HUT65932A - Methods for inducing cell differentiation using ceramides - Google Patents
Methods for inducing cell differentiation using ceramides Download PDFInfo
- Publication number
- HUT65932A HUT65932A HU9300375A HU37593A HUT65932A HU T65932 A HUT65932 A HU T65932A HU 9300375 A HU9300375 A HU 9300375A HU 37593 A HU37593 A HU 37593A HU T65932 A HUT65932 A HU T65932A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- carbon atoms
- ceramide
- hydrogen
- cells
- alkyl
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/13—Amines
- A61K31/145—Amines having sulfur, e.g. thiurams (>N—C(S)—S—C(S)—N< and >N—C(S)—S—S—C(S)—N<), Sulfinylamines (—N=SO), Sulfonylamines (—N=SO2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
- A61K31/18—Sulfonamides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/21—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates
- A61K31/215—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids
- A61K31/22—Esters, e.g. nitroglycerine, selenocyanates of carboxylic acids of acyclic acids, e.g. pravastatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
A jelen találmány sejtdifferenciálódás indukálására alkalmas vegyületekkel és eljárásokkal kapcsolatos. Még pontosabban a jelen találmány ceramid és ennek származékai sejtdifferenciálódás indukálására és abnormális sejtosztódással jellemzett állapotok kezelésére való alkalmazásával kapcsolatos.The present invention relates to compounds and methods for inducing cell differentiation. More particularly, the present invention relates to the use of ceramide and derivatives thereof for the induction of cell differentiation and for the treatment of conditions characterized by abnormal cell division.
Számos humán malignus (rosszindulatú) és nemmalignus Góindulatú) betegségek egyik jellemző tulajdonsága a sejtek hiperproliferációja (sejtburjánzása). Ezen betegségben a sejtek abnormálisán nagy sebességgel proliferálódnak. Rákos tumorok és leukémiák esetén a sejtek korlátlanul növekednek és osztódnak, és ez indokolja részben a szervezetben való gyors terjedésüket. Hasonlóan, néhány nemmalignus betegségben mint pl. a pikkelysömörben, a sejtek abnormálisán nagy sebességgel növekednek és osztódnak. Ezekben a betegségekben a gyorsan osztódó sejtek viszonylag nemdifferenciálódott állapotban vannak jelen. A nemdifferenciálódott sejtek képesek növekedni és osztódni. Azonban amint egy sejt differenciálódik, elveszti proliferációra való képességét. Számos olyan kezelést javasolnak, melyek célja az, hogy sejtdifferenciálódást indukálva megállítsák a sejtburjánzást és így vonják ellenőrzés alá a betegségeket.Hyperproliferation (cell proliferation) of cells is one of the hallmarks of many human malignant and non-malignant diseases. In this disease, cells proliferate abnormally at high rates. In cancerous tumors and leukemias, the cells grow and divide indefinitely, which partly explains their rapid spread within the body. Similarly, in some non-malignant diseases such as in psoriasis, cells grow and divide at abnormally high rates. In these diseases, rapidly dividing cells are present in a relatively undifferentiated state. Undifferentiated cells are able to grow and divide. However, as a cell differentiates, it loses its ability to proliferate. Many treatments are proposed to stop cell proliferation by inducing cellular differentiation and thus controlling disease.
Újabban megállapították, hogy a szfingolipidek jelentős szerepet játszanak a sejtek növekedésében, ontogenezisében és differenciálódásában (Hannun, Y. A. és Bell, R. M. (1989) Science 243: 500507). A szfingolipid lebontási termékeit a sejtszabályozó molekulák egy új osztályának tekintik. A szfingolipid lebontási termékei, a szfingozin és a lizoszfingolipidek, gátolják a protein-kináz C-t, amit a sejtreguláció és jelátvitel kulcsfontosságú enzimének tartanak (Hannun, Y. A. és mtsai (1986) J. Bioi. Chem. 261: 12604-12609). A szfingolipidek és a lizoszfingolipidek fontos celluláris válaszokat befolyásolnak és tumorellenes aktivitásokat mutatnak különböző emlős sejtekben (Hannun, Y. A. és Bell, R. M. (1987)Recently, sphingolipids have been found to play an important role in cell growth, ontogeny and differentiation (Hannun, Y. A. and Bell, R. M. (1989) Science 243: 500507). Sphingolipid degradation products are considered a new class of cell regulatory molecules. Sphingolipid degradation products, sphingosine and lysophospholipids, inhibit protein kinase C, which is considered to be a key enzyme in cell regulation and signaling (Hannun, Y. A. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 12604-12609). Sphingolipids and lysosphingolipids influence important cellular responses and exhibit antitumor activities in various mammalian cells (Hannun, Y. A. and Bell, R. M. (1987)).
Science 235: 670- 674, Hannun, Y. A. és mtsai (1987) J. Bioi. Chem. 262: 13620-13626, Wilson, E. és mtsai (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 204214).Science 235: 670-674, Hannun, Y. A. et al. (1987) J. Bioi. Chem. 262: 13620-13626; Wilson, E. et al. (1987) Arch. Biochem. Biophys. 259: 204214).
A 4.710.490 számú, 1987. december 1-én közzétett USA-beli szabadalmi leírásban olyan készítményről számolnak be, mely lipidtartalmú molekulákat tartalmaz, melyek angiogenikus aktivitással rendelkeznek. A lipidek emlősökből származnak, főleg cseplesz eredetűek. Ismert lipidek pl.gangliozidok keverékéről is kimutatták, hogy angiogenikus aktivitással rendelkeznek. A készítmények véredények növekedését stimulálják in vitro és in vivő. A gangliozidok rendelkeznek a legnagyobb angiogenikus aktivitással, míg a glikolipideknek pl. a ceramid származékoknak nincs vagy csak kismértékű ilyen aktivitásuk van.U.S. Patent No. 4,710,490, issued December 1, 1987, discloses a composition comprising lipid-containing molecules having angiogenic activity. The lipids are derived from mammals and are predominantly of droplet origin. Known lipids have also been shown to have angiogenic activity in a mixture of gangliosides. The compositions stimulate the growth of blood vessels in vitro and in vivo. Gangliosides have the highest angiogenic activity, while glycolipids have, for example, the highest activity. ceramide derivatives have little or no such activity.
A 4.673.667 számú, 1987. június 16-án kibocsátott USA-beli szabadalmi leírásban plazmingátló anyagokat ismertetnek, melyek emlős cseplesz-extraktumokból származnak. Az anyagok lipid komponenseket tartalmaznak. A gangliozidok mutatnak legnagyobb plazmingátló aktivitást. A különböző ceramid vagy ceramidszármazék tartalmú minták nem vagy csak minimális plazmingátló aktivitással rendelkeznek.U.S. Patent No. 4,673,667, issued June 16, 1987, discloses plasmid inhibitors derived from mammalian spleen extracts. The materials contain lipid components. Gangliosides show the highest plasma-inhibiting activity. Samples containing different ceramide or ceramide derivatives have no or only minimal plasma inhibitory activity.
A H1-93562 számú, 1989. április 12-én megjelentetett japán szabadalmi bejelentésben olyan szfingozinszármazékokat tesznek közzé, melyek hatékonyak tumorok kezelésére.Japanese Patent Application H1-93562, published April 12, 1989, discloses sphingosine derivatives which are effective in the treatment of tumors.
A 4.816.450 számú, 1989. március 18-án közzétett USA-beli szabadalmi leírásban Bell hosszúláncú bázisokról, általában szfingozinról és szfingozinszármazékokról számol be, melyek hatékonyan gátolják a proteinkináz C-t. A protein-kináz C aktivációját alapvetőnek tekintik tumorok elősegítésében, a celluláris transzformációban és tumorellenes vegyületekkel való gátlás megértésében.U.S. Patent No. 4,816,450, issued March 18, 1989, to Bell, discloses long chain bases, generally sphingosine and sphingosine derivatives, which are effective inhibitors of protein kinase C. Activation of protein kinase C is considered essential for tumor promotion, cellular transformation, and understanding of inhibition by antitumor compounds.
A sejtdifferenciációt indukáló interferonnak is vizsgálták tumorok kezelésére való alkalmasságát. Hasonlóan a HL-60 nevű humán mielocita leukémia sejtvonal differenciálódását előidéző D3 vitaminnak is vizsgálták tumorok kezelésére való hatékonyságát. Bár a D3 vitamin a sejtek differenciálódását indukálja , ezen vegyület alkalmazása tumorok kezelésére nem lehetséges, mivel az ehhez szükséges D3 vitamin nagy mennyisége a szervezetben a kálcium metabolizmust káros mértékben zavarja.The ability of cellular differentiation-inducing interferon to treat tumors has also been studied. Similarly, vitamin D3, which induces differentiation of the human myelocyte leukemia cell line HL-60, has been tested for its efficacy in the treatment of tumors. Although vitamin D3 induces cellular differentiation, it is not possible to use this compound in the treatment of tumors, since the high levels of vitamin D3 required for this cause harmful metabolism of calcium in the body.
A celluláris hiperproliferációval jellemzett betegségek kezelésében történt erőfeszítések ellenére még mindig szükséges ezen betegségek kezelésére alkalmas eljárások kifejlesztése. Ennek megfelelően a jelen találmány tárgyaként sejtdifferenciáció indukálására alkalmas eljárásokat és készítményeket kívánunk bemutatni. A jelen találmány tárgyát képezik azon eljárások és készítmények is, melyek megváltoztatják a sejtek fenotípusát. Továbbá, a találmány tárgyaként tekinthetők azon eljárások és készítmények is, melyek a sejtek hiperproliferációval jellemzett betegségek kezelésére használhatók. A jelen találmány még további tárgyaként olyan készítményeket ismertetünk, melyek emlősökben abnormális sejtdifferenciációval jellemezhető betegségek vagy abnormális állapotok megelőzésére és tüneti gyógyítására alkalmasak. A találmány további tárgyai nyilvánvalóvá válnak e leírás áttekintése és a szabadalmi igénypontok alapján.Despite efforts to treat diseases characterized by cellular hyperproliferation, there is still a need to develop methods for treating these diseases. Accordingly, it is an object of the present invention to provide methods and compositions for inducing cell differentiation. The present invention also relates to methods and compositions that alter the phenotype of cells. Furthermore, the present invention provides methods and compositions for treating diseases characterized by cellular hyperproliferation. Still another object of the present invention is to provide compositions for the prevention and symptomatic treatment of diseases or abnormal conditions characterized by abnormal cell differentiation in mammals. Other objects of the invention will become apparent from the review of this specification and the claims.
A jelen találmány készítményeket és eljárásokat nyújt sejtdifferenciáció indukálására. A találmány a sejtek fenotípusának megváltoztatására illetve sejtek hiperproliferációjával jellemzett betegségek kezelésére is nyújt eljárásokat és készítményeket. A találmány eljárásai során olyan vegyületeket juttatunk be emlősökbe, általában humán betegekbe terápiásán hatásos mennyiségben, melyek az (I) általános képlettel jellemezhetők, aholThe present invention provides compositions and methods for inducing cell differentiation. The invention also provides methods and compositions for altering the phenotype of cells and for treating diseases characterized by cellular hyperproliferation. The methods of the present invention provide a therapeutically effective amount of a compound of formula (I) wherein the compound is administered to a mammal, generally a human patient.
Rí jelentése maximálisan kb. 20 szénatomot tartalmazó alkil- vagy alkenilcsoport,R 1 has a maximum value of approx. An alkyl or alkenyl group containing 20 carbon atoms,
R2 jelentése hidroxil- vagy alkoxicsoport vagy hidrogénatom,R 2 is hydroxy or alkoxy or hydrogen,
R3 jelentése hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport,R3 is hydrogen or lower alkyl,
R4 jelentése COR5, SO2R5 vagy CSRs, ahol R5 jelentéseR4 is COR5, SO2R5 or Csrs, wherein R 5 is
1-20 szénatomot tartalmazó alkil-, alkenil- vagy alkinilcsoport, melyek adott esetben egy vagy több OH, SH, ORg, SR$, NRyRg, COORg vagy CONR10R8 csoporttal szubsztituáltak - a képletekben Rg, R7, Rg, Rg és R-,0 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, vagy maximálisan 10 szénatomot tartalmazó alkil-, aril-, alkaril- és arilalkilcsoport.Alkyl of 1 to 20 carbon atoms, alkenyl or alkynyl group optionally substituted by one or more OH, SH, ORg, SR $, NRyRg, COOR 10 or CONR substituted with R8 - wherein the Rg, R7, Rg, Rg and R O is independently hydrogen or alkyl, aryl, alkaryl and arylalkyl having up to 10 carbon atoms.
A találmány szerinti vegyületek hatásosak olyan állapotok kezelésében, ahol a sejtek hiperproliferációja vagy a sejtek differenciálódásában jelentős zavar következik be. Ennek megfelelően a találmány szerinti vegyületek és gyógyászati készítmények hatékonyak sejtek differenciálódását indukáló gyógyhatású anyagok előállítására és/vagy gyártására.The compounds of the invention are effective in the treatment of conditions in which hyperproliferation of cells or significant disruption of cell differentiation occurs. Accordingly, the compounds and pharmaceutical compositions of the invention are effective for the preparation and / or production of therapeutic agents that induce cell differentiation.
Az 1. ábra az 1,25-(OH)2D3 hatására képződő ceramid dózisfüggését mutatja.Figure 1 shows the dose dependence of ceramide formed by 1,25- (OH) 2 D 3.
A 2. ábra a ceramid tömegének 1,25-(OH)2D3 hatására történő növekedését mutatja az idő függvényében.Figure 2 shows the increase in weight of ceramide over time as a result of 1,25- (OH) 2 D 3 .
A 3. ábra a HL-60 sejtekben 1,25-(OH)2D3 kezelés hatására bekövetkező teljes foszfolipid (A), foszfatidil-kolin (B) és szfingomielin (C) tömegének változását ábrázolja.Figure 3 shows the change in total phospholipid (A), phosphatidylcholine (B) and sphingomyelin (C) mass in HL-60 cells following treatment with 1,25- (OH) 2 D 3 .
A 4. ábra a C-|g/C2 ceramid és 1 nM/l 1,25-(OH)2D3 sejtdifferenciálódást indukáló képességét mutatja HL-60 sejtekben.Figure 4 shows the ability of C-g / C 2 ceramide and 1 nM / L 1,25- (OH) 2 D 3 to induce cell differentiation in HL-60 cells.
Az 5. ábra a Cig/C2 ceramid HL-60 sejtek növekedésére gyakorolt hatását mutatja.Figure 5 shows the effect of Cig / C 2 ceramide on HL-60 cell growth.
A 6. ábra a Cig/C2 ceramid HL-60 sejtek differenciálódására gyakorolt hatását ábrázolja 1,25-(OH)2D3 jelenléte nélkül.Figure 6 shows the effect of Cig / C 2 ceramide on HL-60 cell differentiation in the absence of 1,25- (OH) 2 D 3.
A 7. ábra a Cig/C2 ceramid által kiváltott HL-60 sejtdifferenciálódás időfüggését mutatja.Figure 7 shows the time dependence of HL-60 cell differentiation induced by Cig / C 2 ceramide.
A 8. ábra mutatja be a C-|g/C2 ceramid hatását a szfingomielin tömegnövekedésére HL-60 sejtekben.Figure 8 illustrates the effect of C-g / C 2 ceramide on sphingomyelin mass growth in HL-60 cells.
A 9. és 10. ábrák a C-fg/C2 ceramid átmeneti növekedésének hatásait mutatja HL-60 sejtek differenciálódására.Figures 9 and 10 show the effects of transient growth of C-fg / C 2 ceramide on HL-60 cell differentiation.
A 11. ábra egy vékonyréteg kromatográfiás lemezről készült autoradiogrammot mutat HL-60 sejtek 24 órás [3H]-Cig/C2 ceramid felvétele és metabolizmusa után.Figure 11 shows an autoradiogram of a thin-layer chromatography plate after 24 hours of [ 3 H] -Cig / C 2 ceramide uptake and metabolism by HL-60 cells.
A 12. ábra a HL-60 sejtekből extrahált lipideket mutatja a HL-60 sejtek által felvett és metabolizált [3H]-Cig/C2 ceramidot ábrázolva.Figure 12 shows lipids extracted from HL-60 cells showing [ 3 H] -Cig / C 2 ceramide uptake and metabolized by HL-60 cells.
A 13. ábra a szfingozin 1,25-(OH)2D3 -mai indukált HL-60 sejtek differenciálódására gyakorolt hatását ábrázolja.Figure 13 shows the effect of sphingosine on the differentiation of HL-60 cells induced by 1,25- (OH) 2 D 3.
A jelen találmány bejelentői megállapítják, hogy ceramid vagy ceramidszármazékok bejuttatása HL-60 sejtekbe, mely egy humán mielocita leukémia sejtvonal, annak differenciálódását indukálja. Ceramiddal vagy ceramidszármazékokkal való kezelés lelassítja a sejtek pro I iterációját, és a normális monocita sejtekre jellemző fenotípus kialakulásához vezető differenciálódást indukál. Feltételezhető, hogy e hatás más típusú sejtekben is bekövetkezik.Applicants of the present invention find that delivery of ceramide or ceramide derivatives to HL-60 cells, a human myelocytic leukemia cell line, induces its differentiation. Treatment with ceramide or ceramide derivatives slows down the pro-Iteration of the cells and induces differentiation leading to the development of a phenotype characteristic of normal monocyte cells. This effect is also expected to occur in other cell types.
