ES2295149T3

ES2295149T3 - Sistemas de suministro de farmacos contra infecciones parasiticas.

Info

Publication number: ES2295149T3
Application number: ES01921262T
Authority: ES
Inventors: Kent Jorgensen; Jesper Davidsen; Charlotte Vermehren; Sven Frokjaer; Ole G. Mouritsen
Original assignee: Liplasome Pharma ApS
Current assignee: Liplasome Pharma ApS
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2008-04-16
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: US20030175205A1; PT1272225E; WO2001076555A2; WO2001076556A2; US20030170297A1; AU2001248301A1; US7368254B2; PT1272161E; EP1272225A2; DK1272161T3; US20070134153A1; DE60132184T2; EP1272225B1; JP2003530362A; WO2001076644A3; JP2003530339A; ATE382333T1; EP1272160B1; ES2270991T3; US20030162748A1

Abstract

Utilización de un sistema de suministro de fármacos basado en lípidos para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección parasítica de un mamífero, caracterizándose dicha infección parasítica por el aumento del nivel de PLA2 en dicho mamífero, y seleccionándose dicha infección parasítica del grupo que consiste en: Leishmaniasis; Tripanosomiasis; Malaria; Entamoeba histolyticasis; y el trematodo Oriental de hígado Chlornorchis sinensis, que comprende una sustancia farmacológica activa seleccionada entre derivados lisolipídicos, en la que la sustancia farmacológica activa está presente en un sistema basado en lípidos en forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la fosfolipasa A2 extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológica activa se libera en forma de un derivado lisolipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa, y en la que, dichos derivados lipídicos son triésteres de glicerol con la siguiente fórmula: (Ver fórmula) en la que R A y R B son fragmentos de ácido graso (alquilo/alquileno/alquildieno/alquiltrieno/alquiltetraeno-C(=O)-C9 - 30), y R C es un ácido fosfatídico (PO2-OH) o un derivado de ácido fosfatídico.

Description

Sistemas de suministro de fármacos contra infecciones parasíticas.

Sector de la invención

La presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas basadas en lípidos para su utilización en el tratamiento o detección de infecciones parasíticas.

Antecedentes de la invención

La Patente U.S.A. 5.827.836 da a conocer glicerofosfoetanolaminas sustituidas con retinoílo. Se describe que los compuestos y sales de las mismas muestran actividades antitumorales, antipsoriásicas y antiinflamatorias. Una posible clase de compuestos tiene un sustituyente de éter graso en la posición 1, un sustituyente de éster retinoide (retinoílo) en la posición 2 y un sustituyente de fosfoetanolamina en la posición 3. Se menciona que algunos de los compuestos se pueden presentar en una formulación de liposomas.

La Patente U.S.A. 4.372.949 da a conocer un agente carcinostático e inmunoestimulante que contiene un lisofosfolípido y un fosfolípido. Entre los ejemplos de compuestos se encuentran 3-fosforilcolina que tiene un sustituyente aciloxi-C_{5-22} o alcoxi-C_{5-22} en la posición 1 y un sustituyente hidrógeno, hidroxi, aciloxi-C_{1-5} o alcoxi-C_{1-5} en la posición 2. Se menciona que los agentes se pueden dispersar en forma de micelas o vesículas lipídicas.

La Patente U.S.A. 5.484.911 da a conocer conjugados de nucleósido 5'-difosfato de éter-lípidos que muestran actividad antivírica. Los compuestos pueden tener un sustituyente éter/tioéter graso en la posición sn-1 y un sustituyente éster de ácido graso en la posición sn-2. Los compuestos se diseñan para que penetren en la membrana celular en la que posteriormente el fármaco nucleósido se libera por escisión por medio de fosfatasas intracelulares. Además, se sugiere que los éter-lípidos que también se liberan se pueden escindir posteriormente por medio de la fosfolipasa A_{2} intracelular. Se sugiere que los conjugados se pueden presentar en forma de micelas que los macrófagos pueden absorber fácilmente.

La Patente U.S.A. 4.622.392 da a conocer compuestos citotóxicos de tipo conjugado nucleótido-lípido.

La Patente ES 2 034 884 da a conocer 2-aza-fosfolípidos, tales como inhibidores de la PLA_{2}. De forma similar, de Haas y otros (Biochem. Biophys. Acta, "Lipid and Lipids Metabolism" ("Lípidos y Metabolismo de Lípidos"), 1167 (1993) No. 3, págs. 281-288), dan a conocer la inhibición de la PLA_{2} pancreática por análogos de (R)-2-acilamino fosfolípidos.

Hoffman y otros, "Blood" ("Sangre"), Vol. 63, No. 3 (marzo), 1984, págs. 545-552, dan a conocer la citotoxicidad de PAF y análogos de alquil-fosfolípidos relacionados en células de leucemia humana.

La Patente WO 94/09014 da a conocer ésteres de ácido fosfórico, tales como inhibidores de la PLA_{2}. Un grupo de los inhibidores son los 1-O-fosfo-2-O-(C_{2-21}-acil)-(C_{12-24}-alcanos).

Xia y Hui dan a conocer la síntesis química de una serie de éter-fosfolípidos a partir de D-manitol y sus propiedades como agentes citotóxicos tumorales.

Las Patentes U.S.A. 5.985.854, U.S.A. 6.077.837, U.S.A. 6.136.796 y U.S.A. 6.166.089 describen profármacos con penetración aumentada en las células, que son particularmente útiles para el tratamiento de una afección o enfermedad en un humano relacionada con una actividad enzimática intracelular superior a la habitual. Los profármacos pueden ser ésteres-sn-2 de lisofosfolípidos. Tales fármacos se diseñan para que sean escindidos por la fosfolipasa A_{2} intra-
celular.

Vadas y otros ("Infection and Immunity" ("Infección e Inmunidad"), 60 (1992) 3928-3931 y Am. J. Trop. Hyg. 49 (1993) 455-459) describen la inducción de la expresión de PLA_{2} circulante en humanos con infecciones de malaria provocadas por Plasmodium falciparum.

Lux y otros ("Biochem. Parasitology" ("Parasitología bioquímica") 111 (2000) 1-14) describen la acción antileishmania de ciertos análogos de éter-lípidos que se cree que está provocada por la interferencia con biosíntesis importantes del parásito.

Hart y otros ("Drugs of today" ("Drogas de hoy") 34 (1998) 117-131) describen cómo la acción antimetabólica de análogos de éter-lípidos puede dar como resultado la perturbación de la biosíntesis de glicolípidos y glicoproteínas de membrana de leishmania claves.

Breve descripción de la invención

La presente invención se describe mediante las reivindicaciones.

Los sistemas de liberación de fármacos son particularmente útiles en el tratamiento de infecciones parasíticas, especialmente infecciones parasíticas en las que el ciclo de vida del parásito implica el hígado y/o el bazo del organismo infectado. Los liposomas sólo se degradan en un grado muy bajo mediante enzimas presentes en la corriente sanguínea, mientras que dichos liposomas se concentran en gran medida y se degradan en el hígado y/o el bazo por los macrófagos presentes en estos órganos. Esta degradación de los liposomas libera constituyentes que se han diseñado para ser tóxicos para varios tipos de parásitos. De acuerdo con ello, en el caso de infección parasítica de tejidos, tales como el hígado y/o el bazo, caracterizada por la presencia de macrófagos, se puede conseguir una liberación altamente eficiente e indirectamente específica de sustancias tóxicas para los parásitos.

Aún otra realización de la presente invención se refiere a la utilización para el diagnóstico de los sistemas de liberación de fármacos descritos en la presente invención, en los que el sistema de liberación de fármacos transporta un marcador que se dirige específicamente, mediante la acción descrita anteriormente, hacia el tejido u órgano que está siendo infectado por el parásito.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Curvas de capacidad calorífica obtenidas mediante calorimetría de barrido diferencial. (a) Liposomas Multilamelares, MLV (la curva superior) y unilamelares (la curva inferior) preparados a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 1 mM. (b) Liposomas MLV (la curva superior) y LUV (la curva inferior) preparados a partir de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC).

Figura 2. Perfil característico de tiempo de reacción a 41ºC para hidrólisis de fosfolipasa A_{2}, PLA_{2} (A. piscivorus piscivorus) de liposomas unilamelares compuestos de 1-O-DPPC. La reacción de hidrólisis por PLA_{2} se monitoriza mediante fluorescencia intrínseca (línea continua) del enzima y dispersión de la luz estática a 90º (líneas discontinuas) de la suspensión de lípido. Tras la adición de la PLA_{2} al tiempo de 800 s a la suspensión de liposomas equilibrada viene un tiempo de latencia característico antes de que tenga lugar un súbito incremento de la actividad catalítica. Se tomaron muestras para HPLC antes de la adición del enzima y 20 minutos después del tiempo de latencia
observado.

Figura 3. Cromatogramas de HPLC que ilustran el efecto de la hidrólisis por la fosfolipasa A_{2} de los liposomas compuestos de 1-O-DPPC. Los cromatogramas muestran la cantidad de 1-O-DPPC (100%, línea continua) antes de que se añadiera la fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a la suspensión de liposomas y la cantidad de 1-O-DPPC (21%, línea discontinua) después del "lag-burst", tiempo de latencia previo a un aumento súbito de la actividad catalítica.

Figura 4. Liberación controlada por la PLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, de liposomas compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 25 \muM, suspendidos en un solución tampón de HEPES 10 mM (pH = 7,5), en función del tiempo. Se añadió fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) 25 nM al tiempo de 900 s, la temperatura era de 37ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina de la siguiente manera: % de Liberación = 100(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida en un tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, e I_{T} la fluorescencia total medida después de la adición de Tritón X-100, que conduce a la liberación completa de la calceína mediante la rotura de los liposomas.

Figura 5. Liberación controlada por la PLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana de membranas no hidrolizables (ver la figura 11b), en función del tiempo, para liposomas compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) 25 \muM suspendidos en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH = 7,5). Se añadió fosfolipasa A_{2} 25 nM a los 0 s y la temperatura era de 37ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se ha descrito en la figura 4.

Figura 6. Perfil de hemólisis de glóbulos rojos normales en presencia de liposomas compuestos del 100% de 1-O-DPPC (cuadrados); el 95% de 1-O-DPPC y el 5% de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) (triángulos) y 1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina (ET-18-OCH_{3}) (rombos), cargados negativamente. Las concentraciones que produjeron el 5% de hemólisis (H_{5}) eran bastante superiores a 2 mM para liposomas compuestos del 100% de 1-O-DPPC, y para liposomas compuestos del 90% de 1-O-DPPC con el 5% de DPPE-PEG350. El ensayo de hemólisis se llevó a cabo tal como describen Perkins y otros, 1997, "Biochimica et Biophysica Acta" 1327, 61-68. Brevemente, cada muestra se diluyó en serie con una solución salina de tampón fosfato (PBS), y se mezclaron 0,5 ml de cada suspensión diluida con 0,5 ml de glóbulos rojos humanos (RBC) lavados [4% en PBS (v/v)]. La muestra y el patrón se colocaron en un incubador a 37ºC y se agitaron durante 20 horas. Los tubos se centrifugaron a baja velocidad (2000 x G) durante 10 minutos y se cuantificaron 200 \mul del sobrenadante mediante la absorbancia a 550 nm. El 100 por cien de hemólisis se definió como la cantidad máxima de hemólisis obtenida mediante el detergente Tritón X-100. El perfil de hemólisis en la figura 6 muestra un valor de hemólisis bajo (por debajo del 5% por ciento) para liposomas de 1-O-DPPC 2 mM y para liposomas de 1-O-DPPC con el 5% de 1-O-DPPE-PEG350.

Figura 7. Perfiles característicos de tiempo de reacción a 41ºC para la hidrólisis por la PLA_{2} (A. piscivorus piscivorus) de liposomas unilamelares en los que se ha incluido el 0 y el 5% de lipopolímeros 1-O-DPPE-PEG350. La reacción de hidrólisis por la PLA_{2} se monitoriza por fluorescencia intrínseca (línea continua) del enzima y dispersión de la luz estática a 90º (líneas discontinuas) de la suspensión. Después de la adición de la PLA_{2} a la suspensión de liposomas equilibrada prosigue un tiempo de latencia característico antes de que tenga lugar un súbito incremento de la actividad catalítica.

Figura 8. Liberación controlada por la PLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana, de membranas de D-O-SPC no hidrolizables, en función del tiempo, para micelas compuestas de 1-O-DPPE-PEG350 (línea de puntos), DSPE-PEG750 (línea discontinua), 25 \muM, suspendidas en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH = 7,5). Se añadió fosfolipasa A_{2} (25 nM) a los 1200 s y la temperatura era de 41ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se ha descrito en la figura 4. La hidrólisis catalizada por PLA_{2} de 1-O-DPPE-PEG350 indujo la liberación más rápida y más elevada.

Figura 9. Cromatogramas de HPLC que ilustran el efecto de la hidrólisis por fosfolipasa A_{2} de micelas compuestas de DSPE-PEG750 (0,150 mM). Los cromatogramas muestran la cantidad de ácido esteárico generado antes (línea continua) de la adición de la fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a la suspensión de micelas y la cantidad (línea discontinua) de DSPE-PEG750 después del "lag burst" o tiempo de latencia previo a un aumento súbito de la actividad catalítica. La línea de puntos muestra el ácido esteárico puro (0,4 mM). El porcentaje de hidrólisis se calculó sobre la base del área integrada del patrón de ácido esteárico (115850 unidades) y el área integrada de la muestra (45630 unidades). La concentración del ácido esteárico en la muestra se calculó en 0,157 mM (45630/115850 x 0,4 mM), lo que significa que se hidrolizó el 100% del DSPE-PEG750 a liso-SPE-PEG750 y ácido esteárico.

Figura 10. Describe el principio de direccionamiento, liberación y absorción de fármacos liposómicos mediante enzimas extracelulares.

(I): Sistema reticuloendotelial, por ejemplo, macrófagos en el hígado y el bazo infectados con parásitos (es decir, Leishmania).

(II): Liposoma portador del profármaco

(III): Célula parasítica y membrana celular dianas

(IV): Profármaco (es decir, monoéter-lípido), propotenciador (lípido), proactivador (lípido)

(V): Fármacos (es decir, derivados de éter-lisolípido y ácido graso), potenciadores (lisolípido + ácido graso) activadores de PLA_{2} (lisolípido + ácido graso)

Figura 11. Ilustración esquemática de un principio del direccionamiento de fármacos liposómicos que implica la acumulación de los portadores de fármacos liposómicos, el SRE (Sistema Reticuloendotelial), en tejido enfermo poroso y la posterior liberación del fármaco y el transporte a través de la membrana diana por medio de la actividad de la PLA_{2} extracelular.

