivados de los mismos" implican que estos grupos, tales como el ácido fosfatídico, deben permitir la hidrólisis enzimática por la FLA_{2} extracelular.

Típicamente, se selecciona R^{3} de entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), fosfatidilcolina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{3}), fosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NH_{2}), N-metil-fosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NCH_{2}), fosfatidilserina, fosfatidilinositol, y fosfatidilglicerol (PO_{2}-O-CH_{2}CHOHCH_{2}OH). Otros derivados posibles de ácido fosfatídico son aquellos en los que ácidos dicarboxílicos, tales como los ácidos glutárico, sebácico, succínico y tartárico, se acoplan al nitrógeno terminal de fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, etc.

Un aspecto altamente interesante es la posibilidad de modificación del efecto farmacéutico del derivado lipídico modificando el grupo R^{2}. Debe entenderse que R^{2} debe ser un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono (tales como un grupo alifático que tiene una cierta longitud (como mínimo 7, preferentemente 9, átomos de carbono)), es posible un elevado grado de variabilidad, por ejemplo, no es necesario que R^{2} sea un residuo de cadena larga, pero puede representar estructuras más complejas.

Generalmente, se cree que R^{2} bien puede ser bastante inerte al ambiente en el que éste se puede liberar por la FLA_{2} extracelular o bien que R^{2} pueden tener una función farmacéutica activa, típicamente como una sustancia farmacológica auxiliar para el tratamiento de afecciones de la piel o como un modificador de la eficiencia para el lisoderivado lipídico y/o cualquier otra (segunda) sustancia farmacológica presente en el ambiente.

En algunas realizaciones, el grupo R^{2} será un residuo de cadena larga, por ejemplo, un residuo de ácido graso (el ácido graso incluirá un carbonilo del grupo Y). Esto se ha descrito con detalle anteriormente. Ejemplos interesantes de sustancias farmacológicas auxiliares, tal como R^{2}, dentro de este subgrupo son los ácidos poliinsaturados, por ejemplo, oleato, linoleico, linonleico, así como derivados de araquidonoílo (incluyendo el carbonilo de Y), por ejemplo, prostaglandinas tales como la prostaglandina E_{1}, ya que los derivados de ácido araquidónico son reguladores conocidos de la acción hormonal, entre las que se incluyen la acción de prostaglandinas, tromboxanos, y leucotrienos. Ejemplos de modificadores de eficiencia, tal como R^{2}, son aquellos que aumentan la permeabilidad de la membrana celular diana, así como los que aumentan la actividad de la FLA_{2} extracelular o la sustancia farmacológicamente activa o cualquier segunda sustancia farmacológica. Ejemplos de los mismos son ácidos grasos de cadena corta (C_{8-12}).

Sin embargo, se prevé además que otros grupos pueden ser útiles tal como el radical orgánico R^{2}, por ejemplo, derivados de vitamina D, derivados de esteroides, ácido retinoico (que incluye ácido todo-trans-retinoico, ácido todo-cis-retinoico, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico), análogos de colecalciferol y tocoferol, ácidos carboxílicos farmacológicamente activos tales como ácidos carboxílicos alifáticos de cadena ramificada (por ejemplo, ácido valproico y aquellos descritos en la Patente WO 99/02485), ácidos salicílicos (por ejemplo, ácido acetilsalicílico), ácidos carboxílicos esteroidales (por ejemplo, ácidos lisérgico e isolisérgico), ácidos carboxílicos monoheterocíclicos (por ejemplo, ácido nicotínico) y ácidos carboxílicos poliheterocíclicos (por ejemplo, penicilinas y cefalosporinas), diclofenaco, indometacina, ibuprofeno, naproxeno, ácido 6-metoxi-2-naftilacético, así como derivados de ácido graso tales como derivados de ácido graso N-(\omega-3).

Debe entenderse que los diferentes ejemplos de posibles grupos R^{2} se denominan por el nombre de una especie discreta, en vez del nombre del radical. Además, debe entenderse que los posibles ejemplos pueden incluir el grupo carbonilo o el grupo oxi del enlace por medio del que el radical orgánico está unido al esqueleto lipídico (que corresponde a "Y" en la fórmula anterior). Por supuesto, esto se entenderá por los técnicos en la materia.

Aunque no se ha indicado específicamente en la fórmula general para los ejemplos adecuados de derivados lipídicos que van a utilizarse en la presente invención, debe entenderse que el fragmento de glicol de los derivados lipídicos se puede sustituir, por ejemplo, a efectos de modificar la velocidad de hidrólisis por la FLA_{2} extracelular o simplemente a efectos de modificar las propiedades de los liposomas que comprenden los derivados lipídicos.

Derivados lipídicos como profármacos

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invención proporciona la utilización de un sistema de administración de fármacos basado en lípidos para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del tratamiento de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento localizado de la actividad de la FLA_{2} extracelular en la piel de un mamífero, en forma de liposomas, para la administración de una sustancia farmacológicamente activa que se selecciona de entre los lisoderivados lipídicos, comprendiendo dicho sistema un compuesto de actividad interfacial, y dicha sustancia farmacológicamente activa está presente en el sistema basado en lípidos en la forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la FLA_{2} extracelular en la medida de que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente no afectado, de manera que se libera la sustancia farmacológicamente activa en forma de un lisoderivado lipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa.

El término "sustancia farmacológicamente activa" significa cualquier entidad química que proporcionará un efecto profiláctico o terapéutico en el cuerpo de un mamífero, en particular un humano, especialmente con respecto a las enfermedades de la piel. Además, en la presente descripción, las sustancias que pueden encontrar utilización para propósitos cosméticos son consideradas "sustancias farmacológicamente activas".

El término "profármaco" debe entenderse en el sentido normal, en concreto como un fármaco que está enmascarado o protegido con el propósito de convertirse (típicamente por hidrólisis, pero además por conversión química in vivo) a la sustancia farmacológica pretendida. Un técnico en la materia reconocerá el alcance del término "profármaco". Además, en la presente descripción, sustancias que pueden encontrar utilización para propósitos cosméticos son consideradas un "profármaco".

La sustancia farmacológicamente activa se selecciona de entre los lisoderivados lipídicos, tal como se entenderá de la presente descripción con las reivindicaciones, los lisoderivados lipídicos relevantes dentro de la presente invención tendrán, como mínimo, un efecto terapéutico relacionado con las enfermedades y afecciones especificadas en la presente descripción, es decir, enfermedades y afecciones particulares en la que un área local del cuerpo del mamífero tiene un nivel de actividad de FLA_{2} extracelular que puede liberar el lisoderivado lipídico.

Tal como se entenderá de la presente descripción con las reivindicaciones, el derivado lipídico constituirá habitualmente el profármaco referido anteriormente y el lisoderivado lipídico constituirá de esta manera la sustancia farmacológicamente activa, habitualmente un lisoderivado lipídico monoéter. Sin embargo, debe entenderse que esto no excluye la posibilidad de incluir otras sustancias farmacológicas, denominadas segundas sustancias farmacológicas, en los sistemas de administración de fármacos, ni excluye que el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente por la acción de la FLA_{2} extracelular pueda tener un cierto efecto farmacéutico (por ejemplo, como sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de eficiencia, tal como se describe en otras partes de la presente descripción). Además, el efecto farmacéutico de la "sustancia farmacológicamente activa", es decir, el lisoderivado lipídico, no es necesariamente el más predominante en los casos en los que se incluye una segunda sustancia farmacológica, en realidad el efecto de la segunda sustancia farmacológica muy bien puede ser el más predominante, como se destacará en la otra realización principal (véase "Liposomas derivados lipídicos como sistemas de administración de fármacos", a continuación).

Se cree que la liberación de la sustancia farmacológicamente activa (lisoderivado lipídico) del profármaco (derivado lipídico) tiene lugar como se ilustra en el siguiente ejemplo:

1

Además, el sustituyente R^{2} puede estar constituido por una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficiencia para la sustancia farmacológicamente activa y se liberará de forma simultánea bajo la acción de la FLA_{2} extracelular:

2

Se ha descrito anteriormente en la definición de R^{2} como el grupo R^{2} puede tener varios efectos independientes o sinergísticos en asociación con la sustancia farmacológicamente activa, por ejemplo, como una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficiencia, por ejemplo, modificador de la permeabilidad o lisis celular. Debe tenerse en cuenta que los grupos que corresponden a R^{2} (por ejemplo, R^{2}-OH o R^{2}-COOH) pueden tener un efecto farmacéutico que es predominante en relación al efecto del lisoderivado lipídico (sustancia farmacológicamente activa).

Como es evidente para aquellos técnicos en la materia, el criterio para los efectos es menos riguroso para los componentes de formulaciones cosméticas.