A HL-60 humán sejtvonalat, amit eredetileg egy akut mielocita leukémiában szenvedő betegből izoláltak, gyakran alkalmazzák mieloid sejtdifferenciáció tanulmányozására. Ezen sejtek granulocitákká érhetnek, ha olyan vegyületekkel, mint pl. dimetil-szulfoxid vagy retinsav kezeljük, vagy monocita/makrofág-szerű sejtekké differenciálódnak fórból-észterekkel pl. 1 a, 25-dihidroxi-D3 vitaminnal vagy G^3 ganglioziddal való inkubálás során. A legtöbb ilyen vegyülettel kiváltott sejtérés mechanizmusa nem ismert. A HL60 promielocita leukémia sejtvonal jellemzőiről és e sejtvonal alkalmazásáról sejtdifferenciálódás vizsgálati modelljeként Collins, S. J. (1987) Blood 70: 1233-1244 művében ad áttekintést. Ezt a jól ismert sejtmodellt alkalmazzuk a jelen találmány szerinti vegyületek hatékonyságának bemutatására a sejtek hiperproliferációval jellemzett betegségek kezelésében.The HL-60 human cell line, originally isolated from a patient with acute myelocytic leukemia, is often used to study myeloid cell differentiation. These cells can become granulocytes when treated with compounds such as dimethyl sulfoxide or retinoic acid, or differentiated into monocyte / macrophage-like cells from phosphorus esters, e.g. 1α, 25-dihydroxy-vitamin D3 or G3β3 ganglioside. The mechanism of cellular maturation induced by most of these compounds is unknown. The characteristics of the HL60 promyelocytic leukemia cell line and its use as an assay model for cell differentiation are reviewed by Collins, S. J. (1987) Blood 70: 1233-1244. This well-known cell model is used to demonstrate the efficacy of the compounds of the present invention in the treatment of diseases characterized by cellular hyperproliferation.
Korábbi munkákban (Okazaki, T. és mtsai (November 15, 1989) J. Bioi. Chem. 264:19076-19080) beszámoltak arról, hogy 1,25-(OH)2D3 -mai kiváltott differenciáció HL-60 sejtekben szfingomielin lebontással jár együtt. Kimutatták, hogy a HL-60 sejtek extraktumában detektált neutrális szfingomielináz aktivitását az 1,25-(OH)2D3 kezelés indukálja, és ceramid és foszforil-kolin képződésével jár együtt. A szfingomielin, a ceramid és a foszforil-kolin szintje négy órán belül az alapszintre tér vissza, ami a szfingomielin újraszintézisére utal, így a szfingomielin körfolyamat teljessé válik. Ezekről a megfigyelésekről feltételezik, hogy egy szfingomielin ft · · 4 ·*« körfolyamat működését jelzi, melyben az inaktív szülői szfingolipidek aktív termékké alakulnak át sejtaktiváció során. A foszfatidil-inozitol körfolyamattal ellentétben a szfingomielin lebontás hosszabb időn keresztül jelentkezik, és a sejtben történő hosszútávú változásokban vehet részt.Previous work (Okazaki, T. et al. (November 15, 1989) J. Bioi. Chem. 264: 19076-19080) reported that 1,25- (OH) 2D3-induced differentiation in HL-60 cells resulted in sphingomyelin degradation. together. Neutral sphingomyelinase activity detected in HL-60 cell extract has been shown to be induced by treatment with 1,25- (OH) 2D3 and associated with the formation of ceramide and phosphorylcholine. Sphingomyelin, ceramide, and phosphorylcholine levels return to baseline levels within four hours, suggesting a re-synthesis of sphingomyelin, thus completing the sphingomyelin cycle. These observations are thought to indicate the function of a sphingomyelin ft · · 4 · * «cycle in which inactive parental sphingolipids are converted to an active product upon cell activation. In contrast to the phosphatidylinositol cycle, sphingomyelin is degraded over time and may be involved in long-term changes in the cell.
A különböző emlős sejttípusokban legalább 300-féle szfingolipid szintetizálódik. Szerkezetileg a szfingolipidek hosszúláncú szfingoid bázisból, amidkötésben lévő zsírsavból és az 1-es helyzetben egy poláros csoportból állnak. A ceramid, ahol az 1-es helyzetben hidroxilcsoport áll, és a szfingomielin, amely foszforil-kolin poláros csoporttal rendelkezik, kivételével minden más szfingolipid szénhidrátot tartalmaz poláros csoportként és ezért ezeket glikoszfingolipideknek nevezzük. Ezek a neutrális lipidek 1-től (cerebrozidok) 20 vagy még több glükóz egységet tartalmaznak, míg a savas glikoszfingolipidek 1 vagy több sziálsavszármazékot (gangliozidok) vagy szulfát-monoészter csoportokat (szulfatidok) tartalmaznak. A legtöbb gangliozidról és komplex glikolipidről feltételezik, hogy a sejtmembrán külső rétegében helyezkednek el. A szfingomielin azonban a sejtek külső membránjában is megtalálható.At least 300 types of sphingolipids are synthesized in different mammalian cell types. Structurally, the sphingolipids consist of a long chain sphingoid base, an amide bonded fatty acid and a 1-position polar group. With the exception of ceramide, which has a hydroxyl group at position 1, and sphingomyelin, which has a polar group of phosphorylcholine, all sphingolipids contain carbohydrates as polar groups and are therefore called glycosphingolipids. These neutral lipids contain from 1 (cerebrosides) 20 or more glucose units, while acidic glycosphingolipids contain 1 or more sialic acid derivatives (gangliosides) or sulfate monoester groups (sulfatides). Most gangliosides and complex glycolipids are believed to be located in the outer layer of the cell membrane. However, sphingomyelin is also present in the outer membrane of cells.
A találmányban alkalmazható vegyületek lehetnek természetben előfordulók vagy szintetikus úton előállítottak. A találmány szerinti gyógyászati készítményekhez és eljárásokhoz az (I) általános képletű vegyületek alkalmazhatók, aholThe compounds useful in the present invention may be naturally occurring or synthetically produced. For use in the pharmaceutical compositions and methods of the present invention, the compounds of formula I wherein:
R-! jelentése maximálisan kb. 20 szénatomot tartalmazó alkil- vagy alkenilcsoport,R! meaning max. An alkyl or alkenyl group containing 20 carbon atoms,
R2 jelentése hidroxil- vagy alkoxicsoport vagy hidrogénatom, R3 jelentése hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport, R4 jelentése COR5, SO2R5 vagy CSR5, ahol R5 jelentése maximálisan 1-20 szénatomot tartalmazó alkil-, alkenil- vagy alkinilcsoport, melyek adott esetben egy vagy több OH, SH, ORq, SRg, NRyRg, COORg vagy ·*«R 2 is hydroxy or alkoxy or hydrogen, R 3 is hydrogen or lower alkyl, R 4 is COR 5 , SO 2 R 5 or CSR 5 where R 5 is alkyl, alkenyl or alkynyl containing up to 1 to 20 carbon atoms, optionally one or more OH, SH, ORq, SRg, NRyRg, COORg or · * «
CONRi0R8 csoporttal szubsztituáltak - a képletekben Rg, R7, R8, Rg és R10 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, vagy maximálisan 10 szénatomot tartalmazó alkil-, aril-, alkaril- és arilalkilcsoport.CONR 10 is substituted with R 8 - wherein R 8 , R 7 , R 8 , R 8 and R 10 are each independently hydrogen or alkyl, aryl, alkaryl and arylalkyl having up to 10 carbon atoms.
A vegyületek előnyösen sejtben oldódóak, azaz képesek áthatolni a sejtfalon és belépni a sejt belső terébe. Előnyösebbek azon vegyületek, amelyekben Rí és R4 együttesen kb. 10-28 szénatomot tartalmaznak. Az Rf és R4 szénláncainak teljes hossza bármilyen arányban megosztható R-f és R4 között feltételezve, hogy mindkettő legalább egy szénatomot tartalmaz. Például Rt lehet 1 és R4 12 szénatomszámú, vagy R·, lehet 10 és R4 7 szénatomszámú. Megállapították, hogy az ilyen méretű vegyületek könnyebben átjutnak a sejtmembránon keresztül és lépnek be a sejt belsejébe.Preferably, the compounds are cell soluble, i.e., they can penetrate the cell wall and enter the cell's interior space. More preferred compounds are those in which R 1 and R 4 taken together are ca. They contain from 10 to 28 carbon atoms. The total length of the carbon chains of Rf and R4 can be divided in any proportion between Rf and R4, provided that both contain at least one carbon atom. For example, R 1 can be 1 and R 4 is C 12, or R 1, can be 10 and R 4 is C 7. Compounds of this size have been found to more readily pass through the cell membrane and enter the cell.
Rí előnyösen 1-20 szénatomot tartalmazó alkil- vagy alkenilcsoport, még előnyösebben maximálisan1-20 szénatomot tartalmazó alkil- vagy 1-12 szénatomot tartalmazó alkil- vagy alkenilcsoport.R1 is preferably an alkyl or alkenyl group containing from 1 to 20 carbon atoms, more preferably an alkyl having up to 1 to 20 carbon atoms or an alkyl or alkenyl group containing from 1 to 12 carbon atoms.
R2 előnyösen hidrogénatom, hidroxil- vagy alkoxicsoport, még előnyösebben hidroxil- vagy alkoxicsoport. A találmány egyik előnyben részesített megvalósításában R2 egy metoxicsoport.R2 is preferably hydrogen, hydroxy or alkoxy, more preferably hydroxy or alkoxy. In a preferred embodiment of the invention, R 2 is a methoxy group.
R3 előnyösen hidrogénatom vagy kis szénatomszámú alkilcsoport (azaz 1-6 szénatomot tartalmazó alkilcsoport), még előnyösebben hidrogénatom.Preferably R 3 is hydrogen or lower alkyl (i.e., C 1-6 alkyl), more preferably hydrogen.
R4 előnyösen COR5, SO2R5 vagy CSR5, ahol R5 jelentése 1-20 szénatomot tartalmazó alkil-, alkenil- vagy alkinilcsoport, melyek adott esetben egy vagy több OH, SH, ORg, SRg, NR7R8, COORg vagy CONRiqR8 csoporttal szubsztituáltak. A képletekben Rg, R7, R8, Rg és R10 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, vagy kis szénatomszámú alkilcsoport (azaz 1-6 szénatomot tartalmazó alkilcsoport) és 1-12 szénatomot tartalmazó • » · aril-, alkaril- és arilalkilcsoport. Még előnyösebben R4 egy COR5, ahol R5 jelentése 1-20 szénatomot tartalmazó alkil- vagy alkenilcsoport. Alkalmas arilcsoport lehet fenil-, szubsztituált fenil és piridin. Alkalmas arilalkilcsoport lehet benzil- vagy feneti lesöpört.Preferably R4 COR5, SO2R5, or CSR5, where alkyl, alkenyl or alkynyl group having 1 to 20 carbon atoms in R5, which are optionally substituted by one or more OH, SH, ORg, SRG, NR 7 R 8, COOR 8 group or CONRiqR They substituted. In the formulas, R 8 , R 7 , R 8 , R 8 and R 10 are each independently hydrogen or lower alkyl (i.e., C 1-6 alkyl) and C 1-12 aryl, alkaryl and arylalkyl. More preferably, R 4 is COR 5 , wherein R 5 is alkyl or alkenyl of 1 to 20 carbon atoms. Suitable aryl groups include phenyl, substituted phenyl and pyridine. Suitable arylalkyl groups may be benzyl or phenethyl.
Az előnyben részesített vegyületek a következők lehetnek: ceramid, C18/C2 ceramid, C-j j/Cg ceramid és 3-O-metil-szfingozin. Ezen vegyületek nevezéktanát a leírás kísérleti részében ismertetjük.Preferred compounds include ceramide, C18 / C2 ceramide, C3 / C8 ceramide and 3-O-methyl sphingosine. The nomenclature of these compounds is described in the experimental section of this specification.
A találmány szerinti vegyületek hatékonyak celluláris differenciálódás indukálására. Olyan mennyiségben juttatjuk be ezeket emlős sejtekbe, általában humán betegekbe, hogy a sejtek differenciálódását indítsák el. A celluláris differenciálódás, sejtdifferenciálódás és hasonló kifejezéseket arra a biológiai folyamatra használjuk, melyben a sejtek érése és egy működőképes sejt jellemvonásainak megszerzése következik be. Differenciálódás közben a sejt pl. megszerezheti vagy elvesztheti morfológiai alakját vagy jellemzőit és képessé válhat vagy elvesztheti azon képességét, hogy bizonyos anyagokhoz kötődjön vagy kémiai reakciókat vigyen végbe. A differenciálódás indukálása kifejezést differenciálódásra képes sejtek befolyásolásának folyamatára használjuk, mely során egy differenciált fenotípust nyer el. Általában az emlős sejtek kezdetben éretlen, nemdifferenciálódott sejtek, melyek aztán differenciálódáson mennek keresztül és az érett, differenciált sejtek jellemzőit szerzik meg.The compounds of the present invention are effective in inducing cellular differentiation. They are delivered to mammalian cells in amounts sufficient to induce cell differentiation. Cellular differentiation, cell differentiation, and the like are used to refer to the biological process of cell maturation and acquisition of the characteristics of a functional cell. During differentiation, the cell, e.g. it may acquire or lose its morphological form or characteristics and may become or lose its ability to bind to certain substances or undergo chemical reactions. Induction of differentiation is used to describe the process of influencing cells capable of differentiation to obtain a differentiated phenotype. In general, mammalian cells are initially immature, undifferentiated cells, which then undergo differentiation and acquire the characteristics of mature, differentiated cells.
Az (I) általános képletű vegyületek hatásosak a sejtek fenotípusának megváltoztatásában is. Egy sejt alakját, viselkedését és más jellemzőit, beleértve biokémiai aktivitásait is, általában egy sejt fenotípusaként ismerünk. A találmány ezen megvalósításában a találmány szerinti vegyületeket sejtekbe juttatjuk be, melyek egy emlősben, általában humán betegekben megváltozott fenotípussal rendelkeznek olyan mennyiségben, ami hatékony a sejt fenotípusának ugyanolyan típusú, normális sejtekre jellemző fenotípussáThe compounds of formula I are also effective in altering the phenotype of cells. The shape, behavior and other characteristics of a cell, including its biochemical activities, are generally known as the phenotype of a cell. In this embodiment of the invention, the compounds of the invention are introduced into cells that have an altered phenotype in a mammal, generally a human patient, in an amount effective to produce the same type of normal cell phenotype of the cell phenotype.
való módosítására. Egy sejt normális fenotípusa alatt olyan sejtet értünk, ami a hagyományos kritériumok pl. alak, sejtmarkerek, növekedés, környezeti változásokra való adott válasz és szabályozás alapján szokásosnak tűnik. A transzformált sejtek olyan sejtek, melyek normális sejtekből erednek spontán vagy mesterséges beavatkozás hatására, és melyek rákos sejtekre jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek pl. éretlenebb/kevésbé differenciálódott fenotípus, gyorsabb növekedés, a környezeti hatásokra vagy a sejtnövekedés ellenőrzésére való válaszképtelenség ill. gyenge válasz és tumor kialakításának képessége kísérleti állatmodellekben. Egy sejt fenotípusának megváltoztatása így azt jelenti, hogy megváltoztatjuk a sejt legalább egy tulajdonságát pl. bizonyos vegyületekhez való kötődésének képességét, enzimatikus aktivitását, a környezetre adott válaszát és más celluláris jellemzőit.. By a normal phenotype of a cell is meant a cell which, e.g. shape, cell markers, growth, response to changes in the environment, and regulation seem normal. Transformed cells are cells that are derived from normal cells by spontaneous or artificial intervention and have the characteristics of cancer cells, e.g. immature / less differentiated phenotype, faster growth, lack of responsiveness to environmental effects or control of cell growth, poor response and ability to develop tumors in experimental animal models. Changing the phenotype of a cell thus means changing at least one property of the cell, e.g. the ability to bind certain compounds, its enzymatic activity, its environmental response and other cellular characteristics.
Mivel a találmány szerinti vegyületek képesek sejtdifferenciálódást indukálni és megváltoztatni a sejtek fenotípusát, ezen vegyületekről feltételezik, hogy hasznosak sejtek hiperproliferációjával jellemzett betegségek kezelésében vagy olyan esetben, ahol a sejtek differenciálódásában jelentős zavar következett be. A sejtek hiperproliferációjával jellemzett betegségek azok, melyekben a betegség következménye vagy megtestesülése az adott sejtek abnormális proliferációja.Because the compounds of the present invention are capable of inducing cellular differentiation and altering the phenotype of cells, these compounds are believed to be useful in the treatment of diseases characterized by cellular hyperproliferation or in cases of significant disruption of cellular differentiation. Diseases characterized by cellular hyperproliferation are those in which the disease results in or is an abnormal proliferation of a given cell.
