PT742789E - Lipossomas e compostos farmaceuticamente activos e metodos para a sua utilizacao - Google Patents
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Description
84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ
DESCRICÀO “Lipossomas e compostos farmaceuticamente activos, e métodos para a sua utilização”
Campo do Invento
Este invento refere-se a compostos esfingolipídicos farmaceuticamente activos, a lipossomas contendo compostos esfingolipídicos farmaceuticamente activos e a métodos de utilização destes compostos e lipossomas, particularmente para o tratamento de animais que sofram de cancro. A morte de células em organismos multicelulares pode ser uma resposta acidental a um trauma externo ou pode ser uma resposta programada a estímulos internos ou externos. A necrose ou morte acidental de células é observada mais frequentemente quando as células morrem descontroladamente em resultado de injúria súbita e grave a um organismo, p.ex., por trauma físico ou químico, isquémia ou hipertermia constantes (ver, e.g., J. Cohen, Immunol. Today, 14(3):126 (1993); J. Marx, Science 259: 750 (1993)). Danos na membrana plasmática podem fazer com que as células percam a sua capacidade de regular a sua pressão osmótica e daí pode resultar a ruptura das células. A consequente perda do conteúdo das células pode ainda causar prejuízos às células circundantes e pode chamar um processo inflamatório para limpar os fragmentos celulares.
Em contraste, a apoptose descreve uma série programada de eventos que têm como resultado a morte da célula por fragmentação em partículas ligada à membrana; estas partículas são depois fagocitosadas por outras células (ver, e.g., Stedman's Medicai Dictionarv (Illustrated), supra). As células normalmente sofrem apoptose em circunstâncias determinadas fisiologicamente tais como a eliminação de células T auto-reactivas, a morte de células {e.g., neutrófilos) com meias-vidas curtas, involução de células desprovidas do factor de crescimento, morte celular morfogenética durante o desenvolvimento embrionário e morte de alvos celulares de citotoxicidade mediada por células (ver, e.g., J. Cohen, supra).
As células que sofrem apoptose podem partir-se em corpos apoptóticos que são fragmentos celulares que retêm as suas membranas e são capazes de regular as suas pressões osmóticas. Ao contrário das células necróticas, usualmente não há perda do conteúdo celular e
84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ portanto não é invocada nenhuma resposta inflamatória. As células apoptóticas normalmente apresentam membranas plasmáticas rotas e núcleos rotos e condensados. A cromatina nuclear nestas células está fragmentada ao acaso entre nucleossomas, em resultado da activação da endonuclease durante a apoptose.
Ainda que nas células apoptóticas cesse a transcrição, a morte das células ocorre mais rapidamente do que seria de esperar apenas do facto da transcrição ter cessado. Isto indica que é provável que processos celulares, além do fim da transcrição, estejam envolvidos na apoptose. Pode presentemente ser necessária a própria expressão dos genes para a ocorrência das alterações morfológicas associadas à apoptose (ver, e.g., J. Cohen, supra). Em alternativa, a inibição do fim da transcrição pode ela própria induzir apoptose. Além disso, a apoptose de algumas células não parece ser afectada duma ou doutra maneira pela inibição da síntese de proteína. A expressão do oncogene bcl-2, por exemplo, pode inibir a apoptose de outro modo induzida por estímulos diferentes e pode portanto contribuir para o desenvolvimento de cancro. Assim, pode ser necessária a inibição da expressão do bcl-2 para induzir apoptose (ver, e.g., J. Marx, supra-, J. Cohen, supra-, G. Williams e C. Smith, Cell ΤΑ-.11Ί (1993); M. Barinaga, Science 259:762 (5 de Fevereiro de 1993)). Sabe-se que a proteína C-myc estimula a proliferação das células; contudo, pode também estimular a apoptose na ausência de estímulos proliferativos adicionais. p53, que se pensa suprimir o crescimento de tumores, pode também estimular a apoptose. C-fas, um homólogo de proteína da transmembrana para o Factor de Necrose Tumoral (TNF), pode também induzir apoptose como pode o próprio TNF. TNF é uma proteína monocina produzida por monócitos e macrófagos. Há duas proteínas TNF já conhecidas estruturalmente e funcionalmente relacionadas, a TNF-α e a TNF-β, ambas se ligam aos mesmos receptores da superfície das células. A ligação destes receptores pela TNF conduz à activação de múltiplos caminhos de transdução de sinal, incluindo a activação da esfmgomielinase (ver, e.g., M. Raines et al.. J. Biol. Chem. 268(20):14572 (1993); L. Obeid et al., Science 259:1769 (12 de Março, 1993); H. Morishige et al., Biochim. Biophys. Acta. 1151:59 (1993); J. Vilcek e T. Lee, J. Biol. Chem. 266(12)7313 (1991); Dbaibo et al., J. Biol. Chem., 268(24)17762 (1993); R. Kolesnik, Trencls Cell. Biol. 2:232 (1992); J. Fishbein et al., J. Biol. Chem.. 268(131:9255 (1993)).
Os Requerentes verificaram que aumentos nas concentrações de ceramida podem estimular a apoptose. As ceramidas constituem uma classe de esfmgolípidos que compreendem 84 731 ΕΡ Ο 742 789 ! ΡΤ j
derivados de ácidos gordos de um esfmgoide, e.g., a esfmgosina, base (ver, e.g., Stedman's Medicai Dictionarv (Illustratedf, 24a edição (J.V. Basmajian et al., eds.), Williams and Wilkins, Baltimore (1982), p. 99)). Ceramidas diferentes caracterizam-se por diferentes ácidos gordos ligados à base esfmgoide. Por exemplo, o ácido esteárico pode ser ligado ao grupo amida da esfmgosina dando origem à ceramida CH3(CH:)i;CH=CH-CHOH-CH(CH2OH)-NH-CO-(CH2)I6CH3. Ácidos gordos de cadeias mais curtas ou mais compridas podem também ser ligados à base esfmgoide. Os Requerentes verificaram também que a ligação de certos grupos químicos aos esfíngolípidos e ceramidas de modo a formar análogos destes compostos pode inibir a bioconversão de ceramidas em esfmgomielinas e podem portanto conduzir a uma apoptose estimuladora do aumento das concentrações em ceramida.
Em Chemical Abstracts 112:56573η descreve-se a preparação de derivados da esfmgosina como agentes anti-tumorais. O único composto revelado é (2S,3R)-(Z)-HOCH2CH;CH(NHAc)CH(OH)CH=CH(CH2)|2Me. Não há qualquer sugestão no sentido de modificar o agrupamento HOCH2- pela introdução de um grupo que iniba ou bloqueie a hidrólise inversa de uma ceramida na correspondente esfingomielina.
As ceramidas encontram-se em todas as membranas das células eucarióticas e sabe-se que participam em diversos processos celulares críticos. Além disso, verificou-se que certos compostos esfingolipídicos desempenham um papel na prevenção da proliferação celular. Nenhuma destas referências, contudo, apresenta os produtos químicos e lipossomas dos Requerentes ou a sua utilização no estímulo da morte das células.
Sumário do Invento
Proporciona-se um composto com a fórmula Ri-Y'-CHZ'-CH(NY2Y3)-CH2-Z2! onde R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 8 a 19 átomos de carbono na cadeia alifática; Y1 é -CH=CH-, -C^C- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 é OH ou um grupo inibidor da ligação de fosforilcolina com a fórmula -X1, -OX', -X2X3 ou -0-X2X3; Z2 é um grupo inibidor da ligação de fosforilcolina com a fórmula -X1, OX1, -X2X3 ou -0-X2X3; X1 é C(0)H, C02H, CH3, C(CH3)3, Sí(CH3)3, SíCH3(C(CH3)?)2, Sí(C(CH3)3)3, Sí(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia do alquilo, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, um flúor, um cloro, ou um grupo com a fórmula C(RJR4)OH; e cada um entre R3 e R4 é, independentemente um do outro, uma cadeia de alquilo 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 4
com 1 a 6 carbonos; X2 é escolhido entre o grupo constituído por CH2-, C(CH3)2-, Si(P04)2-, Si(CH3)2-, S1CH3PO4-, C(O)- e S(0)2-; X-’ é escolhido entre 0 grupo constituído por -C(0)H,
-Si(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia do alquilo, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, um cloro, um flúor, ou um grupo com a fórmula C(R:’R4)OH, onde cada um entre R3 e R4 é, independentemente um do outro, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos, um grupo fenilo ou um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia de alquilo; Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia do alquilo, ou uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos; Y3 é H ou um grupo de fórmula -C(0)R2 ou -S(0)2R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono na cadeia; e quando Z2 for amino, R2 é uma cadeia alifática com 1 a 9 ou de 19 a 23 átomos de carbono na cadeia alifática. De preferência, R1 é um grupo alquilo, com maior preferência CH3(CH2)12-, Y1 é -CH=CH-, Y2 é Η, Y3 é -C(0)R' e R2 é uma cadeia alquílica.
Preferencialmente, o grupo inibidor da ligação da fosforilcolina com a fórmula -X1, -OH1, -X2X3 ou -0-X2X3 (grupo inibidor da conversão) é -0C(0)CH3, -0C(0)CH2CH2CH3, -0C(0)CH(CH3)CH;„ ou -OSí(CH3)2C(CH3),, com maior preferência -OSi(CH3)2C(CH3)3.