Derivados lipídicos formulados como liposomas

El término "sistema de administración de fármacos basado en lípidos en forma de liposomas" debe abarcar estructuras macromoleculares que incluyen, como el constituyente principal, lípidos o derivados lipídicos, y que al mismo tiempo son capaces de experimentar suficiente deformación para permitir que la estructura pase a través del estrato córneo y llegue profundamente dentro de la piel de un mamífero. Un ejemplo preferente en la presente descripción son los liposomas flexibles (por ejemplo, Transfersomes®) tal como los descritos por la compañía IDEA AG, Alemania, en la patente U.S.A. No. 6.165.500.

En una variante importante que se puede combinar de forma ventajosa con las realizaciones descritas en la presente descripción, el derivado lipídico (por ejemplo, el profármaco) se incluye en los liposomas en combinación con otros constituyentes (tensoactivos, otros lípidos, agentes, etc.) de una forma que el liposoma se vuelve suficientemente flexible. De este modo, los sistemas basados en lípidos descritos en la presente descripción están preferentemente en la forma de liposomas, en los que los liposomas se forman de capas que comprenden el derivado lipídico (por ejemplo, un profármaco).

Otros constituyentes importantes de los liposomas, en concreto los constituyentes que proporcionan las propiedades de flexibilidad a los liposomas, generalmente se pueden caracterizar como "sustancias con actividad interfacial" farmacéuticamente aceptables, en concreto, los constituyentes que "alisarán" o "suavizarán" la membrana lipídica.

Según la presente aplicación, una "sustancia con actividad interfacial" es cualquier sustancia capaz de inducir o aumentar la capacidad de los sistemas portadores para formar interfases, protrusiones o superficies curvadas de forma relativamente importante; además, esta propiedad se manifiesta a sí misma por la capacidad para inducir poros en estructuras lipídicas, tales como membranas, o incluso provocar una solubilización (lisis) en intervalos de concentración más elevados. Hablando más estrictamente, todas estas sustancias se consideran activas de interfase que muestran una tendencia a acumularse en las fronteras entre las partes polares y apolares de las moléculas o cerca de las mismas y/o cerca de las fronteras entre las partes polares y apolares de los agregados supramoleculares o en los mismos, disminuyendo de este modo la energía libre para la formación de interfases y/o superficies fuertemente curvadas. Todos los tensoactivos y muchos disolventes, así como las moléculas o polímeros asimétricos, y de este modo amfipáticos, tales como muchos oligo y policarbohidratos, oligo y polipéptidos, oligo y polinucleótidos o sus derivados también pertenecen a esta categoría. Preferentemente, el tensoactivo o material de tipo tensoactivo es un tensoactivo no iónico, zwitteriónico, aniónico o catiónico, especialmente un ácido o alcohol graso, un sal de alquil-tri/di metil-amonio, una sal de alquilsulfato, una sal monovalente de colato, deoxicolato, glicocolato, glicodeoxicolato, taurodeoxicolato, taurocolato, etc., un acil o alcanoíl-dimetilaminóxido, especialmente un dodecil-dimetil-aminóxido, un alquil o alcanoíl-N-metilglucamida, N-alquil-N,N-dimetilglicina, alcanosulfonato de 3(acildimetilamonio), N-acil-sulfobetaína, un polietilenglicol-octilfenil éter, especialmente un nonaetilen-glicoloctilfenil éter, un polietilen-acil éter, especialmente un nonaetilen-dotiecil éter, un polietilenglicol-isoacil éter, especialmente un octaetilenglicolisotridecil éter, polietilen-acil éter, especialmente octaetilendodecil éter, acil éster de polietilenglicol-sorbitán, tal como monolaurato de polietilenglicol-20 (Tween 20) o monooleato de polietilenglicol-20-sorbitán (Tween 80), un polihidroxietilen-acil éter, especialmente polihidroxietilenlauril, miristoíl, cetilestearil, u oleoíl éter, como en los polihidroxietilen 4 o 6 o 8 o 10 o 12, etc., lauril éteres (tal como en las series Brij), o en los correspondientes ésteres, por ejemplo, tipo estearato laurato u oleato de polihidroxietilen-8 (Myrj 45), o en aceite de ricino polietoxilado 40, un monoalquilato de sorbitán (por ejemplo, en Arlacel o Span), especialmente monolaurato de sorbitán, una acil o alcanoíl-N-metilglucamida, especialmente en decanoíl o dodecanoíl-N-metilglucamida, un alquilsulfato (sal), por ejemplo, en lauril o oleoílsulfato, deoxicolato sódico, glicodeoxicolato sódico, oleato sódico, taurato sódico, una sal de ácido graso, tal como elaidato sódico, linoleato sódico, laurato sódico, un lisofosfolípido, tal como ácido N-octadecilen (=Oleoíl)glicerofosfatídico, -glicerofosforilglicerol, o -fosforilserina, ácido N-acil-, por ejemplo, lauril u oleoíl-glicero-fosfatídico, lauril u oleoíl-glicero-fosforilglicerol, o lauril u oleoíl-glicero-fosforilserina, ácido N-tetradecil-glicero-fosfatídico, N-tetradecil-glicero-fosforilglicerol, o N-tetradecil-glicero-fosforilserina, el correspondiente palmitoeloíl-, elaidoíl-, vaccenil-lisofosfolípido o el correspondiente fosfolípido de cadena corta, o también un polipéptido de actividad superficial. Se dan otros muchos ejemplos de sustancias con actividad interfacial, de las que muchas se pueden considerar aceptables farmacéuticamente, en la patente U.S.A. No. 6.165.500, que se incorpora en la presente descripción por referencia.

Como se reconocerá por aquellos con experiencia en el tipo de enfermedad o afección que va a ser tratada, así como en el tipo de piel, se establecerán los requerimientos específicos con respecto a la proporción relativa entre los constituyentes. Generalmente, la proporción entre el lípido y la sustancia o sustancias con actividad interfacial es desde 50:1, aproximadamente, hasta 1:500, aproximadamente, tal como desde 5:1, aproximadamente, hasta 1:500, aproximadamente, desde 20:1 hasta 1:500, desde 10:1 hasta 1:500, desde 10:1 hasta 1:200, desde 10:1 hasta 1:100, desde 5:1 hasta 1:200, desde 5:1 hasta 1:100, desde 5:1 hasta 1:50, desde 5:1 hasta 1:20, o desde 5:1 hasta 1:10, preferentemente desde 5:1 hasta 1:5.

Los "liposomas" son conocidos como estructuras que se autoorganizan comprendiendo una o más bicapas de lípidos, cada una de las cuales rodea un compartimiento acuoso y comprende dos monocapas de moléculas de lípido anfipático que se oponen. Los lípidos anfipáticos (en la presente descripción, entre otros, los derivados lipídicos) comprenden un grupo polar (hidrofílico) de región de cabeza (que corresponde al sustituyente R^{3} en los derivados lipídicos) enlazado covalentemente a uno o dos grupos alifáticos no polares (hidrofóbicos) (que corresponden a R^{1} y R^{2} en los derivados lipídicos). Generalmente, se cree que contactos entre los grupos hidrofóbicos y el medio acuoso energéticamente no favorables inducen a las moléculas de lípido a reorganizarse, de manera que el grupo polar de las cabezas se orienta hacia el medio acuoso mientras que los grupos hidrofóbicos se reorientan hacia el interior de la bicapa. Se forma una estructura estable energéticamente en la que los grupos hidrofóbicos están efectivamente protegidos de entrar en contacto con el medio acuoso.

Los liposomas pueden tener una única bicapa lipídica (liposomas unilamelares, "ULVs"), o múltiples bicapas lipídicas (liposomas multilamelares, "MLVs"), y se pueden preparar por una variedad de métodos (para una revisión, véase, por ejemplo, Deamer y Uster, "Liposomas" ("Liposomes"), Marcel Dekker, Nueva York, 1983, 27-52). Entre estos métodos se incluyen los métodos de Bangham para preparar liposomas multilamelares (MLVs); los métodos de Lenk, Fountain y Cullis para preparar MLVs con una distribución de soluto interlamelar sustancialmente igual (véase, por ejemplo, las patentes U.S.A. Nos. 4.522.803, 4.588.578, 5.030.453, 5.169.637 y 4.975.282); y método de Papahadjopoulos y colaboradores de evaporación en fase inversa (la patente U.S.A. No. 4.235.871) para preparar liposomas oligolamelares. Los ULVs se pueden producir a partir de MLVs por métodos tales como sonicación (véase Papahadjopoulos y otros, Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) o extrusión (patentes U.S.A. Nos. 5.008.050 y 5.059.421). El liposoma se puede producir por los métodos de cualquiera de estos descubrimientos así como por el método utilizado en la patente U.S.A. No. 6.165.500, los contenidos de todos se incorporan en la presente descripción por referencia.