(I): Liposoma portador del profármaco

(II): Membrana liposómica diana no degradable

(III): Éter-lípidos no hidrolizables

(IV): Propotenciador (lípido), profármaco (es decir, monoéter-lípido), proactivador (lípido)

(V): Potenciadores (lisolípido + ácido graso), fármacos (es decir, derivados de éter-lisolípido y ácido graso), activadores de PLA_{2} (lisolípido + ácido graso)

Figura 12. (a) Liberación controlada por PLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana en función del tiempo para diferentes composiciones de los liposomas portadores. La temperatura es de 37ºC. En comparación con los portadores de DPPC solamente, la velocidad de liberación del fármaco modelo aumenta notablemente para los portadores en los que se ha incluido un 2,5% molar del DPPE-PEG2000 cargado negativamente. Se obtiene otro aumento de la velocidad de liberación, si el portador también contiene un fosfolípido de cadena corta, didecanoilfosfatidilcolina (DCPC), que actúa como un activador local para el enzima. El porcentaje de calceína liberada se determina de la siguiente manera: % de Liberación = 100 (I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida a un tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, e I_{T} es la fluorescencia total medida después de la adición de Tritón X-100, lo que conduce a la liberación completa de calceína por rotura de los liposomas diana. (b) Liberación controlada por PLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a través de la membrana diana en función del tiempo a diferentes temperaturas. Al aumentar la temperatura, la velocidad de liberación se incrementa debido a la actividad aumentada del enzima, inducida por cambios estructurales en el sustrato de la bicapa lipídica del liposoma portador. En el presente ensayo, se consigue, en todos los casos, una liberación máxima del 70% aproximadamente. El inserto muestra el tiempo del 50% de liberación de calceína, t_{50%}, en función de la temperatura. La concentración de los liposomas diana y portadores es 25 \muM, y la PLA_{2} se añade en una concentración de 25 nM en una solución tampón de HEPES de pH = 7,5.

Figura 13. Liberación total después de 20 min de la calceína, fármaco modelo fluorescente, a través de la membrana diana en función de la adición, separadamente, de cantidades crecientes de liso-palmitoíl fosfolípido y ácido palmítico, y en una mezcla 1:1. La concentración de las membranas diana es 25 \muM en una solución tampón de HEPES de pH = 7,5 a una temperatura de 39ºC.

Figura 14. Liberación controlada por PLA_{2} de la calceína, fármaco fluorescente modelo, a partir de liposomas compuestos de un 90% molar de 1-O-DPPC y un 10% molar de 1-O-DPPE-PEG350 cargado negativamente, 25 mM, suspendidos en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH = 7,5), en función del tiempo. Se añadió fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) 50 nM (línea recta), 1 nM (línea continua) y 0,02 nM (línea de puntos) al tiempo de 300 s, la temperatura era de 35,5ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se ha descrito en la figura 4.

Figura 15. Espectro de emisión de bis-py-DPC 1% molar que se ha incluido dentro de liposomas cargados negativamente (0,100 mM) antes (línea continua) y después (línea discontinua) de la adición de PLA_{2} 100 nM (Agkistrodon piscivorus piscivorus) a una suspensión de liposomas equilibrada a 41ºC.

Figura 16. Perfil característico de tiempo de reacción a 41ºC de la hidrólisis catalizada por fosfolipasa de rata de liposomas cargados negativamente. La reacción catalítica se inició mediante la adición de fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada equilibrada durante 60 s, anteriormente a la adición del fluido peritoneal. La reacción de hidrólisis se monitoriza por fluorescencia del monómero (línea continua) y fluorescencia del excímero (línea discontinua) a partir de bis-py-DPC. A los 60 s, después de la adición de fluido peritoneal no diluido a la suspensión de liposomas equilibrada, se observa un súbito aumento en la fluorescencia del monómero, y simultáneamente, una disminución de la fluorescencia del excímero al hidrolizarse el sustrato de bis-py-DPC. El inserto muestra el perfil del tiempo de reacción de los primeros 120 s.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se define mediante las reivindicaciones.

Un elemento importante es la comprensión de la rápida absorción de liposomas in vivo por parte de células del sistema fagocítico mononuclear (MPS). El MPS comprende los macrófagos, uno de los componentes más importantes del sistema inmune, especialmente en la eliminación de las partículas foráneas, entre las que se incluyen los liposomas. Los macrófagos residen en varios órganos y tejidos, por ejemplo, en el tejido conectivo (como histiocitos), en el hígado (células de Kupffer) y como macrófagos libres y establecidos en el bazo, la médula ósea y los nodos linfáticos.

Cuando los liposomas, en general, se administran intravenosamente, habitualmente se eliminan de la circulación mediante los macrófagos del hígado, el bazo y la médula ósea. Esta eliminación consiste en una primera opsonización por parte de las proteínas sanguíneas, seguida de la absorción de macrófagos de estos liposomas marcados. Las opsoninas del sistema inmune están compuestas por inmunoglobulinas y proteínas de complemento, y aunque cada opsonina tiene su propia interacción y confiere diferentes destinos, parece ser que el secuestro hepático está mediado por complemento y el bazo elimina los liposomas opsonizados, en general. La eliminación aumentada de los liposomas de la presente invención, obtenida mediante la opsonización, se puede calificar de direccionamiento pasivo.

Dado que la absorción de liposomas del MPS da como resultado la acumulación de los liposomas en tejidos como el hígado, el bazo y la médula ósea, permite un direccionamiento hacia infecciones parasíticas de estos tejidos. Los liposomas que pueden utilizarse en las utilizaciones de la presente invención comprenden constituyentes que pueden actuar como marcador para la detección de tejidos/órganos infectados por parásitos o pueden actuar como fármacos antiparasíticos cuando se liberan de los liposomas a los tejidos de un mamífero que sufre una infección parasítica.

Una realización de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de infecciones parasíticas que se caracterizan por un nivel aumentado de PLA_{2} en un mamífero, preferentemente un humano, mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz de un sistema de liberación basado en lípidos para la administración de una sustancia farmacológica activa seleccionada entre derivados lisolipídicos, en el que la sustancia farmacológica activa está presente, en el sistema basado en lípidos, en forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo dicho profármaco, además, un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológica activa se libera en forma de un derivado lisolipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa. El derivado lipídico se describe con más profundidad a continuación y en las reivindicaciones.

Otra realización se refiere a un método para el tratamiento de infecciones parasíticas que se caracterizan por un nivel aumentado de PLA_{2} en un mamífero, preferentemente un humano, mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz del sistema de liberación basado en lípidos descrito anteriormente para la administración de una segunda sustancia, en el que la segunda sustancia es un fármaco antiparasítico que se ha incluido en el mencionado sistema.

En una realización específica de la presente invención el nivel aumentado de PLA_{2} se localiza en un tejido y/u órgano específico del mamífero, estando infectado dicho tejido y/u órgano por el parásito. Una situación en la que la infección parasítica implica el hígado y/o el bazo y/o la médula ósea del mamífero se comprende, especialmente, en las utilizaciones de la presente invención.

El tratamiento se realiza, preferentemente, mediante la administración, de forma sistemática, del sistema de liberación basado en lípidos de la presente invención, incluso más preferentemente, administrado parenteralmente mediante inyección, tal como inyección intravenosa.

Aún otra realización de la presente invención se refiere a un método para el diagnóstico de una infección parasítica, que se caracteriza por un nivel aumentado de PLA_{2} del tejido infectado, mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz del sistema de liberación basado en lípidos descrito anteriormente para la administración de una segunda sustancia, en el que la segunda sustancia es un marcador que se ha incluido en dicho sistema. Mediante la administración de tal construcción a un paciente que se sospecha que tiene una infección parasítica, es posible determinar si el paciente está infectado y, en el caso de una infección parasítica, se identifican las áreas localizadas del cuerpo de los pacientes en las que se aloja el parásito. La liberación localizada del agente de diagnóstico (el marcador), permite la utilización de técnicas de diagnóstico por imagen, tales como la tomografía por emisión de positrones (PET), los rayos X, la escintigrafía gamma, la formación de imágenes por resonancia magnética (MR), la formación de imágenes por tomografía computada (CT) y la ultrasonografía.

Los marcadores aplicables a las técnicas médicas de formación de imágenes se seleccionan del grupo que comprende radionúclidos para el diagnóstico, tales como ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga, ^{11}C; iones paramagnéticos, tales como Gd y Mn, y óxido de hierro; gases, tales como aire, argón, nitrógeno; yodo; bromo y bario.

Organismos parasíticos diana

Los liposomas de la presente invención son capaces de liberar varios análogos de éter-lípido en tejidos en los que se alojan parásitos, debido a los niveles aumentados de PLA_{2} de dicho tejido. Los análogos de éter-lípido han mostrado que dan como resultado una perturbación de enzimas claves implicados en, por ejemplo, la biosíntesis de alquil-fosfolípidos de parásitos, tales como Leishmania y Tripanosomas (Lux y otros, "Biochem. Parasitology" ("Parasitología bioquímica") 111 (2000) 1-14) y, por lo tanto, son tóxicos para los parásitos si se administran en una cantidad suficiente.

Dado que el hígado, el bazo y la médula ósea son órganos/tejidos en los que se pueden encontrar concentraciones altas de macrófagos, se prefiere el direccionamiento hacia los parásitos que habitan en estos órganos, debido a la acumulación resultante de liposomas de la presente invención, pero también pueden ser de interés otros tejidos que se caracterizan por tener niveles aumentados de PLA_{2} durante la infección parasítica.

Además, las infecciones parasíticas que se caracterizan por niveles muy elevados de PLA_{2} circulante, tales como los parásitos que causan la malaria, por ejemplo, la causada por Plasmodium falciparum, también son diana para el tratamiento con liposomas de la presente invención. Esta característica de niveles elevados de PLA_{2} circulante en infecciones de malaria causadas por el parásito Plasmodium falciparum la han descrito Vadas y otros ("Infection and Immunity" ("Infección e Inmunidad"), 60 (1992) 3928-3931 y Am. J. Trop. Hyg. 49 (1993) 455-459).

A continuación se muestran ejemplos de infecciones parasíticas que dan como resultado un nivel aumentado de PLA_{2} en el tejido en el que se aloja el parásito.

Leishmania

Miembro del género Leishmania, tiene la capacidad de infectar algunas especies de vertebrados, entre las que se incluyen los humanos, perros y roedores y los diferentes tipos de leishmaniasis se concentran, principalmente, aunque no exclusivamente, en Centroamérica y Sudamérica, en Centroáfrica y en partes del sur y del centro de Asia.

El ciclo de vida de los miembros del género implica un huésped vertebrado, por ejemplo, el humano y un vector que transmite el parásito entre los huéspedes vertebrados. En el caso de Leishmania, el vector es distintas especies de moscas de arena Phlebotomus.

La forma morfológica característica que toma el parásito Leishmania en el vector es el promastigote, y en esta etapa se reproduce asexualmente en el intestino del vector. Tras la picadura al huésped vertebrado, los promastigotes del vector se inyectan dentro del huésped vertebrado. Después de la entrada dentro del huésped vertebrado los promastigotes cambian a una forma llamada amastigote. El amastigote se reproduce en las células del huésped, y cuando la célula del huésped vertebrado finalmente muere, los amastigotes se liberan y potencialmente podrán infectar otras células. Los síntomas y patologías asociados con la leihsmaniasis son el resultado de la muerte de las células del huésped por parte de los amastigotes.

La Leishmania es la causa de varias afecciones distintas, dependiendo del lugar de la infección del huésped vertebrado. En algunas enfermedades, los amastigotes no se extienden más allá del lugar de la picadura del vector, lo que da como resultado una "leishmaniasis cutánea", también conocida como llaga oriental, furúnculo Jericho, furúnculo Aleppo, o furúnculo Delhi. Estas afecciones a menudo sanan espontáneamente. En otros casos, los amastigotes se pueden extender a los órganos viscerales, es decir, al hígado y al bazo, lo que da como resultado "leishmaniasis visceral" también conocida como kala-azar o fiebre Dum-Dum. Además, los amastigotes se pueden extender a las membranas mucosas de la boca y de la nariz, dando como resultado la afección de "leishmaniasis mococutánea" también conocida como espundia o uta. Sin tratamiento, estas últimas enfermedades dan como resultado tasas elevadas de mortalidad.

Entre ejemplos no limitativos de especies de Leishmania se encuentran Leishmania major Friedlin, Leishmania (viannia) gr., Leishmania mexicana, Leishmania tropica, Leishmania donovani (infantum), Leishmania aethiopica, Leishmania amazonensis, Leishmania enriettii, Leishmania chagasi y Leishmania pifanoi.

Los agentes terapéuticos tradicionales antileishmaniasis son compuestos como los compuestos de antimonio pentavalente, estibogluconato sódico (Pentosram^{TM}) y antimoniato de meglumina (Glucantime^{TM}), otros fármacos son la anfotericina, el metronidazol, el alopurinol y la pentamidina, además de la paromomicina y el interferón gamma.

Tanto para el tratamiento de la malaria como el tratamiento de la Leishmania, se ha propuesto un nuevo fármaco, Licochalcona A, que se aisló originariamente de las raíces del regaliz chino.

Tripanosoma

Tres especies principales de tripanosomas causan enfermedades en humanos, las cuales son Tripanosoma gambiense y Tripanosoma rhodesiense, que causan enfermedad del sueño en África, y Tripanosoma cruzi, que causa la enfermedad de Chagas en Sudamérica.

Ambos tipos de enfermedad se caracterizan por ataques de parasitemia y fiebre. El daño a los órganos está causado por toxinas liberadas por los parásitos.

El vector más común para la transmisión de los tripanosomas que causan la enfermedad del sueño es la mosca tsetse Glossina sp. Las especies que causan tripanosomiasis africana humana (enfermedad del sueño) también infectan animales salvajes y se pueden transmitir de estos animales a los humanos (infecciones zoonóticas).

En humanos, el Tripanosoma cruzi se encuentra tanto en forma intracelular, el amastigote, como en la sangre, en forma de tripomastigote. El vector de la enfermedad de Chagas es un "chinche del campo" (Hemiptera), tal como un Triatoma, Rhodnius, o Panstongylus que ingiere amastigotes o tripomastigotes cuando se alimenta. En el vector el parásito se reproduce asexualmente y en el intestino posterior del vector se encuentran tripomastigotes metacíclicos. El vector defeca en la piel del huésped al mismo tiempo que se alimenta, y los tripomastigotes metacíclicos entran en el cuerpo del huésped, la mayor parte de las veces siendo "introducidos por frotamiento" en la picadura del vector o en las membranas mucosas del ojo, nariz o boca. En el huésped humano, la enfermedad de Chagas afecta principalmente el sistema nervioso y el corazón pero a veces también el hígado, el bazo, la médula ósea y el intestino. Las infecciones crónicas dan como resultado diferentes trastornos neurológicos, entre los que se incluyen la demencia, el megacolon y el megaesófago y daños en el músculo cardíaco. Sin tratamiento, la enfermedad de Chagas a menudo resulta
mortal.

Los principales fármacos tradicionales utilizados para el tratamiento de la enfermedad del sueño son la suramina y la pentamidina. Fármacos tradicionales para la enfermedad de Chagas son derivados de la primaquina, puromicina y nitrofurantoína, pero ninguno de estos fármacos se ha probado que sean realmente eficaces en el tratamiento de esta enfermedad.

Entre ejemplos no limitativos de especies de Tripanosoma se encuentran Tripanosoma cruzi (que causa la enfermedad de Chagas), Tripanosoma brucei, Tripanosoma equiperdum y Tripanosoma evansi.

Plasmodium - malaria

La malaria es una de las principales enfermedades mortales a nivel mundial que causa un número estimado de uno - dos millones de muertes anualmente. La malaria está causada por varias especies de plasmodia. La hembra del mosquito anofelino inyecta esporozoítos, los cuales se pueden convertir en merozoítos en el hígado. Los merozoítos infectan los glóbulos rojos y en los glóbulos rojos los merozoítos crecen y, finalmente, provocan la ruptura de la célula y la liberación de más merozoítos, la mayor parte de los cuales infectan otros glóbulos rojos y repiten el ciclo. Algunos de los merozoítos evolucionan a gametocitos, los cuales infectan el mosquito anofelino hembra.