De preferência, o composto deste invento tem a fórmula CH3(CH2)12-CH=CH-CH2Z1-CH(NHY')-CH,-Z2. γ- é então um grupo com a fórmula -C(0)R2, mais preferivelmente -C(0)(CH2)4CH3. Z2 é preferivelmente -OSi(CH3)2C(CH3)3, -0Si(P04)2C(CH3)3, -C(0)CH3 ou -0C(0)CH2CH2CH3.
Também aqui se apresenta uma composição farmacêutica que compreende o composto deste invento e um veiculo farmaceuticamente aceitável; a composição pode ainda compreender um agente bioactivo adicional. Apresenta-se ainda um método de preparação da referida composição para administração a um animal, de preferência o homem, que compreende a formulação do composto deste invento, um veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente um agente bioactivo adicional. O animal pode sofrer de cancro, em que a composição compreende uma quantidade eficaz do composto anti-cancro. Normalmente, a quantidade eficaz anti-cancro do composto é, pelo menos, cerca de 0,1 mg do composto por kg de peso de corpo do animal. Geralmente, a 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 5
quantidade eficaz anti-cancro é desde cerca de 1 mg por kg até cerca de 50 mg por kg. Os cancros tratáveis incluem, sem que tal constitua uma limitação, os cancros do cérebro, seio, pulmão, ovário, cólon, estômago ou da próstata, e podem ser sarcomas, carcinomas, neuroblastomas ou gliomas. Os cancros resistentes às drogas podem também ser tratados.
Apresenta-se aqui um lipossoma com uma bicamada que compreende um lípido e um composto com a fórmula RI-Y'-CHZ1-CH(NY2YJ)-CH2-Z^, onde R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 5 a 19 átomos de carbono na cadeia; Y1 é -CH=CH-, -OC- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 e Z2 são definidos como acima; Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, ou uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos; Y3 é H ou um grupo com a fórmula -R2, -C(0)R2 ou -S(0):R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono; e onde a bicamada compreende pelo menos cerca de 5 moles por cento do composto. Y3 é preferivelmente R2, que é preferivelmente -(CH:)3CH3, -(CH2)5CH3, -(CH2)7CH3 ou -(CH2)9CH3 e, com maior preferência, Y' é -(CH,)5CH3 ou -C(0)R2 que é preferivelmente -C(0)(CH2)4CH3. Preferivelmente, no lipossoma deste invento o grupo inibidor de conversão é -0C(0)CH„ -0C(0)CH2CH2CH3, -0C(0)CH(CH3)CH3 ou -OSí(CH3)2C(CH3)3. Mais preferivelmente, o grupo inibidor de conversão é -OSi(CH3)2C(CH3)3. Ainda com maior preferência, o lipossoma compreende um composto com a fórmula CH3-(CH2)I2-CH=CH-CH2Z'-CH(NHY3)-CH2Z2.
De preferência, a camada lipossomal compreende pelo menos 10 por cento molar do composto. A bicamada pode compreender vitamina D,; estas bicamadas compreendem preferivelmente cerca de 1 por cento molar de vitamina D3. A bicamada pode ainda compreender um lípido de grupo de cabeça modificado. O lipossoma pode compreender um agente bioactivo adicional e pode estar desidratado.
Também aqui se apresenta uma composição farmacêutica que compreende o lipossoma deste invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Também se apresenta um método de preparação da referida composição para administrar a um animal, compreendendo a formulação do lipossoma do invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. O método pode ser usado para tratar um animal que sofra de cancro, onde é administrada uma dose da composição e onde a dose compreende uma quantidade eficaz anti-cancro do lipossoma. Normalmente a dose compreende pelo menos cerca de 1 mg do lipossoma por kg de 6 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ peso de corpo do animal. Geralmente a dose compreende desde cerca de 1 mg por kg até cerca de 1000 mg por kg.
Proporciona-se aqui um lipossoma com uma bicamada que compreende um lípido e um composto com a fórmula R'-Y'-CHZ'-CH(NY2Y:')-CH:-Z2 onde R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 5 a 19 átomos de carbono na cadeia; Y1 é -CH=CH-, -OC- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 é OH ou um grupo inibidor de conversão; Z~ é um grupo inibidor de conversão, Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos ou uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos; Y2' é H ou um grupo com a fórmula -R2, -C(0)R2 ou -S(0),R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono; e onde a bicamada compreende uma quantidade eficaz anti-cancro do composto. Também se apresenta uma composição farmacêutica compreendendo este lipossoma e um veículo farmaceuticamente aceitável. Apresenta-se também um método de preparação da referida composição para administrar a um animal que sofra de cancro.
Breve descrição dos desenhos
Figura 1. Metabolismo da ceramida. Cer: ceramidas; SM: esfingomielina.
Figura 2. Ceramidas compreendendo o grupo inibidor da conversão. A: Tipo ΙΠ Cer-l-TBDMS; C2 Cer-l-TBDMS; C6 Cer-l-TBDMS; C2 Cer-l-TBDPS; B: 3-TBDMS C6-Cer; 1-TBDMS C6-Cer; 1,3 DiTBDMS C6 Cer (YWISl.a); 1-TBDMS, 3-acetato C6-Cer, l-TBDMS,3-butirato, C6-Cer. C: l-acetato-3-ona C6-Cer; 4,5-diol C6-Cer. D: N-C4 esfingosina; n-hexil-esfingosina; n-C8 esfingosina; N-C10 esfmgosina.
Figura 3. Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfmgomielina sobre o crescimento de células HL-60. O número de células viáveis (por ml xlOOOO, eixo dos yy) foi determinado para doses de lípido de 100 pm e 200 pm (eixo dos zz). Eixo dos xx: controlo fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), EPC/Chol/C2-ceramida (C2), EPC/Chol/vitamina D3 (D3), EPC(chol/D3/C2, EPC/Chol/C6-ceramida (C6), EPC/Chol/D3/C6, SM/Chol e SM/Chol/D3 lipossomas.
Figura 4. Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células P388. O número de células viáveis (por ml xlOOOO, eixo dos yy) 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 7
foi determinado para doses de Iípido de 50 μΜ, 100 μΜ e 200 μΜ (eixo dos zz). Eixo dos xx: controlo, fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), EPC/Chol/C2-ceramida (C2), EPC/Chol/vitamina D3 (D3). EPC/Chol/D3/C2. EPC/Chol/C6-ceramida (C6), EPC/Chol/D3/C6, Esfingomielina (SM)/Chol e SM/Chol/D3 lipossomas.
Figura 5. Efeito de várias foimulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células U937. O número de células viáveis (por ml x 10000, eixo dos yy) foi determinado para doses de Iípido de 50 μΜ, 100 μΜ e 200 μΜ (eixo dos zz). Eixo dos xx: controlo, fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), EPC/Chol/C2-ceramida (C2), EPC/Chol/vitamina D3 (D3), EPC/Chol/'D3/C2, EPC/Chol/C6-ceramida (C6), Esfingomielina (SM)/Chol e SM/Chol/D3 lipossomas.
Figura 6. Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células RPMI-7666. O número de células viáveis (por ml xlOOOO, eixo dos yy) foi determinado para uma dose de Iípido de 200 μΜ. Eixo dos xx: controlo, fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), EPC/Chol/C2-ceramida (C2), EPC/Chol/vitamina D3 (D3), EPC/Chol/D3/C2, EPC/Chol/C6-ceramida (C6), EPC/Chol/D3/C6, Esfingomielina (SM)/Chol e SM/Chol/D3 lipossomas.
Figura 7. Efeito de ceramida lipossomal sobre o crescimento de células normais (RPMI-7666) e de cancro (U-937). O número de células viáveis em cada cultura foi determinado e é apresentado em percentagem em relação ao controlo (eixo dos yy).
Figura 8. Eficácia terapêutica de ceramidas lipossomais em ratinhos. Eixo dos xx: dias pós-administração de lipossomas/ controlo; eixo dos yy: percentagem de sobrevivência no grupo de tratamento. Círculo-no-quadrado: ratinhos de controlo administrados com soro salino tamponado HEPES; quadrado-a-cheio: vitamina D3 lipossomal; losango-vazio: ceramida C2 lipossomal; losango-a-cheio: ceramida C6 lipossomal.
Figura 9. Sensibilidade in vitro de células A549 aos derivados da C6-Ceramida. A: uma hora de exposição; B: quatro horas de exposição; C: oito horas de exposição; D: vinte e quatro horas de exposição; E: quarenta e oito horas de exposição. Eixo dos xx: concentração (micromolar) da droga (derivado da ceramida); eixo dos yy: percentagem de crescimento das células. "X": N-C8 esfingosina; losango: 1-acetato, C6-ceramida; quadrado: 1-butirato, 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 8
C6-ceramida; triângulo: 1-isobutirato, C6-ceramida.
Figura 10. Sensibilidade in vitro de células A549 a 1-acetato, C6-Ceramida para diferentes tempos de exposição. Eixo dos xx: concentração (micromolar) da droga; eixo dos yy: percentagem de crescimento. Losango: uma hora; quadrado: quatro horas; triângulo: oito horas; X: vinte e quatro horas; estrela: quarenta e oito horas.
Figura 11. Sensibilidade in vitro de células A549 ao 1-butirato, C6-Ceramida para diferentes tempos de exposição. Eixo dos xx: concentração (micromolar) da droga; eixo dos yy: percentagem de crescimento. Losango: uma hora; quadrado: quatro horas; triângulo: oito horas; X: vinte e quatro horas; estrela: quarenta e oito horas.