Se pueden utilizar varias metodologías, tales como sonicación, homogenización, aplicación de la prensa francesa y molienda para preparar liposomas de un tamaño más pequeño a partir de liposomas más grandes. La extrusión (véase la patente U.S.A. No. 5.008.050) se puede utilizar para reducir el tamaño de los liposomas, es decir, para producir liposomas que tienen un tamaño medio predeterminado, forzando que los liposomas, bajo presión, atraviesen los poros de un filtro de un tamaño definido y seleccionado. Además, se puede utilizar la filtración por flujo tangencial (véase la patente WO 89/08846) para regularizar el tamaño de los liposomas, es decir, para producir liposomas que tienen una población de liposomas que tienen menos heterogeneidad de tamaño, y una distribución de tamaños más homogénea y definida. El contenido de estos documentos se incorpora en la presente descripción por referencia. Además, se pueden determinar los tamaños de los liposomas por muchas técnicas, tales como dispersión de la luz cuasi elástica, y con un equipamiento, por ejemplo, el medidor de partícula Nicomp®, que están dentro del conocimiento ordinario de los técnicos en la materia.

Es bastante interesante destacar que los derivados lipídicos junto con la sustancia o sustancias con actividad interfacial constituyen la mayor parte de los sistemas basados en lípidos (sistema de liposoma). Este hecho reside en la similaridad estructural (pero no funcional) entre los derivados lipídicos y los lípidos. De este modo, se cree que los derivados lipídicos y las sustancias con actividad interfacial pueden ser el constituyente único de los liposomas, es decir, hasta el 100% molar del total de los liposomas deshidratados puede estar constituido por los derivados lipídicos y las sustancias con actividad interfacial. Esto contrasta con los lisolípidos mono-éter conocidos, que pueden constituir solamente una parte minoritaria de los liposomas.

Dicho esto, se cree que la combinación de derivados lipídicos y una sustancia con actividad interfacial constituirán típicamente el 50-100% molar, tal como el 60-100% molar, preferentemente desde el 75-100% molar, en particular desde el 90-100% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Los liposomas pueden incluir también otros constituyentes que pueden tener o no un efecto farmacéutico, pero que harán a la estructura del liposoma más aceptable para las aplicaciones tópicas de la piel. Ejemplos de esto son otros lípidos, compuestos esterólicos, y compuestos de direccionamiento, etc. En algunas realizaciones interesantes, los liposomas además comprenden otros lípidos, por ejemplo, diacilfosfolípidos.

Los liposomas que comprenden derivados lipídicos pueden comprender exclusivamente (en principio) derivados lipídicos. Sin embargo, a efectos de modificar los liposomas, se pueden incluir también "otros lípidos". Los otros lípidos se seleccionan por su capacidad para adaptarse a conformaciones de empaquetamiento compatibles con los componentes del derivado lipídico de la bicapa, de modo que la totalidad de los constituyentes del lípido están tensamente empaquetados, y se inhibe la liberación de los derivados lipídicos desde la bicapa. Los factores basados en lípidos que contribuyen a conformaciones de empaquetamiento compatibles son bien conocidos por los técnicos con experiencia ordinaria en la materia y entre éstos se incluyen, sin que constituyan limitación, la longitud de cadena de acilo y el grado de insaturación, así como el tamaño del grupo de cabeza y su carga. Por consiguiente, se pueden seleccionar otros lípidos adecuados, entre los que se incluyen varias fosfatidiletanolaminas ("PEs") tales como fosfolípidos de huevo o soja o dioleoíl fosfatidiletanolamina ("DOPE"), por técnicos con experiencia ordinaria en la materia sin una experimentación excesiva. Los lípidos se pueden modificar de varias formas, por ejemplo, por derivatización del grupo de cabeza con ácidos dicarboxílicos, tales como ácidos glutárico, sebácico, succínico y tartárico, preferentemente el ácido dicarboxílico es ácido glutárico ("GA").

Por consiguiente, entre los lípidos adecuados con el grupo de cabeza derivatizado se incluyen fosfatidiletanolamina-ácidos dicarboxílicos tales como dipalmitoíl fosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("DPPE-GA"), palmitoiloleoíl fos-
fatidiletanolamina-ácido glutárico ("POPE-GA") y dioleoíl fosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("DOPE-GA"). Más preferentemente, el lípido derivatizado es DOPE-GA.

El contenido total de "otros lípidos" estará típicamente dentro del intervalo del 0-30% molar, en particular del 1-10% molar o 0-10% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Compuestos esterólicos incluidos en el liposoma generalmente pueden afectar a la fluidez de las bicapas lipídicas. Por consiguiente, las interacciones del esterol con los grupos hidrocarbonados de alrededor inhiben generalmente la migración de estos grupos de la bicapa. Ejemplos de un compuesto esterólico (esterol) a incluirse en el liposoma son colesterol, pero son posibles una variedad de otros compuestos esterólicos. Generalmente, se cree que el contenido de compuesto esterólico, si está presente, estará dentro del intervalo del 0-25% molar, en particular del 0-10% molar, tal como el 0-5% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Aún otros ingredientes pueden constituir el 0-2% molar, en particular el 0-1% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Sistemas particulados basados en lípidos, es decir, liposomas; de tamaños que abarcan un amplio intervalo, se pueden preparar según las técnicas que se han mencionado anteriormente. Dependiendo de la aplicación particular, los tamaños adecuados para aplicaciones farmacéuticas estarán normalmente dentro del intervalo de 20-10.000 nm, en particular dentro del intervalo de 30-1000 nm. Normalmente, son preferentes tamaños dentro del intervalo de
50-200 nm.

Los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares. Algunos liposomas preferentes son unilamelares y tienen diámetros menores de 200 nm, aproximadamente, más preferentemente, desde mayores de 50 nm, aproximadamente, hasta menores de 200 nm, aproximadamente.

Los liposomas, tal como se conoce en la técnica, se preparan típicamente por un método que comprende las etapas de: (a) disolución del derivado lipídico y la sustancia con actividad interfacial y los otros constituyentes en un disolventes orgánico; (b) eliminación del disolvente orgánico de la solución de derivado lipídico de la etapa (a); y (c) hidratación del producto de la etapa (b) con un disolvente acuoso para que se formen liposomas.

El método puede comprender adicionalmente una etapa de adición de una segunda sustancia farmacológica (véase anteriormente) al disolvente orgánico de la etapa (a) o a la fase acuosa de la etapa (c).

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Posteriormente, el método puede comprender una etapa de extrusión de los liposomas producidos en la etapa (c) a través de un filtro para producir liposomas de un cierto tamaño, por ejemplo, 100 nm.

El liposoma puede deshidratarse, almacenarse y, a continuación, reconstituirse de manera que se retiene una parte sustancial de su contenido interno. La deshidratación de los liposomas requiere generalmente de la utilización de un protector de secado hidrofílico, tal como un azúcar disacárido tanto en las superficies interiores como exteriores de las bicapas liposómicas (véase la patente U.S.A. No. 4.880.635). Generalmente, se cree que este compuesto hidrofílico impide la reorganización de los lípidos en el liposoma, de modo que se mantienen el tamaño y los contenidos durante el procedimiento de secado y la posterior rehidratación. Las cualidades apropiadas de estos protectores de secado son la capacidad de ser aceptores fuertes de enlaces de hidrógeno, y poseer características estereoquímicas que preserven el espaciado intramolecular de los componentes de la bicapa liposómica. Alternativamente, se puede omitir el protector de secado si la preparación de liposomas no se congela anteriormente a la deshidratación, y permanece suficiente agua en la preparación posteriormente a la deshidratación.

Liposomas de derivados lipídicos como sistemas portadores de fármacos

Como se ha mencionado anteriormente, los liposomas que incluyen los derivados lipídicos pueden incluir también segundas sustancias farmacológicas. En una realización particular, los sistemas de administración de fármacos basados en lípidos descritos anteriormente están en forma de liposomas en los que se incorpora una segunda sustancia farmacológica. Debe entenderse que segundas sustancias farmacológicas pueden comprender ingredientes activos farmacéuticamente que pueden tener un efecto farmacéutico individual o sinergístico en combinación con el derivado lipídico y los lisoderivados lipídicos. El término "segundo" no implica necesariamente que el efecto farmacéutico de la segunda sustancia farmacológica sea inferior en relación al de, por ejemplo, la sustancia farmacológicamente activa derivada del profármaco, sino que solamente se utiliza para diferenciar entre los dos grupos de sustancias.