La rotura de las células sanguíneas y la liberación de merozoítos provoca la fiebre asociada con la malaria. La frecuencia de los ataques de fiebre depende de las especies de Plasmodium. Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax y Plasmodium ovale provocan la rotura de los glóbulos rojos después de 48 horas y, por lo tanto, el paciente de malaria experimenta ataques de fiebre violentos cada tres días. Plasmodium malariae provoca la rotura de los glóbulos rojos cada 72 horas.

Entamoeba histolytica

Este parásito protozooario infecta el intestino inferior y frecuentemente causa disentería amébica. Sin tratamiento, puede llevar a la muerte. Esta ameba no está restringida al intestino grueso sino que se puede extender a otros órganos blandos, particularmente el hígado, en los que puede producir grandes abscesos en el curso de pocos años. La gente se infecta mediante la ingestión del quiste amébico en alimentos o agua contaminados.

El trematodo hepático oriental

El ciclo de vida del trematodo hepático oriental Chlornorchis sinensis empieza con un miracidio que infecta un caracol. En el caracol el miracidio se convierte en cercaria. La cercaria abandona el caracol y penetra en la piel de un pez. En el pez, la propia cercaria se enquista en el tejido muscular y cuando alguien se come el pescado crudo o poco hecho el gusano inmaduro se libera y migra al hígado en el que madura provocando daños en el hígado.

Derivados lipídicos

Los sistemas de liberación basados en lípidos (liposomas o micelas) cuentan con derivados lipídicos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo dicho profármaco, además, un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológica activa se libera en forma de un derivado lisolipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa.

Aunque los términos "lípido" y "lisolípido" (en el contexto de los fosfolípidos) serán términos bien conocidos para un técnico en la materia, se debe poner énfasis en que, dentro de la presente descripción y en las reivindicaciones, se pretende que el término "lípido" signifique triésteres de glicerol con la siguiente fórmula:

1

en la que R^{A} y R^{B} son fragmentos de ácido graso (alquilo/alquileno/alquildieno/alquiltrieno/alquiltetraeno-C(=O)-C_{9-30}) y R^{C} es un ácido fosfatídico (PO_{2}-OH) o un derivado de ácido fosfatídico. De este modo, los grupos R^{A} y R^{B} están unidos a la estructura de glicerol por medio de enlaces éster.

Se pretende que el término "lisolípido" signifique un lípido en el que el grupo ácido graso R^{B} está ausente (por ejemplo, se ha escindido hidrolíticamente), es decir, un derivado de glicerol de la fórmula anterior, en la que R^{B} es un hidrógeno, pero en la que los otros sustituyentes están sustancialmente inafectados. La conversión de un lípido a un lisolípido puede tener lugar bajo la acción de un enzima, específicamente bajo la acción de la PLA_{2} tanto celular como extracelular.

Se pretende que los términos "derivado lipídico" y "derivado lisolipídico" incluyan los posibles derivados de los posibles compuestos anteriores, dentro de los grupos "lípido" y "lisolípido", respectivamente. Se dan ejemplos de derivados lipídicos y derivados lisolipídicos biológicamente activos en Houlihan y otros, Med. Res. Rev., 15, 3, 157-223. De este modo, como resultará evidente, la extensión de "derivado" debería entenderse en el sentido más
amplio.

Dentro de la presente solicitud, sin embargo, los derivados lipídicos y lisolipídicos deben cumplir ciertos criterios funcionales (ver anteriormente) y/o requerimientos estructurales. Es particularmente relevante destacar que los derivados lipídicos adecuados son aquéllos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7, preferentemente, como mínimo, de 9 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico. Resultará evidente que el grupo alifático y el radical orgánico corresponderán a los dos fragmentos de ácido graso en un lípido normal y que el fragmento hidrofílico corresponderá al fragmento fosfato de un (fosfo)lípido o un bioisóstero del mismo.

De este modo, un elemento de la idea subyacente en la presente invención es aprovechar el nivel aumentado de actividad de la PLA_{2} extracelular en áreas localizadas del cuerpo de un mamífero, en particular, áreas de infección parasítica, los derivados lipídicos que se pueden utilizar en la presente invención deben ser sustratos para la PLA_{2} extracelular, es decir, los derivados lipídicos deben ser capaces de experimentar escisión hidrolítica y enzimática del radical orgánico que corresponde al ácido graso en la posición 2 de un lípido. Se conoce que la PLA_{2} extracelular pertenece a la clase de enzimas (EC) 3.1.1.4. De este modo, como referencia a la PLA_{2} (extracelular) deben entenderse todos los enzimas extracelulares de esta clase, por ejemplo, las lipasas, que pueden inducir la escisión hidrolítica del radical orgánico que corresponde al ácido graso en la posición 2 de un lípido. Una ventaja particular del sistema de liberación basado en lípidos (como liposomas y micelas) es que la actividad de la PLA_{2} extracelular aumenta significativamente frente a sustratos organizados en comparación con sustratos monoméricos.

En vista del requerimiento de hidrolizabilidad por la PLA_{2} extracelular, resulta claro que el radical orgánico (por ejemplo, el grupo alifático) se une preferentemente por medio de una funcionalidad éster que se puede escindir por la PLA_{2} extracelular, preferentemente, para que el grupo que se escinde sea un ácido carboxílico.

Además, una característica importante es que el grupo alifático (el grupo que corresponde al ácido graso en la posición 1 de un lípido) del derivado lipídico, es decir, el derivado lisolipídico después de la escisión por la PLA_{2} extracelular, está sustancialmente inafectado por la acción de la PLA_{2} extracelular. Se comprende que "estar sustancialmente inafectado" indique que la integridad del grupo alifático se mantiene y que menos del 1% molar, preferentemente, menos del 0,1% molar, del grupo alifático (el grupo alifático en la posición 1) se escinde por la acción de la PLA_{2} extracelular.

Además, el derivado lisolipídico resultante de la escisión hidrolítica del radical orgánico no debe ser en sí mismo un sustrato para la lisofosfolipasa. Se conoce que la lisofosfolipasa pertenece a la clase de enzimas (EC) 3.1.1.5. De este modo, con referencia a la lisofosfolipasa se deben comprender todos los enzimas de esta clase que catalizan la reacción liso(fosfo)lípido + agua que producen fosfoglicerol + ácido graso. Se comprende que el término "no ser un sustrato para la lisofosfolipasa" signifique que la lisofosfolipasa tiene una actividad inferior al 1% frente al sustrato, en comparación con el correspondiente éster-lípido, es decir, no tiene virtualmente actividad enzimá-
tica.

Ejemplos adecuados de estos derivados lisolipídicos son aquellos que no experimentarán escisión hidrolítica por la acción de las lisofosfolipasas. De este modo, los derivados lisolipídicos, en particular, no son lisolípidos y los derivados lisolipídicos, que tienen una unión éster en la posición 1 del lisolípido o en la posición de un derivado lisolipídico que corresponde a la posición 1 de un lisolípido.

Una clase preferente de derivados lipídicos para su incorporación en los sistemas de liberación basados en lípidos se puede representar por la fórmula siguiente:

2

en la que

X y Z, independientemente, se seleccionan entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2}, preferentemente entre O, NH, NMe y CH_{2}, en particular, O;

Y es -OC(O)-, estando Y conectada entonces con R^{2} o bien por medio del oxígeno o bien el átomo de carbono del carbonilo, preferentemente por medio del átomo de carbono del carbonilo;

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, tales como un grupo alifático que tiene una longitud, como mínimo, de 7, preferentemente, como mínimo, de 9 átomos de carbono, preferentemente un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2};

en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7}-(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 29; n1 es cero o un número entero de 1 a 29, n3 es cero o un número entero de 1 a 20, n5 es cero o un número entero de 1 a 17, n7 es cero o un número entero de 1 a 14, y n9 es cero o un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8 es independientemente cero o 1; y Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; en la que cada uno de los Y^{1}-Y^{2} independientemente pueden estar sustituidos con halógeno o C_{1-4}-alquilo, pero preferentemente Y^{1}-Y^{2} no está sustituido,

R^{3} se selecciona entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros de ácido fosfático y derivados de los mismos.

Tal como se ha mencionado anteriormente, realizaciones preferentes sugieren que Y es -OC(O)-, en el que Y está conectado a R^{2} por medio del átomo de carboxilo. Las realizaciones más preferentes sugieren que X y Z son O y que Y es -OC(O)-, en el que Y está conectado a R^{2} por medio del átomo de carboxilo. Esto significa que el derivado lipídico es un compuesto del tipo 1-monoéter-2-monoéster-fosfolípido.

Otro grupo de derivados lipídicos preferente es aquel en el que el grupo X es S.

En una realización, R^{1} y R^{2} son grupos alifáticos de fórmula Y^{1} Y^{2}, en la que Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H, pero preferentemente CH_{3}, y en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}(CH=CH)_{n2}(CH_{2})_{n3}(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}(CH=CH)_{n6}(CH_{2})_{n7}(CH=CH)_{n8}(CH_{2})_{n9}; la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 23; es decir, el grupo alifático, Y^{1}Y^{2}, tiene una longitud de 10-24 átomos de carbono. n1 es igual a cero o es un número entero de 1 a 23; n3 es igual a cero o es un número entero de 1 a 20; n5 es igual a cero o es un número entero de 1 a 17; n7 es igual a cero o es un número entero de 1 a 14; n9 es igual a cero o es un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8, independientemente, es igual a cero o 1.

En una realización, uno o más de los grupos alifáticos R^{1}/R^{2} o los grupos R^{3} incluyen un marcador, por ejemplo, átomos de halógenos (bromo, yodo) o bario que son particularmente adecuados para la formación de imágenes mediante tomografía computada (CT), o se enriquecen con isótopos inestables, por ejemplo, ^{11}C, que es particularmente útil para los propósitos del barrido PET.

Aunque los grupos alifáticos pueden estar insaturados e incluso sustituidos con halógenos (flúor, cloro, bromo, yodo) y grupos C_{1-4} (es decir, generando grupos alifáticos ramificados), en una realización los grupos alifáticos, tales como R^{1} y R^{2}, están preferentemente saturados así como no ramificados, es decir, preferentemente no tienen dobles enlaces entre átomos de carbono adyacentes, siendo entonces cada uno de los n2, n4, n6 y n8 igual a cero. De acuerdo con ello, Y^{1} es, preferentemente, (CH_{2})_{n1}. Más preferentemente (en esta realización), cada uno de los R^{1} y R^{2} son independientemente (CH_{2})_{n1}CH_{3}, y más preferentemente, (CH_{2})_{17}CH_{3} o (CH_{2})_{15}CH_{3}. En realizaciones alternativas, los grupos pueden tener uno o más dobles enlaces, es decir, estos pueden ser insaturados, y uno o más de los n2, n4, n6 y n8 pueden ser igual a 1. Por ejemplo, en los casos en los que los hidrocarburos insaturados tienen un doble enlace, n2 es igual a 1, cada uno de los n4, n6 y n8 son igual a cero y Y^{1} es (CH_{2})_{n1}CH=CH(CH_{2})_{n3}. n1 es igual a cero o es un número entero de 1 a 21, y n3 es también cero o un número entero de 1 a 20, siendo, como mínimo, uno de los n1 o n3 no igual a cero.

En una realización particular, los derivados lipídicos son aquellos que son monoéter lípidos en los que X y Z son O, R^{1} y R^{2} se seleccionan independientemente entre grupos alquilo, (CH_{2})_{n}CH_{3}, en los que n es 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29, preferentemente 14, 15 ó 16, en particular, 14; Y es -OC(O)-, estando Y entonces conectado a R^{2} por medio del átomo de carbono de carbonilo.

Con respecto al fragmento hidrofílico (conocido habitualmente como el "grupo de cabeza") que corresponde a R^{3}, se cree que se pueden utilizar una gran variedad de grupos que corresponden a ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros al ácido fosfático y derivados de los mismos. Como resultará evidente, el requerimiento crucial de R^{3} es que los grupos deben permitir la escisión enzimática del grupo R^{2} (en realidad R^{2}-C(=O) o R^{2}-OH) por la PLA_{2} extracelular. De hecho, los "bioisósteros al ácido fosfatídico y derivados de los mismos" implican que tales grupos, como el ácido fosfatídico, deben permitir la escisión enzimática por la PLA_{2} extra-
celular.

Generalmente, R^{3} se selecciona entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), fosfatidilcolina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{3}), fosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NH_{2}), N-metil-fosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NCH_{2}), fosfatidilserina, fosfatidilinositol, y fosfatidilglicerol (PO_{2}-O-CH_{2}CHOHCH_{2}OH). Otros derivados posibles del ácido fosfatídico son aquellos en los que ácidos dicarboxílicos, tales como los ácidos glutárico, sebácico, succínico y tartárico, se acoplan al nitrógeno terminal de fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, etc.

Un aspecto muy interesante es la posibilidad de modificación del efecto farmacéutico del derivado lipídico mediante la modificación del grupo R^{2}. Se debe comprender que R^{2} debe ser un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono (tal como un grupo alifático que tiene una cierta longitud (como mínimo, 7, preferentemente, 9 átomos de carbono)), es posible un elevado grado de variabilidad, por ejemplo, no es necesario que R^{2} sea un residuo de cadena larga, pero puede representar estructuras más complejas.

Generalmente, se cree que R^{2} puede ser bastante inerte para el medio en el que éste se puede liberar por la PLA_{2} extracelular o bien que R^{2} puede tener una función farmacéutica activa, generalmente como una sustancia farmacológica antiparasítica auxiliar, tal como alopurinol, amodiaquina, anfotericina, antifolatos, una combinación de artemeter + benflumetol, derivados de la artemisina, cloroproguanil, Cloroquina, combinación de atovacuona y proguanil HCL (nombre comercial Malarone^{TM}), dapsona, Doxiciclina, halofantrina, interferón gamma, Licochalcona A, Mefloquina, antimoniato de meglumina, metronidazol, derivados de nitrofurantoína, paromomicina, pentamidina, primaquina, primaquina, Proguanil, (Cloroquina más proguanil), puromicina, pirimetamina, pironaridina, quinina y estibogluconato sódico o como un modificador de eficacia para el derivado lisolipídico y/o cualquier otra (segunda) sustancia presente en el medio.

En una realización, uno o más de los grupos alifáticos R^{1}/R^{2} o los grupos R^{3} incluyen un marcador, por ejemplo, átomos de halógenos (bromo, yodo) o bario que son particularmente adecuados para la formación de imágenes por tomografía computada (CT), o se enriquecen con isótopos inestables, por ejemplo, ^{11}C, que es particularmente útil para los propósitos del barrido PET.