Figura 12. Sensibilidade in vitro de células A549 ao 1-isobutirato, C6-Ceramida para diferentes tempos de exposição. Eixo dos xx: concentração (micromolar) da droga; eixo dos yy: percentagem de crescimento. Losango: uma hora; quadrado: quatro horas; triângulo: oito horas; X: vinte e quatro horas; estrela: quarenta e oito horas.
Figura 13. Sensibilidade in vitro de células A549 à N-C8 Esfingosina para diferentes tempos de exposição. Eixo dos xx: concentração (micromolar) da droga; eixo dos yy: percentagem de crescimento. Losango: uma hora; quadrado: quatro horas; triângulo: oito horas; X: vinte e quatro horas; estrela: quarenta e oito horas.
Figura 14. Eficácia terapêutica da N-hexil-esfingosina contra ratinhos com tumores P-388/ADR (Adriamicina-resistentes). Eixo dos xx: dias pós-terapia; eixo dos yy: percentagem de sobrevivência no grupo de tratamento."+": Controlo (não tratados); quadrados: uma dose de 20 mg de n-hexil-esfingosina por kg de peso de corpo; círculos: 3x20 mg/kg doses.
Descricão detalhada do invento
Proporciona-se aqui um composto com a fórmula R1 -Y1 -CHZ1 -CH(NY2 Y3)-CH2-Z2, onde R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 8 a 19 átomos de carbono na cadeia alifática; Y1 é -CH=CH-, -C=C- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 é OH ou um grupo inibidor da ligação de fosforilcolina com a fórmula -X', -OX', -X2X3 ou Ό-Χ2Χ3; Z2 é um grupo inibidor da ligação de fosforilcolina com a fórmula -X', OX1, -X:X3 ou -0-X2X3; X1 é C(0)H, C02H,
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grupo fenilo substituído com alquilo com l a 6 carbonos na cadeia do alquilo, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, um flúor, um cloro, ou um grupo com a fórmula C(RJR4)OH; e cada um entre RJ e R4 é, independentemente um do outro, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos; X: é escolhido entre o grupo constituído por CH2-, C(CH3),-,
-Si(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia do alquilo, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, um cloro, um flúor, ou um grupo com a fórmula C(R3R4)OH, onde cada um entre R3 e R4 é, independentemente um do outro, uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos, um grupo fenilo ou um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia de alquilo; Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia do alquilo, ou uma cadeia de alquilo com 1 a 6 carbonos; Y3 é H ou um grupo de fórmula -C(0)R2 ou -S(0)2R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono na cadeia; e quando Z2 for amino, R· é uma cadeia alifática com 1 a 9 ou de 19 a 23 átomos de carbono na cadeia alifática.
Preferivelmente, R1 é um grupo alquilo, mais preferivelmente CH3(CH2)I2-, Y1 é -CH=CH-, Y2 é Η, Y3 é -C(0)R2 e R2 é uma cadeia alquílica, com maior preferência uma cadeia alquílica com 6 a 8 carbonos. Com maior preferência, R1 e R2 juntos compreendem de cerca de 15 a cerca de 25 carbonos, onde R1 de preferência compreende 13 carbonos e R2 de preferência compreende 6 a 8 carbonos. Sem pretender estar limitado pela teoria, crê-se que o comprimento total da cadeia de carbonos de um lípido constitui um factor importante na determinação da capacidade de ele se inserir nas membranas biológicas.
Sem pretender que este invento esteja de qualquer modo limitado pela teoria, crê-se que as esfingosinas e as ceramidas podem actuar como transdutores de sinais ou como mensageiros secundários nas células, isto é, que os níveis intracelulares são aumentados em resposta a estímulos externos e que destes aumentos resultam actividades melhoradas da proteína cinase e da fosfatase (ver, e.g., M. Raines et al., supra; R. Kolesnik et al., supra-, G. Dbaibo et al., supra, e J. Fishbein et al., supra). As proteínas cinases e as fosfatases activadas podem activar processos celulares que conduzem à morte das células. Pode assim ser terapeuticamente desejável aumentar as concentrações intracelulares das esfingosinas e ceramidas nas células do 84 731 ΕΡ Ο 742 789 /' ΡΤ 10
cancro.
As esfingosinas e as ceramidas forniam-se nas células animais por combinação do palmitoílo CoA (CH3(CH2)14-CO-S-CoA) e serina para dar desidroesfinganina (CH3(CH2)I4Co-CH(NH3)-CH2OH e C02 (ver, e.g., L. Strver, Biochemistrv (2a edição), W.H. Freeman and Co., Nova Iorque, págs. 461-462)). A desidroesfinganina é convertida em di-hidroesfíngosina (CH3(CH2)14-CH(OH)-CH(NH3)-CH2OH) que é depois convertida em esfingosina (CH3(CH2)12CH=CH-CH(OH)-CH(NH3)-CH2OH. Liga-se então um ácido gordo ao grupo amida da esfingosina para se obter uma ceramida (CH3(CH2)i:CH=CH-CHOH-CH(CH2OH)-NH-CO-R, onde R é uma cadeia do ácido gordo). Pode-se ligar um grupo fosforilcolina (P04CH2CH2-N(CH3)3) à ceramida no seu grupo hidróxilo para dar uma esfmgomielina (CH3(CH2)12CH=CH-CH0H-CH(CH2P04CH2CH2-N(CH3)3)-NH-C0-R). A esfingomielinase pode catalisar a remoção hidrolítica da fosforilcolina da esfmgomielina, obtendo-se uma ceramida (ver, e.g., Figura 1). A hidrólise inversa da ceramida pode dar uma esfmgomielina. O bloqueio ou inibição deste passo de "hidrólise inversa", isto é, a conversão de uma ceramida na correspondente esfmgomielina, pode conduzir a um aumento dos níveis de ceramida intracelular. Os "grupos inibidores de conversão" geralmente não são grupos ligados às esfingosinas ou às ceramidas nas células animais ou aos seus precursores biossintéticos. De preferência esses grupos são ligados sinteticamente às esfingosinas e ceramidas para inibir a formação de esfmgomielina a partir delas.
Os compostos deste invento, compreendendo os grupos inibidores de conversão e cadeias de alquilo, alcenilo, alcinilo, de vários comprimentos, são sintetizados por diversas vias já bem conhecidas e facilmente realizadas pelos peritos na arte, dados os ensinamentos deste invento (ver, e.g., abaixo, onde "rfi se refere a uma das seguintes referências: 1: J. Am. Chem. Soc., 94:6190 (1972); 2: J. Org. Chem. 59:668 (1994); 3: Angew. Chem., Lntl. Ed. (English), 17:569 (1978); 4: Vogers Textbook of Practical Organic Chemistrv (5a ed.) pp. 769-780; 5: J. Org. Chem. 40: 574 (2975); 6: J. Org. Chem. 59:182 (1994); 7: J. Org. Chem. 25:2098 (1960); 8: Synthesis (1985): pp. 253-268; 9: J. Chem. Soc. (1953): p. 2548; 10: J. Am. Chem. Soc. 90:4462, 4464 (1968); 11: Oxidations in Organic Chemistrv (Am. Chem. Soc. Washington, D.C. (1990) pp 60-64; 12: J. Meei. Chem. 30 1326 (1987); 13: Synth. Commun. 9:757 (1979); 14: The Chemistrv of Amides (J. Wiley & Sons, Nova Iorque (2970)), pp. 795-801; 15: J. Med. Chem. 37:2896 (1994); 16: Rec. Chem. Prog. 29:85 (1968); e 17: Phospholipids Handbook 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ
11 (Marcell Dekker, Inc., Nova Iorque (1993), p.97)). Por exemplo, aqueles peritos usariam uma esfingosina ou uma ceramida como matéria-prima. A ela podem-se ligar por meios já conhecidos, ou dela se removem, cadeias de alquilo, alcenilo ou alcinilo, de diversos comprimentos. Podem também ser ligados às esfíngosinas ou às ceramidas, grupos inibidores de conversão, por meios já conhecidos. Estes incluem, sem que tal constitua uma limitação, reacções de oxidação/redução, substituição, condensação e alquilação, bem como outros meios geralmente aceites para ligar e remover grupos químicos de compostos e para converter compostos de uma forma para outra. Estas reacções realizam-se geralmente usando os solventes habitualmente aceites e sob condições facilmente determináveis. (Segue Esquema) 84 731
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Os compostos específicos podem ser sintetizados como segue. Síntese do sililéter da ceramida: A mistura de Ceramida e cloreto de t-butildimetilsililo (1 equivalente) e imidazol (2 equivalentes) em DMF foi agitada sob N, à temperatura ambiente, durante a noite. Removeu-se o solvente com uma corrente de N2 e dissolveu-se o resíduo em CH2C12, lavou-se (H20), secou-se (MgS04) e concentrou-se até à secura. Purificou-se o resíduo sobre sílica-gel (AcOEt/Hexano = 1:3). Síntese de 1-éster-ceramida: A mistura de ceramida e Ac20 (1 equivalente) e de uma quantidade catalítica de dimetilaminopiridina em CHCL foi aquecida à temperatura ambiente durante 1 hora e a reacção foi controlada por TLC (AcOEt). Concentrou-se a mistura. O produto em bruto foi purificado sobre sílica-gel (AcOEt/ hexano = 2:3,5). Oxidação de C3-OH da ceramida até cetona: Dissolveu-se 1-OAc-ceramida em acetona e arrefeceu-se em banho de gelo. Juntou-se, gota a gota. lentamente, reagente de Jone até cor de laranja persistente. Parou-se a reacção com isopropanol, juntou-se NaHC03 e agitou-se durante 5 minutos. Filtrou-se a solução e concentrou-se até à secura. 0 produto em bruto foi purificado por TLC preparativa (AcOEt/hexano = 1:2,5). Redução da ceramida até análogos da esfingosina: A uma solução arrefecida com gelo, agitada, de ceramida em THF anidro, juntou-se LiAlH4 e agitou-se a mistura à temperatura ambiente sob N2 durante 24 horas. Sob arrefecimento a gelo, a reacção foi parada por adição de NaHCO, aquoso saturado. A pasta resultante foi filtrada e lavada com THF. Concentrou-se a solução e tomou-se o resíduo em CH2C12, lavou-se com H20, secou-se (MgS04) e concentrou-se à secura. Purificou-se o resíduo por TLC preparativa (sílica-gel) CH2Cl2/MeOH/TEA=8:l :0,08. Síntese da 4,5-diol-ceramida: A uma solução de ceramida numa mistura de Me2CO, H,0 destilada e t-BuOH, juntou-se N-metil-morfolina-N-óxido (NMO, 1,2 equivalentes) e 0s04 (quantidade catalítica) em THF. A mistura reagente foi agitada a 45°C durante 6 horas, a reacção foi parada com NaHCOj sólido e agitou-se a mistura durante 15 minutos. Filtrou-se a suspensão e dissolveu-se o filtrado em THF. Lavou-se a solução com salmoura. A solução orgânica foi separada, seca e concentrada à secura. Purificou-se o resíduo por TLC preparativa (THF).