Una posible "segunda sustancia farmacológica" es cualquier compuesto o composición de materia que se puede administrar a mamíferos, preferentemente humanos. Estos agentes pueden tener actividad biológica en mamíferos. Entre las segundas sustancias farmacológicas que se pueden asociar con liposomas se incluyen, pero no constituyen limitación: agentes antivirales tales como aciclovir, zidovudina y los interferones; agentes antibacterianos tales como aminoglicósidos, cefalosporinas y tetraciclinas; agentes antifúngicos tales como antibióticos de polieno, imidazoles y triazoles; agentes antimetabólicos tales como ácido fólico, y análogos de purina y pirimidina; agentes antineoplásicos tales como el antibiótico de antraciclina y alcaloides vegetales; esteroles tales como colesterol; carbohidratos, por ejemplo, azúcares y almidones; aminoácidos, péptidos, proteínas tales como proteínas receptoras celulares, inmunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmisores y glicoproteínas; colorantes; anestésicos locales; y similares.

Los liposomas se pueden cargar con una o más segundas sustancias farmacológicas solubilizando el fármaco en la fase lipídica o acuosa utilizada para preparar los liposomas. Alternativamente, las segundas sustancias farmacológicas ionizables se pueden cargar dentro de los liposomas mediante la formación en primer lugar de los liposomas, el establecimiento de un potencial electroquímico, por ejemplo, por medio de un gradiente de pH, a través de la bicapa de liposomas más externa y, a continuación, la adición de la segunda sustancia farmacológica ionizable al medio acuoso externo al liposoma (véase, por ejemplo, la patente U.S.A. No. 5.077.056 y patente WO 86/01102).

Son conocidos en la técnica métodos de preparación de derivados farmacológicos lipofílicos que son adecuados para la formulación de liposomas (véase por ejemplo, las patentes U.S.A. Nos. 5.534.499 y 6.118.011 que describen el enlace covalente de agentes terapéuticos a un ácido graso de cadena de un fosfolípido). Una formulación micelar de taxol se describe en Alkan-Onkyuksel y otros, Pharmaceutical Research, 11:206 (1994).

Por consiguiente, la segunda sustancia farmacológica puede ser una cualquiera de una amplia variedad de ingredientes activos farmacéuticamente conocidos y posibles, aplicables para enfermedades y afecciones en el tejido epidérmico, dérmico o subcutáneo de la piel. Debido al mecanismo involucrado en la degradación de los liposomas, es preferente que la segunda sustancia farmacológica sea una relacionada a las enfermedades y/o afecciones de la piel asociadas con un aumento localizado en la actividad de la FLA_{2} extracelular, tales como: derivados de
araquidonoílo.

Se prevé que la segunda sustancia farmacológica se distribuirá en el liposoma según su hidrofilicidad, es decir, segundas sustancia farmacológicas hidrofílicas tenderán a estar presentes en la cavidad de los liposomas y segundas sustancias farmacológicas hidrofóbicas tenderán a estar presentes en la bicapa hidrofóbica. Los métodos para la incorporación de segundas sustancias farmacológicas son conocidos en la técnica como se ha dejado claro anteriormente.

A partir de lo anterior, debe entenderse que los derivados lipídicos pueden, como profármacos o constituyentes discretos, poseer una actividad farmacéutica. Sin embargo, en una realización particular, la presente invención además se refiere a la utilización de un sistema de administración de fármacos basado en lípidos en forma de liposomas para la administración de una segunda sustancia farmacológica, en la que la segunda sustancia farmacológica se incorpora en el sistema (por ejemplo, en la que la segunda sustancia farmacológica se encapsula en el interior del liposoma o en la parte de la membrana del liposoma), incluyendo dicho sistema derivados lipídicos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, en el que el derivado lipídico además es un sustrato para la FLA_{2} extracelular en la medida en que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente no afectado, de manera que da como resultado un fragmento de ácido orgánico o un fragmento de alcohol orgánico y un lisoderivado lipídico, no siendo dicho derivado lisolipídico un sustrato para la lisofosfolipasa.

Como se ha descrito anteriormente para el sistema según las otras realizaciones, el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente, puede ser una sustancia farmacológica auxiliar o una modificadora de la eficiencia para la segunda sustancia farmacológica. Debe entenderse que el derivado lipídico es un derivado lipídico tal como también se ha definido anteriormente. Típicamente, la combinación del derivado lipídico y la sustancia con actividad interfacial constituye el 50-100% molar, tal como el 90-100% molar, del total del sistema (liposoma) deshidratado.

Preparaciones farmacéuticas y utilizaciones terapéuticas

Típicamente, las enfermedades o afecciones a tratarse o aliviarse se seleccionan de entre cáncer de piel, soriasis, y afecciones inflamatorias.

La composición farmacéutica a administrarse a la persona con necesidad de la misma comprende típicamente un portador farmacéuticamente aceptable y el liposoma.

Los "portadores farmacéuticamente aceptables", tal como los que se utilizan en la presente descripción, son aquellos medios generalmente aceptables para su utilización en conexión con la administración de liposomas, entre los que se incluyen formulaciones farmacológicas de liposomas, a mamíferos, entre los que se incluyen humanos. Generalmente, los portadores farmacéuticamente aceptables se formulan de acuerdo con muchos factores, que se determinan y se tienen en cuenta dentro del ámbito del técnico con experiencia ordinaria, entre los que se incluyen, sin que constituya limitación: la sustancia farmacológicamente activa particular y/o la segunda sustancia farmacológica utilizadas, la preparación de los liposomas, su concentración, estabilidad y biodisponibilidad pretendidas; la enfermedad, trastorno o afección que se va a tratar con la composición de liposomas; el individuo, su edad, tamaño y condición física general; y la ruta de administración de la composición pretendida (en la presente descripción: dérmica). Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener ingredientes adicionales, por ejemplo aquellos que aumentan la estabilidad de los ingredientes activos incluidos, tales como conservantes y antioxidantes.

Las composiciones tópicas de la presente invención se pueden preparar dentro de una gran variedad de tipos de producto. Entre estos se incluyen, sin que constituya limitación, soluciones, lociones, cremas, productos de playa, geles, barras, pulverizadores, compresas, pomadas, pastas, espumas y productos cosméticos. Estos tipos de producto pueden comprender varias tipos de sistemas portadores de liposomas entre los que se incluyen las sustancias descritas en la presente invención.

Es bien conocida la formulación y preparación de estas composiciones para aquellos con experiencia en la técnica de formulación farmacéutica. Se pueden encontrar formulaciones específicas en el libro de consulta "Ciencias farmacéuticas de Remington" ("Remington's Pharmaceutical Sciences").

En dermatología, se utilizan dosis de aplicación de hasta 50 mg, habitualmente hasta 10 mg y muy frecuentemente menos de 2,5 mg (o incluso menos de 1 mg) de sustancia portadora por cm cuadrado de superficie de piel, y las masas dadas pertenecen a la sustancia portadora básica. La masa óptima depende de la composición de portador, la profundidad de penetración deseada y la duración de la acción, así como del lugar detallado de aplicación.

Para aplicaciones dérmicas, se utilizan preferentemente como portadores partículas o vesículas con un diámetro del orden de 100-10.000 nm, frecuentemente en el intervalo de 100 a 400 nm, y más frecuentemente con tamaños entre 100 y 200 nm.

La presente invención se ilustrará con los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de liposomas

Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y di-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC). Se obtuvo el DPPC de Avanti Polar lipids y 1-O-DPPC se sintetizó en el laboratorio de los presentes inventores. Brevemente, se disolvieron cantidades pesadas de DPPC o 1-O-DPPC en cloroformo. El disolvente se eliminó mediante una corriente ligera de N_{2} y las películas lipídicas se secaron toda la noche a baja presión para eliminar cantidades traza de disolvente. Se prepararon vesículas multilamelares dispersando los lípidos secos en una solución tampón que contiene: KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH=7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM y EDTA 10 \muM. Las vesículas multilamelares se extruyeron diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm de tamaño de poro, tal como se describe en Mayer y otros, Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168.

Se obtuvieron curvas de capacidad calorífica utilizando un calorímetro de barrido diferencial N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp., Provo) del tipo de energía compensada, con un volumen de célula de 0,34 ml. Antes del barrido, la suspensión de liposomas se equilibró durante 50 min en el calorímetro a la temperatura inicial. Se utilizó una velocidad de barrido de +10ºC/h. La concentración de lípido fue de 1 mM. La transición de gel a fluido de los liposomas multilamelares (MLV) se caracteriza como una transición aguda de primer orden, como se refleja por el pico estrecho en las curvas de capacidad calorífica mostradas en las figuras 1a y 1b (curvas superiores) para el 1-O-DPPC y el DPPC. El pico agudo refleja el comportamiento transicional de los liposomas multilamelares y contrasta con la transición de gel a fluido más ancha observada para los liposomas unilamelares (LUV) (Pedersen y otros, 1996, Biophys. J. 71, 554-560) tal como las mostradas en las figuras 1a y 1b (curvas inferiores) para los liposomas unilamelares extruídos de 1-O-DPPC y DPPC.