A sejtek abnormális proliferációja általában a sejtek számának növekedésében nyilvánul meg összehasonlítva a jelenlévő sejtek számát betegség hiányában. A sejtek hiperproliferációja bekövetkezhet normális, abnormális vagy malignus sejtekben. Azon betegségek, melyeket sejtek hiperproliferációjával jellemezhetünk lehetnek rákos tumorok, leukémiák, nemrosszindulatú tumorok, pikkelysömör, atheroszklerozis, és más betegségek. A fenti felsorolást példaként szánjuk, ami nem meríti ki azAbnormal cell proliferation is usually manifested by an increase in the number of cells compared to the number of cells present in the absence of disease. Hyperproliferation of cells can occur in normal, abnormal or malignant cells. Diseases that can be characterized by cellular hyperproliferation include cancerous tumors, leukemias, non-malignant tumors, psoriasis, atherosclerosis, and other diseases. The above list is intended as an example, but is not intended to be exhaustive
4 4 összes ilyen betegséget. Ezek a betegségek megegyeznek abban, hogy elsősorban rosszindulatú (pl. rák, leukémia és limfóma), premalignus (pl. mielodiszplázia) vagy jóindulatú (pl. limfoproliferatív, jóindulatú tumorok és pikkelysömör) sejtek megnövekedett és abnormális proliferációja okozza. A sejtek proliferációjának gátlása a találmány szerinti vegyületekkel lelassíthatja a betegségben megtámadott sejtek növekedését, ami jelentős terápiás és esetleg gyógyító hatást eredményezhet.4 4 all such diseases. These diseases are consistent with being caused primarily by increased and abnormal proliferation of malignant (eg cancer, leukemia and lymphoma), premalignant (eg myelodysplasia) or benign (eg lymphoproliferative, benign tumors and psoriasis) cells. Inhibition of cell proliferation by the compounds of the present invention may slow down the growth of the cells attacked by the disease, resulting in significant therapeutic and possibly curative effects.
Számos ilyen típusú rendellenességet a nemdifferenciálódott sejtek is jellemzik. Nemdifferenciálódott sejtek vagy nemdifferenciálódott fenotípus alatt olyan éretlen sejteket értűnk, melyek általában képtelenek az érett sejtekhez hasonlóan működni, mivel hiányzik az ehhez szükséges, az érett sejtekre jellemző biokémiai- és fiziológiai mechanizmus. A sejtdifferenciálódás folyamata közben az éretlen sejtek elkezdik az érett sejtekre jellemző biokémiai- és fiziológiai tulajdonságokat mutatni. Például in vivő az őssejtek granulocitákká ill. monocitákká differenciálódnak. A nemdifferenciálódott sejtek azon hiányossága, hogy nem képesek differenciáltabb, egészségesebb fenotípussal bíró sejtekké átalakulni hozzájárul a normális működés hiányához. A jelen találmány szerinti vegyületek differenciálódást indukáló képessége segít ezen sejtek megnövekedett proliferációjának gyengítésében is, és azon fontos biokémiaiés fenotípusos jellemzők megszerzésének lehetővé válásában, ami biztosítja, hogy normális sejtekként működjenek. Például jelen találmány szerinti vegyületekről azt feltételezik, hogy pikkelysömör esetén az abnormálisán proliferálódó sejtek differenciálódását indukálva lehetővé teszik a sejtek egészséges bőrré való differenciálódását. Hasonlóan, mielodiszplázia esetén ezen vegyületekről azt tartják, hogy a korai- és nemdifferenciálódott mieloid sejtek differenciálódását idézik elő, ami fontos szerepet játszhat ezen betegségeknek az egészségre leginkább káros hatásaival, azaz a normális, ··· jól differenciálódott vérsejtek számának csökkenésével szembeni küzdelemben. Leukémia, limfóma és más rákos betegségek is kezelhetők a rosszindulatú sejtek differenciálódásának növelésével. Ez segít a fenti betegségek kezelésében, mivel a differenciálódott sejtek általában nem képesek osztódni, igy az egyedi sejtek nem képesek többé a rosszindulatú klón feltöltésére és áttétel kialakítására.Many of these disorders are also characterized by non-differentiated cells. Undifferentiated cells, or undifferentiated phenotype, refers to immature cells that are generally unable to function like mature cells due to the lack of the necessary biochemical and physiological mechanism required for mature cells. During the process of cell differentiation, immature cells begin to show the biochemical and physiological properties characteristic of mature cells. For example, stem cells become granulocytes or cells in vivo. differentiate into monocytes. The lack of non-differentiated cells to transform into cells with a more differentiated, healthier phenotype contributes to the lack of normal function. The ability of the compounds of the present invention to induce differentiation also helps to attenuate the increased proliferation of these cells and allows them to obtain important biochemical and phenotypic characteristics that ensure that they function as normal cells. For example, the compounds of the present invention are believed to induce differentiation of cells to healthy skin by inducing differentiation of abnormally proliferating cells in psoriasis. Similarly, in myelodysplasia, these compounds are thought to induce differentiation of early and undifferentiated myeloid cells, which may play an important role in counteracting the most deleterious effects of these diseases, i.e., the reduction of normal, ··· well differentiated blood cells. Leukemia, lymphoma, and other cancers can also be treated by increasing the differentiation of malignant cells. This helps in treating the above diseases, since differentiated cells are generally unable to divide, so that individual cells are no longer able to populate the malignant clone and generate metastases.
A jelen találmány szerinti vegyületek alkalmazását neoplasztikus betegségek széles köre ellen erősen alátámasztják azon megfigyelések, mely szerint a tumor nekrózis faktor (TNF) és a gamma interferon növeli a ceramidszintet, és az így keletkezett ceramid közvetítheti ezen reagensek HL-60 sejtek differenciálódására kifejtett hatásait. Ezért ezekről a vegyületekröl feltételezik, hogy tumor elhalást és tumor regressziót indukákva hatékonyak tumorok kezelésében.The use of the compounds of the present invention against a wide range of neoplastic diseases is strongly supported by the observation that tumor necrosis factor (TNF) and interferon gamma increase ceramide levels, and the resulting ceramide may mediate the effects of these reagents on HL-60 cell differentiation. Therefore, these compounds are believed to be effective in the treatment of tumors by inducing tumor death and tumor regression.
Mivel a ceramid és származékai képesek lassítani a limfociták növekedését, a jelen találmány szerinti vegyületeket is hatékonynak tartják emlősökben, főleg emberekben immunszupresszió indukálásában. Más limfociták növekedését gátló reagensek pl. szteroidok, anti-limfocita antitestek és mások is jelentős szerepet játszanak immunszupresszió indukálásában. Az immunszupresszió igen fontos szervkilökődés esetén, ami bekövetkezhet pl. vese-, szív-, máj- és más szervbeültetéseknél. Mivel a szteroidok is növelik a ceramid szintjét, a ceramid utánozhatja a szteroidok immunrendszert gátló hatásait. A sejtek, főleg a limfociták növekedésének lassítása alatt a sejtnövekedés normális sebességének és a sejtosztódásnak visszafogását vagy megakadályozását értjük. így azon vegyületek, melyek lassítják a sejtek növekedését, hatással vannak ezen sejtek növekedési sebességére és normális működésére.Because ceramide and its derivatives are capable of slowing lymphocyte growth, the compounds of the present invention are also found to be effective in inducing immunosuppression in mammals, particularly humans. Other lymphocyte growth inhibitors are e.g. steroids, anti-lymphocyte antibodies and others play an important role in inducing immunosuppression. Immunosuppression is very important in the case of organ rejection, which can occur e.g. kidney, heart, liver and other organ transplants. Because steroids also increase levels of ceramide, ceramide may mimic the immune system's inhibitory effects on steroids. By slowing the growth of cells, particularly lymphocytes, is meant to suppress or prevent the normal rate of cell growth and cell division. Thus, compounds that slow cell growth affect the growth rate and normal functioning of these cells.
Az autoimmun rendellenességeket a szervezet saját struktúráival reagáló limfociták megnövekedett aktivitásával és proliferációjával jellemezhetjük. A ceramid azon képessége alapján, hogy potenciálisan gátolja a limfociták növekedését, várhatóan jelentősen hozzájárul autoimmun rendellenességek megtestesülésének gátlásához. Mivel a kortikoszteroidok terápiás szerepet játszanak autoimmun rendellenességekben, így napjainkban az a nézet alakult ki, hogy a ceramid és a jelen találmány szerinti más vegyületek közvetíthetik a szteroidok hatásait ezekben a rendellenességekben.Autoimmune disorders are characterized by increased activity and proliferation of lymphocytes responsive to the body's own structures. Ceramide's potential to inhibit the growth of lymphocytes is expected to significantly contribute to the inhibition of the incidence of autoimmune disorders. Because corticosteroids play a therapeutic role in autoimmune disorders, it is now believed that ceramide and other compounds of the present invention may mediate the effects of steroids in these disorders.
Az elhízottságot is jellemezhetjük a szervezetben lévő zsírsejtek megnövekedett proliferációjával és metabolizmusával. A jelen találmány szerinti vegyületek lassíthatják ezen sejtek növekedését és így hozzájárulhatnak az elhízottság csökkentéséhez. A fö kapcsolat abból a tényből merült fel, hogy mely szerint a tumor nekrózis faktor növeli a ceramidszintjét. A TNF-röl feltételezik, hogy szerepet játszik cachexia (leromlás) indukálásában és felvetették elhízásra való esetleges terápiás alkalmazását. Napjainkban a ceramidról úgy hiszik, hogy hatékony lehet az elhízottság kezelésében.Obesity can also be characterized by increased proliferation and metabolism of fat cells in the body. The compounds of the present invention can slow the growth of these cells and thus contribute to the reduction of obesity. The main relationship arose from the fact that tumor necrosis factor increased ceramide levels. TNF is thought to play a role in the induction of cachexia and its potential therapeutic use for obesity. Nowadays, ceramid is believed to be effective in treating obesity.
Az atheroszklerozis egy másik olyan betegség, amit a simaizomsejtek és az endothélsejtek megnövekedett és feltehetőleg abnormális proliferációjával jellemezhetünk. Feltételezik, hogy ezen sejtek növekedésének lassítása a jelen találmány szerinti vegyületekkel való kezeléssel hozzájárulhat az atheroszklerozis gyógyításához.Atherosclerosis is another disorder characterized by increased and possibly abnormal proliferation of smooth muscle cells and endothelial cells. It is believed that slowing the growth of these cells by treatment with compounds of the present invention may contribute to the treatment of atherosclerosis.
A jelen találmány szerinti vegyietekről azt is feltételezik, hogy hatékony a bőr öregedését gátló kezelésben. A retinsav, amelyet a bőr öregedését gátló kezelésekben elterjedten használnak, növeli a bőr sejtjeinek ceramidszintjét. Mivel a retinsav növeli a ceramidszintet, a ceramid közvetítheti a retinsav működését és hatékony lehet a bőr öregedését gátló kezelésekben.The compounds of the present invention are also believed to be effective in anti-aging treatment. Retinoic acid, which is widely used in anti-aging treatments, increases ceramide levels in skin cells. Because retinoic acid increases ceramide levels, ceramide may mediate the function of retinoic acid and may be effective in anti-aging treatments.
::
A jelen találmány hasznos lehet kémiai megelőzésben is, azaz a sejtek olyan kezelésében, amely során megakadályozzuk vagy lassítjuk egy normális fenotípusú sejt transzformált malignus fenotípussá való átalakulását. A ceramid képes rosszindulatú és másféle nemdifferenciálódott sejtek differenciálódásának indukálására, így a jelen találmány szerinti vegyületekről feltételezzük, hogy hatékonyak a korai (klinikailag nem kimutatható) rosszindulatú sejtek differenciálódásának indukálására és proliterációjának lassításására. Ez egy erős kémiai megelőző reagens kialakítását teszi tehetővé. Hasonlóan a retinsav is hatékony lehet kémiai megelőző reagensként, és mivel a retinsav növeli a ceramidszintet, a találmány szerinti vegyületek is hasonló módon hasznosak lehetnek kémaiai megelőzéshez.The present invention may also be useful in chemical prevention, that is, in the treatment of cells by preventing or slowing the transformation of a cell of normal phenotype into a transformed malignant phenotype. Ceramide is capable of inducing the differentiation of malignant and other non-differentiated cells, and the compounds of the present invention are believed to be effective in inducing differentiation and slowing down proliferation of early (clinically undetectable) malignant cells. This makes it possible to develop a strong chemical preventive reagent. Similarly, retinoic acid can be effective as a chemical preventive reagent, and since retinoic acid increases ceramide levels, the compounds of the invention may similarly be useful for chemical prevention.
A jelen találmány szerinti vegyületeket és/vagy ezek gyógyászatilag elfogadható aktív sóit gyógyászati készítmények vagy gyógyszerek formájában lehet kiszerelni, amelyeket olyan emlősök pl. ember kezelésére használhatunk, melyek az itt ismertetett különböző betegségekben vagy más defektív differenciációs folyamatok által okozott körülmények miatt szenvednek. A gyógyászati készítmények vagy gyógyszerek előnyösen a jelen találmány szerinti vegyületek és/vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóit terápiásán hatékony mennyiségét tartalmazzák. A találmány szerinti vegyületeket betegségben szenvedő vagy feltételezhetően beteg emlősbe juttathatjuk önmagukban vagy a találmány más vegyületeivel illetve más gyógyászati- vagy gyógyító reagensekkel együtt. A jelen találmány szerinti készítmények bármilyen módon bejuttathatok, azaz orálisan, parenterálisan, intradermálisan, intramuszkulárisan, intravénásán, szubkután vagy helyi kezeléssel. Az adott módszer ismert eljárásokkal analóg módon gyorsan meghatározható, és ez függ a kezelendő betegség állapotától, ennek súlyosságától, a beteg korától és állapotától. Orálisan bejuttatható tabletta, • · ··*:j • * ·· « · * · ·« I • · «· · · kapszula vagy oldat formájában ill. parenterálisan oldat vagy szuszpenzió alakjában. Injekció esetén oldószerként egy steril folyadék alkalmazható. Injekcióhoz használhatunk vizet, amely az injekciós oldatoknál szokásos stabilizáló reagenseket, oldódást elősegítő reagenseket és/vagy puffereket tartalmaz. A kívánt adalékok lehetnek pl. tartarát- és borát puffer, etanol, dimetil-szulfoxid, komplexképző reagensek (pl. etilén-diamin-tetraecetsav), nagy molekulatömegú polimerek (pl. polietilénoxid) a megfelelő viszkozitáshoz vagy szorbit-anhidridek polietilén származékai.The compounds of the present invention and / or their pharmaceutically acceptable active salts may be formulated in the form of pharmaceutical compositions or medicaments which may be administered to mammals, e.g. can be used to treat human beings suffering from various diseases or conditions caused by other defective differentiation processes described herein. Preferably, the pharmaceutical compositions or medicaments comprise a therapeutically effective amount of a compound of the present invention and / or pharmaceutically acceptable salts thereof. The compounds of the invention may be administered to a mammal suffering from or suspected of suffering from a disease, or in combination with other compounds of the invention or other therapeutic or therapeutic agents. The compositions of the present invention may be administered by any route, i.e., orally, parenterally, intradermally, intramuscularly, intravenously, subcutaneously or topically. The method can be quickly determined by analogy with known methods and depends on the condition of the disease being treated, its severity, the age and condition of the patient. For oral administration in the form of tablets, capsules or solutions or as a solution for injection. parenterally in the form of a solution or a suspension. For injection, a sterile liquid may be used as a solvent. Water for injection may be used which contains the stabilizing reagents, solubilizing reagents and / or buffers customary for injection solutions. The desired additives may be e.g. tartrate and borate buffer, ethanol, dimethylsulfoxide, complexing agents (e.g., ethylene diamine tetraacetic acid), high molecular weight polymers (e.g., polyethylene oxide) for appropriate viscosity, or polyethylene derivatives of sorbitic anhydrides.
A jelen találmány szerinti vegyületek teljes rutinszerű (azaz napi, heti, havi stb.) dózisa olyan, hogy hatásos legyen az adott sejtek differenciálódásában, a sejtproliteráció csökkentésében vagy a kezelendő állapot javításában ill. stabilizálásában. E területen jártas szakemberek könnyen megállapíthatják az adott esetre optimális, terápiásán hatékony dózist a fent körvonalazott tartományt kiindulási pontként használva.The total routine dose (i.e. daily, weekly, monthly, etc.) of the compounds of the present invention is such as to be effective in differentiating the respective cells, reducing cell proliferation, or improving the condition to be treated. stabilize. Those skilled in the art can readily determine the optimal therapeutically effective dose for the particular case using the range outlined above as a starting point.
Egy betegség kezelésére alkalmas készítmény előállítása vagy gyártása esetén egy, a jelen találmány szerinti vegyületet vagy annak fiziológiailag elfogadható sóját ill. ezek keverékét egy fiziológiásán alkalmas vivőanyaggal, hordozóval, masszával, kötőanyaggal, tartósítóanyaggal, stabilizáló anyaggal, ízesítőanyaggal és/vagy más adalékanyaggal egységdózis formában szerelhetjük ki. A tablettáknál és kapszuláknál felhasználható adalékanyagok tipikus példái a következők: kötőanyagként tragantmézga, arabmézga, kukorica keményítő és zselatin, kötőmasszaként mikrokristályos cellulóz, záróanyagként kukorica keményítő, előzselatinozott keményítő és alginsav, kenőanyagként magnézium-sztearát, édesítőszerként szukróz, laktóz és aszpartáz, ízesítőszerként borsmenta. Egyéb adalékanyagok lehetnek kapszulák esetén folyékony hordozóanyagként étolaj, tabletták fedéséhez (drazsírozáshoz) sellak, cukor és ezek kombinációja.In the manufacture or manufacture of a composition for the treatment of a disease, a compound of the present invention, or a physiologically acceptable salt thereof, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or a mixture of these with a physiologically acceptable carrier, carrier, paste, binder, preservative, stabilizer, flavoring and / or other excipient, in unit dosage form. Typical examples of additives for use in tablets and capsules include tragacanth, gum arabic, corn starch and gelatin as binder, microcrystalline cellulose as binder, corn starch, pregelatinized starch and alginic acid, magnesium stearate as a lubricant, and magnesium stearate as a lubricant. Other additives for capsules include liquid carriers for cooking oil, shellac, sugar, and combinations thereof to form tablets.