Os grupos de inibição de conversão adequados podem ser identificados por alguns meios facilmente realizáveis pelos peritos da arte, motivados por este invento para identificar esses grupos. Por exemplo, e sem que tal constitua uma limitação, os peritos podem escolher um agrupamento químico e ligá-lo a uma esfingosina ou a uma ceramida como acima se descreveu. Os peritos podem facilmente determinar a velocidade relativa a que esses compostos sofrem hidrólise e a velocidade a que se forma uma esfingomielina a partir do composto. A velocidade 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 14
de hidrólise é facilmente determinável pelos peritos na arte, por exemplo e sem limitação, ligando um agrupamento radioactivo a uma esfmgosina ou ceramida e seguir depois a velocidade da cisão hidrolítica desse agrupamento, por meios cromatográficos. A velocidade de formação da esfingomielina é também facilmente determinável, por exemplo e sem limitação, combinando fosforilcolina radioactiva com um composto contendo um grupo de inibição de conversão num sistema enzimático capaz de ligar a fosforilcolina ao composto, e usando depois meios cromatográficos para avaliar a velocidade a que se junta a fosforilcolina. Os grupos de inibição de conversão preferidos são os que acima de tudo inibem a hidrólise e a ligação da fosforilcolina.
Os grupos de inibição de conversão podem ter a fórmula -X2X3 ou -0-X2X3, onde X2 é escolhido entre o grupo constituído por CH,-, C(CH,),-, Si(P04)2-, Si(CH3)2-, SiCH3P04-, C(O)-, S(0):- e onde X3 é escolhido entre o grupo constituído por C(0)H, -C02H, -C02H, -CH3, -C(CH,)3, -Sí(CH3)3, -SíCH3(C(CH3);.)2, -Sí(C(CH3)3)3, -Sí(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo, com l a 6 carbonos na cadeia alquílica, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, cloro, flúor ou um grapo de fórmula C(R’R4)OH onde R3 ou R4 são, independentemente um do outro, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos, um grupo fenilo ou um grupo fenilo substituído com um alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica. De preferência, o grupo de inibição de conversão é -0C(0)CH3, -0C(0)CH2CH2CH3, -0C(0)CH(CH3)CH3 ou -OSi(CH3)2C(CH3)3 (TBDMS), mais preferivelmente -OSi(CH3)2C(CH:)3. Os grupos de inibição de conversão podem também ter a fórmula -X1 ou -OX1, onde X1 é C(0)H, CO,H, CH3, C(CH3)3, Si(CH3)3, SiCH3(C(CH3)3)2, Si(C(CH,)3)3, Sí(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com um alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, flúor, cloro ou um grupo com a fórmula C(R3R4)OH onde R3 ou R4 são, independentemente um do outro, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos. Assim, os grupos de inibição de conversão incluem a ligação de agrupamentos químicos às esfingosinas e ceramidas, por ligações éter, sililéter, éster, acetal e sulfonato.
De preferência, o composto deste invento tem a fórmula CH3(CH2)12-CH=CH-CH2Z'-CH(NHY3)-CH2-Z2. Preferivelmente, Y3 é então um grupo com a fórmula -C(0)R2, mais preferivelmente -C(0)CH2)4CH3. Preferivelmente, Z2 é -OSi(CH3)2C(CH3)3, -0Si(P04)2C(CH3)3, -C(0)CH3 ou -OC(0)CH2CH2CH3.
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Também aqui se apresenta uma composição farmacêutica compreendendo o composto deste invento e um veículo farmaceuticamente aceitável; a composição pode ainda compreender um agente bioactivo adicional. Pretende-se em geral que os "veículos farmaceuticamente aceitáveis" aqui usados sejam para utilização ligada à administração a animais, incluindo o homem, de lípidos e lipossomas, incluindo as formulações com agentes bioactivos lipossomais. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente formulados de acordo com um certo número de factores dentro do campo de acção dos peritos na arte para determinar e ter em consideração, incluindo, sem limitação: o particular agente bioactivo lipossomal usado, a sua concentração, estabilidade e biodisponibilidade pretendida; a doença, distúrbio ou estado a ser tratado com a composição lipossomal; o paciente, a sua idade, tamanho e estado geral; e as vias pretendidas de administração das composições, e.g., nasal, oral, oftálmica, tópica, transdérmica, vaginal, subcutânea, intramamária, intraperitoneal, endovenosa ou intramuscular (ver, por exemplo, Naim (1985)). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis normais usados na administração parentérica do agente bioactivo incluem, por exemplo, D5W, uma solução aquosa contendo 5% em peso por volume de dextrose, e soro fisiológico. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem conter ingredientes adicionais, por exemplo, os que aumentam a estabilidade dos ingredientes activos incluídos, tais como conservantes e anti-oxidantes.
Ainda se proporciona um método de preparação da composição de acordo com o invento para administrar a um animal, de preferência o homem, que compreende formular o composto do invento, um veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente um agente bioactivo adicional. A administração, que pode ser feita por quaisquer meios geralmente aceites para administrar produtos farmacêuticos, é geralmente a administração endovenosa.
Quando um animal sofre de cancro, a composição deve compreender uma quantidade eficaz anti-cancro do composto. Os cancros tratáveis incluem, sem que tal constitua uma limitação, cancro do cérebro, seio, pulmão, ovário, cólon, estômago ou próstata, e podem ser sarcomas, carcinomas neuroblastomas ou gliomas. Cancros resistentes a drogas podem também ser tratados. "Quantidades eficazes anti-cancro" dos compostos deste invento são geralmente quantidades eficazes para inibir, melhorar, minorar ou prevenir o estabelecimento, crescimento,
84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 16 metástases ou invasão de um ou mais cancros em animais aos quais foram administrados os compostos. As quantidades eficazes anti-cancro são geralmente escolhidas de acordo com alguns factores, e.g., a idade, tamanho e estado geral do paciente, do cancro a ser tratado e da via de administração pretendida, e são determinadas por diversos meios, por exemplo, por tentativas para determinação da zona de dosagem, já bem conhecidas e facilmente praticadas pelos peritos na arte, dados os ensinamentos deste invento. Normalmente, a quantidade eficaz anti-cancro do composto é pelo menos cerca de 0,1 mg de composto por kg de peso de corpo do animal. Geralmente, a quantidade eficaz anti-cancro encontra-se entre cerca de 1 mg por kg e cerca de 50 mg por kg.
Proporciona-se aqui um lipossoma com uma bicamada que compreende um lípido e um composto com a fórmula Κ'-Υ'-ΟΗΖ'-Ο^ΝΥ^Υ^-ΟΗ,-Ζ2 onde R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 5 a 19 átomos de carbono na cadeia; Y1 é -CH=CH-, -C=C- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 e Z2 são definidos como acima; Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, ou uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos; Y3 é H ou um grupo com a fórmula -R:, -C(0)R2 ou -S(0)2R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo. de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono; e onde a bicamada compreende pelo menos cerca de 5 por cento molar do composto.
Os lipossomas são estruturas que se auto-congregam e que possuem uma ou mais bicamadas de lípido onde cada uma rodeia um compartimento aquoso e compreende duas monocamadas opostas de moléculas de lípido anfipático. Estas compreendem uma região com um grupo de cabeça polar (hidrófilo) ligada de modo covalente a uma ou duas cadeias acílicas não polares (hidrófobas). Crê-se que contactos energeticamente desfavoráveis entre as cadeias acílicas hidrófobas e o meio aquoso induzem as moléculas de lípido a um rearranjo tal que os grupos de cabeça polares se orientam para o meio aquoso enquanto que as cadeias acílicas se orientam para o interior da bicamada. Forma-se uma estrutura energeticamente estável onde as cadeias acílicas ficam resguardadas contra o contacto com o meio aquoso.