Ejemplo 2

Perfil de reacción de la Fosfolipasa A_{2} y medidas del tiempo de latencia. Se aisló fosfolipasa A_{2} de veneno de serpiente purificado (FLA_{2} a partir de Agikistrodon piscivorus piscivorus) de acuerdo con el procedimiento de Maraganore y otros, J. Biol. Chem. 259, 13839-13843. Este enzima FLA_{2} pertenece a la clase de enzimas secretores de peso molecular bajo de 14 kD que muestra similaridad estructural con la fosfolipasa A_{2} extracelular humana, indicando mecanismos moleculares comunes de la hidrólisis catalizada por la fosfolipasa en la interfase lípido-membrana (Wery y otros, Nature 352, 79-82; H\diameternger y otros Biochemistry 35, 9003-9006; Vermehren y otros, Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36). Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y a partir de 1-O-DPPC con un 5% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). Las condiciones del ensayo para el perfil de tiempo de reacción de la FLA_{2} mostradas en la figura 2 y el tiempo de latencia y porcentaje hidrólisis descritos en la Tabla 1 fueron: liposomas unilamelares 0,15 mM, FLA_{2} 150 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), 1 NaN_{3} mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM.

TABLA 1 Tiempo de latencia y porcentaje de 1-O-DPPC hidrolizado a 41ºC, tal como se determina por HPLC. La concentración de lípido fue de 0,150 mM en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH = 7,5)

Composición	Tiempo de latencia (s)	1-O-DPPC (%)
100% 1-O-DPPC	583	79
95% 1-O-DPPC/5% 1-O-DPPE-PEG350	128	73

La reacción catalítica se inició por adición de 8,9 \mul de una solución de reserva de FLA_{2} 42 \muM (150 nM) a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada (0,150 mM) y equilibrada durante 800 s anteriormente a la adición de FLA_{2}. El comportamiento característico de aumento de actividad de la FLA_{2} hacia los liposomas se señala por un aumento súbito en la fluorescencia intrínseca de la FLA_{2} a 340 nm después de la excitación a 285 nm, seguida de una disminución simultánea en la dispersión de la luz a 90º de la suspensión de lípido (H\diameternger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Muestras para análisis por HPLC de la cantidad de 1-O-DPPC no hidrolizada remanente y, por lo tanto, la cantidad de 1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-1-O-PPC) generada fueron extraídas antes de la adición de FLA_{2} y 1200 s después del tiempo de latencia observado. Se extrajeron alícuotas de 100 \mul de la suspensión de lípidos y se mezclaron rápidamente con 1 ml de una solución de cloroformo/metanol/ácido acético (2:4:1) a efectos de detener la reacción enzimática. La solución se lavó con 1 ml de agua y 20 \mul de la fase orgánica pesada se utilizó para HPLC. Los cromatogramas de HPLC en la figura 3 muestran las cantidades de 1-O-DPPC antes de la adición de FLA_{2} (t=800 s) a la suspensión de liposomas y después de la misma (t=3000 s). Se realizó el análisis por HPLC utilizando una columna de diol de 5 \mum, una fase móvil compuesta de cloroformo/metanol/agua (730:230:30, v/v) y un detector de dispersión de luz evaporativo. Se midió el ciclo de hidrólisis de lípidos catalizado por FLA_{2} de 1-O-DPPC a liso-1-O-PPC por HPLC (véase Tabla 1). La fluorescencia intrínseca del enzima y la dispersión de luz a 90º se midieron en función del tiempo, tal como se muestra en la figura 2.

Ejemplo 3 Liberación inducida por fosfolipasa A_{2} de un fármaco modelo encapsulado soluble en agua

Se prepararon liposomas de 1-O-DPPC multilamelares en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción ("self-quenching") de 20 mM hidratando una película de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina en una solución tampón de HEPES de pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase. Se formaron liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas de 1-O-DPPC que contienen calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sefadex G-50.

Las condiciones de ensayo para la liberación de calceína inducida por FLA_{2} fueron liposomas unilamelares 1-O-DPPC 25 \muM, FLA_{2} 25 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5 o 8,0), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM. A los 900 s, se añadió FLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de liposomas de 1-O-DPPC termostatizada y equilibrada durante, como mínimo, 20 min a 37ºC, anteriormente a la adición de FLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como: % de Liberación = 100 x (I_{F(t)}-I_{B}) / (I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida a tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, y I_{T} la fluorescencia total medida después de adición de Triton X-100 que conduce a la liberación completa de la calceína por rotura de los liposomas de 1-O-DPPC. La FLA_{2} indujo una liberación total del 90 por ciento de la calceína retenida en los liposomas de 1-O-DPPC, tal como se muestra en la figura 4.

Ejemplo 4 Aumento de permeabilidad controlada por la fosfolipasa A_{2} de una membrana diana modelo

Se prepararon liposomas multilamelares de membrana diana modelo, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, hidratando una película de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC) en una solución tampón de HEPES de pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase (T_{m} = 55ºC). Se formaron liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas diana multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contienen calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sefadex G-50. Se prepararon los liposomas unilamelares portadores compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina tal como se ha descrito anteriormente. Se determina la liberación de calceína de los liposomas diana midiendo la intensidad fluorescente a 520 nm después de la excitación a 492 nm.

Las concentraciones de liposomas de D-O-SPC y 1-O-DPPC fueron 25 \muM. Se añadió FLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la reacción hidrolítica conduciendo a la formación de 1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-1-O-DPPC) y productos de hidrólisis ácido graso. Dado que la calceína se libera de los liposomas D-O-SPC, debido a la incorporación del liso-1-O-DPPC polimérico que no forma bicapa y los productos de hidrólisis de ácido graso dentro de la membrana lipídica diana, se observa un aumento lineal en la fluorescencia a 520 nm después de la excitación a 492 nm, en los casos en los que la calceína se diluye en el medio de solución tampón de alrededor, tal como se muestra en la figura 5. El porcentaje de calceína liberada se determina como se ha descrito anteriormente (véase Ejemplo 3).

Ejemplo 5 Aumento de la actividad de la fosfolipasa A_{2} por 1-O-lípidos injertados a polímeros cargados negativamente

Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y 1-O-DPPC con un 5% molar 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), tal como se describe en el ejemplo 2. Las condiciones de ensayo para las mediciones de tiempo de latencia de FLA_{2} fueron liposomas unilamelares 0,15 mM, FLA_{2} 150 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM. La reacción catalítica se inició por adición de 8,9 \mul de una solución de reserva de FLA_{2} 42 \muM a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada y equilibrada durante 800 segundos a 41ºC, anteriormente a la adición de FLA_{2}. El tiempo transcurrido antes de la aparición de la rápida actividad enzimática se determina por un súbito aumento en la fluorescencia intrínseca de la FLA_{2} a 340 nm después de la excitación a 285 nm. Los resultados mostrados en la figura 7 muestran una disminución significativa en el tiempo de latencia en los casos en los que se incorpora un 5% molar del 1-O-DPPE-PEG_{350} cargado negativamente dentro de los liposomas 1-O-DPPC.

Ejemplo 6 Preparación de Micelas compuestas de 1-O-DPPE-PEG350 y DSPE-PEG750

Se prepararon micelas de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanol-amina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750 (DSPE-PEG750). Brevemente, se disolvieron cantidades pesadas de los lípidos poliméricos en cloroformo. El disolvente se eliminó mediante una ligera corriente de N_{2}. Las películas lipídicas se secaron toda la noche a baja presión para eliminar cantidades traza de disolvente. Se prepararon las micelas dispersando los lípidos poliméricos secos en una solución tampón que contiene: KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH=7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM y EDTA 10 \muM.

Ejemplo 7 Aumento de permeabilidad de membranas diana modelos controlada por la hidrólisis de micelas por la fosfolipasa A_{2}

Se prepararon liposomas multilamelares de membrana diana modelo, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, por hidratación de una película de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC) en una solución tampón de HEPES a pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase (T_{m}=55ºC). Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contienen calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sefadex G-50. Se prepararon micelas compuestas de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750 (DSPE-PEG750) tal como se ha descrito en el ejemplo 6. Se determina la liberación de calceína de los liposomas diana midiendo la intensidad fluorescente a 520 nm después de la excitación a 492 nm.