Parenterális injekciók esetén az aktív komponens oldásához vagy szuszpendálásához vivőanyagként a következőket használhatjuk: víz, természetes növényi olajok pl. szezámmagolaj, kókuszolaj, földimogyoróolaj vagy gyapotmagolaj, szintetikus olajok pl. etil-oleát, és szükség szerint tartalmazhatnak pufferoldatokat tartósítószereket és antioxidánsokat.In the case of parenteral injection, the following can be used as a carrier for dissolving or suspending the active ingredient: water, natural vegetable oils, e.g. sesame seed oil, coconut oil, peanut oil or cotton seed oil, synthetic oils e.g. ethyl oleate and may contain buffer solutions, preservatives and antioxidants as required.
A jelen találmány szerinti eljárást végezhetjük oly módon, hogy a találmány szerinti készítmény hatásos mennyiségét közvetlenül sejtekhez adjuk. De a találmány területébe tartozik az a lehetséges megoldás is, hogy az eljárást indirekt módon végezzük, azaz olyan vegyületet vagy készítményt juttatunk be, mely in vivő indukálja a jelen találmány szerinti vegyületek valamelyikének termelődését. Továbbá az a megoldás is a találmány területébe tartozik, mely során gyógyszerek előanyagai in vivő alakulnak át a találmány szerinti vegyületté.The method of the present invention may be carried out by directly adding an effective amount of the composition of the invention to cells. However, it is also within the scope of the invention to provide the process indirectly, i.e., by administering a compound or composition which in vivo induces the production of one of the compounds of the present invention. Furthermore, it is within the scope of the present invention to convert prodrugs of drugs into in vivo compounds of the invention.
A jelen leírásban számos vegyület elnevezésére olyan rövidítést használunk, mely jelzi az (I) általános szerkezeti képlettel jellemzett vegyületek szénláncainak teljes szénatomszámát. Például Ci8/C2 ceramid egy olyan (I) általános szerkezeti képletű vegyületet jelent, ahol R-| jelentése 15 szénatomot tartalmazó alkenil-, R2 jelentése hidroxilcsoport, R3 jelentése hidrogénatom, R4 jelentése COR5 és R5 jelentése metilcsoport. A Cfg/Cz ceramid Rf részében a kettős kötés ugyanolyan helyzetben található, mint a ceramidban. így 18 szénatom található az elsőként említett láncban, mely lánc tartalmazza az R-f-ben lévő szénatomokat, azt a szénatomot, amihez R2 kapcsolódik, azt a szénatomot, amihez a nitrogén kötődik és a CH2OH csoportot a lánc végén. Két szénatom található a másodikként említett láncban, azaz az R4 amidkötésben lévő szénatomja és az R5 metilcsoportjának szénatomja. Az ily módon elnevezett vegyületek esetén az első szénlánc tartalmazza az R-j-et és azokat a szénatomokat, amikhez R2, N és OH kapcsolódik, a második szénlánc az R4-ben lévő szénatomokat jelenti. Hasonlóan a Cfg/Cg ceramid egy olyan (I) általános szerkezeti képletű vegyületet jelent, ahol jelentése 15 szénatomot tartalmazó alkenil-, R2 jelentése hidroxilcsoport, R3 jelentése hidrogénatom, R4 jelentése COR5 és R5 jelentése pentanilcsoport. A C^/Cg ceramid egy olyan vegyületet jelent, ahol R-| jelentése 8 szénatomot tartalmazó alkenil-, R2 jelentése hidroxilcsoport, R3 jelentése hidrogénatom, R4 jelentése COR5 és R5 jelentése heptanilcsoport. Mindegyik itt közölt példában az R-j-ben a kettős kötés a ceramidban megegyező helyzetben található, bár más helyen lévő telítetlenség is alkalmazható. A 3-O-metil-szfingozin olyan (I) általános szerkezeti képletű vegyületet jelent, ahol R-| jelentése 15 szénatomot tartalmazó alkenil-, R2 jelentése metoxicsoport, R3 jelentése hidrogénatom, R4 jelentése COR5 és R5 jelentése metilcsoport.Many of the compounds used herein are abbreviated to denote the total number of carbon atoms of the compounds of formula (I). For example CI8 / C2 ceramide is a (I) a compound of structural formula wherein R | represents an alkyl group having 15 carbon atoms, R2 is hydroxy, R3 is hydrogen, R4 is COR5 and R5 is methyl. In the Rf portion of Cfg / Cz ceramide, the double bond is in the same position as in ceramide. Thus, 18 carbon atoms are present in the first-mentioned chain, which contains the carbon atoms in Rf, the carbon to which R 2 is attached, the carbon to which nitrogen is attached, and the CH 2 OH group at the end of the chain. There are two carbon atoms in the second chain, namely the carbon atom in R 4 amide bond and the carbon atom in R 5 methyl group. In the compounds so named, the first carbon chain contains R 1 and the carbon atoms to which R 2 , N and OH are attached, the second carbon chain represents the carbon atoms in R 4 . Similarly the Cfg / Cg is a ceramide of formula (I) compound of the structural formula wherein represents an alkyl group having 15 carbon atoms, R2 is hydroxy, R3 is hydrogen, R4 is COR5 and R5 pentanilcsoport. C ^ / / Cg ceramide means a compound wherein R- is C 8 alkenyl, R 2 is hydroxy, R 3 is hydrogen, R 4 is COR 5 and R 5 is heptanyl. In each of the examples herein, the double bond in Rj is in the same position in the ceramide, although unsaturation at other sites may be used. 3-O-Methyl-sphingosine is a compound of general formula (I) wherein represents an alkyl group having 15 carbon atoms, R2 is methoxy, R3 is hydrogen, R4 is COR5 and R5 is methyl.
Az 16,25-dihidroxi-D3 vitamint (1,25-(OH)2D3) a Hoffman-LaRoche, Nutley, New Jersey cégtől szerezzük be. Az SM-et és PC-t az Avanti Polar Lipids cégtől, a ceramidot a Supelco cégtől vásároltuk. Az inzulin, transzferrin, NBT és α-naftil-acetát a Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri cégtől származnak.16,25-Dihydroxy Vitamin D 3 (1,25- (OH) 2 D 3) was obtained from Hoffman-LaRoche, Nutley, New Jersey. We purchased the SM and PC from Avanti Polar Lipids, ceramide from Supelco. Insulin, transferrin, NBT and α-naphthyl acetate are from Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri.
CERAMID ÉS SZFINGOZIN ANALÓGOK ELŐÁLLÍTÁSAPREPARATION OF CERAMIDE AND SPINGINGOSIN ANALOGES
Az N-acetil- és [3H]-N-acetil-szfingozint a Gaver, R. C. és Sweely, C.N-acetyl and [ 3 H] -N-acetyl sphingosine are described by Gaver, RC and Sweely, C.
C., J. Amer. Chem. Soc. 88: 3643- 3647 (1966) műben ismertetett módon szintetizáljuk. Röviden: összefoglalva az N-acetil-szfingozint (Cig/C2 ceramid) és N-hexanoil-szfingozint (C^g/Cg ceramid) neutrális szfingozin ecetsavanhidriddel ill. kapronanhidriddel való acilálással állítjuk elő (termelés 90 %). A [3H]-N-acetil-szfingozint (specifikus aktivitása 2,5 x 104 cpm/nmol/l)C., J. Amer. Chem. Soc. 88: 3643-3647 (1966). Briefly summarizing the N-acetyl sphingosine (Cig / C2 ceramide) and N-hexanoyl-sphingosine (C ^ g / Cg ceramide) or neutral sphingosine with acetic anhydride. by acylation with caproic anhydride (90% yield). The [3 H] -N-acetyl-sphingosine (specific activity 2.5 x 10 4 cpm / nmol / L)
3-oxo-1 -hidroxi-2-acetamid-4-oktadecén pHJNaBfy-del való redukálásával állítjuk elő (termelés 40 % TLC után). A 3-oxo-1-hidroxi-2-acetamid-4oktadecént hideg N-acetil-szfingozin száraz krómanhidriddel történő oxidálással nyerjük (termelés 80 % TLC után). Az N-etil-szfingozint N-acetil szfingozinból LiBH4-del való redukcióval állítjuk elő és preparatív TLC-vel tisztítjuk (termelés 30 %). A Cn/Cg ceramidot Liotta és mtsai, Tetrahedrom Letters 29: 3037 (1988) műben közölt eljárás szerint állítjuk elő. Minden vegyület szerkezetét NMR-rel igazoljuk és a preparátumok tisztaságát TLCvel vizsgáljuk, mely 97 %-nál nagyobbra becsülhető. Ezen vegyületeket etanolban oldjuk majd a tenyésztöközegbe visszük (amiben az etanol végső koncetrációja kisebb 0,1 %-nál).It is prepared by reduction of 3-oxo-1-hydroxy-2-acetamide-4-octadecene with pHJNaBfy (40% yield after TLC). 3-Oxo-1-hydroxy-2-acetamide-4-octadecene is obtained by oxidation of cold N-acetyl sphingosine with dry chromic anhydride (yield after 80% TLC). N-ethyl sphingosine was prepared from N-acetyl sphingosine by reduction with LiBH 4 and purified by preparative TLC (30% yield). The Cn / Cg ceramide is prepared according to the procedure described by Liotta et al., Tetrahedrom Letters 29: 3037 (1988). The structure of each compound was confirmed by NMR and the purity of the preparations was assayed by TLC, which is estimated to be greater than 97%. These compounds are dissolved in ethanol and transferred to the culture medium (in which the final concentration of ethanol is less than 0.1%).
3-O-METIL-SZFINGOZIN ELŐÁLLÍTÁSAPREPARATION OF 3-O-METHYL-SPINGOSIN
A 3-O-metil-szfingozint Carter és mtsai, Journal of Biochemistry 192: 197- 207 (1951) által közölt módszerrel szintetizáljuk. 100 mg marhaagyból származó cerebrozidokat (katalógusszám: A-46, Serdary Research Labs, London, Ontario, Canada) 112 μΙ koncentrált kénsavat és 2,3 ml metanolt tartalmazó gömblombikban oldjuk fel. A keveréket 6 órán át keverés közben melegítjük és refluxáltatjuk. A melegítés után a reakciókeveréket jégen kb. 15 percig hűtjük. A zsírsavakból és metil-észterekből származó csapadékot szűréssel távolítjukel 1-es Whatman szűrőpapírt és Brüchner-tölcsér segítségével. A szúrletben maradó zsírsavakat és észtereket 4 x 1 ml petróleuméterrel extraháljuk ki. Az étert vákuum alatt távolítjuk el kb. 15 perc alatt. Az oldatot 4 M/l metanolos KOH-val semlegesítjük (kb. 6,5 ml szükséges, pH-papírral ellenőrizzük), és a kicsapódott kálium-szulfátot 1-es Whatman szűrőpapíron Brüchner-tölcsér segítségével szűrjük le. A szúrt oldatot 4°C-on (hűtőszekrényben) egy éjszakán keresztül tároljuk, majd eltávolítjuk az állás közben keletkezett további kálium-szulfát csapadékot. Az oldatot 6 M/l NaOH-dal 10-es pH-ra állítjuk (pH-papírral ellenőrizzük). Az oldatot ezután kétszer dietil-éterrel extraháljuk. Az extraktumokat egyesítjük, vízzel egyszer mossuk és nátrium-szulfáton vákuum alatt szárítjuk. A száraz anyagot kloroform/metanol (1:1) oldószerben oldjuk.3-O-Methyl sphingosine was synthesized according to the method described by Carter et al., Journal of Biochemistry 192: 197-207 (1951). 100 mg of bovine cerebrosides (Cat. No. A-46, Serdary Research Labs, London, Ontario, Canada) were dissolved in a round-bottom flask containing 112 μΙ of concentrated sulfuric acid and 2.3 mL of methanol. The mixture was heated and refluxed for 6 hours with stirring. After heating the reaction mixture on ice for approx. Cool for 15 minutes. The precipitate from the fatty acids and methyl esters was removed by filtration using Whatman filter paper 1 and a Brücner funnel. The fatty acids and esters remaining in the filtrate were extracted with 4 x 1 mL of petroleum ether. The ether was removed in vacuo for ca. In 15 minutes. The solution was neutralized with 4M KOH in methanol (approximately 6.5 mL required pH checked paper) and the precipitated potassium sulfate was filtered through Whatman filter paper 1 using a Brüchner funnel. The pelleted solution was stored at 4 ° C (refrigerator) overnight, and any additional potassium sulfate precipitate formed upon standing was removed. The solution was adjusted to pH 10 with 6 M NaOH (checked with pH paper). The solution was then extracted twice with diethyl ether. The extracts were combined, washed once with water and dried over sodium sulfate in vacuo. The dry material was dissolved in chloroform / methanol (1: 1).
A mintát vékonyréteg kromatográfiával (TLC) tisztítjuk Sambasivaroco és McCluer, Journal of Lipid Research 4: 106-108 (1963) cikkben közölt eljárás felhasználásával. Preparativ TLC lemezt használunk a termék elválasztására oldószerként kloroform: metanol: 2 M/l ammónium-hidroxid (40:10:1) oldatot és standardként szfingozint alkalmazva. A lemez egy kis részét ninhidrin-spray-el tesszük láthatóvá. A 3-O-metil-szfingozin fut a legmesszebbre a lemezen, ez a leggyorsabban vándorló komponens. A 3-Ometil-szfingozinnak megfelelő szilikacsíkot lekaparjuk a lemezről és a 3-0metil-szfingozint kloroform: metanol (1:1) oldószerrel eluáljuk ki. Az eluátumot IEC centrifugában 2000 fordulat/perc fordulatszámon kb. 5 percig centrifugáljuk és a felülúszót egy tiszta csőbe öntjük. A 3-0-metil-szfingozin szilikáról kloroform: metanol (1:1) oldószerrel való elúcióját megismételjük és a felülúszókat egyesítjük. Az egyesített felülúszókat vákuum alatt szárítjuk és a teljes termelésként kapott 11 mg 3-O-metil-szfingozint etanolban szuszpendáljuk fel.The sample was purified by thin layer chromatography (TLC) using the procedure described in Sambasivaroco and McCluer, Journal of Lipid Research 4: 106-108 (1963). A preparative TLC plate was used to separate the product using chloroform: methanol: 2 M ammonium hydroxide (40: 10: 1) as solvent and sphingosine as standard. A small portion of the plate is visualized with a ninhydrin spray. 3-O-Methyl Sphingosine runs farthest on the plate, the fastest migrating component. The silica strip corresponding to 3-O-methyl sphingosine is scraped off and the 3-O-methyl sphingosine is eluted with chloroform: methanol (1: 1). Elute the eluate in an IEC centrifuge at 2000 rpm for approx. Centrifuge for 5 minutes and pour the supernatant into a clean tube. Elution of 3-O-methyl sphingosine from silica with chloroform: methanol (1: 1) was repeated and the supernatants were combined. The combined supernatants were dried under vacuum and the total yield of 11 mg of 3-O-methyl sphingosine was suspended in ethanol.
SEJTTENYÉSZTÉSCell culture
A HL-60 humán mielocita leukémia sejteket (45 passzálás után) 10 % magzati borjú szérumot (FCS) tartalmazó RPMI1640 tápközegben (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) növesztjük 37°C-on 5 % CO2-t tartalmazó inkubátorban. A sejteket kétszer foszfáttal pufferolt sóoldatban (PBS) mossuk és a különböző vegyületekkel való kezelés előtt szérummentes tápközegben szuszpendáljuk fel, ami inzulint (5 mg/l) és transzferrint (5 mg/l) tartalmaz. LIPIDEK MENNYISÉGÉNEK MEGHATÁROZÁSAHL-60 human myelocytic leukemia cells (after 45 passages) were grown in RPMI1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. . The cells were washed twice in phosphate buffered saline (PBS) and resuspended in serum-free medium containing insulin (5 mg / L) and transferrin (5 mg / L) prior to treatment with the various compounds. DETERMINATION OF THE QUANTITY OF LIPIDS
A jelzett időpontokban a sejteket learatjuk és a lipideket Bligh és Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917 (1959) műben közölt eljárással extraháljuk. A mintákat nitrogén gáz alatt szárítjuk, majd 0,1 ml kloroformban oldjuk: 40 μΙ-t vékonyréteg kromatográfiás (TLC) lemezre (Merek) viszünk, 40 μΙ-t pedig foszfolipid-foszfát mérésére (két párhuzamos) használunk. A • · · foszfátot Van Veldhoven, P. és Mammaerts, G, Ann. Biochem. 161: 45- 48 (1987) műben közölt eljárással mérjük. A szfingomielin (SM) és a foszforilkolin (PC) azonosítása végett a TLC lemezeket kloroform/ metanol/ ecetsav/ H2O (50:30:8:5) (A oldat) vagy kloroform/ metanol/ 2 M/l NH4OH (60:35:5) (B oldat) segítségével hívjuk elő. A kétdimenziós TLC lemezekhez az A és B oldat kombinációját használjuk. A lemezek jódgözzel való festése után az SM-nek és PC-nek megfelelő foltokat lekaparjuk, kloroform/ metanol (1:1) oldattal extraháljuk, nitrogén alatt szárítjuk és a foszfolipid-foszfátot mérjük.At the indicated times, the cells were harvested and the lipids were harvested by Bligh and Dyer, Can. J. Biochem. Physiol. 37: 911-917 (1959). The samples were dried under nitrogen and then dissolved in 0.1 ml of chloroform: 40 μ visz was applied to a thin layer chromatography (TLC) plate (Merek) and 40 μΙ was used to measure phospholipid phosphate (duplicate). The phosphate is · Van · Veldhoven, P. and Mammaerts, G, Ann. Biochem. 161: 45-48 (1987). Of sphingomyelin (SM) and the phosphorylcholine (PC), the purpose of identifying the TLC plates with chloroform / methanol / acetic acid / H 2 O (50: 30: 8: 5) (solution A) and chloroform / methanol / 2 M / l NH 4 OH (60: 35: 5) (Solution B). For two-dimensional TLC plates, use a combination of solution A and solution B. After staining the plates with iodine vapor, the spots corresponding to SM and PC were scraped off, extracted with chloroform / methanol (1: 1), dried under nitrogen and the phospholipid phosphate was measured.