Os lipossomas podem ser preparados por diversos métodos (para uma recapitulação ver, por exemplo, Deamer e Uster (19S3)). Estes métodos incluem, sem haver limitação: os métodos de Bangham para preparar lipossomas multilamelares (MLVs); métodos de Lenk, Fountain e Cullis para preparar MLV com distribuição substancialmente igual de solutos interlamelares (ver, por exemplo, patentes U.S. Nos 4,522,803, 4,588,578, 5,030,453, 5,169,637 e 4,975,282); e
84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 17 ο método de evaporação em fase inversa de Paphadjopoulos et al. (patente U.S. N° 4,235,871) para preparar lipossomas oligolamelares. As vesículas unilamelares podem ser produzidas a partir de MLVs por métodos como ultra-sons (ver Paphadjopoulos et al., (1968) ou extrusão (patente U.S. N° 5,008,050 e patente U.S. N° 5,059,421). O éter-lípido-lipossoma deste invento pode ser produzido pelos métodos de qualquer destes trabalhos, cujo conteúdo é aqui citado apenas para referência. Várias metodologias, como a dos ultra-sons, homogeneização, aplicação French Press, moagem e extrusão, podem ser usadas para reduzir o tamanho dos lipossomas, isto é, preparar lipossomas de menor tamanho a partir dos lipossomas maiores. Pode também ser usada a filtração de fluxo tangencial (ver WO89/008846) para regularizar o tamanho dos lipossomas, isto é, produzir lipossomas tendo uma população de lipossomas com menor heterogeneidade de tamanhos, e uma distribuição de tamanhos mais homogénea e definida. O lipossoma deste invento pode ser unilamelar ou multilamelar e de preferência tem um diâmetro inferior a cerca de 200 nm, mais preferivelmente acima de cerca de 50 nm e abaixo de 200 nm.
As bicamadas lipossomais podem compreender diversos lípidos anfipáticos, incluindo os que são saturados ou insaturados e que normalmente têm cadeias acílicas de 10 a 24 carbonos. Os grupos polares adequados incluem, sem limitação, a fosforilcolina, fosforiletanolamina, fosforilserina, fosforilglicerol e fosforilinositiol. As cadeias acílicas adequadas incluem, sem limitação, cadeias de laurato, miristato, palmitato, estearato e oleato. Assim, os lípidos adequados que formam lipossomas incluem, sem limitação: a fosfatidilcolina do ovo, diestearoíl-fosfatidilcolina, dimiristoíl-fosfatidilcolina, dipalmitoíl-fosfatidiletanolamina, dipalmitoíl-fosfatidilglicerol e outros. As bicamadas lipossomais podem ainda compreender esteróis, como o colesterol. Os esteróis geralmente afectam a fluidez das bicamadas do lípido, normalmente aumentando a fluidez das cadeias de hidrocarbonetos das bicamadas abaixo da temperatura de transição de gel para líquido (Tm) e reduzindo a fluidez acima de Tm (ver, por exemplo, Lewis e McElhaney (1992) e Damell et al. (1986). Assim, as interacções do esterol com as cadeias de hidrocarbonetos circundante geralmente inibem a emigração destas cadeias da bicamada.
Preferencialmente, a bicamada lipossomal compreende pelo menos cerca de 10 por cento molar do composto. Quando YJ é R2, então é preferivelmente -(CH,)3CH3, -(CH2)5CH3, -(CH,)7CH3, ou -(CH2)qCH3 e, com maior preferência, (CH2)5CH3. Quando Y3 é -C(0)R2, é então
84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 18 de preferência -C(0)(CH,)4CH3. De preferência, o lipossoma compreende um composto com a fórmula CH3-(CH2)i;!-CH=CH-CH:Zi-CH(NHY5)-CH:Z2; com maior preferência, o composto compreende pelo menos um grupo de inibição de conversão, como -0C(0)CH3, -0C(0)CH,CH2CH3, -0C(0)CH(CH,)CH3 ou -OSi(CH3)2C(CH.)3. Com maior preferência, o grupo de inibição de conversão é -OSi(CH3)3C(CH3), (TBDMS).
Os níveis intracelulares de ceramida podem também ser aumentados por administração de vitamina D3, quer separadamente da administração dos compostos e lipossomas deste invento quer, com maior preferência, em ligação com a administração de lipossomas. Sem pretender de qualquer modo ficar limitado pela teoria, crê-se que a vitamina D3 pode estimular a esfmgomielinase para converter as esfingomielinas em ceramidas. Normalmente, a bicamada pode compreender vitamina D3; estas bicamadas de preferência contêm cerca de 1 por cento molar de vitamina D3. A bicamada pode também compreender um lípido de grupo de cabeça modificado. O lipossoma pode compreender um agente bioactivo adicional. Um "agente bioactivo" é qualquer composto ou composição de matéria que pode ser administrado a animais, de preferência ao homem. Estes agentes podem ter actividade biológica nos animais; os agentes podem também ser usados, mediante diagnóstico, nos animais. Os agentes bioactivos incluem agentes terapêuticos e de imagiologia. Os agentes bioactivos que podem estar associados a lipossomas incluem, sem limitação: agentes antivirais como o aciclovir, zidovudina e interferões; agentes antibacterianos como os aminoglicósidos, cefalosporinas e tetraciclinas; agentes antifungicos como os antibióticos de polieno, imidazolos e triazolos; agentes antimetabólicos como o ácido fólico, e análogos de purina e pirimidina; agentes antineoplásticos como os antibióticos de antraciclina e alcaloides das plantas; esteróis como o colesterol; hidratos de carbono, e.g., açúcares e amidos; aminoácidos, péptidos, proteínas como as proteínas receptoras das células, imunoglobinas, enzimas, hormonas, neurotransmissores e glicoproteínas; corantes; radiomarcadores como os radioisótopos e compostos marcados com radioisótopos; compostos radiopacos; compostos fluorescentes; compostos midriáticos; broncodilatadores; anestésicos locais; e semelhantes. As formulações de agentes bioactivos lipossomais podem aumentar o índice terapêutico do agente bioactivo, por exemplo, por tamponagem da toxicidade dos agentes. Os lipossomas podem também reduzir a velocidade a que o agente bioactivo é eliminado da circulação dos animais. Assim, a formulação lipossomal dos agentes bioactivos pode significar ser necessário administrar menos agente para alcançar o efeito desejado. Os 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 19
agentes bioactivos adicionais preferidos para o lipossoma deste invento incluem agentes antimicrobianos, anti-inflamatórios e antineoplásticos, ou lípidos terapêuticos, por exemplo, ceramidas. Com maior preferência, o agente bioactivo adicional é um agente antineoplástico.
Os lipossomas podem ser postos em contacto com um ou mais agentes biologicamente activos solubilizando o agente no lípido ou na fase aquosa usada para preparar os lipossomas. Em alternativa, os agentes bioactivos ionizáveis podem juntar-se aos lipossomas formando primeiro os lipossomas, estabelecendo um potencial electroquímico, e.g., por meio de um gradiente de pH, através da bicamada lipossomal mais externa e juntando depois o agente ionizável ao meio aquoso exterior ao lipossoma (ver Bally et al., patente U.S. N° 5,077,056 e W086/01102). O lipossoma deste invento pode compreender um lípido com um grupo de cabeça modificado. "Lípidos de grupo de cabeça modificado" são lípidos que, quando incorporados nas bicamadas lipídicas dos lipossomas, podem inibir a eliminação dos lipossomas dos sistemas circulatórios dos animais aos quais tenham sido administrados. Os lipossomas são eliminadas do corpo dos animais por meio do seu sistema reticuloendotelial (RES) que consiste em macrófagos fixos e circulantes. Evitando a eliminação pelo RES consegue-se que os lipossomas permaneçam mais tempo em circulação o que significa ser necessário administrar menos droga para alcançar os níveis pretendidos no soro. Melhorar os tempos de circulação pode também dirigir lipossomas para tecidos sem RES. As superfícies lipossomais podem ficar revestidas com proteínas do soro quando administradas a animais, isto é, os lipossomas podem ser opsonizados. A velocidade de eliminação pelo RES pode ser relacionada com a velocidade e nível de opsonização; assim, a eliminação pode ser inibida modificando a superfície exterior dos lipossomas de modo a que a ligação de proteínas do soro seja geralmente inibida. Consegue-se isto minimizando ou tapando as cargas negativas da superfície que podem promover a ligação de proteínas, ou de outro modo criando um estéreo-impedimento à ligação das proteínas. A modificação eficaz da superfície, isto é, as alterações às superfícies externas dos lipossomas das quais resulta a inibição da opsonização e apreensão pelo RES, pode ser conseguida incorporando lípidos de grupos de cabeça modificados nas bicamadas lipossomais. Os termos "lípidos de grupos de cabeça modificados", aqui usados, são lípidos anfipáticos a cujos grupos de cabeça polares se ligou um agrupamento químico, e.g., polietilenoglicol, um éter polialquílico, um gangliósido, um ácido orgânico dicarboxílico ou semelhantes, que pode
84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ inibir a ligação de proteínas do soro aos lipossomas de modo a que o comportamento farmacocinétíco das vesículas nos sistemas circulatórios dos animais seja alterado (ver, e.g., Blume et al., Biochim. Biophys. Acta, 1149:180 (1993); Gabizon et al., Pharm. Res. K) (5):703 (1993); Park et al., Biochim. Biophys. Acta, 1108:257 (1992); Woodle et al., patente U.S. N° 5,013,556; Allen et al., patentes U.S. Nos 4,837,028 e 4,920,016; U.S N° de Série 142,691, registada em 25 Outubro, 1993). A quantidade de lípido de grupos de cabeça modificados incorporada nos lipossomas depende de vários factores já bem conhecidos dos peritos na arte, ou dentro da sua área de acção para os determinar sem experimentação excessiva. Incluem, mas sem limitação: o tipo de lípido e o tipo de modificação do grupo de cabeça; o tipo e tamanho do lipossoma; e o uso terapêutico pretendido para a formulação lipossomal. Normalmente, a concentração do lípido de grupo de cabeça modificado na bicamada de lípido do lipossoma é de, pelo menos, cerca de cinco por cento molar, de preferência, cerca de dez por cento molar. O lipossoma deste invento pode ser desidratado, armazenado e depois reconstituído de modo que uma porção substancial do seu conteúdo interno esteja retido nos lipossomas. A desidratação dos lipossomas geralmente requer o uso de um protector de secagem hidrofílico (ver patentes U.S. Nos 4,229,360 e 4,880,635). Crê-se que este composto hidrofílico evita o rearranjo dos lípidos no lipossoma, de modo que o tamanho e o conteúdo se mantenham durante o procedimento de secagem e durante a re-hidrataçào, a fim dos lipossomas poderem ser reconstituídos. Estes protectores de secagem devem ter qualidades apropriadas como a de serem receptores fortes de ligações de hidrogénio e de possuírem características estereoquímicas que preservam o espaçamento intramolecular dos componentes das bicamadas dos lipossomas. Açúcares de sacáridos, preferencialmente mono- e dissacáridos, são protectores de secagem adequados para lipossomas. Em alternativa, o protector de secagem pode ser omitido se a preparação do lipossoma não for congelada antes da desidratação, e se permanecer água suficiente na preparação subsequente à desidratação.