Las concentraciones de D-O-SPC y micelas de lípido polimérico fueron de 25 \muM. Se añadió FLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la reacción de hidrólisis conduciendo a la formación instantánea del liso-1-O-DPPE polimérico y los productos de hidrólisis ácidos grasos libres. Dado que la calceína se libera de los liposomas D-O-SPC, debido a la incorporación de los liso-1-O-lípidos poliméricos que no forman bicapa y los ácidos grasos dentro de la membrana lipídica diana, se observa un aumento lineal en la fluorescencia a 520 nm después de la excitación a 492 nm, en los casos en los que la calceína se diluye en el medio solución tampón de alrededor, tal como se muestra en la figura 7. El porcentaje de calceína liberada se determina como se ha descrito en el ejemplo 3. La hidrólisis catalizada por FLA_{2} de 1-O-DPPE-PEG350 indujo la velocidad de liberación mayor.

Ejemplo 8 Hidrólisis de Micelas compuestas de DSPE-PEG750

La hidrólisis de micelas compuestas de DSPE-PEG750 fue seguida por análisis de la cantidad de ácido esteárico generada. La reacción catalítica se inició por la adición de 8,9 \mul de una solución de reserva de FLA_{2} 42 \muM (150 nM) a 2,5 ml de una suspensión de micelas de DSPE-PEG750 (0,150 mM) termostatizada y equilibrada a 45ºC durante 600 segundos, anteriormente a la adición de FLA_{2}. El comportamiento característico de aumento de actividad de la FLA_{2} hacia las micelas se señala por un aumento súbito en la fluorescencia intrínseca de FLA_{2} a 340 nm después de la excitación a 285 nm, seguida por una disminución simultánea en la dispersión de luz a 90º de la suspensión de lípidos (H\diameternger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Se extrajeron muestras para análisis de HPLC de la cantidad de ácido esteárico generado antes de la adición de FLA_{2} y 100 s después del tiempo de latencia observado. Los cromatogramas de HPLC en la figura 8 muestran la cantidad de ácido esteárico generada 100 s después del tiempo de latencia observado (10 s) a 45ºC. La cantidad (0,156 mM) de ácido esteárico generada por hidrólisis fue igual al 100% de hidrólisis de los lípidos DSPE-PEG750 poliméricos. El análisis HPLC se realizó utilizando una columna de diol de 5 \mum, una fase móvil compuesta de cloroformo/metanol/agua (730:230:30, v/v) y un detector de dispersión de luz evaporativo (véase el ejemplo 2).

Ejemplo 9 Ejemplos de modelos

Liposomas compuestos de fosfolípidos neutros o negativamente cargados pueden actuar como sistemas de administración de fármacos y profármacos dérmicos flexibles orientando, en muchas enfermedades de la piel diferentes que están asociadas con niveles incrementados de fosfolipasa A_{2}, al lugar enfermo en la piel. En los casos en los que se aplican sobre la superficie de la piel, los liposomas flexibles comenzarán a migrar dentro de la piel en la que finalmente alcanzarán el tejido subcutáneo diana enfermo. En la presente descripción, se describe en los ejemplos un sistema modelo experimental que ilustra el principio para la mejora de la administración del fármaco y el profármaco a la piel, que aprovecha la elevada actividad de la fosfolipasa A_{2} extracelular en la piel enferma. La fosfolipasa A_{2} hidroliza el potenciador basado en lípidos en el liposoma portador flexible, produciendo un liso-fosfolípido y un ácido graso libre, lo que se muestra que de forma sinergística conduce a la desestabilización aumentada del liposoma y a la liberación del fármaco al mismo tiempo, dado que se incrementa la permeabilidad de la membrana diana. El sistema propuesto se puede hacer termosensible y ofrece una forma racional para desarrollar sistemas de administración de fármacos basados en liposomas inteligentes, incorporando dentro del portador potenciadores, desestabilizadores o profármacos específicos, basados en lípidos, que automáticamente quedan activados por la fosfolipasa A_{2} solamente en los lugares diana infectados.

Los liposomas son sistemas lipídicos autoorganizados y, por lo tanto, su estabilidad está controlada en gran medida por interacciones físicas no específicas. Por lo tanto, una mejor comprensión del control molecular de las propiedades físicas de los liposomas es importante para manipular y adaptar las propiedades de los liposomas en relación con propósitos de administración de fármacos específicos. Como ejemplo, se ha utilizado la transición de fase de lípido de gel-fluido inducida térmicamente y se han diseñado sistemas optimizados para la liberación aumentada de fármacos debido a hipertermia. Sería deseable que se pudiera diseñar un sistema de administración de fármacos inteligente y versátil que se construyera con un mecanismo de activación dual virtual de (i) liberación aumentada selectiva de fármaco en el hígado y en el bazo (el tejido diana) y (ii) transporte incrementado del fármaco dentro de las células infectadas, de forma simultánea. Este principio se ilustra de forma esquemática en la figura 9.

En la presente descripción, se describe por los ejemplos el desarrollo de un sistema modelo biofísico experimental, simple y operativo que sostiene un mecanismo dual de este tipo para ser activado en los tejidos diana subcutáneos infectados. El modelo asume la elevada actividad de la fosfolipasa A_{2} extracelular en el tejido diana de piel enferma, como es el caso del tejido enfermo, en el que el nivel de FLA_{2} extracelular se puede magnificar muchas veces. Después de la exposición a la FLA_{2} extracelular, los fosfolípidos de, por ejemplo, los liposomas negativamente cargados han mostrado que sufren hidrólisis aumentada en comparación con liposomas neutros. Esto conduce a la desestabilización del liposoma y a la liberación aumentada del fármaco encapsulado. Los productos de hidrólisis, los liso-fosfolípidos y los ácidos grasos libres, actúan a su vez como potenciadores de la absorción para la permeación del fármaco a través de la membrana diana. De esta forma, los fosfolípidos del liposoma portador se comportan como prodesestabilizadores en el lugar del portador y como propotenciadores en el lugar de la membrana diana. Se ilustran de forma esquemática los detalles moleculares de este principio en la figura 10.

El sistema modelo experimental comprende un liposoma portador negativamente cargado y una membrana diana modelo. El portador es un liposoma unilamelar de 100 nm hecho de lípidos de dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC) con pequeñas cantidades (2,5% molar) de lípidos cargados negativamente del tipo dipalmitoíl fosfatidiletanolamina (DPPE)-PEG_{2000.} La membrana diana es otro liposoma preparado de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-fosfatidilcolina (D-O-SPC) que es un fosfolípido en el que los enlaces acilo de las cadenas de estearoílo son enlaces éter. En contraste con el DPPC, el D-O-SPC es inerte frente a la hidrólisis catalizada por FLA_{2}, mimetizando de esta manera la estabilidad de una membrana celular diana intacta frente a la degradación por sus propios enzimas. Este ensayo experimental, que permite la investigación tanto simultánea como por separado del efecto de los desestabilizadores en el liposoma portador y el efecto de los potenciadores en la membrana diana, implica la retención de calceína fluorescente, un fármaco modelo soluble en agua en una concentración de autoextinción, en el interior del liposoma diana no hidrolizable, en vez de en el liposoma portador. A continuación, el nivel incrementado de FLA_{2} extracelular en la membrana diana se puede simular por adición de FLA_{2} extracelular para iniciar la reacción de hidrólisis en una suspensión de los liposomas portadores y diana. La permeación de calceína a través de la membrana diana de D-O-SPC se monitoriza posteriormente mediante el aumento de fluorescencia. A efectos de investigar el efecto de la presencia de pequeñas cantidades de lípidos cargados negativamente en el liposoma portador, se llevó a cabo un experimento similar con liposomas de DPPC neutros convencionales. Además, a efectos de comparar y discriminar el efecto del aumento de la permeabilidad de los liso-fosfolípidos de los ácidos grasos libres, se llevaron a cabo experimentos sin enzimas en los que los liso-fosfolípidos y los ácidos grasos libres se añadieron simultánea o separadamente a los liposomas diana.

En la figura 11a se muestran los resultados para la liberación de calceína en función del tiempo después de la adición FLA_{2} al sistema. El curso temporal de la reacción de la FLA_{2} particular utilizada tiene un comportamiento característico de aumento de actividad con un denominado tiempo de latencia que se puede utilizar convenientemente como una medida de la actividad enzimática. Se observan una disminución dramática en el tiempo de latencia y un aumento simultáneo de la velocidad de liberación, en los casos en los que los liposomas portadores contienen el DPPE-PEG2000 cargado negativamente, de acuerdo con descubrimientos previos de degradación aumentada por FLA_{2} extracelular de liposomas recubiertos de polímeros cargados negativamente.