CERAMID MEGHATÁROZÁSADETERMINATION OF CERAMIDE
A ceramid mennyiségét enzimatikus úton mérjük sn-1,2-diacil-glicerol(DAG)-kinázt használva, ahogy ezt Preiss és mtsai, J. Bioi. Chem. 261: 86978700 (1986) és Van Veldhoven, Anal. Biochem. 183: 177-189 (1989) művekben közük. Annak ellenőrzésére, hogy a HL-60 sejtekben a ceramid átalakul-e ceramid-1 -foszfáttá, TLC lemezen ceramid-foszfátot és foszfatidsavat futtatunk különböző oldószer-rendszereket pl. kloroform/ metanol/ecetsav (65: 15: 5), kloroform/piridin/formálsav (60: 30: 8) és kloroform/ aceton/ metanol/ ecetsav/ H2O (6: 2:2) alkalmazva. Az Rf értékeket a ceramid standardra kapott értékekkel hasonlítjuk össze. Továbbá a ceramid-1-foszfátot alkalikus hidrolízissel (70°C, 20 óra 1 M/l NaOH-ban) szfingozin-1-foszfáttá alakítjuk, és az Rf értékeket a szfingozin-1-foszfát standardnál butanol/ ecetsav/ H2O (6:2:2) vagy kloroform/ aceton/ metanol/ ecetsav/ H2O (10: 4:2: 2:1) oldószerekkel kapott értékkel hasonlítjuk össze, és 0,45 vagy 0,42 értékeknél azonosnak találjuk.The amount of ceramide was measured enzymatically using sn-1,2-diacylglycerol (DAG) kinase as described by Preiss et al., J. Bioi. Chem. 261: 86978700 (1986) and Van Veldhoven, Anal. Biochem. 183: 177-189 (1989). To check for ceramide conversion to ceramide-1-phosphate in HL-60 cells, TLC plate was run with ceramide phosphate and phosphatidic acid in various solvent systems, e.g. chloroform / methanol / acetic acid (65: 15: 5), chloroform / pyridine / formalic acid (60: 30: 8) and chloroform / acetone / methanol / acetic acid / H 2 O (6: 2: 2). Rf values are compared with those obtained for the ceramide standard. Also ceramide-1-phosphate (70 C, 20 h, 1 M / l NaOH) is converted to sphingosine-1-phosphate by alkaline hydrolysis, and the Rf values of the sphingosine-1-phosphate standard one, butanol / acetic acid / H 2 O ( 6: 2: 2) or chloroform / acetone / methanol / acetic acid / H 2 O (10: 1 compared with the value obtained) solvent, and found to be identical values of 0.45 or 0.42: 4: 2: 2nd
A HL-60 SEJTEK NÖVEKEDÉSÉNEK ÉS DIFFERENCIÁLÓDÁSÁNAK VIZSGÁLATATESTING FOR GROWTH AND DIFFERENCE OF HL-60 CELLS
A sejtnövekedést hemocitométerrel mérjük. Az élő sejteket a tripánkék festék kiszorításuk alapján határozzuk meg. Az élő sejtek százaléka mindig 80 %-nál nagyobb, más esetben külön jelöljük. A monocita/makrofág és aCell growth was measured with a hemocytometer. Live cells were determined by their displacement of trypan blue dye. The percentage of live cells is always greater than 80%, otherwise it is specifically labeled. Monocyte / macrophage and
I granulocita sejtvonal azonosítására a nitro-tetrazólium kék (NBT) redukálását, a monocita/makrofág sejtvonal azonosítására a nemspecifikus észterázt alkalmazzuk. Mindkét markert az Okazaki, T. és mtsai, J. CellNitrogen tetrazolium blue (NBT) reduction was used to identify granulocyte cell line, and non-specific esterase was used to identify monocyte / macrophage cell line. Both markers are described in Okazaki, T. et al., J. Cell
Physiol. 131: 50- 57 (1987) műben közöltek alapján mérjük.Physiol. 131: 50-57 (1987).
A [3H]-C18C2 ceramid felvétele és metabolizmusaUptake and metabolism of [ 3 H] -C 18 C 2 ceramide
A HL-60 sejteket szérummentes tápközegben való felszuszpendálás után [3H]-C18/C2 ceramiddal jelöljük (1 x 105 cpm/ml), a jelzett időben learatjuk és háromszor PBS-ben mossuk. A lipideket Bligh és Dyer, supra eljárása szerint extraháljuk. A szárított mintákat 100 μΙ kloroformban oldjuk: 20 μΙ-t TLC lemezre viszünk, 40 μΙ-t pedig foszfolipid-foszfát mérésére használunk. A lemezeket kloroform/ metanol/2 M/í NH40H (40:10:1) tartalmú oldószerben hívjuk elő a C-|8/C2 ceramid, az SM és a szfingozin (SPH) elválasztása végett. A kapott foltokat lekaparjuk és egy Safety Solve oldószerben (Research Products International Corp.) egy LKB szcintillációs számlálóban (LKB) mérjük.After resuspension of the HL-60 cells in serum free medium labeled [3 H] -C18 / C2 ceramide (1 x 10 5 cpm / ml), harvested at the indicated time and were washed three times with PBS. The lipids were extracted according to the procedure of Bligh and Dyer, supra. Dried samples were dissolved in 100 μΙ chloroform: 20 μΙ was transferred to a TLC plate and 40 μΙ was used to measure phospholipid phosphate. The plates were developed in chloroform / methanol / 2M / NH4OH (40: 10: 1) in C- | | |. 8 / C2 for the separation of ceramide, SM and sphingosine (SPH). The resulting spots were scraped off and weighed in a Safety Solve solvent (Research Products International Corp.) in an LKB scintillation counter (LKB).
A CERAMID KÉPZŐDÉS DÓZIS- ÉS IDÖFÜGGÉSE 1,254OH)2D3 HATÁSÁRADOSE AND TIME DETERMINATION OF CERAMIDE FORMATION 1,254OH) 2 D 3
A ceramid mennyiségét a korábban diacil-glicerol mérésére kifejlesztett (lásd Van Veldhove és mtsai, supra) diacil-glicerol-kináz eljárással mérjük. Az E. coli-ból származó DAG-kináz képes a ceramidot ceramid-1 -foszfáttá alakítani. A sejtekben lévő ceramidot a ceramid ceramid1 -foszfáttá való átalakítása után vékonyréteg kromatográfiás (TLC) lemezeken azonosítjuk a ceramid-foszfát standarddal való együttvándorlása alapján. A sejtekben lévő és a standard ceramid-foszfát azonos Rf értéket ad a TLC lemezek 4 különöböző oldószer-rendszerben történő előhívása után. A további azonosítást a ceramid-foszfát alkalikus hidrolízisével végezzük. Ez szfingozin-1-foszfát képződéshez vezet, mely a TLC lemez butanol/ ecetsav/The amount of ceramide is measured using the diacylglycerol kinase method previously developed for diacylglycerol (see Van Veldhove et al., Supra). DAG kinase from E. coli is capable of converting ceramide to ceramide-1-phosphate. After converting ceramide into ceramide1-phosphate, the cells in the cells are identified by thin-layer chromatography (TLC) plates by co-migration of ceramide phosphate with the standard. Cellular and standard ceramide phosphate give the same Rf value after developing TLC plates in 4 different solvent systems. Further identification was carried out by alkaline hydrolysis of ceramide phosphate. This leads to the formation of sphingosine-1-phosphate, which in the TLC plate is butanol / acetic acid /
Η20 (2: 2:2) oldószer rendszerben történő előhívásakor együttfut (Rf 0,45) a standarddal.Η 2 0 (2: 2: 2) when developed in a solvent system, it interacts (Rf 0.45) with the standard.
Amint azt az l.ábra mutatja, a HL-60 sejtek 1,25-(OH)2D3-mal való kezelése a ceramidszint dózisfüggő emelkedését eredményezi a kezelést követő második órában. Az adatokat a kontroll %-ában fejezzük ki (C-|g/C2 ceramid nélkül). A függőleges szakaszok két párhuzamos mérésből származó standard deviáció értékeket jelzi. Az alap ceramidszint 26,1* 0,82 nM/ nM foszfolipid. Az eredmények három különböző kísérletet reprezentálnak.As shown in Figure 1, treatment of HL-60 cells with 1,25- (OH) 2 D 3 results in a dose-dependent increase in ceramide levels in the second hour after treatment. Data are expressed as% of control (without C g / C 2 ceramide). Vertical sections represent standard deviation values from two parallel measurements. The base ceramide level is 26.1 * 0.82 nM / nM phospholipid. The results represent three different experiments.
Maximális ceramidszint emelkedés 100 nM/Ι 1,25-(OH)2D3 koncentrációnál jelentkezik. Ennél a koncentrációnál 41 % ceramidszint növekedés tapasztalható a kontrollszinthez képest. Az 1,25-(OH)2D3 hatására bekövetkező ceramidképződés dózisfüggése nagymértékben egyezik az 1,25-(OH)2D3 hatására történő HL-60 sejtdifferenciálódás dózisfüggésével, mely 100-300 nM/l-nél maximális. így ezen eredmények mennyiségi összefüggést sugallnak a ceramidképződés és a sejtdifferenciálódás között.Maximum increase in ceramide level occurs at 100 nM / Ι 1,25- (OH) 2 D3. At this concentration, there was a 41% increase in the level of ceramide compared to the control level. The dose dependence of ceramide formation by 1,25- (OH) 2 D3 is very similar to that of HL-60 cell differentiation by 1,25- (OH) 2 D3, which is maximal at 100-300 nM / l. Thus, these results suggest a quantitative relationship between ceramide formation and cell differentiation.
Vizsgáljuk az 1,25-(OH)2D3 hatására történő ceramidszint változás időfüggését is HL-60 sejteken. Amint az a 2.ábrán látható, a HL-60 sejteket 100 nM/Ι Cig/C2 ceramiddal való kezelés után a jelzett időpontokban aratjuk le. A ceramid mennyiségét a Kísérleti részben ismertetett módon mérjük. Az eredmények két különböző meghatározásból származnak. A függőleges szakaszok egy mérésből származó standard deviáció értéket jelzi. Az eredmények három olyan kísérletet reprezentálnak, mikor HL-60 sejteket 100 nM/l 1,25-(OH)2D3-mal kezelünk (ami optimális koncentráció az 1.ábrán bemutatott dózisfüggés vizsgálata alapján), a ceramidszint progresszíven emelkedik az első 2 órában, majd visszatér alapszintre. Az 1,25-(OH)2D3 kezelést követően 30 perc után észlelünk leghamarabb növekedést (7 % az alapszinthez képest), ami 2 óra múlva éri el a maximális 41 %-ot (2.ábra).We also investigate the time dependence of the change in ceramide levels by 1,25- (OH) 2 D3 on HL-60 cells. As shown in Figure 2, HL-60 cells are harvested at the indicated times after treatment with 100 nM / Ι Cig / C 2 ceramide. The amount of ceramide is measured as described in the Experimental section. The results are derived from two different definitions. The vertical sections represent the standard deviation value from a single measurement. The results represent three experiments where HL-60 cells are treated with 100 nM / l 1,25- (OH) 2 D3 (which is an optimal concentration based on the dose-dependency assay shown in Figure 1), with a gradual increase in ceramide levels over the first 2 hours. , and then return to baseline. The fastest growth (7% of baseline) was observed after 30 minutes after treatment with 1,25- (OH) 2 D3, reaching a maximum of 41% after 2 hours (Figure 2).
• « ·• «·
Ezek a vizsgálatok azt mutatják, hogy az 1,25-(OH)2D3 a ceramidszintben idő- és dózisfüggő átmeneti növekedést indukál, ami bevezeti a HL-60 sejtek differenciációját (maximális ceramidképzödés a 2. órában jelentkezik, a differenciálódás fenotípusos változásai pedig a 2-4. órában). Mivel a ceramidképzödés tűnik az 1,25-(OH)2D3 kezelés hatására bekövetkező legkorábbi biokémiai változásnak, ezen eredmények a ceramid, mint lipid mediátor szerepére mutatnak rá.These studies show that 1,25- (OH) 2 D 3 induces a time- and dose-dependent transient increase in ceramide levels, which introduces HL-60 cell differentiation (maximal ceramide formation at 2 h and phenotypic changes in differentiation). in hours 2-4). As ceramide formation appears to be the earliest biochemical change following treatment with 1,25- (OH) 2 D3, these results point to the role of ceramide as a lipid mediator.
CERAMIDKÉPZÖDÉS SZFINGOMIELINBÖLCERAMIDE FORMING FROM SPINGOMIELINE
Korábbi vizsgálatok (Okazaki, T. és mtsai, supra) már kimutatták, hogy az 1,25-(OH)2D3 a szfingomielin hidrolízisét indukálja foszforil-kolin és ceramidszint egyidejű változásával, ezt a szfingomielin újraszintézise és az alapszintre való visszatérése következik be. Annak bizonyítására, hogy a ceramid valóban szfingomielinböl képződik, az elhidrolizálódott szfingomielin mennyiségét mérjük és összehasonlítjuk a képződött ceramid mennyiségével. Ahogy az a 2.ábrán látható, maximális ceramidszint a 2. órában jelentkezik és összesen 13+ 2 pM ceramid/ nM foszfolipid keletkezik. Ezután a ceramidszint a 4. órában visszatér alapszintre. A 3.ábra mutatja, hogy a teljes foszfolipidszintben (3A ábra) és a foszfatidil-kolin szintjében (3B.ábra) nem történik jelentős változás az 1,25-(OH)2D3 kezelést követő első 4 órában. A szfingomielinszint viszont 51 + 6 pM/ nM foszfolipid értékről 34+ 2 pM/ nM foszfolipid értékre csökken a 2. órában (3C ábra). A szfingomielin tömegében bekövetkező teljes változás 17+4 pM/ nM foszfolipid, ami nagyon hasonlít a ceramid mennyiségének teljes, 13 pM/ nM foszfolipid értékhez. Ezen eredmények erősen azt sugallják, hogy a ceramid a szfingomielin lebontásból származik a HL-60 sejtek 1,25-(OH)2D3 kezelése hatására. A szfingozin prekurzorok [3H]-palmitáttal való jelölése azt mutatja, hogy ezen időtartam alatt más szfingolipidekben nem történik jelentős változás 1,25(OH)2D3 kezelése hatására, és hogy a különböző szfingolipidek közül a • ·· szfingomielin raktárban jelentkezik a jelzés legnagyobb része. Ezért az valószerűtlen, hogy a ceramid más, szfingomielintől eltérő szfingolipid hidrolíziséből származhatna. Ezek a vizsgálatok azonban nem zárják ki a ceramid 1,25-(OH)2D3 kezelése hatására történő de novo szintézisét, bár ez nem valószínű a szfingomielin jelentékeny és arányos hidrolízisét figyelembe véve.Previous studies (Okazaki, T., et al., Supra) have already shown that 1,25- (OH) 2 D3 induces hydrolysis of sphingomyelin with simultaneous changes in phosphorylcholine and ceramide levels, followed by sphingomyelin re-synthesis and return to baseline. To verify that ceramide is indeed formed from sphingomyelin, the amount of sphingomyelin hydrolyzed is measured and compared with the amount of ceramide formed. As shown in Figure 2, the maximum level of ceramide occurs at hour 2 and a total of 13+ 2 pM ceramide / nM phospholipid is produced. The ceramide level then returns to baseline at 4 o'clock. Figure 3 shows no significant change in total phospholipid levels (Figure 3A) and phosphatidylcholine levels (Figure 3B) during the first 4 hours after 1,25- (OH) 2 D 3 treatment. In contrast, sphingomyelin levels decrease from 51 + 6 pM / nM phospholipid to 34+ 2 pM / nM phospholipid at hour 2 (Figure 3C). The total change in sphingomyelin weight is 17 + 4 pM / nM phospholipid, which is very similar to the total amount of ceramide in the total 13 pM / nM phospholipid. These results strongly suggest that ceramide is derived from sphingomyelin degradation by treatment with 1,25- (OH) 2 D 3 in HL-60 cells. The labeling of sphingosine precursors with [ 3 H] -palmitate shows that during this period no significant change occurs in other sphingolipids upon treatment with 1,25 (OH) 2 D 3 , and that of the various sphingolipids, the · ·· most of the signal. Therefore, it is unlikely that ceramide could be derived from hydrolysis of a sphingolipid other than sphingomyelin. However, these assays do not preclude de novo synthesis of ceramide by treatment with 1,25- (OH) 2 D 3 , although this is unlikely given the significant and proportional hydrolysis of sphingomyelin.