Também aqui se proporciona uma composição farmacêutica compreendendo o lipossoma deste invento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Ainda se apresenta um método para preparar a referida composição para administração a um animal ou ao homem. A composição pode ser usada para tratar um animal ou o homem que sofra de cancro, onde uma dose da composição é administrada e onde a dose compreende uma quantidade eficaz do 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ
21 lipossoma anticancro. Normalmente, a dose compreende pelo menos cerca de 1 mg do lipossoma por kg de peso corporal do animal. Geralmente a dose compreende desde cerca de 1 mg por kg até cerca de 1000 mg por kg.
Proporciona-se aqui um lipossoma com uma bicamada que compreende um lípido e um composto com a fórmula RI-YI-CHZI-CH(NY2Y3)-CH2-Z' onde R! é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 5 a 19 átomos de carbono na cadeia; Y1 é -CH=CH-, -C=C- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 e 2? são definidos como acima; Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, ou uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos; Y3 é H ou um grupo com a fórmula -R2, -C(0)R2 ou -S(0)2R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono; e onde a bicamada compreende uma quantidade anticancro eficaz do composto. Também aqui se apresenta uma composição farmacêutica compreendendo este lipossoma e um veículo farmaceuticamente aceitável.
Exemplos
Exemplo 1
Preparação do lipossoma
Foram preparados lipossomas, estando os componentes nas proporções molares indicadas no Quadro 1 (ver em seguida) pelo método de evaporação do solvente. Por exemplo, lipossomas de PC/Chol/C2-ceramida foram preparados dissolvendo 1,8242 mg de fosfatidilcolina bovina (BPC), 0,4639 mg de colesterol (Chol) e 0,1366 mg de C2-ceramida (C2) numa mistura de solventes clorofórmio/metanol (2:1, volume/volume). O solvente foi então evaporado para dar lípido seco e o lípido seco foi re-hidratado com soro tamponado HEPES (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4). Para as preparações contendo vitamina D3, juntaram-se 0,0154 mg de vitamina D3 à mistura de lípidos. Para as preparações que contêm C6-ceramida, a C2-ceramida foi substituída por 0,1590 mg de C6-ceramida. Para as preparações contendo esfingomielina (SM), usaram-se 2,0479 mg de SM, 0,4639 mg de colesterol e 0,0154 mg de vitamina D3. Além destas foram feitas preparações de PC/Chol e PC/Chol/D3 com 2,1280 mg BPC, 0,4639 mg de colesterol e 0,0154 mg de vitamina D3.
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Ouadro 1 Preparação do lipossoma COMPONENTE PROP: MOLAR PC:Chol:C2 6:3:1 PC:Chol:C2:D3 6:3:1:0,1 PC:Chol:C6 6:3:1 PC:Chol:C6:D3 6:3:1:0,1 SM:Chol 7:3 SM:Chol:D3 7:3:0,1 PC: Chol 7:3 PC:Chol:D3 7:3:1:0.1 PC: fosfatidilcolina; Chol: colesterol; C2: C2-ceramida D3: vitamina D3; C6: C6-ceramida; SM: esfingomielina
Exemplo 2
Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células HL-60 2x103 células H-60 foram incubadas com lipossomas de fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), EPC/Chol/C2-ceramida (C2), EPC/Chol/Vitamina D3 (D3), EPC/Chol/D3/C2, EPC/Chol/C6-ceramida (C6), EPC/Chol/D3/C6. esfingomielina (SM)/Chol e SM/Chol/D3, bem como com tampão (sem lipossomas; "controlo") e com lipossomas de fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol). A incubação foi a 37°C em meio isento de soro, suplementado com 5 mg/1 de insulina e 5 mg/1 de transferrina, durante 24 horas. Juntou-se então soro de vitela fetal ao meio de cultura até uma concentração final de 10%; as células foram então incubadas por mais 24 horas, após o que se contou o número de células viáveis em cada cultura, usando manchas de azul tripano e um hemocitómetro. O número de células viáveis foi determinado para doses de lípido de 100 μΜ e 200 μΜ, e está indicado nas figuras (a seguir) como número de células viáveis por ml de meio de cultura, vezes 10.000. Os resultados estão indicados na Figura 3 e Quadro 2 (ver a seguir). 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 23
Exemplo 3
Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células P388 2x103 células P388 foram incubadas com várias formulações lipossomais de ceramida ou esfingomielina (ver Exemplo 2, acima), bem como com tampão isolado e com lipossomas fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), nas condições acima mencionadas. O número de células viáveis nas culturas foi determinado para doses de lípido de 50 μΜ, 100 μΜ e 200 μΜ. Os resultados estão indicados na Figura 4 e Quadros 2 e 3.
Exemplo 4
Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células U937 2x103 células U937 foram incubadas com várias formulações lipossomais de ceramida ou esfingomielina acima indicadas (ver Exemplo 2), bem como com tampão isolado e com lipossomas de fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), nas condições acima mencionadas. O número de células viáveis nas culturas foi determinado para doses de lípido de 50 μΜ, 100 μΜ e 200 μΜ. Os resultados estão indicados nas Figuras 5 e 7 e nos Quadros 2 e 3.
Exemplo 5
Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina sobre o crescimento de células RPMI-7666 2x103 células RPMI-7666 foram incubadas com as várias formulações lipossomais de ceramida/esfingomielina acima mencionadas (ver Exemplo 2), bem como sem lipossomas (controlo) e com lipossomas de fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol), nas condições acima mencionadas. Foi determinado nas culturas o número de células viáveis. Os resultados estão indicados nas Figuras 6 e 7, e nos Quadros 2 e 3.
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Exemplo 6
Efeito de várias formulações lipossomais de ceramida/esfíngomielina sobre o crescimento de células CHQ/K1. 2x105 células CHO/kl foram incubadas com as várias formulações lipossomais de ceramida/esfíngomielina acima mencionadas (ver Exemplo 2), bem como sem lipossomas (controlo) e com lipossomas de fosfatidilcolina do ovo/colesterol (EPC/Chol) nas condições acima indicadas. Determinou-se nas culturas o número de células viáveis. Os resultados estão indicados no Quadro 2.
Quadro 2
Sobrevivência de várias linhas de cancro (sem soro) % de Sobrevivência (ensaio de exclusão pelo azul tripano) Formulações RPMI-7666 U-937 P-388 HL-60 CHO/kl BPC/CHOL/ VD3 129.7, 107,1 113,4, 130 136, 103 87 138 Controlo 100 100 100 100 100 BPC/CHOL/VD3/C-6 103, 90 63,5, 55 49,6, 26 37 73 Ceramida C-6 livre 79 82,6 55,4 - - C-6 m-silil-éster livre 85.6 80,6 - - - BPC/CHOL/ VD3/C-2 93.7 49 46 47 90
Dose de lípido bioactivo = 20 μΜ
Quadro 3
Efeito da ceramida livre e lipossomal sobre várias linhas de cancro (sem soro) % de Sobrevivência (ensaio pelo azul tripano) Formulações RPMI-7666 U-937 P-388 Controlo 100 100 100 BPC/CHOL/VD3/C-6 93,8 84,3 55,0 82 (thy)* 75,1 (thy)* 84,7 (thy)* Ceramida C-6 livre 89,2 97 84,5
Dose de lípido bioactivo = 20 μΜ; *: inibição do crescimento medida pelo ensaio padrão de incorporação de timidina.