Estos resultados sugieren que los productos de la hidrólisis catalizada por FLA_{2} de los liposomas de DPPC portadores, el liso-fosfolípido y ácido graso libre, que se producen en una mezcla 1:1, se incorporan dentro de la membrana diana, conduciendo a un gran aumento en la permeabilidad de la membrana. Se conoce que estos productos, que tienen una solubilidad en agua muy baja, debido a sus formas moleculares no cilíndricas, inducen un campo de tensión de curvatura en la membrana o separación de fase lateral de pequeña escala que induce defectos en la membrana e incrementan la permeabilidad. Esto se sostiene por los datos de la figura 12, que muestran que la adición de liso-fosfolípido o ácido graso separadamente al presente sistema diana, en ausencia de FLA_{2}, conduce a una velocidad incrementada de liberación de calceína a través de la membrana diana. Sin embargo, el descubrimiento crucial es que si se añaden el liso-fosfolípido y el ácido graso libre simultáneamente en una mezcla 1:1, se observa un aumento dramático en la velocidad de liberación, como se muestra en la figura 12. Esto sugiere fuertemente que los dos potenciadores actúan de una forma sinergística, destacando de este modo la posibilidad única de aprovechar la hidrólisis catalizada por FLA_{2} para combinar desestabilización del liposoma portador y aumento del transporte del fármaco a través de la membrana diana. El efecto sinergístico se aumenta adicionalmente por el hecho de que la FLA_{2} extracelular se activa por sus propios productos de hidrólisis, revelando a los fosfolípidos degradables del liposoma portador como un tipo de proactivador.

Debe destacarse que, en el presente sistema de administración de fármacos modelo, el efecto de utilizar lípidos como propotenciadores y prodesestabilizadores por medio de la actividad de la FLA_{2} extracelular es dinámico y está referido a una escala temporal intrínseca. Esta escala temporal es el tiempo de retención efectivo de los liposomas portadores cerca de la membrana diana. Cuanto más rápidamente el enzima, se vuelve activo, más rápida es la liberación del fármaco y mayor la absorción del fármaco durante el tiempo que el portador pasa cerca de la diana. Además, cuanto más rápidamente trabaja el enzima más fácilmente pasa a estar disponible para la hidrólisis de otros liposomas que portan fármacos que se aproximan al lugar diana enfermo. Una vez se ha establecido que la actividad de la FLA_{2} extracelular se puede utilizar para controlar la liberación de fármacos, se abren varias formas racionales para mejoras inteligentes del sistema de administración de fármacos propuesto, mediante la utilización de mecanismos bien conocidos de alteración de la actividad de la FLA_{2} extracelular, mediante la manipulación de las propiedades físicas de la bicapa lipídica a las que se conoce que el enzima es sensible. Por lo tanto, la estrategia es modificar ciertas propiedades físicas de los liposomas portadores sin cambiar significativamente su tiempo de circulación vascular. Los presentes inventores pueden ilustrar este principio general demostrando los efectos tanto de un factor físico-químico, la composición lipídica del portador, y un factor ambiental (termodinámico), la temperatura local en el lugar diana.

Los fosfolípidos de cadena corta, tales como didecanoíl fosfatidilcolina (DCPC), activan la FLA_{2} extracelular. El efecto sobre la permeación de calceína a través de las membranas diana inducido por la incorporación de una pequeña cantidad de DCPC dentro de los liposomas de PEG portadores se muestra además en la figura 11a. La liberación es muy rápida debido a una activación casi instantánea del enzima. Los presentes inventores han descubierto además que la FLA_{2} extracelular se desactiva (datos no mostrados) en los casos en los que se incorpora un gran cantidad de colesterol (\approx20% molar) dentro de los liposomas. En contraste, los presentes inventores han descubierto que una pequeña cantidad de colesterol (\approx3% molar) activa la FLA_{2} extracelular.

Se conoce que la temperatura tiene un efecto dramático y altamente no lineal sobre la activación de la FLA_{2} extracelular en la región de la transición de fase gel-fluido de bicapas de fosfolípidos saturados. Este efecto no está causado por cambios en el enzima, sino por dramáticos cambios estructurales laterales en la bicapa lipídica. Es posible aprovechar este efecto en el presente sistema de administración de fármacos como se sugiere por los datos de la figura 11b. Al acercarse la temperatura a la temperatura de transición a 41ºC, la velocidad de liberación de calceína aumenta progresivamente, tal como se cuantifica por el tiempo de 50% de liberación de calceína, t_{50%}, mostrado en el inserto de la figura 11.b. Se ha sugerido previamente que la hipertermia puede ser aprovechada para aumentar la liberación de fármaco, y que se podría utilizar un calentamiento local en áreas tumorales predefinidas para desestabilizar liposomas portadores de fármacos, aprovechando la permeabilidad aumentada de los liposomas en su fase de transición. En el nuevo sistema de administración de fármacos modelo propuesto en la presente invención, estas posibilidades termosensibles se integran y se aprovechan totalmente por medio de la sensibilidad térmica de la FLA_{2} extracelular a las propiedades físicas del liposoma portador. En contraste con el caso en el que solamente se puede conseguir el efecto térmico por un aumento local de temperatura utilizando fuentes de calentamiento externas en un lugar tumoral predeterminado de algún tamaño mínimo, la liberación controlada por FLA_{2} aumentará en todos los lugares en los que la temperatura y la concentración de FLA_{2} extracelular son elevadas, por ejemplo, en el tejido inflamado, independientemente del tamaño de la región enferma y sin requerir una localización anterior del tejido enfermo.

DPPC, DCPC, D-O-SPC, y DPPE-PEG_{2000} se obtuvieron de Avanti Polar Lipids. FLA_{2} de veneno de serpiente purificado (Agkistrodon piscivorus piscivorus) fue un regalo generoso del Dr. R. L. Biltonen. Este enzima FLA_{2} pertenece a la clase de enzimas secretores de peso molecular bajo de 14 kD que muestra similaridad estructural a la fosfolipasa A_{2} extracelular humana. Se prepararon liposomas diana multilamelares, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, por hidratación de una película de D-O-SPC en una solución tampón de HEPES a pH=7,5, durante 1 hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase T_{m}=55ºC. Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarboxilato de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contienen calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50. Se prepararon los liposomas portadores unilamelares de DPPC, DCPC y DPPE-PEG_{2000} de una forma similar (T_{m}=41ºC). La liberación de calceína de los liposomas diana se determina mediante la medición de la intensidad fluorescente a 520 nm después de la excitación a 492 nm. Todas las mediciones se realizaron a temperaturas en las que los lípidos de los liposomas portadores y diana están en el estado gel.

Ejemplo 10 Ensayo de liberación dependiente de la concentración de fosfolipasa A_{2}

Se prepararon liposomas de 1-O-DPPC multilamelares con un 10% molar de 1-O-DPPE-PEG350, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, mediante la hidratación de una película del 90% de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina y el 10% de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] en una solución tampón de HEPES a pH=7,5, durante 1 hora a 10ºC por encima de la temperaturas de transición de fase. Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contienen calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50.

Las condiciones de ensayo para la liberación de calceína inducida por FLA_{2} fueron liposomas unilamelares 25 \muM, FLA_{2} 50, 1 y 0,02 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM. Se añadió FLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de lípidos termostatizada y equilibrada durante, como mínimo, 300 s a 35,5ºC, anteriormente a la adición de FLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determina de la siguiente manera: % de Liberación = 100 x (I_{F(t)}-I_{B}) / (I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida a tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, y I_{T} la fluorescencia total medida después de adición de Triton X-100 que conduce a la liberación completa de la calceína por rotura de los liposomas de 1-O-DPPC. La figura 13 muestra que la liberación inducida de calceína más lenta fue cuando sólo se añadió FLA_{2} 0,02 nM.

Ejemplo 11 Preparación de liposomas ultraflexibles

Se prepararon liposomas ultraflexibles disolviendo 0,08-0,32 mmol de una mezcla de un lípido monoéter profármaco (1-O-lípido), de composición similar a la que se encuentra en las mezclas de fosfatidilcolina de soja, en 80-320 \mul y adicionando cantidades crecientes de ácido oleico para crear 18 muestras con una proporción molar lípido/tensoactivo (US) comenzando por US = 0,4 y aumentando a razón de 0,2 unidades hasta US = 4. Después de mezclar intensamente los lípidos y tensoactivos se añadieron 5 ml de solución tampón HEPES 10 mM (pH = 7,5 – 8,0) a cada una de las muestras lipídicas y las mezclas se incubaron a 4 - 10ºC durante 24 horas. Los liposomas formados se extruyeron cinco veces a través de 2 filtros de policarboxilato apilados de 0,5 \mum de tamaño de poro, tal como se describe en Mayer y otros, Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168 y, a continuación, se dejaron equilibrar 24 horas a 4-10ºC antes de la medición del tamaño mediante dispersión de luz dinámica utilizando un Malver Master Sizer. Se espera que el tamaño de las vesículas esté entre 300-400 nm y que sea relativamente independiente de la proporción US.