Ezek az eredmények azt is mutatják, hogy a HL-60 sejtekben a teljes foszfolipidszint 15,6+ 1,0 fM/ sejt, amiből 53,3+ 2,3 % PC és 5,1+0,6 % SM. Ez jó egyezést mutat a korábbi adatokkal, mely szerint a két lipid [3H]kolinnal való jelölését alkalmazva az SM/ PC arány 0,05- 0,1 (Okazaki, T. és mtsai (1989) J. Bioi. Chem. 264: 19076-19080). Ezen eredmények arra is magyarázatot adnak, hogy miért nem figyelhetünk meg jelentős változást a teljes foszfolipidszintben, hiszen az SM szintben való teljes csökkenés csak 1,5+ 2,0 %-os változásnak felel meg a teljes foszfolipidszintben.These results also show that the total phospholipid level in HL-60 cells is 15.6+ 1.0 µM / cell, of which 53.3+ 2.3% PC and 5.1 ± 0.6% SM. This is in good agreement with previous data that using the labeling of two lipids with [ 3 H] choline, the SM / PC ratio is 0.05 to 0.1 (Okazaki, T. et al. (1989) J. Biol. Chem. 264 : 19076-19080). These results also explain why no significant change in total phospholipid levels can be observed, since a total decrease in SM levels corresponds only to a change of 1.5+ to 2.0% in total phospholipid levels.
A C18/C2 CERAMID ELŐSEGÍTI AZ 1,25-(OH)2D3 HL-60 SEJTDIFFERENCIÁCIÓRA KIFEJTETT HATÁSAITC 18 / C 2 CERAMIDE PROMOTES THE EFFECTS OF 1,25- (OH) 2 D 3 HL-60 ON CELL DIFFERENCE
Kimutatták, hogy ha bakteriális szfingomielinázt, ami a membrán szfingomielin hidrolízisét és a ceramidképzödést indukálja, exogén alkalmazunk, ez lehetővé teszi, hogy az 1,25-(OH)2D3 sejtdifferenciációt indukáljon HL-60 sejtekben (Okazaki, T. és mtsai, supra). A bakteriális szfingomielináz alkalmazását azonban bonyolítja az, hogy nagyobb szfingomielináz koncentrációknál a membrán foszfatidil-kolin is hidrolizálódik, így ez korlátozza használatát.Exogenous use of bacterial sphingomyelinase, which induces membrane sphingomyelin hydrolysis and ceramide formation, has been shown to allow 1,25- (OH) 2 D 3 cell differentiation in HL-60 cells (Okazaki, T. et al. supra). However, the use of bacterial sphingomyelinase is complicated by the fact that at higher concentrations of sphingomyelinase the membrane is also hydrolyzed by phosphatidylcholine, thus limiting its use.
Ennek a problémának a megoldása céljából és azért, hogy megvizsgáljuk vajon a ceramid helyettesítheti-e a bakteriális szfingomielináz hatását, egy szintetikus sejtpermeábilis ceramidot, a C-|g/C2 ceramidot, állítunk elő, mely egy amidkötésben acetátot tartalmaz. A természetben előforduló ceramidokkal összehasonlítva a Cig/C2 ceramid 14-16 szénatommal kevesebbet tartalmaz, és így vízben jobban oldható. Azonos körülmények között a természetben előforduló, hosszú N-acil láncokkal rendelkező ceramid 50 μΜ koncentrációban nem befolyásolja a sejtnövekedést vagy a sejtdifferenciálódást, ami a hosszú N-acil láncokkal rendelkező ceramidok gyenge felvételével magyarázható.To overcome this problem and to investigate whether ceramide can replace the action of bacterial sphingomyelinase, a synthetic cell-permeable ceramide, C-g / C 2 , is prepared containing acetate in an amide bond. In comparison to the wild ceramidokkal the Cig / C2 ceramide contains less than from 14 to 16 carbon atoms, and thus more soluble in water. Under the same conditions, naturally occurring ceramide with long N-acyl chains at 50 μΜ does not affect cell growth or cell differentiation, which can be explained by poor uptake of ceramides with long N-acyl chains.
Ez a jelenség igaz a sejtpermeábilis DAG analógok pl. dioktanoilglicerol és oleoil-acetil-glicerol esetén is, melyeknek a természetben előforduló DAG-nál rövidebb acil-lácaik van. Ha HL-60 sejteket suboptimális koncentrációjú 1,25-(OH)2D3-mal (1 nM/l, ami az optimális koncentráció 100ad része) és ceramid különböző koncentrációjával egyidejűleg kezelünk, megnövekedett sejtdifferenciálódást figyelünk meg.This phenomenon holds true for cell-permeable DAG analogs e.g. and dioctanoylglycerol and oleoylacetylglycerol, which have acyl chains shorter than the naturally occurring DAG. Increased cell differentiation was observed when HL-60 cells were treated with sub-optimal concentrations of 1,25- (OH) 2D3 (1 nM / l, which is 100% of the optimal concentration) and different concentrations of ceramide.
HL-60 sejteket (2,5 x 105 sejt/ ml) különböző koncentrációjú 0ιβ/θ2 ceramiddal és 1 nM/l 1,25-(OH)2D3~mal egyidejűleg kezeljük. A sejtdifferenciálódást az NBT redukálás (vonalkázott oszlopok) és NSE aktivitás (nemvonalkázott oszlopok) alapján ítéljük meg. A Cig/C2 ceramid sejtnövekedésre gyakorolt hatását az ábrába illesztett grafikon mutatja. Az eredmények három különböző kísérleteiből származnak. A függőleges szakaszok egy meghatározásból számított standard deviációt jelentik.HL-60 cells (2.5 x 10 5 cells / mL) was treated simultaneously with various concentrations 0ιβ / θ2 ceramide and 1 nM / l 1,25- (OH) 2 D3 ~ mal. Cellular differentiation is assessed by NBT reduction (bars) and NSE activity (bars). The effect of Cig / C 2 ceramide on cell growth is shown in the graph. The results are from three different experiments. The vertical sections represent the standard deviation calculated from one definition.
Amint azt a 4. ábra mutatja a C18/C2 ceramid az 1,25-(OH)2D3-mal indukált sejtdifferenciálódást dózisfüggően növeli és maximális hatást 1 μΜnál fejt ki. A kezelést követő 4. napon 1 μΜ Cfg/C^ ceramid 11,9+ 2,9 %-ról 57,8t1,4 %-ra növeli az NBT redukáló ill. 2,2+ 0,9 %-ról 39,2± 7,2 %-ra növeli a nemspecifikus észteráz aktivitást (NSE). Ugyanebben a koncentráció tartományban a ceramid kismértékben gátolja a sejtnövekedést anélkül, hogy a sejtek életképességét jelentősen befolyásolná. A sejtek életképessége minden esetben nagyobb 80 %-nál. Bár 1 μΜ Οιβ/Ο2 ceramid kismértékben gátolja a sejtnövekedést, az NBT- és NSE-pozitív sejtek abszolút számát 0,9 x 105 sejt/ ml-ről 2,54 x 105 sejt/ ml-re ill. 0,16 x 105 sejt/ ml-röl 1,72 x 105 sejt/ ml-re növeli a kontrollokhoz képest a 4. napon.As shown in Figure 4, ceramide C18 / C2 increases dose-dependent cellular differentiation induced by 1,25- (OH) 2 D 3 and exerts its maximum effect at 1 μΜ. On the 4th day after treatment, 1 μf Cfg / C ^ ceramide increases the NBT reducing and / or NBT from 11.9+ to 2.9% to 57.8 to 1.4%. Increases non-specific esterase activity (NSE) from 2.2 + 0.9% to 39.2 ± 7.2%. At the same concentration range, ceramide slightly inhibits cell growth without significantly affecting cell viability. In all cases, cell viability is greater than 80%. Although one μΜ Οιβ / Ο ceramide 2 slightly inhibited the absolute number of cellular growth, the NBT- and NSE-positive cells 0.9 x 10 5 cells / ml to cells / ml and 2.54 x 10 5 respectively. Increases from 0.16 x 10 5 cells / ml to 1.72 x 10 5 cells / ml on day 4 compared to controls.
A SEJTPERMEÁBILIS CERAMIDOK 1,25-(OH)2D3-TÓL FÜGGETLENÜL INDUKÁLJÁK A HL-60 SEJTDIFFERENCIÁLÓDÁSTCELL PERMABIC CERAMIDES INDUCE HL-60 CELL DIFFERENCE INDEPENDENT FROM 1,25- (OH) 2D3
Az erős szinergia a küszöbérték alatti koncentrációjú 1,25-(OH)2D3 és kis koncentrációjú (100 nM/l -1 μΜ/I) Ci8/C2 ceramid között azt sugallja, hogy a C18/C2 ceramid nagyobb koncentrációnál 1,25-(OH)2D3-tól független sejtdifferenciálódást indukálhat. A szintetikus Cig/C2 ceramid sejtnövekedésre és sejtdifferenciálódásra gyakorolt hatását vizsgáljuk. A HL60 sejtek kezelése növekvő koncentrációjú C18/C2 ceramiddal a sejtnövekedés dózisfüggő gátlását eredményezi, amint ezt az 5. ábra mutatja. A különböző C18/C2 ceramid koncentrációkat a következőképpen jelöljük: o - kontroll, fekete sarkára állított négyszög -1 μΜ/I, fekete négyszög - 3 μΜ/I, fekete kör - 6 μΜ/I és fekete háromszög -10 μΜ/l. Az eredmények három különböző meghatározásból származnak. A függőleges szakaszok egy mérésből származó standard deviáció értéket jelzik. A C-|8/C2 ceramid 10 μΜ/I koncentrációja a 7. napon erős sejtpusztuláshoz vezet. A sejtpusztulás, legalábbis részben, a C-j e/C2 ceramid sejtdifferenciálódást indukáló hatásának köszönhető, nem pedig toxicitás miatt következik be, hiszen 30 %nál több sejt differenciálódik a kezelést követő 2. napra.The strong synergy subthreshold concentrations of 1,25- (OH) 2 D3 and low concentration (100 nM / l -1 μΜ / l) CI8 / C between two ceramide suggests that the C18 / C2 ceramide concentrations higher than 1 , Can induce cell differentiation independent of 25- (OH) 2D3. The effect of synthetic Cig / C 2 ceramide on cell growth and cell differentiation was investigated. Treatment of HL60 cells with increasing concentrations of C18 / C2 ceramide results in dose-dependent inhibition of cell growth, as shown in Figure 5. Various C18 / C2 ceramide concentrations are shown as follows: p - control, set the black rectangle corner μΜ -1 / I, black square - 3 μΜ / I, black circle - 6 μΜ / I and the black triangle -10 μΜ / l . The results are derived from three different definitions. The vertical sections represent the standard deviation value from a single measurement. The C- | Concentration of 8 / C 2 ceramide at 10 μΜ / L on day 7 leads to severe cell death. Cell death is due, at least in part, to the cell differentiation inducing effect of Cj e / C 2 ceramide and not to toxicity, as more than 30% of cells are differentiated by day 2 after treatment.
Amint az a 6. ábrán látható, a Ci8/C2 ceramid növekvő koncentrációja az NBT redukálóképesség és NSE aktivitás indukciója alapján a 4. napra a HL-60 sejtdifferenciálódásban progresszív növekedést eredményez. Az NBT redukálóképességet vonalkázott oszlopok, az NSE aktivitást üres oszlopok jelzik. Az eredmények három különböző kísérleteiből származnak. A függőleges szakaszok egy meghatározásból számított standard deviációt jelentik. A sejteket 4 napig különböző koncentrációjú C-|8/C2 ceramiddal kezeljük. Az NBT-pozitív sejtek 0+ 1.0%-ról 53,2+1,6 %-ra, míg az NSE• · · pozitív sejtek 1,0+ 1,9 %-ról 46,4± 6,0 %-ra nő 6 μΜ/Ι Cig/C2 ceramiddal történő kezelés után. Jelentős növekedést figyelhetünk meg a differenciálódott sejtekben még 1 μΜ/Ι Cj8/C2 ceramid koncentrációnál is.As increasing concentrations of 8 Ci / C2 ceramide is shown in Figure 6 would result in a progressive increase in reducing power according to the NBT and NSE activity in the induction of Day 4, the HL-60 cell differentiation. NBT-reducing capacity is indicated by bar columns and NSE activity is indicated by blank columns. The results are from three different experiments. The vertical sections represent the standard deviation calculated from one definition. The cells for 4 days with various concentrations of C- | 8 treated with ceramide / C 2nd NBT-positive cells from 0+ 1.0% to 53.2 + 1.6%, and NSE • · · positive cells from 1.0+ 1.9% to 46.4 ± 6.0% increase after treatment with 6 μΜ / Ι Cig / C 2 ceramide. Significant growth can be observed in differentiated cells even at 1 μΜ / Ι Cj 8 / C 2 ceramide concentration.
A ceramiddal kezelt HL-60 sejtek fenotípusának morfológiai vizsgálata azt mutatja, hogy a morfológiai változások az 1,25-(OH)2D3 által indukált monocita fenotípussal egyeznek meg. Ezek a sejtek nagy citoplazma: sejtmag aránnyal, lebenyes és excentrikus sejtmaggal jellemezhetők, és nukleáris testek ill. azurofil granulumok nem jelennek meg. A sejtek NBT-redukáló képességet és NSE aktivitást szereznek meg, ez utóbbi a monocita differenciálódás specifikus markere.Morphological examination of the phenotype of ceramide-treated HL-60 cells shows that the morphological changes are consistent with the monocyte phenotype induced by 1,25- (OH) 2 D3. These cells are characterized by a high cytoplasm: nuclear ratio, lobe and eccentric nucleus, and nuclear bodies. azurophilic granules do not appear. Cells acquire NBT-reducing ability and NSE activity, a specific marker of monocyte differentiation.
Ezt követeöen a C^8/C2 ceramid hatására bekövetkező differenciálódás idöfüggését vizsgáljuk 6 μΜ/Ι Ci8/C2 ceramidot használva optimális koncentrációként, ami maximális differenciációt eredményez és minimális sejttoxicitással bír. A sejtdifferenciálódást az NBT-redukáló képesség és az NSE aktivitás alapján ítéljük meg. Hat μΜ/Ι C-j8/C2 ceramid adagolással az NBT- és NSE-pozitív HL-60 sejtek számában progresszív növekedés tapasztalható, a kezelést követő 7. napra 61 %-ra ill. 56 %-ra nö amint ezt a 7. ábrán láthatjuk. A 7. ábrán a 6 μΜ/Ι C18/C2 ceramiddal kezelt HL-60 sejteket fekete szimbólumokkal, a kezeletlen sejteket üres szimbólumokkal jelöljük. Az NBT-redukáló képességet körökkel jelöljük. Az NSE aktivitást négyszögekkel jelöljük.This differentiation követeöen assayed in the C ^ 8 / C2 ceramide 6 as a result of time dependency of μΜ / Ι 8 Ci / C2 ceramide as an optimal concentration, which results in maximal differentiation and cell toxicity is minimal. Cell differentiation is judged by NBT-reducing ability and NSE activity. At six μΜ / Ι Cj 8 / C 2 ceramide doses, there was a progressive increase in the number of NBT- and NSE-positive HL-60 cells, up to 61% and 7 days after treatment. To 56% as shown in Figure 7. Figure 7 18 / C2 ceramide-treated HL-60 cells were labeled empty symbols 6 μΜ / C Ι black symbols, untreated cells. NBT-reducing ability is indicated by circles. NSE activity is represented by rectangles.
Ezek az eredmények azi mutatják, hogy a C-|8/C2 ceramid egyedül adagolva képes a HL-60 sejtek differencióját indukálni monocita fenotípusú sejtekké, 6 μΜ/Ι Cfg/C2 ceramid az 1,25-(OH)2D3-hoz hasonló hatékonysággal bír. Optimális, 100 nM/l koncentrációnál a Οΐβ/Ο2 ceramid a sejtek 74+6 %-ában NBT-redukáló képességet ill. 51+ 4%-ában NSE aktivitást indukál összehasonlítva a Ci^C2 ceramidra kapott 53,2+ 1,6 % és 46,4+ 6 % értékekkel a 4. napon.These results show that C- Ceramide 8 / C 2 alone can induce the differentiation of HL-60 cells into cells with a monocyte phenotype, with 6 μΙ / Ι Cfg / C 2 having similar efficacy to 1,25- (OH) 2 D 3 . At an optimum concentration of 100 nM / L, ceramide Οΐβ / 74 2 was found to reduce NBT-reducing ability or 74 + 6% of cells. 51 + 4% induces NSE activity compared to 53.2+ 1.6% and 46.4+ 6% for C 1 -C 2 ceramide on day 4.
Ahogy azt a 8. ábra mutatja, a C18/C2 ceramid HL-60 sejtekhez való adása nem módosítja a szfingomielin celluláris szintjét. A jelzett időpontokban a HL-60 sejteket 5 μΜ/Ι Ci8/C2 ceramiddal kezeljük. A szfingomielint a Kísérleti részben ismertetett módon extraháljuk és mérjük. Az adatokat a kontroll %-ában (C18/C2 ceramid hozzáadása nélkül) fejezzük ki. A függőleges szakaszok egy meghatározásból számított standard deviációt jelentik. Az eredmények két különböző kísérletetből származnak. Az eredmények erősen azt sugallják, hogy a ceramid és a bakteriális szfingomielináz (SMáz) HL-60 sejtek differencióját a ceramid közvetíti és nem az SM szintben történő változások.As shown in Figure 8, addition of C18 / C2 ceramide to HL-60 cells does not alter the cellular level of sphingomyelin. At the times indicated in the HL-60 cells treated with 5 μΜ / Ι 8 Ci / C2 ceramide. Sphingomyelin is extracted and measured as described in the Experimental section. Data are expressed as% of control (without addition of C18 / C2 ceramide). The vertical sections represent the standard deviation calculated from one definition. The results are from two different experiments. The results strongly suggest that the difference in ceramide and bacterial sphingomyelinase (SMase) HL-60 cells is mediated by ceramide and not by changes in SM levels.