En algunas realizaciones, el grupo R^{2} será un residuo de cadena larga, por ejemplo, un residuo de ácido graso (el ácido graso incluirá un carbonilo del grupo Y). Esto se ha descrito con detalle anteriormente. Ejemplos interesantes de sustancias farmacológicas auxiliares como R^{2}, dentro de este subgrupo, son los ácidos poliinsaturados, por ejemplo, oleato, linoleico, linolénico, así como derivados de araquidonoílo (incluyendo el carbonilo de Y), por ejemplo, prostaglandinas, tales como la prostaglandina E_{1}, ya que los derivados de ácido araquidónico son reguladores conocidos de la acción hormonal, incluyendo la acción de prostaglandinas, tromboxanos, y leucotrinos. Ejemplos de modificadores de eficacia como R^{2} son aquellos que aumentan la permeabilidad de la membrana celular diana, así como la actividad de la PLA_{2} extracelular o la sustancia farmacológica activa o cualquier segunda sustancia farmacológica. Ejemplos de los mismos son los ácidos grasos de cadena corta (C_{8-12}).

Sin embargo, se prevé, además, que otros grupos pueden ser útiles como radical orgánico R^{2}, por ejemplo, derivados de vitamina D, derivados de esteroides, ácido retinoico (que incluye ácido todo-trans-retinoico, ácido todo-cis-retinoico, ácido 9-cis-retinoico, ácido 13-cis-retinoico), análogos de colecalciferol y tocoferol, ácidos carboxílicos farmacológicamente activos, tales como ácidos carboxílicos alifáticos de cadena ramificada (por ejemplo, ácido valproico y los descritos en la Patente WO 99/02485), ácidos salicílicos (por ejemplo, ácido acetilsalicílico), ácidos carboxílicos esteroidales (por ejemplo, ácidos lisérgico e isolisérgico), ácidos carboxílicos monoheterocíclicos (por ejemplo, ácido nicotínico) y ácidos carboxílicos poliheterocíclicos (por ejemplo, penicilinas y cefalosporinas), diclofenac, indometacina, ibuprofeno, naproxeno, ácido 6-metoxi-2-naftilacético.

Se debe comprender que se hace referencia a los diferentes ejemplos de posibles grupos R^{2} por el nombre de una especie discreta, en lugar del nombre del radical. Además, se debe comprender que los posibles ejemplos pueden incluir el grupo carbonilo o el grupo oxi del enlace, por medio del cual el radical orgánico está unido al esqueleto lipídico (que corresponde a "Y" en la fórmula anterior). Por supuesto, esto lo apreciarán los técnicos en la
materia.

Aunque no se ha indicado específicamente en la fórmula general para los ejemplos adecuados de derivados lipídicos que van a utilizarse en la presente invención, se debe comprender que el fragmento de glicol de los derivados lipídicos se puede sustituir, por ejemplo, a efectos de modificar la velocidad de escisión por la PLA_{2} extracelular o simplemente a efectos de modificar las propiedades de los liposomas que comprenden los derivados lipídicos.

Derivados lipídicos como profármacos

Tal como se ha descrito anteriormente, la presente invención da a conocer la utilización de un sistema de liberación basado en lípidos para la administración de una sustancia farmacológica activa seleccionada entre derivados lisolipídicos, en el que la sustancia farmacológica activa está presente en el sistema basado en lípidos en forma de profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual se libera la sustancia farmacológica activa en forma de un derivado lisolipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa para el tratamiento y/o prevención de infecciones parasíticas en mamíferos.

Infecciones parasíticas típicas en mamíferos son aquellas que están dirigidas al hígado, el bazo y la médula ósea.

Con el término "sustancia farmacológica activa" se indica cualquier entidad química que proporcionará un efecto profiláctico o terapéutico en el cuerpo de un mamífero, en particular un humano.

El término "profármaco" se debe comprender en el sentido normal, en concreto, como un fármaco que está enmascarado o protegido con el propósito de convertirse (generalmente por escisión, pero también por conversión química in vivo) en la sustancia farmacológica pretendida. Un técnico en la materia reconocerá el alcance del término "profármaco".

La sustancia farmacológica activa se selecciona entre los derivados lisolipídicos, y tal como se entenderá a partir de la presente descripción con las reivindicaciones, los derivados lisolipídicos tendrán un efecto terapéutico, como mínimo, en relación a las infecciones parasíticas en las que un área local del cuerpo del mamífero tiene un nivel de actividad de la PLA_{2} extracelular provocado por dicha infección parasítica que puede liberar el derivado lisoli-
pídico.

Tal como se entenderá de la presente descripción con las reivindicaciones, el derivado lipídico a menudo constituirá el profármaco al que se ha hecho referencia anteriormente y el derivado lisolipídico constituirá, de esta manera, la sustancia farmacológica activa, frecuentemente un derivado lisolipídico monoéter. Sin embargo, se debe comprender que esto no excluye la posibilidad de incluir en los sistemas de liberación basados en lípidos otras sustancias farmacológicas, a las que se hace referencia como segundas sustancias farmacológicas, ni excluye que el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente por la acción de la PLA_{2} extracelular pueda tener un cierto efecto farmacéutico (por ejemplo, como sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de eficacia, tal como ha descrito en otras partes de la presente descripción) o actuar como marcador. Además, el efecto farmacéutico de la "sustancia farmacológica activa", es decir, el derivado lisolipídico, no es necesariamente el más predominante en los casos en los que se incluye una segunda sustancia farmacológica, en realidad, el efecto de la segunda sustancia farmacológica puede ser satisfactoriamente el más predominante, como se destacará en la otra realización principal (ver "Liposomas de derivados lipídicos como sistemas de liberación de fármacos", a continuación).

Se cree que la liberación de la sustancia farmacológica activa (derivado lisolipídico) a partir del profármaco (derivado lipídico) tiene lugar tal como se ilustra en el siguiente ejemplo:

3

Además, el sustituyente R^{2} puede constituir una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficacia para la sustancia farmacológica activa y se liberará de forma simultánea bajo la acción de la PLA_{2} extracelular.

4

Anteriormente, en la definición de R^{2}, se ha descrito cómo el grupo R^{2} puede tener varios efectos independientes o sinérgicos conjuntamente con la sustancia farmacológica activa, por ejemplo, como una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficacia, por ejemplo, un modificador de la permeabilidad o de la lisis celular. Debe tenerse en cuenta que los grupos que corresponden a R^{2} (por ejemplo, R^{2}-OH o R^{2}-COOH) pueden tener un efecto farmacéutico que es predominante en relación al efecto del derivado lisolipídico (sustancia farmacológica activa).

Derivados lipídicos formulados como liposomas y micelas

El término "sistema de liberación de fármacos basado en lípidos" debe abarcar estructuras macromoleculares que incluyen, como constituyente principal, lípidos o derivados lipídicos. Los liposomas y las micelas son ejemplos adecuados de los mismos. Actualmente, se cree que los liposomas ofrecen el rango más amplio de aplicaciones y éstas se han descrito con más detalle a continuación. Aunque en la actualidad se cree que los liposomas son el sistema basado en lípidos preferente, se cree que los sistemas micelares también ofrecen realizaciones interesantes dentro de la presente invención.

Cuando se utiliza en la presente invención, se pretende que el término "marcador" signifique una especie que es capaz de administrarse al cuerpo del mamífero y de ser detectada por medios extracorporales para la visualización por imágenes de tejidos vivos. El marcador se debe seleccionar entre radiomarcadores, tales como radioisótopos y compuestos marcados con radioisótopos; compuestos radiopacos; compuestos fluorescentes, etc. Entre los marcadores más específicos se encuentran ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga, ^{11}C, Gd, Mn, óxido de hierro, argón, nitrógeno, yodo, bromo y bario.

Entre los marcadores adecuados para la escintigrafía gamma se encuentran los radionúclidos de diagnóstico, tales como ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga. Para propósitos prácticos, los radionucleótidos se complejan con, por ejemplo, quelantes, tales como ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA), hexametilpropilenamina oxima (HMPAO), ácido diisopropil iminodiacético (DISIDA), o incluso proteínas, tales como la albúmina sérica humana (HSA). De forma alternativa, el DTPA o compuestos quelantes similares se pueden derivatizar mediante la incorporación de un grupo hidrofóbico, que puede anclar el fragmento quelante sobre la superficie del liposoma durante la preparación del liposoma o después de la misma.

Entre los marcadores adecuados para los rayos X se encuentran la verografina, ioxaglato, iohexol, iopromida, iomeprol, iopamidol, iopentol, iodixanol, ioversol, diferentes medios de contraste no iónicos, etc., que se pueden incorporar en liposomas y utilizar tanto para la formación de imágenes por rayos X del hígado y el bazo como para la formación de imágenes por tomografía computada (CT).

Entre los marcadores adecuados para la visualización de imágenes por resonancia magnética (MR) se encuentran iones paramagnéticos, tales como el Gd y Mn, y el óxido de hierro acoplado a diferentes moléculas portadoras. Por ejemplo, se ha demostrado que el complejo gadolinio ácido dietilentriamino pentaacético (Gd-DTPA) es un agente de contraste eficaz para la formación de imágenes por MR del hígado, el bazo y metástasis hepáticas.

Entre los marcadores adecuados para la visualización de imágenes por tomografía computada (CT) se encuentran el yodo, bromo, bario, etc.

El método seleccionado de visualización de imágenes o de detección a menudo proporciona otros ejemplos de marcadores adecuados, los cuales se describen detalladamente en el "Manual de Visualización Médica de Imágenes" ("Handbook of Medical Imaging"), Vol 1, 2 y 3, SPIE Press, Washington USA, 2000, eds. Beutel, Konden y van Metter.

El marcador se puede adaptar de tal modo que sea detectable y opcionalmente cuantificable mediante un método de detección seleccionado del grupo que consiste en la tomografía por emisión de positrones (PET), los rayos X, la escintigrafía gamma, la formación de imágenes por resonancia magnética (MR), la formación de imágenes por tomografía computada (CT) y la ultrasonografía.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a la utilización de un sistema potenciador de la imagen (liposomas o micelas), que depende de un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo dichos agentes de contraste conjugados de lípidos también un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual los agentes de contraste conjugados de lípidos se liberan en forma de un derivado lisolipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa.

En una variante importante que se puede combinar de forma ventajosa con las realizaciones descritas en la presente invención, el derivado lipídico (por ejemplo, el profármaco) se incluye en los liposomas como constituyente único o, lo que es más habitual, en combinación con otros constituyentes (otros lípidos, esteroles, etc.). De este modo, los sistemas basados en lípidos descritos en la presente invención están preferentemente en forma de liposomas, en los que los liposomas están formados de capas que comprenden el derivado lipídico (por ejemplo, un profármaco).

Los "liposomas" son conocidos como estructuras que se autoorganizan comprendiendo una o más bicapas de lípidos, cada una de las cuales rodea un compartimento acuoso y comprende dos monocapas de moléculas de lípido anfipático que se oponen. Los lípidos anfipáticos (en la presente invención, entre otros, los derivados lipídicos) comprenden una región polar (hidrofílica) de grupo de cabeza (que corresponde al sustituyente R^{3} en los derivados lipídicos) enlazado covalentemente a uno o dos grupos alifáticos no polares (hidrofóbicos) (que corresponden a R^{1} y R^{2} en los derivados lipídicos). Generalmente, se cree que contactos entre los grupos hidrofóbicos y el medio acuoso energéticamente no favorables inducen a las moléculas de lípido a reorganizarse, de manera que los grupos de cabeza polares se orientan hacia el medio acuoso, mientras que los grupos hidrofóbicos se reorientan hacia el interior de la bicapa. Se forma una estructura energéticamente estable en la que los grupos hidrofóbicos están protegidos eficazmente de entrar en contacto con el medio acuoso.

Los liposomas pueden tener una única bicapa lipídica (liposomas unilamelares, "ULV"), o múltiples bicapas lipídicas (liposomas multilamelares, "MLV"), y se pueden preparar a partir de una variedad de métodos (para una revisión, ver, por ejemplo, Deamer y Uster, "Liposomas" ("Liposomes"), Marcel Dekker, N.Y., 1983, 27-52). Entre estos métodos se incluyen los métodos de Bangham para preparar liposomas multilamelares (MLVs); los métodos de Lenk, Fountain y Cullis para preparar MLVs con una distribución de soluto interlamelar sustancialmente igual (ver, por ejemplo, las Patentes U.S.A. 4.522.803, U.S.A. 4.588.578, U.S.A. 5.030.453, U.S.A. 5.169.637 y U.S.A. 4.975.282); y el método de Papahadjopoulos y otros de evaporación en fase inversa (P atente U.S.A. 4.235.871) para la preparación de liposomas oligolamelares. Los ULV se pueden producir a partir de MLV a mediante métodos, tales como sonicación (ver Papahadjopoulos y otros, Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) o extrusión (Patentes U.S.A. 5.008.050 y U.S.A. 5.059.421). El liposoma se puede producir mediante los métodos de cualquiera de estas descripciones, los contenidos de las cuales se incorporan en la presente invención como referencia.

Se pueden utilizar varias metodologías, tales como sonicación, homogenización, aplicación de la prensa francesa y molienda para preparar liposomas de un tamaño más pequeño a partir de liposomas más grandes. La extrusión (ver la Patente U.S.A. 5.008.050) se puede utilizar para reducir el tamaño de los liposomas, es decir, para producir liposomas que tienen un tamaño medio predeterminado, forzando a los liposomas, bajo presión, para que atraviesen los poros de un filtro de un tamaño definido y seleccionado. Además, se puede utilizar la filtración por flujo tangencial (ver la Patente WO 89/08846) para regularizar el tamaño de los liposomas, es decir, para producir liposomas que tienen una población de liposomas que tienen menos heterogeneidad de tamaño, y una distribución de tamaños más homogénea y definida. El contenido de estos documentos se incorpora en la presente invención como referencia. Además, se pueden determinar los tamaños de los liposomas mediante muchas técnicas, tales como dispersión de la luz casi eléctrica, y con equipos, por ejemplo, el medidor de partícula Nicomp®, que están dentro del conocimiento ordinario de los técnicos en la materia.

Es bastante interesante destacar que los derivados lipídicos pueden constituir la mayor parte de un sistema basados en lípidos, incluso si este sistema es un sistema liposómico. Este hecho reside en la similitud estructural (pero no funcional) entre los derivados lipídicos y los lípidos. De este modo, se cree que los derivados lipídicos pueden ser el constituyente único de los liposomas, es decir, hasta el 100% molar del total de los liposomas deshidratados puede estar constituido por los derivados lipídicos. Esto contrasta con los mono-éter lisolípidos conocidos, que pueden constituir solamente una parte minoritaria de los liposomas.

Típicamente, tal como se describirá con detalle a continuación, los liposomas pueden incluir ventajosamente otros constituyentes que pueden tener o no un efecto farmacéutico, pero que harán que la estructura del liposoma sea más estable (o de forma alternativa, más inestable) o protegerán los liposomas frente a la rotura y, por lo tanto, aumentarán el tiempo de circulación, mejorando, de este modo, la eficacia global de un fármaco que incluye el liposoma. Los liposomas también pueden incluir cofactores, tales como calcio, el cual, tras la liberación, aumentaría la actividad de la PLA_{2}, así como lisolípidos, ácidos grasos, que se sabe que aumentan la actividad de la PLA_{2}.

Dicho esto, se cree que los derivados lipídicos particulares constituirán, generalmente, el 15-100% molar, tal como el 50-100% molar, preferentemente el 75-100% molar, en particular, el 90-100% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares. Algunos liposomas preferentes son unilamelares y tienen diámetros menores de 200 nm, aproximadamente, más preferentemente, desde mayores de 50 nm, aproximadamente, hasta menores de 200 nm, aproximadamente.

Los liposomas, tal como se conoce en la técnica, se preparan, típicamente, por un método que comprende las etapas de: (a) disolución del derivado lipídico en un disolvente orgánico; (b) eliminación del disolvente orgánico de la solución de derivado lipídico de la etapa (a); y (c) hidratación del producto de la etapa (b) con un disolvente acuoso para formar los liposomas.

El método también puede comprender una etapa de adición de una segunda sustancia (ver más adelante) al disolvente orgánico de la etapa (a) o a la fase acuosa de la etapa (c).

Posteriormente, el método puede comprender una etapa de extrusión de los liposomas producidos en la etapa (c) a través de un filtro para producir liposomas de un cierto tamaño, por ejemplo, 100 nm.

Los liposomas que comprenden derivados lipídicos pueden comprender exclusivamente (en principio) derivados lipídicos. Sin embargo, a efectos de modificar los liposomas, se pueden incluir, además, "otros lípidos". Los otros lípidos se seleccionan por su capacidad para adaptarse a conformaciones de empaquetamiento compatibles con los componentes del derivado lipídico de la bicapa, de tal modo que todos los constituyentes del lípido están fuertemente empaquetados, y se inhibe la liberación de los derivados lipídicos de la bicapa. Los factores basados en lípidos que contribuyen a conformaciones de empaquetamiento compatibles son bien conocidos por los técnicos con experiencia ordinaria en la materia, y entre éstos se incluyen, sin que constituyan limitación, la longitud de cadena de acilo y el grado de insaturación, así como el tamaño del grupo de cabeza y su carga. De acuerdo con ello, técnicos con experiencia en la materia, sin una experimentación excesiva, pueden seleccionar otros lípidos adecuados, entre los que se incluyen varias fosfatidiletanolaminas ("PE"), tales como fosfatidiletanolamina de huevo ("EPE") o dioleoíl fosfatidiletanolamina ("DOPE"). Los lípidos se pueden modificar de varias formas, por ejemplo, por derivatización del grupo de cabeza con ácidos dicarboxílicos, tales como los ácidos glutárico, sebácico, succínico y tartárico, preferentemente el ácido dicarboxílico es ácido glutárico ("GA"). De acuerdo con ello, entre los lípidos adecuados con el grupo de cabeza derivatizado se incluyen fosfatidiletanolamina-ácidos dicarboxílicos, tales como dipalmitoíl fosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("DPPE-GA"), palmitoiloleoíl fosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("POPE-GA") y dioleoíl fosfatidiletanolamina-ácido glutárico ("DOPE-GA"). Más preferentemente, el lípido derivatizado es DOPE-GA.

El contenido total de "otros lípidos" estará típicamente dentro del intervalo de 0-30% molar, en particular, de 1-10% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Generalmente, compuestos esterólicos incluidos en el liposoma pueden afectar a la fluidez de las bicapas lipídicas. De acuerdo con ello, las interacciones del esterol con los grupos hidrocarbonados circundantes inhiben, generalmente, la emigración de estos grupos de la bicapa. Un ejemplo de un compuesto esterólico (esterol) que puede incluirse en el liposoma es el colesterol, pero son posibles una variedad de otros compuestos esterólicos. Generalmente, se cree que el contenido de compuesto esterólico, si está presente, estará dentro del intervalo de 0-25% molar, en particular, de 0-10% molar, tal como de 0-5% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Aunque el elemento principal de la idea en la que reside la presente invención es que los liposomas o micelas deberían absorberse por el sistema SER, puede ser ventajoso incluir una pequeña fracción de lípidos o derivados lipídicos sobre los cuales se acoplan cadenas poliméricas, para ajustar la velocidad a la cual los liposomas y las micelas se absorben y, por lo tanto, se degradan. De este modo, puede ser ventajoso utilizar, parcialmente, pero no totalmente, los llamados liposomas STEALTH® (Liposome Technology Inc. Menlo Park, Calif.) que incluyen polietilenglicol (PEG)-lípidos insertados al 5% molar, aproximadamente, del total de liposoma deshidratado, u otros lipopolímeros que contienen cadenas poliméricas hidrofílicas. La presencia de tales polímeros sobre la superficie exterior del liposoma debería retrasar ligeramente, aunque no evitar, la absorción de los liposomas por los órganos del RES. Si están presentes, los lipopolímeros constituyen, típicamente, el 0,1-10% molar del total del sistema deshidratado.

Polímeros hidrofílicos adecuados para su utilización en lipopolímeros son aquellos que son fácilmente solubles en agua, se pueden unir covalentemente a un lípido formador de vesículas, y que son tolerados in vivo sin efectos tóxicos (es decir, son biocompatibles). Entre los polímeros adecuados se incluyen polietilenglicol (PEG), poliláctico (también denominado poliláctido), ácido poliglicólico (también denominado poliglicólido), un copolímero poliláctico-ácido poliglicólico, y alcohol polivinílico. Son preferentes aquellos polímeros que tienen un peso molecular desde 100 ó 120 daltons, aproximadamente, hasta 5.000 ó 10.000 daltons, aproximadamente, y, más preferentemente, desde 300 daltons, aproximadamente, hasta 5.000 daltons, aproximadamente. En una realización particularmente preferente, el polímero es polietilenglicol que tiene un peso molecular desde 100, aproximadamente, hasta 5.000 daltons, aproximadamente, y más preferentemente, que tiene un peso molecular desde 300, aproximadamente, hasta 5.000 daltons, aproximadamente. En una realización particularmente preferente, el polímero es polietilenglicol de 750 daltons (PEG(750)). Los polímeros también se pueden definir por el número de monómeros en los mismos; una realización preferente de la presente invención utiliza polímeros de, como mínimo, tres monómeros, tales como polímeros PEG que comprenden tres monómeros (aproximadamente 150 daltons). Entre otros polímeros hidrofílicos que pueden ser adecuados para su utilización en la presente invención se incluyen polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizadas, tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.

Los glicolípidos son lípidos a los cuales se ha unido covalentemente una cadena de polisacárido hidrofílica. Se puede comprender que los glicolípidos se pueden utilizar como lipopolímeros aunque, en la actualidad, los lipopolímeros presenten los resultados más prometedores.

Generalmente, se cree que el contenido de lipopolímero, si está presente, estará comprendido ventajosamente en el intervalo de 0,1-5% molar, tal como de 0,2-4% molar, en particular, de 0,5-3% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Aún otros ingredientes pueden constituir el 0-2% molar, en particular, el 0-1% molar, en base al total de liposoma deshidratado.

Según una realización, la bicapa lipídica de un liposoma contiene lípidos derivatizados con polietilenglicol (PEG), de tal modo que las cadenas de PEG se extienden desde la superficie interna de la bicapa lipídica dentro del espacio interior encapsulado por el liposoma, y se extiende desde el exterior de la bicapa lipídica dentro del medio circundante (ver, por ejemplo, la Patente U.S.A. 5.882.679).

El liposoma se puede deshidratar, almacenar y, a continuación, reconstituir de manera que se retiene una parte sustancial de su contenido interno. La deshidratación de los liposomas requiere, generalmente, la utilización de un protector de secado hidrofílico, tal como un azúcar disacárido tanto en las superficies interiores como exteriores de las bicapas del liposoma (ver la Patente U.S.A. 4.880.635). Generalmente, se cree que este compuesto hidrofílico impide la reorganización de los lípidos en el liposoma, para que se mantenga el tamaño y los contenidos durante el proceso de secado y la posterior rehidratación. Las cualidades apropiadas de estos protectores de secado son la capacidad de ser aceptores fuertes de enlaces de hidrógeno, y de poseer características estereoquímicas que mantengan el espaciado intramolecular de los componentes de la bicapa del liposoma. Alternativamente, se puede omitir el protector de secado si la preparación de liposomas no se ha congelado anteriormente a la deshidratación, y permanece suficiente agua en la preparación posteriormente a la deshidratación.

Liposomas de derivados lipídicos como sistemas portadores de fármacos o marcadores

Tal como se ha mencionado anteriormente, los liposomas que incluyen los derivados lipídicos también pueden incluir segundas sustancias, en los que dichas segundas sustancias pueden ser fármacos o marcadores. En una realización particular, el sistema de liberación basado en lípidos descrito anteriormente se encuentra en forma de liposomas en los que se incorpora una segunda sustancia. Se debe comprender que segundas sustancias farmacológicas pueden comprender ingredientes farmacéuticamente activos que pueden tener un efecto farmacéutico individual o sinérgico en combinación con el derivado lipídico y los derivados lisolipídicos. Además, el hecho de que cuando la segunda sustancia es un marcador, dicho marcador puede comprender sustancias de contraste u otras sustancias detectables mediante MR, CT, escintigrafía gamma o ultrasonografía. El término "segundo" no implica necesariamente que el efecto farmacéutico de la segunda sustancia farmacológica sea inferior en relación al de, por ejemplo, la sustancia farmacológica activa derivada del profármaco, sino que solamente se utiliza para diferenciar entre los dos grupos de sustancias.

Dicho lo anterior, la presente invención también da a conocer la utilización de un sistema de liberación que se encuentra en forma de liposomas, y en el que se incorpora una segunda sustancia, como fármaco o bien como marcador.

Una posible "segunda sustancia farmacológica" es cualquier compuesto o composición de materia que se puede administrar a mamíferos, preferentemente humanos. Tales agentes pueden tener actividad biológica en mamíferos. Entre las segundas sustancias farmacológicas que se pueden asociar con liposomas son muy conocidos los compuestos antiparasíticos, tales como alopurinol, amodiaquina, anfotericina, antifolatos, artemeter + benflumetol, derivados de la artemisina, cloroproguanil, Cloroquina, una combinación de atovacuona y proguanil HCL (nombre comercial Malarone^{TM}), dapsona, Doxiciclina, halofantrina, interferón gamma, Licochalcona A, Mefloquina, antimoniato de meglumina, metronidazol, derivados de nitrofurantoína, paromomicina, pentamidina, primaquina, Proguanil, (Cloroquina más proguanil), puromicina, pirimetamina, pironaridina, quinina y estibogluconato de sodio.

Las formulaciones de segundas sustancias farmacológicas liposómicas aumentan el índice terapéutico de las segundas sustancias farmacológicas mediante la reducción de la toxicidad del fármaco. Los liposomas también pueden reducir la velocidad a la que la segunda sustancia farmacológica se elimina de la circulación vascular de los mamíferos. De acuerdo con ello, la formulación liposómica de una segunda sustancia farmacológica puede significar que, para conseguir el efecto deseado, se necesita administrar menos fármaco.

Los liposomas se pueden cargar con una o más segundas sustancias solubilizando el fármaco o el marcador en la fase lipídica o acuosa utilizada para preparar los liposomas. Alternativamente, las segundas sustancias ionizables se pueden cargar dentro de los liposomas mediante la formación, en primer lugar, de los liposomas, el establecimiento de un potencial electroquímico, por ejemplo, por medio de un gradiente de pH, a través de la bicapa de liposomas más externa y, a continuación, la adición de la segunda sustancia ionizable al medio acuoso externo al liposoma (ver, por ejemplo, las Patentes U.S.A. 5.077.056 y WO 86/01102).

En la técnica se conocen métodos de preparación de derivados lipofílicos de fármacos o de marcadores que son adecuados para la formulación liposómica o micelar (ver, por ejemplo, las Patentes U.S.A. 5.534.499 y 6.118.011 que describen el acoplamiento covalente de agentes terapéuticos a una cadena de ácido graso de un fosfolípido). En Pharmaceutical Research, 11:206 (1994), de Alkan-Onkyuksel y otros, se describe una formulación micelar de taxol.

De acuerdo con ello, la segunda sustancia farmacológica puede ser una cualquiera de una amplia variedad de ingredientes farmacéuticamente activos conocidos y posibles, pero es preferente una sustancia terapéutica y/o profilácticamente activa. Debido al mecanismo involucrado en la degradación de los liposomas, es preferente que la segunda sustancia farmacológica sea una relacionada con las enfermedades y/o afecciones asociadas con un aumento localizado en la actividad de la PLA_{2} extracelular.

Se prevé que la segunda sustancia se distribuirá en los liposomas según su hidrofilicidad, es decir, las segundas sustancias hidrofílicas tenderán a estar presentes en la cavidad de los liposomas y las segundas sustancias hidrofóbicas tenderán a estar presentes en la bicapa hidrofóbica. En la técnica se conocen métodos para la incorporación de segundas sustancias, tal como se ha dejado claro anteriormente.

A partir de lo anterior, se debe comprender que los derivados lipídicos pueden poseer, como profármacos o constituyentes discretos, una actividad farmacéutica o de diagnóstico. Sin embargo, en una realización particular, la presente invención también se refiere a un sistema de liberación de fármacos o marcadores basado en lípidos para la administración de una segunda sustancia, en el que la segunda sustancia se incorpora en el sistema (por ejemplo, en el que la segunda sustancia se encapsula en el interior del liposoma o en la parte de la membrana del liposoma o la región del núcleo de una micela), incluyendo dicho sistema derivados lipídicos que tienen (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, en el que el derivado lipídico también es un sustrato para la PLA_{2} (fosfolipasa A_{2}) extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, de manera que da como resultado un fragmento de ácido orgánico o un fragmento de alcohol orgánico y un fragmento de lisolípido, no siendo dicho fragmento de lisolípido un sustrato para la lisofosfolipasa.

Tal como se ha descrito anteriormente para el sistema, según las otras realizaciones, el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente puede ser una sustancia farmacológica o marcadora auxiliar o un modificador de la eficacia para la segunda sustancia. Se debe comprender que el derivado lipídico es un derivado lipídico tal como se ha definido anteriormente. Típicamente, el derivado lipídico constituye el 15-100% molar, tal como el 50-100% molar, del total del sistema (liposoma) deshidratado.

La presente invención se refiere a la utilización de los sistemas de liberación de fármacos basados en lípidos descritos en la presente invención, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de infecciones parasíticas de un mamífero, en el que la infección parasítica se caracteriza por incrementar el nivel de la PLA_{2} en dicho mamífero, particularmente en el tejido específico de la infección, preferentemente el hígado o el bazo.

Además, la presente invención se refiere a la utilización de cualquiera de los sistemas de liberación basados en lípidos descritos en la presente descripción, para la preparación de un agente de diagnóstico para la detección o cuantificación de infecciones parasíticas de un mamífero, en el que la infección parasítica se caracteriza por incrementar el nivel de la PLA_{2} en dicho mamífero, particularmente en el tejido específico de la infección, preferentemente el hígado o el bazo.

Preparaciones farmacéuticas y utilizaciones terapéuticas

Tal como se utiliza en la presente invención, los "portadores farmacéuticamente aceptables" son aquellos medios generalmente aceptables para su utilización en relación a la administración de lípidos y liposomas, entre los que se incluyen formulaciones farmacológicas liposómicas, a mamíferos, entre los que se incluyen los humanos. Generalmente, los portadores farmacéuticamente aceptables se formulan de acuerdo con muchos factores, que se determinan y se tienen en cuenta dentro del ámbito del técnico con experiencia ordinaria, entre los que se incluyen, sin que constituya limitación: la sustancia farmacológica activa particular y/o la segunda sustancia farmacológica o marcadora utilizada, la preparación de los liposomas, su concentración, la estabilidad y biodisponibilidad pretendidas; la enfermedad, trastorno o afección que se está tratando con la composición liposómica; el individuo, su edad, tamaño y condición física general; y la ruta de administración pretendida de la composición, por ejemplo, nasal, oral, oftálmica, subcutánea, intramamaria, intraperitoneal, intravenosa, o intramuscular. Entre los portadores farmacéuticamente aceptables típicos utilizados en la administración de fármacos parenteral se incluyen, por ejemplo, D5W, una solución acuosa que contiene el 5% en peso por volumen de dextrosa, y solución salina fisiológica. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener ingredientes adicionales, por ejemplo, aquellos que aumentan la estabilidad de los ingredientes activos incluidos, tales como conservantes y antioxidantes.

El liposoma o derivado lipídico generalmente se formula en un medio de dispersión, por ejemplo, un medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Se administra, preferentemente por vía intravenosa, una cantidad de la composición que comprende una cantidad del derivado lipídico antiparasítica eficaz, generalmente desde 0,1, aproximadamente, hasta 1000 mg, aproximadamente, del derivado lipídico por kg de cuerpo del mamífero. Para los propósitos de la presente invención, "cantidades antiparasíticas eficaces" de los derivados lipídicos liposómicos son cantidades eficaces para inhibir, mejorar, disminuir o evitar el establecimiento, proliferación, crecimiento, etc. de parásitos en mamíferos a los cuales se han administrado los derivados lipídicos. Las cantidades antiparasíticas eficaces se seleccionan, generalmente, según muchos factores, por ejemplo, tamaño y condición física general del individuo, la infección parasítica que se está tratando y la vía de administración pretendida, y se determinan por una diversidad de medios, por ejemplo, pruebas de determinación de dosis, bien conocidas y fácilmente practicables por técnicos con experiencia ordinaria en la materia a partir de la descripción de la presente invención. Las cantidades antiparasíticas eficaces de los fármacos/profármacos liposómicos de la presente invención son aproximadamente las mismas que las cantidades de fármacos/profármacos no liposómicos libres, por ejemplo, desde 0,1 mg, aproximadamente, del derivado lipídico por kg de peso corporal del mamífero que se está tratando hasta 1000 mg, aproximadamente, por kg. La composición farmacéutica se administra, preferentemente mediante inyección, infusión o implante (intravenoso, intramuscular, intraarticular, subcutáneo o similar) en formas de dosificación, formulaciones o, por ejemplo, dispositivos de liberación o implantes adecuados, que contienen portadores o adyuvantes farmacéuticamente aceptables, no tóxicos y convencionales.

La formulación y preparación de tales composiciones es bien conocida por los técnicos en la materia de la formulación farmacéutica. Se pueden encontrar formulaciones específicas en el libro de texto titulado "Ciencias Farmacéuticas de Remington" ("Remington's Pharmaceutical Sciences").

De este modo, las composiciones farmacéuticas pueden comprender las sustancias activas en forma de inyección estéril. Para preparar una composición de ese tipo, las sustancias activas adecuadas se dispersan en un vehículo líquido parenteralmente aceptable que puede comprender, de forma conveniente, agentes de suspensión, solubilizantes, estabilizantes, agentes para ajuste del pH y/o dispersantes. Entre los vehículos aceptables que se pueden utilizar se encuentran el agua, agua ajustada a un pH adecuado mediante la adición de una cantidad adecuada de ácido clorhídrico, hidróxido sódico o un tampón adecuado, 1,3-butanodiol, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro sódico.

La formulación acuosa también puede contener uno o más conservantes, por ejemplo, metil, etil o n-propil p-hidroxibenzoato.

Toxicidad

La toxicidad en los liposomas que comprenden los derivados lipídicos se puede calcular mediante la determinación de la ventana terapéutica "TW", que es un valor numérico que se deriva de la relación entre la inducción de hemólisis de los compuestos y su capacidad de inhibición del crecimiento/proliferación de los parásitos. Los valores de TW se definen como HI_{5}/GI_{50} (en el que "HI_{5}" es igual a la concentración de compuesto que induce una hemólisis del 5% de los glóbulos rojos en un cultivo, y en el que "GI_{50}" es igual a la dosis de compuesto que induce el cincuenta por ciento de inhibición del crecimiento en una población de células parasíticas expuestas al agente). Cuanto mayor es el valor de HI_{5} de un agente, menos hemolítico es el agente, y que HI_{5} sea mayor significa que se requiere que estén presentes concentraciones superiores de compuesto para que el compuesto induzca el 5% de hemólisis. Por lo tanto, cuanto mayor es su HI_{5}, más beneficioso terapéuticamente es un compuesto, ya que se puede administrar más del mismo antes de que induzca la misma cantidad de hemólisis que un agente con un HI_{5} inferior. Contrariamente, valores de GI_{50} inferiores indican agentes terapéuticos mejores, (un valor de GI_{50} inferior indica que se requiere una concentración menor de un agente para el 50% de inhibición del crecimiento). De acuerdo con ello, cuanto mayor es su valor de HI_{5} y menor es su valor de GI_{50}, mejores son las propiedades del compuesto de un agente terapéutico.

Generalmente, cuando la TW de un fármaco es inferior a 1, no se puede utilizar de forma eficaz como agente terapéutico. Es decir, el valor HI_{5} del agente es suficientemente bajo, y su valor GI_{50} suficientemente alto, para que, en general, no sea posible administrar suficiente agente para conseguir un nivel suficiente de inhibición del crecimiento del parásito, sin tampoco conseguir un nivel inaceptable de hemólisis. Dado que los liposomas de derivados lipídicos aprovechan la inferior actividad de la PLA_{2} extracelular en el flujo sanguíneo en comparación con la actividad en el tejido enfermo, se cree que la TW será mucho mayor que la de los monoéter lisolípidos normales. Dado que la variancia en la actividad se encuentra en órdenes de magnitud y como los liposomas estarán "atrapados" en el tejido con una actividad elevada de la PLA_{2} extracelular, se cree que, generalmente, la TW de los liposomas de la presente invención será superior a 3, aproximadamente, más preferentemente superior a 5, y todavía más preferentemente superior a 8, aproximadamente.

La presente invención se ilustrará con los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplos

Ejemplo 1

Preparación de liposomas

Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y di-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC). DPPC se obtuvo de Avanti Polar lipids y 1-O-DPPC se sintetizó en el laboratorio de los presentes inventores. Brevemente, se disolvieron cantidades pesadas de DPPC o 1-O-DPPC en cloroformo. El disolvente se eliminó mediante una corriente ligera de N_{2} y las películas lipídicas se secaron durante toda la noche a baja presión para eliminar cantidades traza de disolvente. Se prepararon vesículas multilamelares mediante la dispersión de los lípidos secos en una solución tampón que contenía: KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH = 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM y EDTA 10 \muM. Las vesículas multilamelares se extrudieron diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm de tamaño de poros, tal como describen Mayer y otros, Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168.

Se obtuvieron curvas de capacidad calorífica utilizando un calorímetro de barrido diferencial N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp., Provo) del tipo de energía compensada, con un volumen de célula de 0,34 ml. Antes del barrido, la suspensión de liposomas se equilibró durante 50 min en el calorímetro a la temperatura inicial. Se utilizó una velocidad de barrido de +10ºC/h. La concentración de lípido fue de 1 mM. La transición de gel a fluido de los liposomas multilamelares (MLV) se caracteriza por ser una transición aguda de primer orden, tal como refleja el pico estrecho en las curvas de capacidad calorífica mostradas en las figuras 1a y 1b (curvas superiores) para el 1-O-DPPC y el DPPC. El pico agudo refleja el comportamiento transicional de los liposomas multilamelares y contrasta con la transición de gel a fluido más ancha observada para los liposomas unilamelares (LUV) (Pedersen y otros, 1996, Biophys. J. 71, 554-560) tal se muestra en las figuras 1a y 1b (curvas inferiores) para los liposomas unilamelares extruídos de 1-O-DPPC y DPPC.

Ejemplo 2

Perfil de reacción de la fosfolipasa A_{2} y medidas del tiempo de latencia

Se ha aislado fosfolipasa A_{2} de veneno de serpiente purificada (PLA_{2} de Agikistrodon piscivorus piscivorus), de acuerdo con el procedimiento de Maraganore y otros, J. Biol. Chem. 259, 13839-13843. Este enzima PLA_{2} pertenece a la clase de enzimas secretores de peso molecular bajo, 14 kD, que muestra similitud estructural con la fosfolipasa A_{2} extracelular humana, indicando mecanismos moleculares comunes de la hidrólisis catalizada por la fosfolipasa en la interfase lípido-membrana (Wery y otros, Nature 352, 79-82; Hønger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006; Vermehren y otros, Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36). Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y a partir de 1-O-DPPC con un 5% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). Las condiciones del ensayo para el perfil de tiempo de reacción de la PLA_{2}, mostrado en la figura 2, y el tiempo de latencia y porcentaje hidrólisis descritos en la Tabla 1 fueron: liposomas unilamelares 0,15 mM, PLA_{2} 150 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA
10 \muM.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 1 Tiempo de latencia y porcentaje de 1-O-DPPC hidrolizado a 41ºC, tal como se determina por HPLC. La concentración de lípido fue de 0,150 mM en una solución tampón de HEPES 10 mM (pH = 7,5)

5

\vskip1.000000\baselineskip

La reacción catalítica se inició por adición de 8,9 \mul de una solución de reserva de PLA_{2} 42 \muM (150 nM) a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada (0,150 mM), equilibrada durante 800 s anteriormente a la adición de PLA_{2}. El comportamiento característico de tiempo de latencia previo a un aumento súbito de la actividad catalítica, ("lag burst") de la PLA_{2} hacia los liposomas se señala por un aumento súbito en la fluorescencia intrínseca de la PLA_{2} a 340 nm después de la excitación a 285 nm, seguida de una disminución simultánea en la dispersión de la luz a 90º de la suspensión de lípido (Hønger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Se tomaron muestras para el análisis por HPLC de la cantidad de 1-O-DPPC no hidrolizada remanente y, por lo tanto, la cantidad de 1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-1-O-PPC) generada, previamente a la adición de la PLA_{2} y 1200 s después del tiempo de latencia observado. Se extrajeron fracciones alícuotas de 100 \mul de la suspensión de lípidos y se mezclaron rápidamente con 1 ml de una solución de cloroformo/metanol/ácido acético (2:4:1) a efectos de detener la reacción enzimática. La solución se lavó con 1 ml de agua y 20 \mul de la fase orgánica pesada se utilizaron para HPLC. Los cromatogramas de HPLC en la figura 3 muestran las cantidades de 1-O-DPPC antes y después (t = 3000 s) de la adición de PLA_{2} (t = 800 s) a la suspensión de liposomas. Se realizó el análisis por HPLC utilizando una columna de diol de 5 \mum, una fase móvil compuesta de cloroformo/metanol/agua (730:230:30, v/v) y un detector evaporativo de dispersión de luz. Se midió el ciclo de hidrólisis de lípidos catalizado por PLA_{2} de 1-O-DPPC a liso-1-O-DPPC por HPLC (ver Tabla 1). La fluorescencia intrínseca del enzima y la dispersión de luz a 90º se midieron en función del tiempo, tal como se muestra en la figura 2.

Ejemplo 3

Liberación inducida por fosfolipasa A_{2} de un fármaco modelo encapsulado soluble en agua

Se prepararon liposomas de 1-O-DPPC multilamelares en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción ("self-quenching") de 20 mM mediante la hidratación de una película de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina en una solución tampón de HEPES de pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase. Se formaron liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas de 1-O-DPPC que contenían calceína se separaron de la calceína libre, utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50.

Las condiciones de ensayo para la liberación de calceína inducida por PLA_{2} fueron liposomas unilamelares de 1-O-DPPC 25 \muM, PLA_{2} 25 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5 u 8,0), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM. Al tiempo de 900 s se añadió PLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de liposomas de 1-O-DPPC termostatizada, equilibrada durante, como mínimo, 20 min a 37ºC, anteriormente a la adición de PLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determina de la siguiente manera: % de Liberación = 100 x (I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida a tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, e I_{T} es la fluorescencia total medida después de adición de Tritón X-100 que conduce a la liberación completa de la calceína por rotura de los liposomas de 1-O-DPPC. La PLA_{2} indujo una liberación total del 90 por ciento de la calceína retenida en los liposomas de 1-O-DPPC, tal como se muestra en la figura 4.

Ejemplo 4

Aumento de permeabilidad controlada por la fosfolipasa A_{2} de una membrana diana modelo

Se prepararon liposomas diana multilamelares de membrana modelo, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, mediante la hidratación de una película de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC) en una solución tampón de HEPES a pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase (T_{m} = 55ºC). Se formaron liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas diana multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contenían calceína se separaron de la calceína libre mediante una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50. Se prepararon los liposomas unilamelares portadores, compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina, tal como se ha descrito anteriormente. La liberación de calceína de los liposomas diana se determina midiendo la intensidad fluorescente a 520 nm después de la excitación a 492 nm.

Las concentraciones de liposomas de D-O-SPC y 1-O-DPPC fueron 25 \muM. Se añadió PLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la reacción hidrolítica que condujo a la formación de 1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-1-O-DPPC) y productos de hidrólisis de ácidos grasos. Dado que la calceína se libera de los liposomas D-O-SPC, debido a la incorporación de productos de liso-1-O-PPC que no forma bicapa y los productos de hidrólisis de ácidos grasos dentro de la membrana lipídica diana, se observa un aumento lineal en la fluorescencia a 520 nm después de la excitación a 492 nm, en los casos en los que la calceína se diluye en el medio de solución tampón circundante, tal como se muestra en la figura 5. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se ha descrito anteriormente (ver Ejemplo 3).

Ejemplo 5

Ensayo de hemólisis

Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y a partir de 1-O-DPPC con un 5% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). Los lípidos se hidrataron en una solución salina tamponada con fosfato (PBS). La 1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina (ET-18-OCH_{3}) en PBS se incluyó en el ensayo como referencia.

El ensayo de hemólisis se realizó tal como describen Perkins y otros, Biochim. Et Biophys. Acta 1327, 61-68. Brevemente, cada muestra se diluyó en serie con PBS, y 0,5 ml de cada suspensión diluida de liposomas de 1-O-DPPC se mezclaron con 0,5 ml de glóbulos rojos humanos lavados (RBC) [4% en PBS (v/v)]. Para los controles, 0,5 ml de la suspensión de glóbulos rojos se mezclaron con 0,5 ml de solución tampón (control de hemólisis negativo) o bien con 0,5 ml de agua (control de hemólisis positivo). Las muestras y los patrones se colocaron en un incubador a 37ºC y se agitaron durante 20 horas. Los tubos se centrifugaron a baja velocidad (2000 x G) durante 10 minutos para formar pellets de RBCs. Se cuantificaron 200 \mul del sobrenadante mediante la absorbancia a 550 nm mediante un espectrofotómetro de barrido Perkin-Elmer 320. El 100 por cien de hemólisis se definió como la cantidad máxima de hemólisis obtenida mediante el detergente Tritón X-100. El perfil de hemólisis en la figura 6 muestra un valor de hemólisis bajo (por debajo del 5% por ciento) para liposomas de 1-O-DPPC 2 mM. La figura 6 también muestra que bajas concentraciones de ET-18-OCH_{3} inducen un grado significativo de hemólisis.

Ejemplo 6

Aumento de la actividad de la fosfolipasa A_{2} mediante 1-O-lípidos injertados con polímeros cargados negativamente

Se prepararon liposomas unilamelares totalmente hidratados con una distribución de tamaños estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y 1-O-DPPC con un 5% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), tal como se ha descrito en el ejemplo 2. Las condiciones de ensayo para las mediciones de tiempo de latencia de PLA_{2} fueron liposomas unilamelares 0,15 mM, PLA_{2} 150 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM. La reacción catalítica se inició mediante la adición de 8,9 \mul de una solución de reserva de PLA_{2} 42 \muM a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada, equilibrada durante 800 segundos a 41ºC, anteriormente a la adición de PLA_{2}. El tiempo transcurrido antes del inicio de la rápida actividad enzimática se determina por un súbito aumento en la fluorescencia intrínseca de la PLA_{2} a 340 nm después de la excitación a 285 nm. Los resultados mostrados en la figura 7 muestran una disminución significativa en el tiempo de latencia en los casos en los que se incorpora un 5% molar del 1-O-DPPE-PEG_{350} cargado negativamente dentro de los liposomas 1-O-DPPC.

Ejemplo 7

Preparación de micelas compuestas de 1-O-DPPE-PEG350, DSPE-PEG750/DPPE-PEG750

Se prepararon micelas a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750 (DSPE-PEG750). Brevemente, se disolvieron cantidades pesadas de los lípidos poliméricos en cloroformo. El disolvente se eliminó mediante una ligera corriente de N_{2}. Las películas de lípidos se secaron toda la noche a baja presión para eliminar cantidades traza de disolvente. Se prepararon las micelas mediante la dispersión de los lípidos poliméricos secados en una solución tampón que contenía: KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH = 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM y EDTA 10 \muM.

Ejemplo 8

Aumento de permeabilidad de una membrana diana modelo controlada por la hidrólisis de micelas por la fosfolipasa A_{2}

Se prepararon liposomas diana multilamelares de membrana modelo, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, por hidratación de una película de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC) en una solución tampón de HEPES a pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase (T_{m}=55ºC). Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contenían calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50. Se prepararon micelas compuestas de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-750 (DSPE-PEG750), tal como se ha descrito en el ejemplo 7. La liberación de calceína de los liposomas diana se determina midiendo la intensidad fluorescente a 520 nm después de la excitación a 492 nm.

Las concentraciones de D-O-SPC y de las micelas de lípido polimérico fueron de 25 \muM. Se añadió PLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la reacción hidrolítica conduciendo a la formación instantánea del lisolípido y los productos de hidrólisis de ácidos grasos. Dado que la calceína se libera de los liposomas de D-O-SPC, debido a la incorporación de los polímero-liso-1-O-lípidos que no forman bicapa y el ácido graso dentro de la membrana lipídica diana, se observa un aumento lineal en la fluorescencia a 520 nm después de la excitación a 492 nm, en los casos en los que la calceína se diluye en el medio de solución tampón circundante, tal como se muestra en la figura 8. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se ha descrito en el ejemplo 3. La hidrólisis catalizada por PLA_{2} de 1-O-DPPE-PEG350 indujo la velocidad de liberación mayor.

\newpage

Ejemplo 9

Hidrólisis de micelas compuestas de DSPE-PEG750

La hidrólisis de micelas compuestas de DSPE-PEG750 fue seguida mediante el análisis de la cantidad de ácido esteárico generada. La reacción catalítica se inició mediante la adición de 8,9 \mul de una solución de reserva de PLA_{2} 42 \muM (150 nM) a 2,5 ml de una suspensión de lípidos de DSPE-PEG750 (0,150 mM) termostatizada, equilibrada a 45ºC durante 600 segundos, anteriormente a la adición de PLA_{2}. El comportamiento característico de inicio súbito de la actividad ("burst") de la PLA_{2} hacia las micelas se indica por un aumento súbito en la fluorescencia intrínseca de PLA_{2} a 340 nm después de la excitación a 285 nm, seguido de una disminución simultánea en la dispersión de luz a 90º de la suspensión de lípidos (Hønger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Se tomaron muestras para análisis por HPLC de la cantidad de ácido esteárico generado, antes de la adición de PLA_{2} y 100 s después del tiempo de latencia observado. Los cromatogramas de HPLC en la figura 9 muestran la cantidad de ácido esteárico generada 100 s después del tiempo de latencia observado (10 s) a 45ºC. La cantidad (0,156 mM) de ácido esteárico generada por hidrólisis fue igual al 100% de hidrólisis de los lípidos poliméricos DSPE-PEG750. El análisis por HPLC se realizó utilizando una columna de diol de 5 \mum, una fase móvil compuesta de cloroformo/metanol/agua (730:230:30, v/v) y un detector evaporativo de dispersión de luz (ver el ejemplo 2).

Ejemplo 10

Ejemplos de modelos

Los liposomas compuestos de fosfolípidos neutros y/o cargados negativamente pueden actuar como sistemas de suministro de fármacos o de marcadores dirigidos a enfermedades parasíticas en tejidos con niveles elevados de PLA_{2} debidos a la infección parasítica, siendo los órganos de especial interés el hígado, el bazo y la médula ósea. En los casos en los que se administran intravenosamente, estos liposomas tienen una fuerte tendencia a acumularse en el hígado y el bazo, debido a una combinación de factores físicoquímicos relacionados con la composición lipídica de los liposomas y factores fisiológicos que implican el gran suministro de sangre y la abundancia de macrófagos en el hígado y el bazo. En los ejemplos de la presente invención se describe un sistema modelo experimental que ilustra un nuevo principio para un suministro de fármacos o marcadores mejorado que aprovecha la elevada actividad de la fosfolipasa A_{2} extracelular en el tejido de hígado o bazo infectado. La fosfolipasa A_{2} hidroliza un proprotenciador basado en lípidos en el liposoma portador, produciendo un lisofosfolípido y ácido graso libre, que se demuestra que de manera sinérgica conducen a una desestabilización aumentada del liposoma y liberación del fármaco, al mismo tiempo que aumenta la permeabilidad de la membrana diana. El sistema propuesto se puede hacer termosensible y ofrece una manera racional de desarrollar sistemas elegantes de suministro, basados en liposomas mediante la incorporación en el portador de propotenciadores, prodesestabilizadores o profármacos específicos basados en lípidos, que automáticamente se activan por la fosfolipasa A_{2}, solamente en los sitios diana enfermos e infectados.

Los liposomas son sistemas lipídicos autoorganizados y, por lo tanto, su estabilidad está controlada, en gran medida, por interacciones físicas no específicas. Por lo tanto, una mejor comprensión del control molecular de las propiedades físicas de los liposomas es importante para manipular y adaptar las propiedades de los liposomas en relación con propósitos específicos de suministro de fármacos. Como ejemplo, se ha utilizado la transición de fase de lípido de gel-fluido inducida térmicamente y se ha optimizado el diseño de sistemas para la liberación aumentada de fármacos debida a hipertermia. Sería deseable que se pudiera diseñar un sistema de suministro de fármacos inteligente y versátil que se construyera con un mecanismo de activación dual virtual de (i) liberación aumentada de fármacos selectivamente en el tejido diana infectado y (ii) transporte aumentado del fármaco o marcador dentro de las células infectadas. Este principio se ilustra de forma esquemática en la figura 10.

En la presente descripción, se describe, mediante los ejemplos, el desarrollo de un sistema modelo biofísico experimental, simple y operativo, que sostiene un mecanismo dual de este tipo para ser activado en los lugares diana infectados, tales como el hígado y el bazo. El modelo asume la elevada actividad de la fosfolipasa A_{2} extracelular en el tejido infectado, tal como es el caso del tejido inflamado y canceroso, en el que el nivel de PLA_{2} extracelular se puede ampliar de forma múltiple. Después de la exposición a la PLA_{2} extracelular, se ha demostrado que los fosfolípidos de los liposomas cargados negativamente sufren hidrólisis aumentada en comparación con liposomas neutros. Esto conduce a la desestabilización del liposoma y a la liberación aumentada del fármaco o marcador encapsulado. Los productos de hidrólisis, los liso-fosfolípidos y los ácidos grasos libres actúan a su vez como potenciadores de la absorción para la permeación del fármaco o del marcador a través de la membrana diana. De esta forma, los fosfolípidos del liposoma portador se comportan como prodesestabilizadores en el lugar del portador y como propotenciadores en el lugar de la membrana diana. Los detalles moleculares de este principio se ilustran de forma esquemática en la figura 11.

El sistema de modelo experimental comprende un portador de liposomas cargado negativamente y una membrana diana modelo. El portador es un liposoma unilamelar de 100 nm preparado a partir de lípidos de dipalmitoíl fosfatidilcolina (DPPC) con una cantidad pequeña (2,5% molar) de lípidos cargados negativamente del tipo dipalmitoíl fosfatidiletanolamina (DPPE)-PEG_{2000.} La membrana diana es otro liposoma preparado a partir de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-fosfatidilcolina (D-O-SPC) que es un fosfolípido en el que los enlaces acilo de las cadenas de estearoílo son enlaces éter. A diferencia del DPPC, el D-O-SPC es inerte frente a la hidrólisis catalizada por PLA_{2}, mimetizando de esta manera la estabilidad de una membrana celular diana intacta frente a la degradación por sus propios enzimas. Este ensayo experimental, que permite la investigación tanto simultánea como por separado del efecto de los desestabilizadores en los liposomas portadores y el efecto de los potenciadores en la membrana diana, implica la retención de calceína fluorescente, un fármaco modelo soluble en agua, en una concentración de autoextinción, en el interior del liposoma diana no hidrolizable, en lugar de en el liposoma portador. El nivel aumentado de PLA_{2} extracelular en la membrana diana se puede simular mediante la adición de PLA_{2} extracelular para iniciar la reacción hidrolítica en una suspensión de los liposomas portadores y diana. La permeación de calceína a través de la membrana diana de D-O-SPC se monitoriza posteriormente mediante el aumento de fluorescencia. A efectos de investigar el efecto de la presencia de pequeñas cantidades de lípidos-PEG cargados negativamente en el liposoma portador, se llevó a cabo un experimento similar con liposomas convencionales, sólo de DPPC. Además, a efectos de comparar y discriminar el efecto de aumento de la permeabilidad de los lisofosfolípidos con respecto al de los ácidos grasos libres, se llevaron a cabo experimentos sin enzimas en los que los lisofosfolípidos y los ácidos grasos libres se añadieron simultánea o separadamente a los liposomas diana.

En la figura 12a se muestran los resultados para la liberación de calceína en función del tiempo después de la adición PLA_{2} al sistema. El curso temporal de la reacción de la PLA_{2} particular utilizada tiene un comportamiento característico de tiempo de latencia previo a un aumento súbito de la actividad catalítica, con un denominado tiempo de latencia que se puede utilizar convenientemente como una medida de la actividad enzimática. Se observan una disminución dramática en el tiempo de latencia y un aumento simultáneo de la velocidad de liberación, en los casos en los que los liposomas portadores contienen el DPPE-PEG_{2000} cargado negativamente, de acuerdo con descubrimientos previos de degradación aumentada por PLA_{2} extracelular de liposomas recubiertos de polímeros cargados negativamente.

Estos resultados sugieren que los productos de la hidrólisis catalizada por PLA_{2} de los lípidos de DPPC del portador liposómico de DPPC, el lisofosfolípido y el ácido graso libre, que se producen en una mezcla 1:1, se incorporan dentro de la membrana diana, conduciendo a un gran aumento en la permeabilidad de la membrana. Se sabe que estos productos, que tienen una solubilidad en agua muy baja, debido a sus formas moleculares no cilíndricas, inducen un campo de tensión de curvatura en la membrana o separación de fase lateral de pequeña escala que induce defectos en la membrana y permeabilidad aumentada. Esto se sostiene por los datos de la figura 13, que muestran que la adición de lisofosfolípido o ácido graso, separadamente, al presente sistema diana, en ausencia de PLA_{2}, conduce a una velocidad aumentada de liberación de calceína a través de la membrana diana. Sin embargo, el descubrimiento crucial es que si se añaden lisofosfolípido y ácido graso libre simultáneamente en una mezcla 1:1, se observa un aumento dramático en la velocidad de liberación, tal como se muestra en la figura 13. Esto sugiere fuertemente que los dos potenciadores actúan de una forma sinérgica, destacando, de este modo, la posibilidad única de aprovechar la hidrólisis catalizada por PLA_{2} para combinar desestabilización del liposoma portador y el aumento del transporte de fármacos a través de la membrana diana. El efecto sinérgico se aumenta más por el hecho de que la PLA_{2} extracelular se activa por sus propios productos de hidrólisis, poniendo de manifiesto a los fosfolípidos degradables del liposoma portador como un tipo de proactivadores.

Debe destacarse que, en el presente sistema modelo de suministro de fármacos, el efecto de la utilización de lípidos como propotenciadores y prodesestabilizadores a través de la actividad de la PLA_{2} extracelular es dinámico y se refiere a una escala temporal intrínseca. Esta escala temporal es el tiempo de retención eficaz de los liposomas portadores cerca de la membrana diana. Cuanto más rápidamente el enzima se vuelve activo, más rápida es la liberación del fármaco y mayor la absorción del fármaco durante el tiempo que el portador está cerca de la diana. Además, cuanto más rápidamente trabaja el enzima, más fácilmente pasa a estar disponible para la hidrólisis de otros liposomas portadores de fármacos que se aproximan al lugar diana enfermo. Una vez se ha establecido que la actividad de la PLA_{2} extracelular se puede utilizar para controlar la liberación de fármacos, se abren varias formas racionales para mejoras inteligentes del sistema de suministro de fármacos propuesto, mediante la utilización de mecanismos bien conocidos de alteración de la actividad de la PLA_{2} extracelular, mediante la manipulación de las propiedades físicas de la bicapa lipídica a las que se sabe que el enzima es sensible. Por lo tanto, la estrategia es modificar ciertas propiedades físicas de los liposomas portadores sin cambiar significativamente su tiempo de circulación vascular. Los presentes inventores ilustrarán este principio general demostrando los efectos tanto de un factor físico-químico, la composición lipídica del portador, así como de un factor ambiental (termodinámico), la temperatura local en el lugar diana.

Los fosfolípidos de cadena corta, tales como didecanoíl fosfatidilcolina (DCPC), activan la PLA_{2} extracelular. El efecto sobre la permeación de la calceína a través de las membranas diana, inducido por la incorporación de una pequeña cantidad de DCPC dentro de los liposomas-PEG portadores, también se muestra en la figura 12.a. La liberación es muy rápida debido a una activación casi instantánea del enzima. Los presentes inventores han descubierto, además, que la PLA_{2} extracelular se desactiva (datos no mostrados) en los casos en los que se incorpora un gran cantidad de colesterol (\approx20% molar) dentro de los liposomas. Al contrario, los presentes inventores han descubierto que una pequeña cantidad de colesterol (\approx3% molar) activa la PLA_{2} extracelular.

Se sabe que la temperatura tiene un efecto dramático y altamente no lineal sobre la activación de la PLA_{2} extracelular en la región de la transición de fase gel-fluido de las bicapas de fosfolípidos saturados. Este efecto no está causado por cambios en el enzima, sino por dramáticos cambios estructurales laterales en la bicapa lipídica. Es posible aprovechar este efecto en el presente sistema de suministro de fármacos, tal como sugieren los datos de la figura 12.b. A medida que la temperatura se acerca a la temperatura de transición a 41ºC, la velocidad de liberación de calceína aumenta progresivamente, tal como se cuantifica por el tiempo de 50% de liberación de calceína, t_{50%}, mostrado en el inserto de la figura 12.b. Se ha sugerido previamente que la hipertermia puede ser aprovechada para aumentar la liberación de fármacos, y que se podría utilizar un calentamiento local en áreas infectadas predefinidas para desestabilizar localmente liposomas portadores de fármacos, aprovechando la capacidad de filtración aumentada de los liposomas en su fase de transición. En el nuevo sistema modelo de administración de fármacos propuesto en la presente invención, estas posibilidades termosensibles se integran y se aprovechan totalmente por medio de la sensibilidad térmica de la PLA_{2} extracelular a las propiedades físicas del liposoma portador. Al contrario que en el caso en el que solamente se puede conseguir el efecto térmico por un aumento local de la temperatura utilizando fuentes de calentamiento externas en un lugar infectado predeterminado de algún tamaño mínimo, la liberación controlada por PLA_{2} aumentará en todos los lugares en los que la temperatura y la concentración de PLA_{2} extracelular han aumentado, por ejemplo, en el tejido infectado, independientemente del tamaño de la región enferma y sin requerir una localización previa del tejido enfermo.

DPPC, DCPC, D-O-SPC, y DPPE-PEG_{2000} se obtuvieron de Avanti Polar Lipids. La PLA_{2} de veneno de serpiente purificada (Agkistrodon piscivorus piscivorus) fue un regalo generoso del Dr. R. L. Biltonen. Este enzima PLA_{2} pertenece a la clase de enzimas secretores de peso molecular bajo, 14 kD, que muestra similitud estructural con la fosfolipasa A_{2} extracelular humana. Se prepararon liposomas diana multilamelares, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, por hidratación de una película de D-O-SPC en una solución tampón de HEPES a pH = 7,5, durante 1 hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase T_{m} = 55ºC. Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contenían calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50. Se prepararon los liposomas portadores unilamelares de DPPC, DCPC y DPPE-PEG_{2000} de una forma similar (T_{m} = 41ºC). La liberación de calceína de los liposomas diana se determina midiendo de la intensidad fluorescente a 520 nm después de la excitación a 492 nm. Todas las mediciones se realizaron a temperaturas a las que los lípidos de los liposomas portadores y diana se encuentran en el estado gel.

Ejemplo 11

Ensayo de liberación dependiente de la concentración de fosfolipasa A_{2}

Se prepararon liposomas de 1-O-DPPC multilamelares con un 10% molar de 1-O-DPPE-PEG350, en presencia de calceína fluorescente en una concentración de autoextinción de 20 mM, mediante la hidratación de una película del 90% de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfocolina y el 10% de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] en una solución tampón de HEPES a pH = 7,5, durante 1 hora a 10ºC por encima de las temperaturas de transición de fase. Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm. Los liposomas unilamelares se enfriaron rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas que contenían calceína se separaron de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica empaquetada con Sephadex G-50.

Las condiciones de ensayo para la liberación de calceína inducida por PLA_{2} fueron: liposomas unilamelares 25 \muM, PLA_{2} 50, 1 y 0,02 nM, KCl 150 mM, HEPES 10 mM (pH 7,5), NaN_{3} 1 mM, CaCl_{2} 30 \muM, y EDTA 10 \muM. Se añadió PLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de micelas termostatizada, equilibrada durante, como mínimo, 300 s a 35,5ºC, anteriormente a la adición de PLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determina de la siguiente manera: % de Liberación = 100 x (I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida a tiempo t después de la adición del enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, e I_{T} es la fluorescencia total medida después de adición de Tritón X-100 que conduce a la liberación completa de la calceína por rotura de los liposomas de 1-O-DPPC. La figura 14 muestra que la liberación inducida de calceína fue más lenta cuando sólo se añadió PLA_{2} 0,02 nM a la suspensión de liposomas.

Ejemplo 12

Hidrólisis de liposomas cargados negativamente por la fosfolipasa A_{2} en fluido peritoneal de rata libre de células

Se preparó fluido peritoneal de rata libre de células, con inflamación aguda inducida por caseína mediante la inyección de 5 ml de caseinato de sodio al 1% en la cavidad peritoneal de una rata macho SRPD, que pesaba 250-260 g. La rata se sacrificó por desangrado después de 24 horas y se recogió el fluido inflamatorio del peritoneo y se centrifugó a 1500 G durante 20 min, a efectos de obtener fluido peritoneal libre de células.

Se prepararon liposomas unilamelares cargados negativamente, totalmente hidratados, con una distribución de tamaños estrecha a partir de un 89% molar de di-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), un 10% molar 1-O-hexadecil-2-hexadecanoíl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) y un 1% molar 1,2-bis-(1-pirenodecanoíl)-sn-glicero-3-fosfocolina (bis-pi-DPC). Bis-pi-DPC es un sustrato de la PLA_{2} con dos fluoróforos de pireno adyacentes que forman dímeros en estado excitado (excímeros) que emiten a 470 nm después de la excitación a 342 nm. La hidrólisis catalizada por fosfolipasa separa los dos fluoróforos, que entonces emiten a 380 nm (monómeros).

La figura 15 muestra el espectro de emisión obtenido después de la excitación a 342 nm de bis-pi-DPC que se ha incluido en liposomas cargados negativamente (0,100 mM) antes y después de la adición de PLA_{2} 100 nM (Agkistrodon piscivorus piscivorus). Los cambios observados en el espectro de emisión, después de la hidrólisis mediada por la fosfolipasa, se utilizan en un ensayo continuo, midiendo la emisión del excímero a 470 nm de forma simultánea con la emisión del monómero a 380, después de la excitación, a 342 nm. La figura 16 muestra el perfil de tiempo de reacción de la hidrólisis de los liposomas cargados negativamente, catalizada por fosfolipasa A_{2} de rata. La reacción catalítica se inició por adición de fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de una suspensión de liposomas termostatizada, equilibrada durante 60 s, anteriormente a la adición de PLA_{2}. El comportamiento característico de tiempo de latencia previo a un aumento súbito de la actividad catalítica de la fosfolipasa se señala por un aumento súbito en la fluorescencia del monómero a 380 nm y una disminución posterior en la fluorescencia del excímero, tal como se muestra en el inserto en la figura 16.

Las condiciones de ensayo para el perfil de tiempo de reacción de la PLA_{2} mostradas en la figura 16 fueron: liposomas unilamelares cargados negativamente 0,100 mM, 100 \mul de fluido peritoneal libre de células no diluido, HEPES 10 mM (pH 7.5), CaCl_{2} 5 mM, y NaCl 150 mM.

Claims

1. Utilización de un sistema de suministro de fármacos basado en lípidos para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección parasítica de un mamífero, caracterizándose dicha infección parasítica por el aumento del nivel de PLA_{2} en dicho mamífero, y seleccionándose dicha infección parasítica del grupo que consiste en: Leishmaniasis; Tripanosomiasis; Malaria; Entamoeba histolyticasis; y el trematodo Oriental de hígado Chlornorchis sinensis, que comprende una sustancia farmacológica activa seleccionada entre derivados lisolipídicos, en la que la sustancia farmacológica activa está presente en un sistema basado en lípidos en forma de un profármaco, siendo dicho profármaco un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, siendo además dicho profármaco un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, por lo cual la sustancia farmacológica activa se libera en forma de un derivado lisolipídico que no es un sustrato para la lisofosfolipasa,

y en la que, dichos derivados lipídicos son triésteres de glicerol con la siguiente fórmula:

6

en la que R^{A} y R^{B} son fragmentos de ácido graso (alquilo/alquileno/alquildieno/alquiltrieno/alquiltetraeno-C(=O)-C_{9-30}), y R^{C} es un ácido fosfatídico (PO_{2}-OH) o un derivado de ácido fosfatídico.

2. Utilización, según la reivindicación 1, en la que el nivel aumentado de PLA_{2} se localiza en un tejido y/u órgano específico del mamífero, estando infectado dicho tejido y/u órgano por el parásito.

3. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que la infección parasítica implica el hígado y/o el bazo del mamífero.

4. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente, es una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficacia para la sustancia farmacológica activa.

5. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el profármaco es un derivado lipídico con la siguiente fórmula:

7

en la que

X y Z se seleccionan, independientemente, entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2};

Y es -OC(O)-, estando Y conectado entonces con R^{2} por medio del oxígeno o bien por medio del átomo de carbono de carbonilo;

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;

en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7}-(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un número entero de 9 a 29; n1 es cero o un número entero de 1 a 29, n3 es cero o un número entero de 1 a 20, n5 es cero o un número entero de 1 a 17, n7 es cero o un número entero de 1 a 14, y n9 es cero o un número entero de 1 a 11; y cada uno de los n2, n4, n6 y n8 es, independientemente, cero o 1; e Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; en la que cada Y^{1}-Y^{2} se puede sustituir, independientemente, con halógeno o C_{1-4}-alquilo,

R^{3} se selecciona entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisósteros del ácido fosfático y derivados de los mismos.

6. Utilización, según la reivindicación 5, en la que R^{2} es un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono.

7. Utilización, según la reivindicación 6, en la que R^{2} es un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2}.

8. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que, como mínimo, una parte del profármaco tiene la fórmula definida en las reivindicaciones 5-7, en la que R^{3} es un derivado del ácido fosfatídico al cual se acopla covalentemente un polímero seleccionado entre polietilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizadas.

9. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el profármaco constituye el 15-100% molar del total del sistema basado en lípidos deshidratado.

10. Utilización, según las reivindicaciones 8-9, en la que el lipopolímero, si está presente, constituye el 0,1-10% molar del total del sistema deshidratado.

11. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sistema basado en lípidos se encuentra en forma de liposomas.

12. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que se encuentra en forma de liposomas, en los que se ha incluido una segunda sustancia farmacológica.

13. Utilización de un sistema de suministro de fármacos basado en lípidos, que comprende una segunda sustancia farmacológica para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una infección parasítica de un mamífero, caracterizándose dicha infección parasítica por el nivel aumentado de PLA_{2} en el mencionado mamífero, y seleccionándose dicha infección parasítica del grupo que comprende: Leishmaniasis; Tripanosomiasis; Malaria; Entamoeba histolyticasis; y el trematodo Oriental de hígado Chlornorchis sinensis, en la que la segunda sustancia farmacológica se incorpora en el sistema, incluyendo dicho sistema un derivado lipídico que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, en la que el derivado lipídico también es un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, para dar como resultado un fragmento de ácido orgánico o un fragmento de alcohol orgánico y un fragmento de lisolípido, no siendo dicho fragmento de lisolípido un sustrato para la lisofosfolipasa,

y en la que dichos derivados lipídicos son triésteres de glicerol con la siguiente fórmula:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

en la que R^{A} y R^{B} son fragmentos de ácidos grasos (C_{9-30}-alquilo/alquileno/alquildieno/alquiltrieno/alquiltetraeno-C(=O)) y R^{C} es un ácido fosfatídico (PO_{2}-OH) o un derivado de ácido fosfatídico.

14. Utilización, según la reivindicación 13, en la que el nivel aumentado de PLA_{2} se localiza en un tejido y/u órgano específicos del mamífero, estando infectado dicho tejido y/u órgano por el parásito.

15. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en la que la infección parasítica implica el hígado y/o el bazo de un mamífero.

16. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en la que el radical orgánico que se puede escindir hidrolíticamente es una sustancia farmacológica auxiliar o un modificador de la eficacia para la segunda sustancia farmacológica.

17. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en la que el derivado lipídico es un derivado lipídico con la siguiente fórmula:

9

en la que

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;

18. Utilización, según la reivindicación 18, en la que R^{2} es un grupo alifático con una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono.

19. Utilización, según la reivindicación 19, en la que R^{2} es un grupo con la fórmula Y^{1}Y^{2}.

20. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13-19, en la que, como mínimo, una parte del profármaco tiene la fórmula definida en la reivindicación 17, en la que R^{3} es un derivado del ácido fosfatídico al cual se acopla covalentemente un polímero seleccionado entre polietilenglicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropilmetacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizadas.

21. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13-20, en la que el derivado lipídico constituye el 15-100% molar del total del sistema deshidratado.

22. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 20-21, en la que el lipopolímero, si está presente, constituye el 0,1-10% molar del total del sistema deshidratado.

23. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 13-22, en la que el sistema se encuentra en forma de liposomas.

24. Utilización, según las reivindicaciones 13-23, en la que la segunda sustancia farmacológica es una sustancia terapéutica y/o profilácticamente activa, seleccionada entre (i) agentes antiparasíticos, (ii) antibióticos, y (iii) agentes antiinflamatorios.

25. Utilización de un sistema basado en lípidos para la preparación de un agente de diagnóstico para la detección o cuantificación de una infección parasítica de un mamífero, caracterizándose dicha infección parasítica por el nivel aumentado de PLA_{2} en el mencionado mamífero, y seleccionándose dicha infección parasítica del grupo que comprende: Leishmaniasis; Tripanosomiasis; Malaria; Entamoeba histolyticasis; y el trematodo Oriental de hígado Chlornorchis sinensis, en la que, dicho sistema que incluye una segunda sustancia y un derivado lipídico, que tiene (a) un grupo alifático de una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) un fragmento hidrofílico, en la que el derivado lipídico también es un sustrato para la fosfolipasa A_{2} extracelular, en la medida que el radical orgánico se puede escindir hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente inafectado, para dar como resultado un fragmento de ácido orgánico o un fragmento de alcohol orgánico y un fragmento de lisolípido, no siendo dicho fragmento de lisolípido un sustrato para la lisofosfolipasa, y siendo dicha segunda sustancia un marcador,

10

26. Utilización, según la reivindicación 25, en la que el nivel aumentado de PLA_{2} se localiza en un tejido y/u órgano específicos del mamífero, estando infectados dicho tejido y/u órgano por el parásito.

27. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26, en la que la infección parasítica implica el hígado y/o el bazo del mamífero.

28. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 25-27, en la que el derivado lipídico es un derivado lipídico con la siguiente fórmula:

11

en la que

R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;

29. Utilización, según la reivindicación 28, en la que R^{2} es un grupo alifático con una longitud, como mínimo, de 7 átomos de carbono.

30. Utilización, según la reivindicación 29, en la que R^{2} es un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2}.

31. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 25-30, en la que el derivado lipídico constituye el 15-100% molar del total del sistema deshidratado.

32. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 25-31, en la que el marcador se selecciona del grupo que comprende ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga, ^{11}C; Gd, Mn, óxido de hierro, argón, nitrógeno; yodo; bromo y bario.

33. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el medicamento o el agente de diagnóstico es adecuado para la administración sistémica.

34. Utilización, según la reivindicación 33, en la que el medicamento o el agente de diagnóstico se formula como un medicamento para la administración intravenosa.

35. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la infección parasítica está causada por un organismo parasítico seleccionado del grupo que comprende Leishmania major Friedlin, Leishmania (viannia) gr., Leishmania mexicana, Leishmania tropica, Leishmania donovani (infantum), Leishmania aethiopica, Leishmania amazonensis, Leishmania enriettii, Leishmania chagasi, Leishmania pifanoi, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Tripanosoma cruzi (que causa la enfermedad de Chagas), Tripanosoma brucei, Tripanosoma equiperdum y Tripanosoma evansi, Entamoeba histolyca y Chlornorchis sinensis.