La resistencia a la permeabilidad de los liposomas ultraflexibles se determinó mediante la medición de la presión relativa necesaria para hacer pasar a los liposomas ultraflexibles a través de un filtro de policarbonato de 0,2 \mum. Se espera que la presión relativa varíe en función de la proporción lípido a tensoactivo, dentro del intervalo de 1 a 10 MPa. Se espera que las formulaciones con una proporción US de 0,5 aproximadamente, sean casi perfectamente permeables, con una resistencia a la permeabilidad similar a la del agua pura.

Ejemplo 12 Hidrólisis de liposomas cargados negativamente por fosfolipasa A2 en fluido peritoneal de rata libre de células

El fluido peritoneal de rata libre de células con inflamación aguda inducida por caseína se preparó inyectando 5 ml de caseinato sódico al 1% dentro de la cavidad peritoneal de una rata macho SRPD, que pesaba 250-260 g. Se sacrificó la rata por desangrado después de 24 horas y se recogió el fluido inflamatorio del peritoneo y se centrifugó a 1500 G durante 20 minutos a efectos de obtener un fluido peritoneal libre de células.

Se prepararon liposomas unilamelares negativamente cargados, totalmente hidratados, y con una distribución de tamaños estrecha a partir de un 89% molar de di-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), un 10% molar 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) y un 1% molar 1,2-bis-(1-pirenodecanoíl)-sn-glicero-3-fosfocolina (bis-pir-DPC). Bis-pir-DPC es un sustrato de la FLA_{2} con dos fluoróforos de pireno adyacentes que forman dímeros de estado excitado (excímeros) que emiten a 470 nm después de la excitación a 342 nm. La hidrólisis catalizada por fosfolipasa separa los dos fluoróforos, que a continuación emiten a 380 nm (monómeros).

La figura 14 muestra el espectro de emisión obtenido después de la excitación a 342 nm de bis-pir-DPC incorporado en liposomas negativamente cargados (0,100 mM) antes y después de la adición de FLA_{2} 100 nM (Agkistrodon piscivorus piscivorus). Los cambios observados en el espectro de emisión, después de la hidrólisis mediada por la fosfolipasa, se utilizan en un ensayo continuo, midiendo la emisión del excímero a 470 nm de forma simultánea con la emisión del monómero a 380, después de la excitación a 342 nm. La figura 15 muestra el perfil de tiempo de reacción de la hidrólisis de los liposomas cargados negativamente catalizada por fosfolipasa A_{2} de rata. La reacción catalítica se inició por adición de fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de una suspensión de liposomas termostatizada y equilibrada durante 60 s, anteriormente a la adición de FLA_{2}. El comportamiento característico de inicio de actividad de la fosfolipasa se señala por un aumento súbito en la fluorescencia del monómero a 380 nm y una disminución posterior en la fluorescencia del excímero, como se muestra en el inserto en la figura 15.

Las condiciones de ensayo para el perfil de tiempo de reacción de la FLA_{2} mostradas en la figura 15 fueron: liposomas unilamelares cargados negativamente 0,100 mM, fluido peritoneal libre de células no diluido 100 \mul, HEPES 10 mM (pH 7.5), CaCl_{2} 5 mM, y NaCl 150 mM.

Claims

1. Utilización de un sistema de administración de fármacos basado en lípidos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento localizado de la actividad de la FLA_{2} extracelular en tejido cutáneo o subcutáneo de un mamífero, en forma de liposomas, para la administración de una sustancia farmacológicamente activa que se selecciona de entre los lisoderivados lipídicos, comprendiendo dicho sistema un compuesto de actividad interfacial, y dicha sustancia farmacológicamente activa está presente en los sistemas basados en lípidos en forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la FLA_{2} extracelular en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológicamente activa se libera en forma de un lisoderivado lipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticalmente, es una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficiencia para la sustancia activa farmacológicamente.

3. Utilización, según la reivindicación 2, en la que el profármaco es un derivado lipídico de la fórmula siguiente:

\uelm{C}{\uelm{\para}{\uelm{CH
--- Y --- R ^{2} }{\uelm{\para}{CH _{2}  --- X ---
R ^{1} }}}}

H_{2} --- Z --- R^{3}

en la que

X y Z se seleccionan independientemente de entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2};

Y es -OC(O)-, Y a continuación está conectado con R^{2} bien por medio del oxígeno o bien por el átomo de carbono de carbonilo;

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;

en el que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7}-(CH=CH)_{nBr}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 29; n1 es cero o un número entero de 1 a 29, n3 es cero o un número entero de 1 a 20, n5 es cero o un número entero de 1 a 17, n7 es cero o un número entero de 1 a 14, y n9 es cero o un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8 es independientemente cero o 1; y Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; en el que cada Y^{1}-Y^{2} se puede sustituir independientemente con halógeno o alquilo C_{1-4}, R^{3} se selecciona de entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros del ácido fosfático y derivados de los mismos.

4. Utilización, según la reivindicación 3, en la que R^{2} es un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono.

5. Utilización, según la reivindicación 4, en la que R^{2} es un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2}.

6. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el profármaco constituye el 15-100% molar del total del sistema basado en lípidos deshidratado.

7. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es en forma de liposomas en los que se incorpora una segunda sustancia farmacológica.

8. Utilización de un sistema de administración de fármacos basado en lípidos, para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades o afecciones asociadas con un aumento localizado en la actividad de la FLA_{2} extracelular en tejido cutáneo o subcutáneo de un mamífero, en forma de liposomas, para la administración de una segunda sustancia farmacológica, comprendiendo dicho sistema un compuesto de actividad interfacial, y dicha segunda sustancia farmacológica se incorpora en el sistema, incluyendo dicho sistema derivados lipídicos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, en el que el derivado lipídico es además un sustrato para FLA_{2} extracelular en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, para dar como resultado un fragmento de ácido orgánico o un fragmento de alcohol orgánico y un lisoderivado lipídico, no siendo dicho derivado lisolipídico un sustrato para la lisofosfolipasa.

9. Utilización, según la reivindicación 8, en la que el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente, es una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficiencia para la segunda sustancia farmacológica.

10. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en la que el derivado lipídico es un derivado lipídico de la fórmula siguiente:

\uelm{C}{\uelm{\para}{\uelm{CH
--- Y --- R ^{2} }{\uelm{\para}{CH _{2}  --- X ---
R ^{1} }}}}

H_{2} --- Z --- R^{3}

la que

Y es -OC(O)-, Y a continuación esta conectado con R^{2} bien por medio del oxígeno o bien por el átomo de carbono de carbonilo;

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;

en el que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7}-(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 29; n1 es cero o un número entero de 1 a 29, n3 es cero o un número entero de 1 a 20, n5 es cero o un número entero de 1 a 17, n7 es cero o un número entero de 1 a 14, y n9 es cero o un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8 es independientemente cero o 1; y Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; en el que cada Y^{1}Y^{2} se puede sustituir independientemente con halógeno o alquilo C_{1-4}, R^{3} se selecciona de entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros del ácido fosfático y derivados de los mismos.

11. Utilización, según la reivindicación 10, en la que R^{2} es un grupo alifático de una longitud de, como mínimo, 7 átomos de carbono.

12. Utilización, según la reivindicación 11, en la que R^{2} es un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2}.

13. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 8-12, en la que el derivado lipídico constituye el 15-100% molar del total del sistema deshidratado.

14. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en la que la segunda sustancia farmacológica es una sustancia activa terapéutica y/o profilácticamente seleccionada de entre (i) agentes antitumorales, (ii) antibióticos y antifungúngicos, y (iii) agentes antiinflamatorios.

15. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las enfermedades o afecciones de la piel se seleccionan del grupo que comprende afecciones inflamatorias de la piel, cáncer de piel y afecciones causadas por infección de la piel.

16. Utilización, según la reivindicación 15, en la que las afecciones inflamatorias de la piel se seleccionan del grupo que comprende enfermedades inflamatorias de la piel tales como soriasis, pitiriasis rosada, ictiosis vulgar, prurigo nodular, neurodermatitis, liquen plano, alopecia, eritema multiforme, eritema nudoso, lupus, dermatomiositis, morfea, pénfigo, penfigoide, pioderma gangrenoso, urticaria, dermatitis atópica y eczema.

17. Utilización, según las reivindicaciones 15 y 16, en la que el aumento en la actividad de la FLA_{2} extracelular es un mínimo del 25% en comparación con el nivel normal de actividad en la parte relevante de la piel.

18. Utilización de los sistemas de administración basados en lípidos, descritos en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para la preparación de una composición tópica.

19. Utilización de los sistemas de administración basados en lípidos, descritos en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición tópica es una composición cosmética.