A ceramid, mint második hírvivő szerepének további tisztázása céljából azt vizsgáljuk, hogy vajon a HL-60 sejteknek ceramiddal való rövid inkubálása elegendő-e differenciáció indukálásához. A C18/C2 ceramidot sejtekhez adva ismételt mosásokkal ismét visszavihetjük a tápközegbe, így 3 mosás után az eredeti Cig/C2 ceramid mennyiségnek kevesebb, mint 20 %-a marad a sejtpellettel asszociálva.To further clarify the role of ceramide as a second messenger, we investigate whether brief incubation of HL-60 cells with ceramide is sufficient to induce differentiation. C18 / C2 ceramide repeated washings added to cells may be applied again to the medium, so that after 3 washes less than 20% of the original Cig / C2 ceramide quantity remains sejtpellettel associated.
Mivel az 1,25-(OH)2D3 az endogén ceramidszint növekedését eredményezi kb. 2 óra elteltével, a HL-60 sejteket C18/C2 ceramiddal (0,5- 2 μΜ/Ι) inkubáljuk 2 órán át. A C18/C2 ceramidot kivonjuk és a differenciálódást értékeljük. A sejteket ceramid nélkül vagy C18/C2 ceramiddal (0,5,1 vagy 2 μΜ/Ι) 2 órán át (9. és 10. ábra) vagy 4 órán át (10. ábra) kezeljük, háromszor RPM11640 tápközegben mossuk, majd szérummentes RPM11640 tápközegben szuszpendáljuk fel. A jelzett napon (9. ábra) vagy a negyedik napon (10. ábra) a differenciálódást az NBT redukcióképesség alapján mérjük a Kísérleti részben ismertetett módon. A függőleges szakaszok egy meghatározásból számított standard deviációt jelentik. A 9. ábrán az üres körök 0 μΜ/Ι C18/C2 ceramidot jelentenek. A fekete háromszögek 0,5 μΜ/Ι 0^8^2 ceramidot jelentenek. A fekete négyszögek 1 μΜ/Ι C18/C2 ceramidot jelentenek. A fekete körök 2 μΜ/Ι C18/C2 ceramidot jelentenek. A 10. ábrán a 10 és 0 μΜ/Ι C-ig/Cg ceramidot üres oszlopokkal jelöljük. A 0,5 μΜ/Ι C-igA^ ceramidot függőlegesen satírozott oszlopokkal jelöljük. Az 1 μΜ/Ι C18/C2 ceramidot ferdén satírozott oszlopokkal jelöljük. A 2μΜ/Ι C-18/C2 ceramidot ferdén satírozott oszlopokkal jelöljük. Az eredmények két különböző kísérleteiből származnak. A C-ig/Cz ceramid (1 vagy 2 μΜ/Ι) a HL-60 sejtek jelentős mértékű differenciálódását eredményezi ilyen körülmények között (9. ábra) jelezvén, hogy a HL-60 sejtek 2 órás kezelése C18/C2 ceramiddal elegendő a differenciálódás indukálásához. Négy órás kezelés nem eredményez további jelentős differenciálódást (10. ábra). Ezen vizsgálatok jelzik, hogy a HL-60 sejtek rövid ideig tartó kezelése emelt ceramidszintekkel elegendő a sejtek differenciálódásra való elkötelezettségéhez.Since 1,25- (OH) 2D3 results in an increase in endogenous ceramide levels of approx. After 2 hours, HL-60 cells were incubated with C18 / C2 ceramide (0.5-2 μΜ / Ι) for 2 hours. 18 C / C2 ceramide is extracted and evaluated differentiation. Cells were treated with C18 / C2 (0.5.1 or 2 μΜ / Ι) without ceramide for 2 hours (Figs. 9 and 10) or 4 hours (Fig. 10), washed three times in RPM11640 medium and then serum free. Suspended in RPM11640 medium. On the indicated day (Figure 9) or on the fourth day (Figure 10), differentiation is measured by the NBT reduction capacity as described in the Experimental section. The vertical sections represent the standard deviation calculated from one definition. In Figure 9, the empty circles represent 0 μΜ / Ι C18 / C2. The black triangles represent 0.5 μΜ / Ι 0 ^ 8 ^ 2 ceramide. Black rectangles represent 1 μΜ / Ι C18 / C2 ceramide. The black circles represent 2 μΜ / Ι C18 / C2 ceramide. In Figure 10, ceramide 10 and 0 μΜ / Ι C / Cg are indicated by blank columns. Ceramide at 0.5 μ ig / Ι C is labeled with vertically shaded columns. The 1 μΜ / Ι C18 / C2 ceramide is labeled with oblique shaded columns. Ceramic 2μΜ / Ι C-18 / C2 is marked with oblique columns. The results are from two different experiments. Cig / Cz ceramide (1 or 2 μΜ / Ι) results in significant differentiation of HL-60 cells under these conditions (Fig. 9), indicating that 2 h treatment of HL-60 cells with C18 / C2 is sufficient for differentiation. To induce. Four hours of treatment do not result in further significant differentiation (Figure 10). These studies indicate that short term treatment of HL-60 cells with elevated ceramide levels is sufficient for cellular commitment to differentiation.
CERAMID ÉS SZFINGOZIN ANALÓGOK HATÁSA A D3-INDUKÁLT HL-60 SEJTDIFFERENCIÁLÓDÁSRAEFFECT OF CERAMIDE AND SPINGINGOSIN ANALOGIES ON D3-INDUCED HL-60 CELL DIFFERENCE
A szfingozin a protein-kináz C farmakológiai inhibitora in vitro és különböző sejtes rendszerekben. Mivel a ceramid savas és/vagy neutrális ceramidázokkal szfingozinná metabolizálható, megvizsgáljuk , hogy a ceramid HL-60 sejtekre való hatása a szfingozinképződésnek tulajdonítható-e. A HL-60 sejtek 1,25-(OH)2D3-mal való kezelése során szfingozin nem mutatható ki. Továbbá, a C18/C2 ceramid HL-60 sejtekhez adása nem eredményez kimutatható szfingozinképződést. Ezekhez a kísérletekhez a C18/C2 ceramidot [3H]-mal jelöljük a szfingozin bázis harmadik szénatonján. A sejteket (5x10® sejt/ ml) 4 μΜ/Ι [3Η]-Οΐβ/Ο2 ceramiddal (1 x 105 cpm/ ml) jelöljük. A C18/C2 ceramidot etanolban alkalmazzuk. A [3Η]-0ΐ8/θ2 ceramid HL-60 sejtekhez való adása a jelzett C18/C2 ceramid azonnali felvételét eredményezi, de szfingozinná való átalakulása nem történik amint ez a 11. és 12. ábrán látható. A C-tg/Cz ceramid kb. 20 %-ának felvétele következik be a kezelést követő 0,5 órában.Sphingosine is a pharmacological inhibitor of protein kinase C in vitro and in various cellular systems. Since ceramide can be metabolized to sphingosine by acidic and / or neutral ceramidases, it is examined whether the effect of ceramide on HL-60 cells can be attributed to sphingosine formation. No sphingosine was detected during treatment of HL-60 cells with 1,25- (OH) 2D3. Furthermore, addition of C18 / C2 ceramide to HL-60 cells does not result in detectable sphingosine formation. For these experiments, C18 / C2 ceramide is labeled with [ 3 H] on the third carbon atom of the sphingosine base. Cells (5x10® cells / ml) labeled 4 μΜ / Ι [3 Η] -Οΐβ / Ο2 ceramide (1 x 10 5 cpm / ml). C18 / C2 ceramide is used in ethanol. Addition of [ 3 Η] -0ΐ8 / θ2 ceramide to HL-60 cells results in immediate uptake of labeled C18 / C2 ceramide, but does not convert to sphingosine as shown in Figures 11 and 12. The C-tg / Cz ceramide was ca. 20% is taken up within 0.5 hours of treatment.
A ceramid maradéka (80 %) a tápközegben változatlanul marad. A 11. ábra egy TLC lemezről készült autoradiográfiás képet mutat (24 órás expozíció). ACeramide residue (80%) remains unchanged in the medium. Figure 11 shows an autoradiographic image of a TLC plate (24 hour exposure). THE
12. ábrán a lipideket extraháljuk, TLC lemezen választjuk el és a radioaktivitást mérjük amint ezt a Kísérleti részben ismertettük. A ceramidot üres körök jelzik. A szfingomielint üres négyszögekkel jelöljük. A szfingozint fekete körök jelzik.In Figure 12, the lipids are extracted, separated on a TLC plate and the radioactivity is measured as described in the Experimental section. Ceramide is indicated by blank circles. Sphingomyelin is indicated by blank rectangles. Sphingosine is indicated by black circles.
Az 1,25-(OH)2D3 hozzáadása Cig/C2 ceramiddal jelzett sejtekhez sem eredményez szfingozin képződést. A jelzés kis %-a szfingomielinné alakul (2,8 % 12 órás jelölés után). Ezen vizsgálatok azt mutatják, hogy az 1,25(0H)2D3 nem vezet szfingozin képződéshez, és azt, hogy ha exogén ceramid analógokat sejtekhez adjuk (1,25-(OH)2D3 jelenlétében vagy anélkül), azok nem alakulnak át szfingozinná.The addition of 1,25- (OH) 2 D 3 to cells labeled with Cig / C 2 ceramide does not result in sphingosine formation either. A small percentage of the mark is converted to sphingomyelin (2.8% after 12 hour mark). These studies show that 1,25 (0H) 2 D3 does not lead to sphingosine formation and that when exogenous ceramide analogs are added to cells (with or without 1,25- (OH) 2 D3), they do not convert to sphingosine .
A szfingozin lassan metabolizálódik HL-60 sejtekben és elsősorban ceramidok és más szfingolipidek formájában épülnek be (Merrill, A. H. és mtsai (1986) J. Bioi. Chem. 261: 12610-12615). A fenti vizsgálatok azonban nem zárják ki a ceramidból képződő szfingozin gyors metabolizmusát, amit a fenti eljárásokkal nem tudunk kimutatni. Mivel a szfingozin szerepét kívánjuk meghatározni a ceramid hatásainak közvetítésében, ezért megvizsgáljuk azt, hogy a szfingozin képes-e a ceramid működését utánozni.Sphingosine is slowly metabolized in HL-60 cells and is mainly incorporated in the form of ceramides and other sphingolipids (Merrill, A.H. et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 12610-12615). However, the above assays do not exclude the rapid metabolism of ceramide-derived sphingosine, which cannot be detected by the above procedures. To determine the role of sphingosine in mediating the effects of ceramide, we investigate whether sphingosine can mimic the function of ceramide.
Amint azt a 13. ábra mutatja, mikor HL-60 sejteket különböző koncentrációjú szfingozinnal és szuboptimális mennyiségű 1,25-(OH)2D3-mal (1 nM/Ι) egyidejűleg kezelünk 4 napig, az NBT-redukáló képesség és az NSE aktivitás nem változik a kontrolihoz képest. A HL-60 sejteket (2,5 x 105 sejt/ ml) különböző koncentrációjú szfingozinnal kezeljük 4 napig 1 nM/l 1,25(OH)2D3 jelenlétében. A sejtdifferenciálódást az NBT-redukáló képesség (vonalkázott oszlopok) és az NSE aktivitás (üres oszlopok) alapján ítéljük meg. A szfingozin hatását a HL-60 sejtek növekedésére az ábrába beillesztett grafikon mutatja. Az eredmények három különböző kísérleteiből származnak. A függőleges szakaszok egy meghatározásból számított standard deviációt jelentik.As shown in Figure 13, when HL-60 cells were simultaneously treated with various concentrations of sphingosine and suboptimal amounts of 1,25- (OH) 2 D3 (1 nM / Ι) for 4 days, NBT-reducing ability and NSE activity does not change compared to control. The HL-60 cells (2.5 x 10 5 cells / ml) were treated with various concentrations of sphingosine for 4 days at 1 nM / l 1,25 (OH) 2 D3 in the presence of. Cell differentiation is assessed by NBT-reducing ability (bared columns) and NSE activity (empty columns). The effect of sphingosine on the growth of HL-60 cells is shown in the graph. The results are from three different experiments. The vertical sections represent the standard deviation calculated from one definition.
Ezen vizsgálatok mutatják, hogy a szfingozin nem növeli az 1,25(OH)2D3 HL-60 sejtdifferenciálódást indukáló képességét, mely éles megkülönböztetést jelent a ceramid hatásától (hasonlítsa össze a 4. és 13. ábrákat). A [3H]-szfingozint a HL-60 sejtek hatékonyan felveszik mutatva, hogy a szfingozin hatástalansága nem a rossz felvételének köszönhető. Továbbá, a szfingozin valóban lelassítja a HL-60 sejtek növekedését (13. ábra tetején beillesztett grafikon) olyan szintre, ami összehasonlítható a Cie/C2 ceramiddal elért hatással jelezvén, hogy a szfingozin celluláris hatása a sejtdifferenciációtól eltérő. A szfingozin azon képessége, hogy lelassítja a HL-60 sejtek növekedését anélkül, hogy elősegítené a sejtdifferenciálódást, alátámasztja azt az elképzelést, miszerint a ceramid a sejtdifferenciálódás indukálását a HL-60 sejtek sejtnövekedési sebességétől függetlenül végzi. A ceramid sejtdifferenciálódásban lévő, a szfingozintól független szerepének további bizonyítása végett szintetikus ceramid és szfingozin analógokat állítunk elő és vizsgáljuk, hogy képesek-e a HL-60 sejtek differenciálódást növelni szuboptimális koncentrációjú 1,25-(OH)2D3 jelenlétében. Az 1. táblázat mutatja, hogy a C^Cq ceramid és a Cig/C2 ceramid is jelentős növekedést eredményez az NBT-redukáló képességben és az NSE aktivitásban a 100 nM/l 1,25-(OH)2D3 alkalmazása esetén megfigyelt értékhez képest. A Cj f/Cg ceramid is jelentősen növeli az NBT-redukáló képességet és az NSE aktivitást. A C^/Cg ceramiddal végzett vizsgálatoknak jelentős szerepük van a szfingozin szerepének kizárása miatt. A C-n/Cg ceramid deacilálása olyan Cn-Sz^,n9oz'n analógot eredményezhet, melyről már kimutatták, hogy nem rendelkezik a szfingozin in vitro és celluláris hatásaival (Norjiri, H. és mtsai, supra).These studies show that sphingosine does not increase the ability of 1,25 (OH) 2 D 3 HL-60 to induce cell differentiation, which is a sharp distinction from the effect of ceramide (compare Figures 4 and 13). [ 3 H] Sphingosine is efficiently uptake by HL-60 cells, indicating that ineffectiveness of sphingosine is not due to poor uptake. Furthermore, sphingosine actually slows the growth of HL-60 cells (graph plotted at the top of Figure 13) to a level comparable to that achieved with Cie / C 2 ceramide, indicating that the cellular effect of sphingosine is different from cellular differentiation. The ability of sphingosine to slow the growth of HL-60 cells without promoting cell differentiation supports the notion that ceramide induces cell differentiation independently of the cell growth rate of HL-60 cells. To further demonstrate the role of ceramide in cell differentiation, sphingosine-independent syntheses, synthetic ceramide and sphingosine analogs were prepared and tested for their ability to increase HL-60 differentiation in the presence of suboptimal 1,25- (OH) 2 D 3 . Table 1 shows that both C 1 -C 4 ceramide and C 8 / C 2 ceramide result in significant increases in NBT-reducing ability and NSE activity observed with 100 nM / l 1,25- (OH) 2 D 3 value. Cj f / Cg ceramide also significantly increases NBT-reducing ability and NSE activity. Studies with C ^ / Cg ceramide play a significant role in excluding the role of sphingosine. The Cn / Cg ceramide deacylation may result in a CN W ^, n 9 oz 'N analog, already has been shown to not have the in vitro and cellular effects of sphingosine (Norjiri, H. et al, supra).
···· · ·
i co táblázat Különböző szfingolipidek hatása 1 nM/1 1,25-(011) D (Ci co Table Effect of various sphingolipids 1 nM / l 1,25- (011) D (C
Ul 'β ω '0 <—i '(C •H o c φ LíUl 'β ω' 0 <—i '{C • H o c φ Lí
VV
U-i ς-ι •HU-i ς-ι • H
Λ3 ΦΛ3 Φ
4J •m4J • m
ΦΦ
CD o oCD o o
4J r-í4J r-i
ΦΦ
N Φ vN Φ v
ni Ξ > •H 4=T dPni Ξ> • H 4 = T dP
NN
C Λ4 a φC Λ4 a φ
I 4J K *m CS Φ z ω > •HI 4J K * m CS Φ z ω> • H
4-> •H4-> • H
N o a i C-i dφN o a i C-i dφ
4-1 •m e tt4-1 • m e tt
N tt 4JN tt 4J
•r->• r->
e κ u. — •C '0 Ή Ή z o •h -rí <—I ’-J —O 44 r-H ~ c c φ z •H 0 2 <44 C — N 0 CC Aí ω Ό i—1e κ u. - • C '0 Ή Ή z o • h -rí <—I' -J -O 44 r-H ~ c c φ z • H 0 2 <44 C - N 0 CC Aí ω Ό i — 1
ΦΦ
N Φ :<N Φ: <
in in • · <N CNin in • · <N CN
HL-60 sejteket (2,5 x 10bsej t/iul) a jelzett lipiddel és küszöbérték alatti koncentrációjú 1,25-(OH )? D3 (1 nM/l)-inal egyidejűleg kezelünk 4 napig. Az eredmények három meghatározásból származnak. A csillagok azt jelzik, hogy a kontrolitól ( 1 nM/1 1,25-(OH)2O3)való eltérés jelentős p<^O,Oi.HL-60 cells (2.5 x 10 b cells / ml) with the labeled lipid and below the threshold concentration of 1,25- (OH)? D 3 (1 nM / L) -inal was treated simultaneously for 4 days. The results are derived from three determinations. The asterisks indicate that the deviation from the control (1 nM / l 1,25- (OH) 2 O 3 ) is significant p <0.01.