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Exemplo 7
Eficácia terapêutica de ceramidas lipossomais em ratinhos
Ratinhos CDF1 foram cada um injectados intraperitonealmente com 2,5xl06 células P388. A grupos com dez ratinhos cada administrou-se intraperitonealmente ou um controlo de soro salino tamponado HEPES (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) ou vitamina D3 lipossomal. ou lipossomas contendo ceramida C2 ou lipossomas contendo ceramida C6, preparados de acordo com os procedimentos descritos no Exemplo 1 (ver anteriormente), a uma dose de 1,5 mg de lípido por kg de peso de corpo dos ratinhos, sendo a administração uma administração de 24 horas de células p388. A sobrevivência foi avaliada a vários intervalos de tempo pós-administração dos lipossomas/controlo. Os resultados estão indicados na Figura 8.
Exemplo 8
Estudos de toxicidade in vitro
Estes estudos foram realizados utilizando um ensaio de sulforrodamina B (ver Monks et al., J. Natl.Câncer Inst. (U.S.) 83:757 (1987)). Os compostos foram dissolvidos em etanol. Os resultados destes estudos, indicados nos quadros seguintes, estão expressos como valores GI50, isto é, a concentração (micromolar) da droga necessária para inibir o crescimento em cinquenta porcento das células.
Quadro 4
Sensibilidade a drogas in vitro de linhas de células do homem e do ratinho aos derivados da ceramida
Exposição à droga de 72 horas [GIS0 (pM)±SD]
Ceramida e derivados C6-Ceramida 1-Acetato de C6-Ceramida 1,3-diacetato de C6-Ceramida 1-Butirato de C6-Ceramida 1-Isobutirato de C6-Ceramida A549 12,0±4,8 12,7±7,6 6,1±1,1 6,2±0,4 7,9±3,5 MCF7 24,2±8,5 ND 15,5±0,2 17,9±10,0 ND MCF7/ADR 36,025+0,88 ND 42,89±3,6 37,80±8,06 37,80±4,67 RPMI 7666 8,5±3,5 9,0±2,0 ND ND ND U937 7,0±1,7 11,3±1,0 ND ND ND Lewis Lung 9,6±4,4 8,5x0,4 4.9±0,5 6,4±2,4 ND ND- Não Determinado; * Apenas Uma Experiência 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 26
Quadro 5
Sensibilidade a drogas in vitro de linhas de células do homem e do ratinho aos derivados da ceramida
Exposição à droga de 72 horas [GI50 (^u\I)±SD]
Ceramida e derivados C6 Ceramida 1-TBDMS C6 Ceramida 3-TBDMS C6 Ceramida 1.3-DiTBDMS C6 Ceramida l-TBDMS-3-butirato C6 Cer A549 12,0±4,8 >200* >200* >200 >200* RPMI 7666 8,5±3,5 >200* >200* >200 >200* U937 7,0±1,7 >200* >200* 134,5±28,8 >200* C3HIOT1/2 14,0±2,5 >161,2* >200* ND >200* Lewis Lung 9,6±4.4 >200* >200* >200 >200* ND: Não Determinado *: Apenas Uma Experiência
Quadro 6
Sensibilidade a drogas in vitro de linhas de células do homem e do ratinho aos derivados da ceramida
Exposição à droga de 72 horas [GI50 (μιΜ)±8ϋ]
Ceramida e Derivados C6 Ceramida Esfingosma N-Hexil Esílngosina 1 -Acetato-3-ona C6 Cer 4,5-Diol C6 Ceramida A549 12,0+4,8 20,2±0,8* 4.9±0, l 14,4±0,1* 25,1 ±0,3* MCF7 24,2±8,5 20.4±0,4* 4,8-0,1 6,7±0,1* 20,7+0,1* MCF7/ADR 36,03±0,88 19,8±0,0* 5,57±1,17 14,7±0,1* 28,3±1,1* CAKI 1 6,04+0,23 39,7±0,8* 6,84±3,62 ND ND OVCAR3 15,15+1,77 44,6+0,9* 4,99±0,05* 15,3±0,1* 38,2±2,3* HT 29 4,0±0,2 19,3+0,1* 5.2±0,1* 13,9±0,2* 14,6±0,4* SKMEL 28 13,3±2,51 15.6±1,0* 4,94±0,66* ND ND P388 6,24±0,3 ND 2,59±0,3* ND ND P388/ADR 12,7±1,7* ND 2,61+1,7* ND ND Lewis Lung 9,6±4,4 12,2+0,1 4,9±0,1 14,5+0,1 15,2±0,1 ND: Não Determinado *: Apenas Uma Experiência 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 27
Quadro 7
Sensibilidade a drogas in vitro de derivados escolhidos de esfingosina sobre um painel de diversas linhas de células tumorais
Exposição à droga de 72 horas
Linhas de Células N-C4 Esfingosina N-C6 Esfingosina N-C8 Esfingosina N-C8 Esfingosin a Sal HC1 N-C10 Esfingosina Cer-C6 A549 4,90±0,10 4,90±0.06 4,91±0,01 4,97x0,19 4,99±0,08 8,08±0,06 MCF 7 4,88±0,03 4,74±0,09 4.88x0.11 4.90±0,02 5,13±0,01 12,70±0,14 MCF7/ADR 9,60±0,47 4,69±0,10 4,88±0,04 4,82+0,18 6,19±0,43 26,1+0,85 OVCAR3 14,05±0,35 4,99x0,05 5.41±0,13 5.23x0,01 12,50+0,85 15,15±1,77 CAKI 1 6.88±0.52 4.28±0.04 4,64+0,07 4,47±0,01 6,18±0,01 5,88+0,10 SKMEL 28 6,13±1.03 4,94±0,06 4,96±0,03 4.95x0,02 13,00±0,00 11,55±0,07 HT 29 6,49±0,ll 5,03+0,06 5,72+0,24 5,78x0,00 14,50±0,14 4,67±0,19 Lewis Lung 5,08+0.13 4,61+0,04 5,05+0,02 4,82+0,18 6,71±1,04 5,81 ±0,31
GI50 (pM)±SD 84 731 ΕΡ Ο 742 789 ί ΡΤ 28
Quadro 8
Sensibilidade a drogas in vitro de A549 e MCF 7/ADR a derivados da C6-Ceramida. a diferentes tempos de exposição de droga 72 Horas de incubação pós-adição de droga A549 MCF 7/ADR Tempo de Exposição à Droga 1-Acetato de C6-Ceramida 1-Butírato de C6-Ceramida 1-Isobuti-rato de C6 Ceramida N-C8- Esfmgo- sina 1-Acetato de C6-Ceramida 1-Butirato de C6-Ceramida 1-Isobuti-rato de C6 Ceramida N-C8 Esfingo- sina 1 Hora 92,9±1,3 >100 >100 31,2±5,0 >100 >100 >100 34,3±4,2 4 Horas 44.1±1,3 52,9x2.5 >100 12,8±1,0 59,5±1,4 79,1±5,3 >100 14,2±1,2 8 Horas 35,3±2.5 36,5±0,8 40.2±2,5 6.7±0,2 42,7±1,2 44.0+1,1 52,3±1,6 8,9+0,2 24 Horas 7,2±0,2 8,6±0,6 8,4x0,7 5,0±0,1 19.5=0.8 20,8±1,8 22,7±1,1 4,8±0,1 48 horas 4,35±0,1 4,7±0,1 5.2±0,3 4,8±0,1 15,6±0,9 17,2±0,1 18,7±0,5 4,62±0,1 72 Horas de expos. continua 5,1±0,1 5,5+0,2 5,6+0,2 5.0±0.3 16.7±1,7 18,5±0,4 19,6±1,0 5,0+0,1
GI50 (μΜ) ±SD
Exemplo 9
Estudos de toxicidade in vivo
Estes estudos foram realizados por injecção endovenosa de n-hexil-esfingosina, à dose indicada (ver a seguir), em ratinhos. Os resultados estão abaixo indicados. 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 29
f^fcnsaaassisSSS1
Quadro 9
Toxicidade da N-hexil-esfinaosina após inieccâo i.v. em ratinhos
Dose N° de Animais fms/kg) Mortos Controlo (Tween 80) 0/2 100 2/2 50 0/2* 25 0/2** 12,5 0/2 * Ataxia imediata, actividade reduzida. Respiração: arquejante. • Após 30 minutos ainda se observava actividade reduzida. • Após 24 horas não se observava qualquer anormalidade. ** Reduz a actividade imediatamente após injecção. • Após 30 minutos não se observava qualquer anormalidade.
Exemplo 10 Estudos in vivo
Estes estudos realizaram-se utilizando células leucémicas resistentes à P-388/adriamicina. Os ratinhos foram injectados i.p. com 100.000 células e depois tratados nos dias 1. 3 e 5. post-injecção com n-hexil-esfingosina. Os resultados estão indicados na Figura 14.
Exemplo 11 Síntese de compostos Síntese do sililéter de ceramida: A mistura de Ceramida e t-Butildimetilsililcloreto (1 equivalente) e imidazol (2 equivalentes) em DMF, foi agitada sob N2 à temperatura ambiente durante a noite. O solvente foi removido sob corrente de N, e o resíduo foi dissolvido em CH2C12, lavado (H20), seco (MgSOJ e concentrado à secura. O resíduo foi purificado sobre sílica-gel (AcOEt/Hexano=l:3). Síntese de 1-éster de ceramida: A mistura de ceramida, Ac20 (1 equivalente) e uma 30 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ quantidade catalítica de dimetilaminopiridina em CH2C12 seco, foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e a reacção foi controlada por TLC (AcOEt). Concentrou-se a mistura. O produto em bruto foi purificado sobre sílica-gel (AcOEt/Hexano = 2:3,5).
Oxidação de C3-OH de ceramida até cetona: l-OAc de ceramida foi dissolvida em acetona e arrefecida em banho de gelo. Juntou-se gota a gota, lentamente, reagente de Jone até cor de laranja persistente. A reacção foi parada por isopropanol, juntou-se NaHC03 e agitou-se durante 5 minutos. A solução foi filtrada e concentrada à secura. O produto em bruto foi purificado por TLC preparativa (AcOEt/Hexano = 1:2.5).
Redução de ceramida até análogos de esfingosina: A uma solução arrefecida a gelo, agitada, de ceramida em THF anidro juntou-se LiAlH, e agitou-se a mistura à temperatura ambiente, sob N2, durante 24 horas. Sob arrefecimento a gelo a reacção foi parada pela adição de NaHCO- aquoso saturado. A suspensão resultante foi filtrada e lavada com THF. Concentrou-se a solução, tomou-se o resíduo em CH2C12, lavou-se com H20, secou-se (MgS04) e concentrou-se à secura. Purificou-se o resíduo por TLC preparativa (sílica-gel) CH2Cl:/MeOH/'TEA = 8:1:0,8. Síntese de 4,5-diol de ceramida: A uma solução de ceramida numa mistura de Me2CO, H,0 destilada e t-BuOH, juntaram-se N-óxido de N-metilmorfolina (NMO, 1,2 equivalentes) e 0s04 (quantidade catalítica) em THF. A mistura reagente foi agitada a 45°C durante 6 horas, a reacção foi parada por NaHC03 sólido e a mistura foi agitada durante 15 minutos. A suspensão foi filtrada e o filtrado foi dissolvido em THF. Lavou-se a solução com salmoura. Separou-se a solução orgânica, secou-se e concentrou-se à secura. Purifícou-se o resíduo por TLC preparativa (THF).
Lisboa, l2 SET 2900
Por THE LIPOSOME COMPANY, INC. - O AGENTE OFICIAL -
DA CUNHA FERREiRA Ag. Of. Pr. ind. Rms das Flores, 74 - 4.° 1 eoo LISBOA
Claims (25)
- 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ KEIVINPICACÒES 1 - Composto com a fórmula R^V-CHZCCHÍNY^Y^-CH.-Z2. onde: R1 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 8 a 19 átomos de carbono na cadeia alifática; Y' é -CH=CH-, -OC- ou -CH(OH)CH(OH)-; Z1 é OH ou um grupo de inibição de ligação da fosforilcolina com a fórmula -X1, -OX1, -X2X3 ou -0-X2X3; Zr é um grupo de inibição de ligação da fosforilcolina com a fórmula -X1, -OX1, -X2X3 ou -0-X2X3; X1 é C(0)H, CO:H, CH3, C(CH_0;., Sí(CH3)3, SíCH3(C(CH3)3):, Sí(C(CH3)3)3, Sí(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, flúor, cloro, ou um grupo com a fórmula C(RJR4)OH; onde RJ ou R4, independentemente um do outro, é uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos; X2 é escolhido entre o grupo constituído por CH2-, C(CH3)2-, Si(P04)2-, Si(CH3)2-, SiCH3P04-, C(O)- e S(0)2-; X3 é escolhido entre o grupo constituído por -C(0)H, -C02H, -CH3, -C(CH3)3, -Si(CH3)3, -SiCH3(C(CH3)3)2, -Si(C(CH3)3)3, -Sí(P04)2C(CH3)3, um grupo fenilo, um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos, um agrupamento amino, cloro, flúor, ou um grupo com a fórmula C(R3R4)OH, onde R3 e R4 são, independentemente um do outro, uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos, um grupo fenilo ou um grupo fenilo substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica; Y2 é H, um grupo fenilo, um grupo fenil substituído com alquilo com 1 a 6 carbonos na cadeia alquílica, ou uma cadeia alquílica com 1 a 6 carbonos;84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ Υ3 é Η ou um grupo com a fórmula -C(0)R2 ou -S(0)2R2; R2 é um grupo alquilo, alcenilo ou alcinilo, de cadeia linear, com 1 a 23 átomos de carbono na cadeia; e, quando Z2 for um amino. R2 será uma cadeia alifática com de 1 a 9 ou de 19 a 23 átomos de carbono na cadeia alifática.
- 2 - Composto de acordo com a reivindicação 1, onde R1 é CH3(CH2)12-, Y1 é CH=CH-, Y2 é Η, Y3 é -C(0)R2 e R‘ é uma cadeia alquílica.
- 3 - Composto de acordo com a reivindicação 1, onde o grupo com a fórmula -X1, -OX1, -X2X3 ou -0-X2X3 é -OSi(CH3)2C(CH3)3.
- 4 - Composto de acordo com a reivindicação 1, com a fórmula CH3(CH2)I2-CH=CH-CH:Z1 -CH(NHY3)-CH:-Z2, onde Y3 é -C(0)R2.
- 5 - Composto de acordo com a reivindicação 4, onde Y3 é -C(0)(CH2)4CH3 e em que Z2 é -OSI(CH3)2C(CH3)3, -0Sí(P04)2C(CH3)3, -C(0)CH3 ou -0C(0)CH2CH2CH3.
- 6 - Composição farmacêutica compreendendo o composto da reivindicação 1 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 7 - Composição de acordo com a reivindicação 6 compreendendo um agente bioactivo adicional.
- 8 - Método para preparar a composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7 para administrar a um animal ou ao homem, compreendendo a formulação do composto de uma das reivindicações 1 a 6, um veículo farmaceuticamente aceitável e opcionalmente um agente bioactivo adicional.
- 9 - Método de acordo com a reivindicação 8, onde o animal ou homem sofre de cancro e onde a composição compreende uma quantidade anticancro eficaz do composto. 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ3/4
- 10 - Método de acordo com a reivindicação 9, onde a quantidade anticancro eficaz do composto é, pelo menos, cerca de 0,1 mg do composto por kg de peso de corpo do animal.
- 11 - Método de acordo com a reivindicação 10, onde a quantidade anticancro eficaz se encontra entre cerca de 1 mg por kg e cerca de 50 mg por kg.
- 12 - Método de acordo com a reivindicação 9, onde o cancro é um cancro do cérebro, seio, pulmão, ovário, cólon, estômago ou da próstata, um sarcoma, carcinoma, neuroblastoma, glioma ou um cancro resistente a drogas.
- 13 - Lipossoma com uma bicamada que compreende um lípido e um composto com a fórmula R^V-CHZ^CHfNY^-CHj-Z2, onde Rl,R2, Y\ Y2, Z1 e Z2 são definidos como na reivindicação 1; Υ·' é H ou um grupo com a fórmula -R2, -C(0)R2 ou -S(0),R:; e onde a bicamada compreende pelo menos cerca de cinco por cento molar do composto.
- 14 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, onde Y3 é um grupo com a fórmula R", onde R2 é escolhido entre o grupo constituído por -(CH:)3CH3, -(CB,)5CH3, -(CH2)7CH3, -(CH;)qCH3, ou Y3 é um grupo com a fórmula -(CO)R2.
- 15 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 14, onde Y3 é -C(0)(CLL)4CH3.
- 16 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, onde pelo menos um de Z1 e Z2, é -0C(0)CH3, -0C(0)CH2CH2CH3, -0C(0)CH(CH3)CH, ou -OSí(CH3)2C(CH3)3.
- 17 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, onde a bicamada compreende pelo menos cerca de 10 por cento molar do composto.
- 18 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, onde a bicamada compreende vitamina D3.
- 19 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 18, onde a bicamada compreende cerca 84 731 ΕΡ Ο 742 789 / ΡΤ 4/4 de 1 por cento molar de vitamina D;..
- 20 - Lipossoma de acordo com a reivindicação 13, em que a bicamada compreende uma fosfatidiletanolamina ligada a um agrupamento escolhido entre o grupo constituído por polietilenoglicóis, éteres polialquílicos, gangliósidos e ácidos dicarboxílicos.
- 21 - Composição farmacêutica compreendendo o lipossoma de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 20 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 22 - Método para preparar a composição de acordo com a reivindicação 21 para administrar a um animal ou ao homem, compreendendo formular o lipossoma de acordo com uma das reivindicações 13 a 20 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 23 - Método de acordo com a reivindicação 22, onde o animal ou o homem sofre de cancro, onde uma dose da composição é administrada e onde a dose compreende uma quantidade anticancro eficaz do lipossoma.
- 24 - Método de acordo com a reivindicação 23, onde a dose compreende pelo menos cerca de 1 mg do lipossoma por kg de peso corporal do animal ou do homem.
- 25 - Método de acordo com a reivindicação 24, onde a dose compreende entre cerca de 1 mg por kg e cerca de 1000 mg por kg. Lisboa, *2. StT. 2900 Por THE LIPOSOME COMPANY, INC.
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