*· ·· · . · ···;* · ·· ·. · ···;
:·% .· ·· *: ·%. · ·· *
Másfelől a szfingozin nem indukál jelentős változást a sejtdifferenciálódás két paraméterében. Hasonló eredményekről szfingozin kapcsán már beszámoltak (Stevens, V. L. és mtsai (1989) Cancer Rés. 49: 3229- 3234). Továbbá, az N-etil-szfingozin, ami a protein-kináz C hatékony inhibitora, nem növeli jelentősen az NBT-redukáló képességet és az NSE aktivitást az alapszinthez képest. Ezen vizsgálatok azt mutatják, hogy a ceramidszármazékok a szfingozinszármazékokkal szemben növelik az 1,25(OH)2D3 hatására bekövetkező HL-60 sejtdifferenciálódást.On the other hand, sphingosine does not induce a significant change in the two parameters of cell differentiation. Similar results have already been reported for sphingosine (Stevens, VL et al. (1989) Cancer Rev. 49: 3229-3234). Furthermore, N-ethyl sphingosine, a potent inhibitor of protein kinase C, does not significantly increase NBT-reducing ability and NSE activity from baseline. These studies show that ceramide derivatives increase HL-60 cellular differentiation to sphingosine derivatives by 1,25 (OH) 2 D3.
Korábbi vizsgálatokban felfedezték, hogy HL-60 sejtekben az 1,25(OH)2D3 a szfingomielin hidrolízisét eredményezi ceramid és foszforil-kolin egyidejű képződésével együtt, ami a szfingomielin ciklus szabályozása alatt áll (Okazaki, T. és mtsai (1989) J. Bioi. Chem. 254:19076-19080). Feltétezték, hogy a szfingomielin hidrolízise szerepet játszik a HL-60 sejtek differenciálódásában, mivel exogén bakteriális szfingomielináz adagolása elősegíti az 1,25-(OH)2D3 küszöbérték alatti koncentrációjának hatására bekövetkező HL-60 sejtdifferenciálódást.Previous studies have found that in HL-60 cells, 1,25 (OH) 2 D3 results in hydrolysis of sphingomyelin with the simultaneous formation of ceramide and phosphorylcholine, which is regulated by the sphingomyelin cycle (Okazaki, T. et al. (1989) J. Bioi. Chem. 254: 19076-19080). It has been suggested that hydrolysis of sphingomyelin plays a role in the differentiation of HL-60 cells since administration of exogenous bacterial sphingomyelinase promotes HL-60 cell differentiation upon exposure to a concentration below 1,25- (OH) 2 D3.
A bejelentők arra jöttek rá, hogy a ceramid lipid-mediátorként működik közvetítve az 1,25-(OH)2D3 hatására bekövetkező HL-60 sejtdifferenciálódást. Kis koncentrációjú ceramid (100 nM/l - 3 μΜ/Ι) növeli az 1,25-(OH)2D3 küszöbérték alatti koncentrációjának hatására bekövetkező HL-60 sejtdifferenciálódást. Még fontosabban az, hogy a ceramid nagyobb koncentrációban (1-6 μΜ/Ι) képes indukálni a HL-60 sejtdifferenciálódást 1,25-(OH)2D3 jelenléte nélkül. A differenciálódott HL-60 sejtek fenotípusa erősen emlékeztet az 1,25-(OH)2D3 hatására létrejövő monocita fenotípusra. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a ceramid nélkülözhetetlen szerepet játszik az 1,25-(OH)2D3 hatására bekövetkező sejtdifferenciálódás közvetítésében. Továbbá, a C18/C2 ceramid hatásosnak bizonyul sejtdifferenciálódás indukálásában akkor is, ha a sejteket csak 2 óráig kezeljük. Ez azt mutatja, hogy az 1,25-(OH)2D3 hatására képződő ceramid elegendő sejtdifferenciálódás indukálására. Mivel a sejtekhez adott ceramid kb. 20 %-át veszik fel a sejtek, ezen eredmények azt is jelzik, hogy a C18/C2 ceramid hatásos koncentrációja a nM tartományba esik (20-1000 nM/l).Applicants have discovered that ceramide acts as a lipid mediator to mediate HL-60 cell differentiation by 1,25- (OH) 2 D3. Low concentrations of ceramide (100 nM / l - 3 μΜ / Ι) increase HL-60 cell differentiation induced by the concentration of 1,25- (OH) 2 below the D3 threshold. More importantly, ceramide is able to induce HL-60 cell differentiation at higher concentrations (1-6 μΜ / nélkül) in the absence of 1,25- (OH) 2 D3. The phenotype of differentiated HL-60 cells closely resembles the monocyte phenotype produced by 1,25- (OH) 2 D3. These results suggest that ceramide plays an essential role in mediating cellular differentiation by 1,25- (OH) 2 D3. Furthermore, the C 18 / C 2 ceramide prove effective in inducing cell differentiation even if cells are treated for only 2 hours. This indicates that the ceramide formed by 1,25- (OH) 2D3 is sufficient to induce cell differentiation. Since the ceramide added to the cells is ca. 20% of the cells are taken up, these results also indicate that the effective concentration of C18 / C2 ceramide is in the nM range (20-1000 nM / l).
Jelenleg a bejelentők még nem ismerik, hogy a ceramid milyen mechanizmussal közvetíti az 1,25-(OH)2D3 hatására bekövetkező sejtdifferenciálódást. A ceramid működésére alkalmas célpontot még nem azonosítottak. Mivel a ceramid szfingolipidek és a szfingozin prekurzoraként szolgálhat, működése metabolitokkal is közvetíthető. A gangliozid GM3~ról leírták, hogy növeli a forbol-észterek hatására létrejövő HL-60 sejtdifferenciálódást és a monocita vonalon történő sejtdifferenciálódást (Norjiri, H. és mtsai (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 782- 786). A ceramidok gangliozidok pl. GM3 prekurzoraként szolgálhat. Az 1,25-(OH)2D3 azonban nem módosítja a GM3-t (Norjiri, H. és mtsai, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 83: 782- 786), és a bejelentők szerint nagyon kis mennyiségű ceramid alakul át ganglioziddá. Továbbá, a HL-60 sejtek ceramidra adott dózisválasza sokkal kisebb, mint amit a GM3 esetén megállapítottak (növelve annak az esélyét, hogy a GM3 működése a ceramiddá történő lebomlásának köszönhető).Applicants are not yet aware of the mechanism by which ceramide mediates cellular differentiation by 1,25- (OH) 2D3. A target for ceramide function has not yet been identified. Since ceramide may serve as a precursor of sphingolipids and sphingosine, its function may also be mediated by metabolites. Ganglioside GM3 has been reported to increase cellular differentiation of HL-60 by phorbol esters and cell differentiation on the monocyte line (Norjiri, H. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 782-786). Ceramides are gangliosides, e.g. It can serve as a precursor to GM3. However, 1,25- (OH) 2 D3 does not modify GM3 (Norjiri, H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 83: 782-786), and according to the applicants an amount of ceramide is converted to ganglioside. Furthermore, the dose response of HL-60 cells to ceramide is much lower than that observed for GM3 (increasing the likelihood of GM3 being degraded to ceramide).
A ceramid a szfingozin prekurzoraként is szolgálhat, ami neutrális vagy savas ceramidázokkal való egylépéses hidrolízissel lehetséges. A bejelentők eredményei ellentmondanak annak, hogy a szfingozin közvetíti a ceramid hatásait. Ez a következőkkel bizonyítható: 1) szfingozin nem mutatható ki 1,25-(OH)2D3 működése során HL-60 sejtekben, 2) a szfingozin nem növeli az 1,25-(OH)2D3 hatására bekövetkező HL-60 sejtdifferenciálódást és nem eredményezi a HL-60 sejtek monocitákká történő differenciálódását önmagában sem, 3) más ceramidszármazékokkal szemben a szfingozin és rokon analógja, az N-etil-szfingozin nem növeli az 1,2536 (OH)2D3 hatására bekövetkező sejtdifferenciálódást, és 4) a C-ι -j/Cg ceramid, melynek hidrolízise olyan rövidláncú szfingozint eredményez, ami nem gátolja a protein-kináz C-t (Merril, A. H. és mtsai, (1989) Biochemistry 28: 31383145) ugyanolyan hatásos, mint a 018/θ2 ceramid a sejtdifferenciálódás indukálásában.Ceramide can also serve as a precursor of sphingosine, which is possible by one-step hydrolysis with neutral or acidic ceramidases. Applicants' findings contradict that sphingosine mediates the effects of ceramide. This can be demonstrated by: (1) sphingosine not being detected by 1,25- (OH) 2D3 in HL-60 cells, (2) sphingosine not increasing or causing HL-60 cell differentiation by 1,25- (OH) 2D3 the differentiation of HL-60 cells into monocytes alone, 3) unlike other ceramide derivatives, sphingosine and its related analogue, N-ethyl sphingosine, do not increase cellular differentiation by 1,2536 (OH) 2 D3, and 4) C-ι j / Cg ceramide, which hydrolysis yields a lower sphingosine, which is not an inhibitor of protein kinase C (Merril, AH et al, (1989) Biochemistry 28: 31383145) is as effective as 0 18 / θ2 ceramide cell differentiation induction.
A Cn/C8 ceramiddal végzett vizsgálatoknak igen jelentős szerepük van a szfingozin fontos szerepének kizárása miatt. A C-ji/Cg ceramid deacilálása olyan Cn-szfingozin analógot eredményezhet, melyről már kimutatták, hogy nem rendelkezik a szfingozin in vitro és celluláris hatásaival (Norjiri, H. és mtsai, supra).Studies with Cn / C8 ceramide play a very important role in excluding the important role of sphingosine. Deacylation of C? / Cg ceramide may result in a Cn-sphingosine analog that has been shown to have no in vitro and cellular effects of sphingosine (Norjiri, H. et al., Supra).
Mivel e két reakcióút léte nem valószínű, a ceramid más célpontjai közvetíthetik működését. A szfingomielin celluláris raktárként szolgál a szfingomielinázok részére, hogy azok ceramidot termeljenek, mely egy potenciális lipid-mediátor (második hírvivő) ahhoz hasonlóan, ahogy a glicerolipidek celluláris raktárként szolgálnak a foszfolipáz C részére, hogy az diacil-glicerol második hírvivőt termeljenek.Since these two pathways are unlikely to exist, other targets of ceramide may mediate their function. Sphingomyelin serves as a cellular repository for sphingomyelinases to produce ceramide, a potential lipid mediator (second messenger), just as glycerolipids serve as a cellular repository for phospholipase C to produce diacylglycerol as a second messenger.
Claims (30)
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US56697890A | 1990-08-13 | 1990-08-13 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HU9300375D0 HU9300375D0 (en) | 1993-05-28 |
HUT65932A true HUT65932A (en) | 1994-07-28 |
Family
ID=24265249
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9300375A HUT65932A (en) | 1990-08-13 | 1991-08-13 | Methods for inducing cell differentiation using ceramides |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0543922A4 (en) |
JP (1) | JPH05508863A (en) |
KR (1) | KR970004038B1 (en) |
AU (1) | AU653363B2 (en) |
BR (1) | BR9106744A (en) |
CA (1) | CA2089001A1 (en) |
HU (1) | HUT65932A (en) |
WO (1) | WO1992003129A1 (en) |
Families Citing this family (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR2690343B1 (en) * | 1992-04-28 | 1995-09-01 | Inocosm Laboratoires | ANTI-RADICAL AND ANTI-LIPOPEROXIDANT COMPOSITION. |
US5631394A (en) * | 1994-02-02 | 1997-05-20 | The Liposome Company, Inc. | Pharmaceutically active ceramide-related compounds |
US5948820A (en) * | 1994-08-22 | 1999-09-07 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Benzene compound and pharmaceutical use thereof |
JP3870419B2 (en) * | 1994-08-22 | 2007-01-17 | 三菱ウェルファーマ株式会社 | Benzene compounds and their use as pharmaceuticals |
FR2747308B1 (en) * | 1996-04-11 | 1998-07-10 | Shrivastava Ravi | ASSOCIATION OF MARGOUSIER, (-) HYDROXYCITRATE AND CERAMIDES AND COMPOSITIONS CONTAINING THEM |
KR19980034991A (en) | 1996-11-11 | 1998-08-05 | 안용찬 | Non-natural ceramide-related compounds and external skin preparations containing them |
NL1022443C2 (en) | 2003-01-20 | 2004-07-22 | Tno | Sphingolipids for improving the composition of the intestinal flora. |
ES2325260T3 (en) | 2003-01-20 | 2009-08-31 | Nederlandse Organisatie Voor Toegepast-Natuurwetenschappelijk Onderzoek Tno | USE OF SPHINGOLIPIDS TO REDUCE THE LEVELS OF TRIACILGLYCEROL AND CHOLESTEROL IN PLASMA. |
EP1618876A1 (en) * | 2004-07-19 | 2006-01-25 | Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO | Use of sphingolipids for prevention and treatment of atherosclerosis |
ATE539741T1 (en) | 2004-11-30 | 2012-01-15 | Tno | SPHINGOLIPIDS IN THE TREATMENT AND PREVENTION OF HEPATIC STEATosis |
EP1661562A1 (en) * | 2004-11-30 | 2006-05-31 | Nederlandse Organisatie voor toegepast-natuurwetenschappelijk Onderzoek TNO | Sphingolipids in treatment and prevention of steatosis |
JP2016188180A (en) * | 2015-03-30 | 2016-11-04 | 株式会社東洋新薬 | Composition containing specific component |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4816450A (en) * | 1986-09-15 | 1989-03-28 | Duke University | Inhibition of protein kinase C by long-chain bases |
JP2588729B2 (en) * | 1987-10-05 | 1997-03-12 | 塩野義製薬株式会社 | Sphingosine derivative |
-
1991
- 1991-08-13 CA CA002089001A patent/CA2089001A1/en not_active Abandoned
- 1991-08-13 WO PCT/US1991/005743 patent/WO1992003129A1/en not_active Application Discontinuation
- 1991-08-13 HU HU9300375A patent/HUT65932A/en unknown
- 1991-08-13 AU AU84960/91A patent/AU653363B2/en not_active Ceased
- 1991-08-13 KR KR1019930700372A patent/KR970004038B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-08-13 BR BR919106744A patent/BR9106744A/en unknown
- 1991-08-13 EP EP19910915805 patent/EP0543922A4/en not_active Withdrawn
- 1991-08-13 JP JP91514680A patent/JPH05508863A/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05508863A (en) | 1993-12-09 |
EP0543922A4 (en) | 1993-07-28 |
WO1992003129A1 (en) | 1992-03-05 |
EP0543922A1 (en) | 1993-06-02 |
CA2089001A1 (en) | 1992-02-14 |
BR9106744A (en) | 1993-07-20 |
AU8496091A (en) | 1992-03-17 |
KR970004038B1 (en) | 1997-03-24 |
HU9300375D0 (en) | 1993-05-28 |
AU653363B2 (en) | 1994-09-29 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Lavie et al. | Activation of phospholipase D by sphingoid bases in NG108-15 neural-derived cells. | |
Okazaki et al. | Role of ceramide as a lipid mediator of 1 alpha, 25-dihydroxyvitamin D3-induced HL-60 cell differentiation. | |
CA1307466C (en) | Inhibition of protein kinase c by long-chain bases | |
Lin et al. | Unique lipids of primate spermatozoa: desmosterol and docosahexaenoic acid. | |
Wertz | The nature of the epidermal barrier: biochemical aspects | |
Zelenka | Lens lipids | |
HUT65932A (en) | Methods for inducing cell differentiation using ceramides | |
AU756008B2 (en) | Methods for treating conditions modulated by lactosylceramide | |
US6127578A (en) | Method of altering sphingolipid metabolism and detecting fumonisin ingestion and contamination | |
US5583160A (en) | Methylsphingosine used to treat apoptosis | |
Magrassi et al. | Vitamin D metabolites activate the sphingomyelin pathway and induce death of glioblastoma cells | |
Bloor et al. | Cholesterol and cholesterol esters in human blood | |
Hichami et al. | Modulation of Platelet‐Activating‐Factor Production by Incorporation of Naturally Occurring 1‐O‐Alkylglycerols in Phospholipids of Human Leukemic Monocyte‐Like THP‐1 Cells | |
JP4707390B2 (en) | Gangliosides with modified acyl groups | |
Bartley et al. | Dietary regulation of fatty acid synthesis in rat liver and hepatic autotransplants | |
JP2000502339A (en) | Composition for regulating intracellular inositol trisphosphate concentration and use thereof | |
Rodriguez de Turco et al. | Kinetics of diacylglycerol accumulation in response to vasopressin stimulation in hepatocytes of continuously endotoxaemic rats | |
Sugden et al. | Control of muscle pyruvate oxidation during late pregnancy | |
HOLLERAN | Lipid modulators of epidermal proliferation and differentiation | |
EP1299400B1 (en) | Novel cytotoxic compounds and their use | |
JPS59128328A (en) | Agent for lowering cholesterol level | |
Spence et al. | Studies on Lysosomal Storage Diseases in Cell Culture: Niemann-Pick Disease Type D | |
McColl | Factors affecting the regulation of leukotriene production by neutrophils | |
Wakita | 27 Sphingolipids: from Chemistry to Possible Biologic Influence on the Skin | |
Deykin | Platelet Lipids |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |