KR100381449B1 - 에테르지질리포좀과이들의제약학적용도 - Google Patents

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더 리포좀 컴퍼니, 인코퍼레이티드
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Abstract

화학식 1을 자지는 에테르 지질은 머리기-유도된 지질, 선택적으로 스테롤과 중성지질을 가지는 리포좀내에 포함된다. 이와 같은 리포좀은 사람과 같은 동물에 암, 염증질환을 치료하기 위해 투여하는 용도를 가지는 것을 특징으로 한다.
[화학식 1]

Description

에테르 지질 리포좀과 이들의 제약학적 용도
에테르 지질은 염증, 면역반응, 알레르기 반응 과 재생과 같은 다양한 생리작인 작용에 관계하는 것으로 보이는 효과물질인 혈소판 활성인자(PAF;1-O-알킬-2-아세틸-sn-글리세로-3-포스포콜린)의 합성 유사체이다. 에테르 지질은 동물에서 효과적인 항종양물질이며 다양한 암세포에 선택적인 세포독성을 가지는 것으로 보인다.(Dietzfelbinger et al.(1993); Zeisig et al(1993): Powis et al(1990), Berdel(1991); Bhatia and Hadju(1991); Reed et al (1991); Workman(1991); Workman et al(1991); Bazill and Bexter(1990), Berdel(1990); Counsell et al(1990); Tritton and Hickman(1990); Muschiol et al.(1990); Layton et al.(1980); Runge et al(1980); Gl-eat Britan Patent No, 1,583,661; U.S. Patent No. 3,752,886). 에테르 지질은 또한 항-전이와 항-침윤성을 나타내고 세포 분화를 유도할 수 있는 것으로 보인다. 그러나 이들중 어느 것도 본 발명의 리포좀 조성물의 장점을 가지는 리포좀성 에테르 지질에 대해 상술하고 있지는 않다. 몇 가지 에테르 지질은 현재 임상 연구대상이다.
에테르 지질 세포독성의 기작은 아직 완전하게 정립되지는 않았지만 세포막에서 작용하고 그리고 이의 파괴에 관계하는 것으로 보인다. 에테르 지질의 선택적 세포독성은 세포내 축적과 알킬 절단 효소의 차등 활성이 관계할 수 있다. 에테르 지질은 또한 포스파티딜이노시톨 포스포리파제 C와 프로테인 카이나제 C 활성뿐만 아니라 포스파티딜콜린 생합성의 선택적 저해물질일 수 있다.
이들의 항종양 활성에 추가하여 에테르 지질은 용혈작응 즉 적혈구 세포를 용해시킨다. 또한, 임상 결과에서는 에테르 지질 투여가 간 기능 이상과 위장 질환을 유도함을 나타내었다. 출원인은 특정 에테르 지질 리포좀 조성물이 이와 같은 독성을 완충시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
발명의 요약
여기에서는 머리기에서 유도된 지질과 에테르 지질로 구성된 지질을 가지는 리포좀을 제공된다. 적절하게는 리포좀은 200nm이하 더욱 적절하게는 50nm이상에서 약 200nm이하의 직경을 가진다.
머리기-유도된 지질은 적절하게는 포스파티딜에탄올아민-다카르복실산이다. 예로써, 디키르복실산은 글루타린산, 세바신산, 숙신 또는 타르타르산이고 적절하게는 글루타린산이다. 포스파티딜에탄올아민(PE)는 적절하게는 디팔미토일-포스파티딜에탄올아민(DPPE), 팔미토일올레일 포스파티딜에탄올아민(POPE) 또는 디올레일 포스파티딜에탄올아민(DOPE)이다 적절하게는 머리기-유도된 지질은 DOPE-GA이다. 머리기-유도된 지질은 순환-강화 지질일 수 있으나 반드시 요구되는 것은 아니다.
에테르 기질은 다음의 화학식을 가진다,
[화학식 1]
Figure pct00001
이때, R1은 Y1Y2이고; Y2는 CH3또는 CO2H이고, Y1은(CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9이다. n1은 0이거나 또는 3 내지 23의 정수, n3은 0이거나 또는 1 내지 21의 정수; n5는 0이거나 또는 1 내지 18의 정수; n7은 0이거나 또는 1 내지 12의 정수; 그리고 n2, n4, n6그리고 n8은 각각 0 또는 1이다. n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9의 합은 3 내지 23의 정수와 같다. Y2는 적절하게는 CH3이고 R1은 적절하게는 (CH2)n1CH3즉, 포화 탄화수소이다. 적절하게는 포화 탄화수소는 R1이 (CH2)17CH3이다,
Z는 적절하게는 O이나 또한 S가 될 수도 있다. R2는 (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5이다. 각 X1, X2, X3, X4, X5는 수소 또는 프로린이나 적절하게는 수소가 된다. n10은 0 , 1 또는 2이고; n11은 0이고; n12는 0 또는 1 내지 23이나 적절하게는 0이다. n12가 0일 경우 R2는 CX3X4X5이고, X3, X4, X5는 적절하게는 H이고, R2는 CH3이다. n12가 0이 아닌 경우, n10+n11은 2이고 n12는 적절하게는 1이 되고 R2는 적절하게는 CH2CH3, CH2CF3또는 CF2CF3이다.
R3는 R5-P(O)2-O-R6이고; R5는 O, S 또는 NH이나 적절하게는 0이고; R6는 CH2CH2N(CH3)3(콜린)CH2CH2HH2, CH2CH(OH)CH2OH 또는 CH2CH2NHC(O)RT이나 적절하게는 콜린인다. 따라서 R3는 적절하게는 -O-P(O)2-O-CH2CH2N(CH3)3이고; R7은 Y2CH3또는 Y2CO2H이다.
따라서, 적절한 에테르 지질은 다음과 같다;
[화학식 2]
Figure pct00002
즉, 에테르 지질은 1-O-옥타데실낀-2-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린( "ET-18-OCH3" ) 이다.
본 발명의 리포좀은 포스파티딜클린(PC)포스파티딜콜린(PC)과 같은 중성 지질로 구성될 수 있다. 적절하게는 PC는 난(egg) 포스파티딜콜린(EPC), 디올레일 포스파티딜콜린(DOPC), 또는 팔미토일 포스파티딜콜린(POPC)이다. 더욱 적절하게는 PC는 DOPC이다. 또한 리포좀은 스테롤 적절하게는 콜레스테롤로 구성된다. 리포좀은 순환-강화 지질로 구성되는데 이는 포스파티딜에탄올아민 그리고 디카르복실산, 강글리오사이드 또는 폴리에틸렌 글리콜로 구성된다.
본 발명의 적절한 구체예에서, 리포좀은 에테르 지질, 머리기-유도된 지질, 스테롤 그리고 중성지질로 구성된 지질 이중층을 가진다. 적절하게는 에테르 지질은 ET-18-OCH3이고, 머리기-유도된 지질은 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산 더욱 적절하게는 DOPE-GA이고, 스테롤은 콜레스테롤이고 주성 지질은 PC더욱 적절하게는 DOPC이다. 이중층은 일반적으로 에테르 지질이 약 10mole%내지 30mole%, 더욱 적절하게는 20mole%, 머리기-유도된 지질이 약 5mole% 내지 약 20mole%, 더욱 적절하게는 약 10mole%; 스테롤이 약 10mole%내지 50mole%, 더욱 적절하게는 30mole%; 중성지질이 약 10mole%내지 50mole%, 더욱 적절하게는 40mole%로 구상된다. 더욱 적절하게는 이중층은 약 200mole%, "ET-18-OCH3", 약 10mole% DOPE-GA, 약 30mole% 콜레스테롤 그리고 약 40mole% DOPC로 구성된다.
리포좀은 추가의 생활성제로 구성되는데 이는 적절하게는 항미생물제, 항-신조직 형성체, 항-염증제, 요법적 지질 또는 조혈성 세포 성장 촉진제가 될 수 있다. 리포좀은 탈수될 수 있다.
또한 여기에서는 제약학적 수용 가능한 합체와 본 발명의 에테르 지질로 구성된 제약학적 조성물을 제공된다. 또한 제약학적 수용 가능한 항체와 에테르 지질과 머리기-유도된 지질로 구성된 지질 이중층을 가지는 리포좀으로 구성된 제약학적 조성물을 동물에 투여하는 것으로 구성된 동물에 에테르 지질을 투여하는 방법을 제공하는데 이때 에테르 지질은 화학식 1의 구조를 가진다. 적절하게는 동물은 사람이다. 적절하게는 리포좀은 약 200nm이하의 직경, 더욱 적절하게는 약 50nm이상 200nm이하의 직경을 가진다.
적절하게는 포화 탄화수소 가장 적절하게는, (CH2)17CH3가 O를 통하여 에테르지질의 1번위치에 결합된다. 적절하게는 R2는 (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5이고 가장 적절하게는 CH3이다. 적절하게는 머리기에서 3번 위치는 포스파티딜콜린이다. 따라서, 에테르 지질은 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린("ET-18-OCH3" ) 이다 .
적절하게는, 여리기-유도된 지질은 PE-디카르복실산, 가장 적절하게는 DOPE-GA이다. 유도된 지질은 순환 강화 지질이다. 적절하게는 이중층은 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 더욱 적절하게는 EPC, POPC 또는 DOPC로 구성된다. 리포좀은 또한 순환강화지질이다.
본 발명의 방법은 폐, 뇌, 난소 결장 또는 유방의 종양, 백혈병, 골수종, 신경아세포종, 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는 암으로 고통을 받는 동물에 에테르 지질을 투여하는데 이용된다. 이와 같은 방법은 일반적으로 에테르 지질 의 항-신조직형성 효과 량으로 구성된 리포좀의 효과 량을 동물에 투여하는 것으로 구성된다. 리포좀의 항-신조직형성 효과 량은 일반적으로 치료를 받을 동물의 체중 kg당 약 0.1mg내지 약 1000mg의 에테르 지질로 구성된다. 적절하게는 리포좀의 항-신조직형성 효과 량은 약 1mg/kg 내지 500mg/kg이 된다. 가장 적절하게는 에테르 지질의 항암 효과 량은 200mg/kg이다. 리포좀성 에테르 지질의 항암효과량은 반복 투여될 수 있다. 리포좀성 에테르 지질의 다중 약량에서 에테르 지질의 항암효과량과에테르 지질 효과 량으로 구성된 1회 약량이 또한 투여될 수 있다. 전이 또는 암의 침투는 에테르 지질 투여에 의해 저해될 수 있다.
본 발명의 방법은 염증성 질환 예로써, 관절염, 알레르기 반응 또는 천식과 같은 질병을 가진 동물에 에테르 지질을 투여하는데 이용될 수 있다. 이와 같은 방법은 일반적으로 동물에 리포좀성 에테르 지질의 항-염증 효과 량을 투여하는 것으로 구성된다. 에테르 지질의 항-염증 효과 량은 일반적으로 치료를 받는 동물의 체중당 약 0.1mg/kg 내지 약 1000mg/kg의 에테르 지질이 된다.
본 발명의 방법은 투여되는 에테르 지질에 추가하여 생물학적 활성물질을 투여하는 것으로 구성된다. 추가되는 생물학적 활성물질은 리포좀과 연합되거나 또는 연합되지 않을 수 있는데 예로써, 항미생물제, 항신조직형성제, 항-염증제, 요법적 지질 또는 조혈성 세포 성장 촉진제가 될 수 있으나 이에 한정하지는 않는다.
본 발명은 에테르 지질 리포좀과 이들의 제약학적 용도 예로써, 암의 치료에 관계한다.
도 1은 쥐에서 폐 전이에 리포좀성 에테르 지질의 효과를 나타낸다. 리포좀 조성물; EPC/콜레스테롤/SPPE-GA/EL(4:3:1:2). 약량;25mg/kg×5, X축, 완충액 컨트롤, 리포좀 컨트롤(에테르지질없음), 자유 에테르 지질, 리포좀성 에테르 지질 ; y축; 종양의 수(평균+s.d.)
도 2은 쥐에서 폐 전이에 리포좀성 에테르 지질의 효과를 나타낸다. 리포좀 조성물; DOPC/콜레스테롤/DPPE-GA/EL(4:3:1:2), 약량; 5회 주사, X축,완충액 컨트롤, 리포좀 컨트롤(에테르지질없음), 자유 에테르 지질, 리포좀성 에테르 지질(25mg/kg), 리포좀성 에테르 지질(100mg/kg) ; y축, 종양의 수(평균+s.d.)
여기에서는 머리기-유도된 지질과 에테르 지질로 구성된 리포좀을 제공한다. 리포좀은 하나이상의 지질 이중층으로 구성되는 자가합체구조를 가지는데 이때, 각 지질은 수용성 격실을 에워싸고 양쪽성 지질 분자로 된 두 개의 마주하는 단층으로 구성된다. 이들은 하나 또는 두 개의 비극성(소수성) 아실기에 공유결합으로 결합된 극성(친수성) 머리기로 구성된다. 일반적으로 소수성 아실기와 수용성 배지사이의 에너지학상으로 불안정한 접촉이 지질분자의 재배열을 유도하는데 즉 아실 사슬이 이중층 안쪽으로 향하게 되는 것이다. 아실 사슬이 수용성 배지와 접촉하지 않도록 효과적으로 차단되는 에너지학상으로 안정한 구조가 형성된다.
리포좀은 다양한 방법에 의해 만들어질 수 있다(Beamer and Uster(1983)). 이들 방법에는 Bangham's method for making muiltilamellar liposomes(MLVs); Lenk's, Fountain's and Cullis'method for maing MLVs with substantiallu equal interlamellar solute distribution(see for example, U.S. Patent Nos 4,522,803, 4,588,578, 5,030,453, 5,169,637 and 4,975,282) and Paphadiopoulos et al's reverse-phase evaporation method(U.S. Patent No.4,235,871) for preparaing oligolamellar liposomes를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 단층라멜라 소포는 초음파파쇄(Paphadiopoulos et al(1968)) 또는 압출(U.S. Patent Nos 5,008,050 and 5,059,421)와 같은 방법에의해 MLV's로부터 생성될 수 있다. 본 발명의 에테르 지질 리포좀은 상기 문헌들중 임의의 것을 이용하여 생성될 수 있다.
초음파파쇄, 균질화작용, 프렌치 프레스 응용, 밀림과 압출과 같은 다양한 방법들이 리포좀의 크기를 줄이는데 이용될 수 있는데 즉 큰 리포좀을 더 작은 리포좀으로 만드는데 사용된다. 접선방향 유동 여과법(Tangential flow filtration; WO89/008846)이 리포좀의 크기를 조절하는데 사용될 수 있는데 즉 크기가 틀린 리포좀이 적은 리포좀 집단을 만들고 좀 더 균질한 한정된 크기 분포를 가지는 리포좀 집단을 만드는 것이다. 본 발명에 따른 리포좀은 단층라벨라 또는 다층라멜라일 수 있고 더욱 적절하게는 200nm이하 더욱 적절하게는 약 50nm이상에서 약 200nm 아하의 직정을 가진다.
에테르 지질이 있는 리포좀성 이중층에 있을 때 "머리기-유도된" 지질은 지질이 에테르 지질의 독성을 완충할 수 있는 지질을 말하는데 즉 에테르 지질의 독성을 감소시킬 수 있는 지질로써 자유 에테르 지질보다는 독성이 적게 하는 것이다, 머리기-유도된 지질은 일반적으로 하나 이상의 아실사슬과 화학기가 결합된 극성 머리기로 구성된 양쪽성지질이다. 아실 사슬은 일반적으로 4내지 24개의 탄소원자를 포함하고 포화 또는 불포화될 수 있다. 적절하게는 아실사슬은 이중층에 있는 다른 지질의 소수성 부분과 적절한 압축 구조를 가질 수 있고 에테르 지질과 접촉하여 에테르 지질의 방출을 저해하고 에테르 지질의 특성은 완충된다. 적절하게는 극성기는 화학기가 결합될 수 있는 에탄올아민과 같은 것이 된다. 적절한 화학기는 디카르복실산, 강글리오사이드, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리알킬에테르와 그유사체이나 적절하게는 디카르복실산이고 이는 극성기에 결합되어 머리기-유도된 지질을 만든다. 시험관 또는 생체에서 유도된 지질의 독성 테스트를 함으로써 에탄올아민과 같은 기에 결합하기에 적합한 화학기를 확인하는 수단은 공지되어 있고 본 발명에 따른 숙지의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 실행될 수 있다. 극성기에 화학기의 결합시키는 수단 또한 공지되어 있으며 숙지의 기술을 가진 자에 의해 용이하게 실행될 수 있다.
팔미테이트와 올레이트 사슬을 포함하는 적절한 아실사슬은 16내지 20개 탄소원자를 가진다. 더욱 적절하게는 올레이트 사슬과 같은 하나 이상의 아실사슬은 불포화이다. 적절한 극성기는 에탄올아민이다. 에탄올아민에 결합되는 적합한 기는 포화 또는 불포화된 그리고 글루타르산, 세바신산 그리고 타르타르산과같은 4 내지 24개 탄소원자를 가진다. 더욱 적절하게는 디카르복실산은 글루타르산이다. 따라서, 적절한 여리기-유도된 지질은디팔미토일-포스파티딜에탄올아민-글루타르산(DPPE-GA), 팔미토일올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타르산(POPE-GA), 그리고 디올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타르산(DOPE-GA)와 같은 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산이다. 가장 적절하게는 머리기-유도된 지질은 DOPE-GA이다. 일반적으로 머리기-유도된 지질은 리포좀 지질 이중층의 약 5mole% 내지 약 50mole%로 구성된다.
머리기-유도된 지질의 독성 완충능력은 본 발명의 기술에 따라 본 기술분야에 숙지된 자에게 공지의 다수 시험관과 생체 테스트방법에의해 결정될 수 있다. 예로써, 에테르 지질-유도된 적혈구 세포(RBC) 용혈은 에테르 지질과 RBC 현탁액을 복합시키고 복합물을 배양하고 그다음 분광광도계로 RBC 용혈 빈도를 정량하여 검사할 수 있다. 하기에 제시된 데이터는 5% 용혈된 RBC 현탁액(HI5)를 포함하는 자유 에테르 지질의 농도가 5.2 micromolar이고 리포좀에서 에테르 지질에 대한 HI5의 값은 8.9 내지 106mircomolar 범위의 머리기-유도된 지질을 가진다.
추가로 에테르 지질의 LD50은 적절한 시험동물 예로써 쥐에 에테르 지질의 약량을 주입함으로써 결정될 수 있는데, 각 집단에서 죽은 동물의 수를 결정하고 죽은 동물의 50%가 되는 에테르 치질의 약량을 결정한다. 하기에서 제시한 데이터는 체중당 100mg 에테르 지질/kg 과 130mg 에테르 지질/kg 의 리포좀성 에테르 지질에서는 처리된 동물에서 죽은 것이 없는데 반해 자유 에테르 100mg/의 약량에서 는 처리된 다섯 마리 집단에서 다섯 마리 모두 죽었다. 자유 에테르 지질 의 LD50(ET-18-OCH3)은 체중 kg당 32.2mg 에테르 지질이고 반면 리포좀성 에테르 지질의 LD50은 130mg/kg이 된다.
치료요법적 창"TW"는 HI5/GI50("GI50"은 약물에 노출된 세포집단에서 50%, 성장 저해를 유도하는 약물의 약량과 동일하다). 일반적으로 생활성제의 TW는 1이하이고 이물질은 50% 성장 저해을 이루기 위해서 투여하면 일반적으로 비적상적인 용혈을 일으킨다. 일반적으로 TW가 1 또는 그 이상인 경우에 생활성제는 일반적으로 비정상적인 응혈을 유도하지 않으면서 투여될 수 있다. 일반적으로 TW값이 높을수록 테스트되는 물질의 치료요법적 효과가 크다. 머리기-유도된 지질을 가지는 에테르 지질 리포좀은 TW가 1이상이다. 적절하게는 머리기-유도된 지질로 구성된 리포좀 이중층에 에테르 지질의 TW는 약 15,이상 더욱 적절하게는 약 2이상 또는 3이상이 적절하다.
다음은 A549와 MCF7 사람 종양세포와 연관된 자유 에테르 지질 와 리포좀 에테르 지질(1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로슨-포스포콜린)의 TW를 나타낸다.
TW
Figure pct00003
Figure pct00004
다음의 실시예에 나타낸 데이터는 EL의 응혈 활성이 여리기-유도된 지질이 포함된 리포좀에서 감소되었다. 50% 적혈구 세포 응혈을 유도하는 에테르 지질의 농도는 자유 EL, 13μM; EL-Lip-1, 43μM, EL-Lip-2, >180μM이다. A549 암세포(GI50)의 50% 성장 저해를 유도하는 에테르 치질의 농도는 자유 EL, 10.2μM, EL-Lip-1, 12.4μM; EL-Lip-2, 14.1μM이다. 또한, 쥐에서 루이스 폐암에 대해 자유 EL과 EL-Lip-1의 항-전이 활성을 비교하였다. EL-Lip-1은 자발적인 폐암 전이를 저해하는 것으로 밝혀겼고 반면에 자유 EL은 극히 제한된 효과를 가졌다.(Control, 28±4.9 폐 결절, 자유 EL, 27.5±5; EL-Lip-1, 8.1±6.5)
머리기-유도된 지질은 순환 강화 지질인데 즉, 지질 독성 완충에 관계하는 변형은 또한 순화 강화에도 관계한다; 유도된 지질은 이것들이 투여된 동물의 순환계로부터 리포좀이 제거되는 것을 저해할 수 있다. 일반적으로 리포좀은 세망내피계(RES)에의해 동물의 신체로부터 제거되는 것으로 보인다. RES 제거를 피한다는 것은 리포좀 투여 빈도와 소요의 효과를 얻기 위해 투여할 필요가 있는 리포좀-연합된 생활성제의 양을 줄이는 것을 의미한다. 보강된 순환 시간은 또한 리포좀이 RES를 보유하지 않는 조직으로 리포좀을 보낼 수 있다. 리포좀의 이표면은 동물 순환계에서 옵소닌과 같은 혈청 단백질로 덮혀있는 것으로 보인다.
임의 방식에 제한하지 않고, 리포좀의 제거는 리포좀의 외표면을 변형시켜 리포좀에 혈청 단백질이 결합되는 것을 방해함으로써 저해된다고 볼 수 있다. 효과적인 표면 변형은 예로써 리포좀의 외표면의 변경은 리포좀에 혈청단백질의 결합을 방해하는 화학기를 리포좀에 결합시킴으로써 유도된 머리기를 가지는 리포좀성 지질 이중층으로 하여 리포좀의 약리학적 특징이 변경되는 옵소닌화와 RES 섭취를 저해하게된다 (Blume et al.(1993); Gabizon et al,(1993); Park et al,(1992); Woodle et al . U. S. Patent No. 5,013,556; U.S, Patent No, 4,837,028; and U.S. Patcnt No.08/065,928, filed May 21, 1993),
에테르 지질은 화학식 1을 가진다;
이때, R1은 Y1Y2이고; Y2는 CH3또는 CO2H이고; Y1은 (CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9이다. n1은 0이거나 또는 3 내지 23의 정수, n3은 0이거나 또는 1 내지 21의 정수; n5는 0이거나 또는 1 내지 18의 정수; n7은 0이거나 또는 1 내지 12의 정수; 그리고 n2, n4, n6그리고 n8은 각각 0 또는 1이다. n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9의 합은 3 내지 23의 정수와 같다. 따라서, 탄화수소는 에테르 지질의 글리세롤 기본 구조의 1번위치에 O원자를 통하여 결합된다. 탄화수소는 CH3또는 CO2H 단부를 가진다. 탄화수소는 적절하게는 포화되는데 적절하게는 인접 탄소원자사이에 이중결합을 가지지 않고 각 n2; n4, n6, n8각각은 0이고; R1은 (CH2)n1CH3이다. 더욱 적절하게는 R1이 (CH2)17CH3이다.
또는 탄화수소는 하나 또는 그이상의 이중 결합을 가질 수 있고 즉, 불포화일 수 있고 n2, n4, n6, n8의 하나 이상이 1이 된다. 불포화 탄화수소가 한 개의 이중결합을 가지는 경우, n2는 1이고; n4, n6, n8은 각 1이 되고: Y1은 (CU2)n1CH=CH(CH2)n3이다. n1과 n5는 각각 0 또는 1 내지 18의 정수이고; n3은 1 내지 16의 정수이다. 불포화 탄화수소가 세 개의 이중결합을 가지는 경우, n2, n4, n6는 각 1이되고 n8은 0이 되고; Y1은 (CH2)n1CH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5CH=CH(CH2)n7이다. n1과 n7는 각각 0 또는 1 내지 15의 정수이고 n3과 n5는 1 내지 15의 정수이다. 불포화 탄화수소가 네 개의 이중결합을 가지는 경우, n2, n4, n6, n8은 1이 되고; Y1은 (CH2)n1CH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5CH=CH(CH2)n7CH=CH(CH2)n9이다. n1과 n9는 각각 0 또는 1 내지 12의 정수이고 n3, n5, n7은 각각 1 내지 12의 정수이다.
Z는 적절하게는 O이나 또한 S가 될 수도 있다, R2는 Y1Y2일 수 있고 R1과 동일하거나 상이할 수 있다. R2는 (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5이다. 각 X1, X2, X3, X4, X5는 수소 또는 F이나 적절하게는 수소가 된다. n10은 0 , 1 또는 2이고; n11은 0이고, n12는 0 또는 1 내지 23이나 적절하게는 0이다. n12가 0일 경우 R2는 CX3X4X5이고, X3, X4, X5는 적절하게는 H이고, R2는 CH3이다. n12가 0이 아닌 경우, n10+n11은 2이고 n12는 적절하게는 1이되고 R2는 적절하게는 CH2CH3, CH2CF3또는 CF2CF3이다.
R3는 R5-P(O)2-O-R6이고; R5는 O, S 또는 NH이나 적절하게는 0이고; R6는CH2CH2N(CH3)3(포스포릴콜린), CH2CH2NH2(포스포릴세린), CH2CH(6H)CH2OH(포스포릴글리세롤) 또는 CH2CH2NHC(O)R7이나 적절하게는 포스포릴콜린이다, 따라서 R3는 적절하게는 -O-P(O)2-O-CH2CH2N(CH3)3이고, R7은 Y2CH3또는 Y2CO2H이다.
따라서, 적절한 에테르 지질은 화학식 2의 구조를 가진다; 즉, 에테르 지질은 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린("ET-18-OCH3") 이다.
리포좀은 머리기-유도된 지질과 에테르 지질에 추가하여 추가 지질 즉 하나 또는 그이상의 지질로 구성된다. 추가 지질은 지질 이중층의 다른 성분과 적절한 아실사슬 압축 구조를 만들 수 있는 능력으로 선택될 수 있고 이로써 지질 성분은 단단히 밀착되어 이중층으로부터 지질의 방출을 저해한다. 적절한 압축구조에 기여하는 지질계 인자는 본 기술에 숙지된 자에게 공지의 것이다. 이와 같은 인자에는 아실사슬 길이, 전하, 불포화도 그리고 머리기의 크기와 전하를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 따라서, 본 기술에서 제공하는 숙지의 기술을 가진 자는 적절한 추가지질을 용이하게 선택할 수 있다.
적절한 추가 지질은 포스파티딜콜린(PC), 난(egg) 포스파티딜콜린(EPC), 디올레일 포스파티딜콜린(DOPC), 팔미토일 포스파티딜콜린(POPC)와 같은 중성지질을 포함한다. 적절한 PC는 두 개의 불포화 사슬은 가지는 DOPC와 같이 하나 또는 두개 아실 사슬을 가진다. 본 발명의 리포좀의 이중층은 또한 스테롤을 포함한다. 스테롤은 일반적으로 지질 이중충의 유동성에 영향을 준다(Lewis and McElhaney(1992) and Darnell et al,(1986)). 주변 탄화수소와 스테롤과의 상호 작용으로 이중층으로부터 이들 사슬의 이동을 일반적으로 저해한다. 본 발명의 스테롤성분은 필수적인 것은 아니나 적절하게는 콜레스테롤이 된다. 리포좀은 또한 머리기-유도된 지질에 추가하여 순화 강화 치질이 될 수 있는 치질로 구성될 수 있으나 필수적인 것은 아니다.
더욱 적절하게는 PC는 DOPC이다. 또한 리포좀은 스테를 적절하게는 콜레스테롤로 구성된다. 리포좀은 순환-강화 지질로 구성되는데 이는 포스파티딜에탄올아민 그리고 디카르복실산, 강글리오사이드 또는 폴리에틸렌 글리콜로 구성된다.
적절하게는 본 발명의 리포좀은 에테르 지질, 머리기-유도된 지질, 스테롤 그리고 중성지질로 구성된 지질 이중층을 가진다. 적절하게는 에테르 지질은 ET-18-OCH3이고; 머리기-유도된 지질은 PE-디카르복실산이고; 스테롤은 콜레스테롤이고 중성 지질은 PC이다. 가장 적절하게는 PE-디카르복실산은 DOPE-GA이고; PC는 DOPC이다. 이중층은 일반적으로 에테르 지질이 약 10mole%내지 30mole%; 머리기-유도된 지질이 약 5mole% 내지 약 20mole%; 스테롤이 약 10mole%내지 50mole%; 중성지질이 약 10mole%내지 50mole% 구성된다. 더욱 적절하게는 이중층은 약 20mole%, "ET-18-OCH3", 약 10mole% DOPE-GA, 약 30mole% 콜레스테롤 그리고 약 40mole%, DOPC로 구성된다.
리포좀은 에테르 지질에 추가하여 생체활성물질을 포함한다. "생체활성물질은 동물 적절하게는 사람에게 투여될 수 있는 임의 화합물 또는 조성물이 될 수 있다. 이와 같은 물질에는 동물에서 생물학적 활성을 가지는데; 물질은 동물에서 진단을 위해 이용될 수 있다. 생체활성물질은 치료요법적 그리고 상 형성 물질을 포함한다. 리포좀에 연합될 수 있는 생체활성물질에는 아시클로비어, 지도부딘 그리고 인터페론과 같은 항-바이러스제, 아미노글리코시드, 세파로스포린 그리고 테트라사이클린과 같은 항-박테리아제; 포리엔 항생제, 이미다졸 그리고 트리아졸과 같은 항-곰팡이제; 폴린산과 같은 항-대사물질; 퓨린과 피리미딘 유도체; 안트라사이클린 항생제 그리고 식물 알칼로이드와 같은 항-신조직형성제, 콜레스테롤와 같은 스테롤, 당과 전분과 같은 탄수화물; 아미노산, 펩티드, 세포 수용체 단백질, 이뮤노글로블린, 효소, 호르몬, 신경전달물질 그리고 당단백질과 같은 단백질; 염료; 방사능 동위원소 그리고 방사능 동위원소 결합된 화합물과 같은 방사능 라벨; 산동증 화합물; 기관지확장제; 국소 마취제; 그리고 이와 유사물질 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 리포좀성 활성물질 조성물은 생체활성물질의 치료요법적 지수를 강화시키는데 예로써, 물질의 독성을 완충시킴으로써 가능하다. 리포좀은 또한 동물 순환계로부터 생체활성물질제의 제거 속도를 감소시킬 수 있다. 따라서, 생체활성물질의 리포좀성 조성물은 소요의 효과를 얻기 위해 투여해야하는 생체활성물질의 양을 감소시킬 수 있다, 본 발명의 리포좀에 적절한 추가의 생체활성물질은 항-미생물제; 항-염증반응제 그리고 항-신조직형성제 또는 세라미드와 같은 치료요법적 지질을 포함할 수 있다. 가장 적절하게는 추가의 생체활성물질은 항-신조직 형성물질이다.
리포좀은 리포좀을 준비하는데 이용되는 지질 또는 수용상에 물질을 용해시켜 하나 이상의 생체활성물질을 적하시킬 수 있다. 또는 이온화 가능한 생체활성물질은 우선 리포좀을 만들고, 리포좀의 최외층 리포좀 이중층을 가로질러 pH 기울기를 만드는 것과 같이 전기 화학적 전위차를 만들고 리포좀의 외부에 있는 수용성 배지에 이온화 가능한 물질을 첨가하여 리포좀내로 넣을 수 있다.(Bally et al., U.S. Patent No. 5,077,056 and WO 86/01102).
본 발명의 리포좀은 탈수하고 저장하고 그 다음 재구성시켜 실제 이들 내부 내용물이 리포좀내에 포함된다. 리포좀성 탈수는 일반적으로 친수성 건조 보호제의 이용을 요구한다 (U S. Patent Nos. 4,?29,360 and 4,880,635). 이와 같은 친수성 화합물은 리포좀에서 지질의 재배열을 막고 건조동안에 크기와 내용물을 유지시키고 재수화를 통하여 리포좀이 재구성될 수 있다. 이와 같은 건조 보호제의 적절한 양은 리포좀 이중층 성분의 분자내 공간을 유지할 수 있는 공간적인 특징을 가지고 강한 수소 결합 수용체일 수 있다. 사카라이드 예로써, 모노-, 디-사카라이드가 리포좀의 적절한 건조 보호제이다. 또한, 건조 보호제는 탈수하기 전에 리포좀 조성물을 냉동시키지 않을 경우 그러고 충분한 물리 조성물에 남아 있게 되면 생략할 수 있다.
또한 본 발명의 리포좀과 제약학적 수용 가능한 담체로 구성된 제약학적 조성물을 제공한다. 여기에서 사용된 "제약학적 수용 가능한 담체"는 사람을 포함하는 동물에 리포좀성 생체활성물질 조성물을 포함하는 일반적으로 지질과 리포좀 투여와 연관되어 사용된다. 일반적으로 제약학적 수용 가능한 담체는 본 기술에 숙지의 기술을 가진 자는 상당수의 요인에 따라 제조될 수 있는데 사용된 특정 리포좀성 생체활성물질, 이의 농도, 안정성 그리고 소요의 생체 이용성, 리포좀 조성물로치료하고자 하는 질병, 질환 또는 상태; 개체, 이의 나이 체격 그리고 일반적인 조건; 그리고 조성물의 투여 경로 예로써, 비강, 구상, 안구, 국소, 경피, 질, 피하, 유방내, 복막내, 정맥내 또는 근육 내와 같은 인자를 포함하나 이에 한정하지는 않는다(see for example, Nairn). 비경구로 생체활성물질을 투여하는데 이용되는 일반적인 제약학적 수용 가능한 담체는 예로써, 덱스트로즈 5wt%와 생리적 염을 포함하는 수용액 D5W를 포함한다. 제약학적 수용 가능한 합체에는 활성 성분의 안정성을 강화시켜주는 방부제와 항산화제와같은 추가 성분이 포함될 수 있다.
머리기-유도된 지질과 에테르 지질로 구성된 지질 이중층을 가지는 리포좀과 제약학적 수용 가능한 담체로 구성된 제약학적 조성물을 동물에 투여하는 것으로 구성된 동물에 에테르 지질의 투여 방법을 제공한다. 에테르 지질은 화학식 1의 구조를 가진다.
적절하게는 동물은 사람이고 에테르 지질은 정맥으로 투여된다. 적절하게는 리포좀은 200nm이하 적절하게는 약 50nm이상 200nm이하의 직경을 가진다.
머리기-유도된 지질은 적절하게는 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산이고 적절하게는 산은 글루타린산이고; PE는 DPPE, POPE 또는 DOPE이다. 더욱 적절하게는 머리기-유도된 지질은 DOPE-GA이다. 머리기-유도된 지질은 또한 순환강화 지질이다.
적절하게는, 포화 탄화수소 더욱 적절하게는 CH3(CH2)17-은 O를 통하여 에테르 지질의 1번 위치에 결합되고, 적절하게는 메틸기는 O를 통하여 2번 위치에 결합되고; 적절하게는 3번 위치의 극성기는 포스파티딜콜린이다. 따라서, 적절한 에테르 지질은 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린("ET-18-OCH3") 이다. 적절하게는 리포좀의 지질 이중층은 스테롤 더욱 적절하게는 콜레스테롤과 PC 더욱 적절하게는 DOPC와 같은 중성지질로 구성된다. 이중층은 순환강화 지질로 구성된다.
적절하게는 본 발명에 사용된 리포좀은 ET-18-OCH3, DOPE-GA, 콜레스테롤 그리고 DOPC로 구성된 지질 이중층을 가진다. 더욱 적절하게는 이중층은 40mole% DOPC, 30mole% 콜레스테롤 그리고 20mole% 에테르 지질로 구성된다.
에테르 지질은 일반적으로 종양 세포에 선택적인 세포득성을 가지는 것으로 보인다. 따라서, 본 발명의 방법은 폐, 뇌, 난소 결장 또는 유방의 종양, 백혈병, 골수종, 신경아세포종, 육종을 포함하나 이에 한정되지 않는 암으로 고통을 받는 동물을 치료하는데 이용된다. 일반적으로 리포좀성 에테르 지질은 자유 즉 리포좀이 없이 에테르 지질로 치료를 받은 동물의 치료에 이용될 수 있다. 그러나, 리포좀내에 에테르 지질의 포함은 치료요법 지수를 증가시키고 따라서, 리포좀성 에테르 지질을 더욱 효과적으로 만들 수 있다. 이 방법은 본 발명의 리포좀성 에테르 지질의 항-신조직형성 효과 량을 동물에 투여함으로써 실행할 수 있다. 리포좀성 에테르 지질의 투여는 암 세포의 전이 또는 이들의 조직내 침윤을 저해한다.
본 발명의 목적을 위해, "리포좀성 에테르 지질의 항암효과량"은 에테르 지질이 투여된 동물에 하나 또는 그이상의 암의 생성, 성장, 전이 또는 침윤을 저해하는 것을 저해하거나, 감소시키거나 또는 경감시키는데 효과적인 양을 말한다. 항암 효과 량은 일반적으로 다양한 인자 예로써, 개체의 나이, 체격 그리고 일반적인 질환 상태, 치료해야할 암, 투여 경로 등에 따라서 선택될 수 있는데, 본 기술에 숙지된 자는 다양한 수단 예로써, 약량 범위 시도 등에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 리포좀성 에테르 지질의 항-신조직형성 효과 량은 자유, 비리포좀성 에테르 지질의 양과 동일한 것으로 기대되며 치료될 동물의 체중 kg당 0.1mg 내지 1000mg 에테르 지질의 범위가 된다. 적절하게는 에테르 지질의 항-신조직형성 효과 량은 약 1mg/kg 내지 500mg/kg이 된다. 더욱 적절하게는 리포좀성 에테르 지질의 항암효과량은 약 5mg/kg 내지 약 100mg/kg이 된다.
본 발명의 방법은 또한 본 발명의 방법에 의해 치료 가능한 염증 질환을 가지는 동물에 에테르 지질을 투여하는데 이용될 수 있는데 예로써, 통풍, 류마티스 관절염, 섬유성 관절염, 라임 질환; 천식; 알레르기 질환, 그리고 이의 유사 질환을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 동물에게 에테르 지질의 항-염증 효과량을 투여함으로써 이와 같은 질환을 치료할 수 있다.
염증은 손상에 반응하여 질병을 가진 혈관과 그 주변 조직에서 일어나는 세포학적 조직학적 반응이다(Stedman's Medical Dictionary(Illustrated)(1982)). 이와 같은 자극에 대한 염증반응은 국소 반응, 최종 형태의 변화, 손상물질의 제거 또는 파괴 그리고 재생 기작을 포함한다. 따라서, 염증은 동물이 이들을 치료하는 과정으로 볼 수 있다. 그러나, 염증은 또한 비정상적인 생리적 반응에 반응하여 일어날 수도 있고 이는 신체에 문제를 일어 킬 수도 있다. 예로써, 관절은 통풍, 섬유성 관절염, 류마티스 관절염 그리고 라임 질환과 같은 관절염에서 염증을 일으킬 수도 있다.(Stedman's Medical Dictionary(Illustrated)(1982), pages 123-124). 이와 같은 상태는 세포의 침은 예로써, 순화계로부터 세포가 염증을 일으키는 부위로 침투하는 것으로 특징을 가진다. 이와 같은 침윤을 저해하거나 또는 비정상적인 자극에 반응하여 염증반응을 저해하는 물질은 염증을 감소시키는데 이용될 수 있다.
리포좀성 에레르 지질의 "항-염증 유발 효과량"은 비정상적인 염증을 특징으로 하는 질환을 가지는 동물에서 염증 반응을 저해하거나 또는 방해하는데 효과적인 에테르 지질의 임의 양인데 예로써, 비정상적인 자극에 반응하고 손상에 반응하여 신체의 정상적인 손상의 일부가 아닌 염증 반응이 된다. 에테르 지질의 항-염증 효과 량은 일반적으로 동물의 체증당 약 0.1mg 내지 약 1000mg/kg이 된다.
본 발명의 방법은 또한 투여되는 에테르 지질에 추가하여 동물에 추가의 생체활성물질의 투여로 구성된다. 이와 같은 추가의 생체활성물질은 예로써, 항미생물제, 항-염증제, 항-신조직형성제, 치료요법적 지질 또는 조혈성 세포 성장 자극 물질등은 리포좀과 연합되거나 또는 연합되지 않을 수 있다, 리포좀과 생체활성물질의 "연합"은 리포좀의 지질 이중층 또는 격실의 포함 또는 이중층의 내층 또는 외층 표면과 물질이 복합될 수 있다. 적절하게는 리포좀과 연합되는 추가의 생체 활성물질는 안트라사이클린 항생제와 같은 항-신조직형성제, 항대사물질 또는 빈카알칼로이드와 연합될 수 있다. 적절한 연합되지 않는 생체활성물질는 에리프로포에틴과 같은 적혈구 세포 성장 인자 또는 인터루킨 3(IL-3)과 입상세포/대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF)이다.
본 발명은 다음의 실시예로 이해될 수 있다. 그러나, 본 기술에 숙지된 자는 이와 같은 실시예는 본 발명을 단순히 설명하기 위함이며 이에 한정하고자 함은 아니다.
실시예 1
준비
화학물질: 에테르 지질(EL), 난 포스파티딜콜린(EPC), 디스테아릴 포스파티딜콜린(DSPC), 디팔미토일-포스파티 딜에탄올아민-글루타린산(DPPE-GA), 팔미토일올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타린산(POPE-GA) 그리고 디올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타린산(DOPE-GA)은 Avanti Polar Lipids(Birmingham, Alabama)에서구하였다. 콜레스테롤(Chol)은 Sigman Chemical Compnay U.S.A 에서 구하였다. 둘베코의 인산 완충염(D-PES)는 Gibco BRL Life Techologies Inc.(Grand Island, New York, U S.A.)에서 구입하였다. 모든 다른 시약은 고순도의 것을 이용한다.
리포좀: "빈" 리포좀은 용매 증발 법에 의해 준비할 수 있다. EL을 포함하는 리포좀은 우선 EL를 클로로포름에 용해시키고 10mole% 에테르 지질 유무 하에 다양한 몰 비로 ESC/Chol, DOPC/Chol 또는 DPPE-GA에 DPPE-GA, POPE-GA 또는 DOPE-GA/클로로포름과 메탄올(2:1 v/v)로 혼합시켜 준비할 수 있다. 유기 용매는 회전 증발기를 이용하여 진공 하에서 제거하고 박막은 DPBS 완충액으로 수화시킨다. 생성된 준비물은 압출기 장치를 이용하여 0.1㎛ 이중으로 겹쳐진 Nucleopore 필터를 통하여 10회 압출시킨다(Lipex Biomembrane Vancouver, BC, Cnanada). 리포좀의 크기는 Nicomp Model 370 Submicron Particle Sizer에서 빛 산란에의해 결정될 수 있다. 모든 연구에서 리포좀은 96-126nm의 평균 직경을 가진다.
실시예 2
적혈구 세포(RBC) 응혈 검사
PBS 0.5㎖으로 3회 세척한 4% 적혈구 세포(RBCs)는 전술한 것과 같이 준비된 "빈" 리포좀 즉, 에테르 지질 또는 다른 생물학적 활성물질이 없는 리포좀, 자유(리포좀이 없는) 에테르 지질 또는 리포좀성 에테르 지질을 다양한 농도에서(연속적으로 희석하여) 배양하였다. 이들 샘플은 37℃에서 교반하고 20시간 에지테이트(agitator)시키고 그 다음 10분간 3000rpm에서 원심 분리시킨다. 최종 상층액 0.2㎖ 은 물 1㎖로 희석하고 샘플에서 용혈 비율을 550nm에서 분광광도계로정량하였다. 물에 의한 동수의 RBC의 저장액 용혈에서 헤모글로빈 방출을 100% 포지티브 컨트롤로 이용한다. PBS는 네가티브 컨트롤로 이용한다. 조성물에 이용된 에테르 지질은 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린("ET-18-OCH3") 이다.
이와 같은 연구의 결과는 표 1에서 나타내는데 첫째컬럼은 용혈 활성에서 테스트된 조성물의 성분을 나타내고 중간은 각 성분의 몰 비율을 나타내고 셋째는 5%, 용혈이 관찰되는(HI5) 지질 농도를 나타낸다.
[표 1a]
용혈 활성
Figure pct00005
[표 1b]
Figure pct00006
실시예 3
시험관에서 쥐 암세포 성장 저해 연구
자유, 리포좀성-ET-18-OCH3또는 빈(EL 자유) 리포좀에의해 다양한 암세포의 시험관내 특정 저해는 Sulforhodamine B(SRB) 검사에의해 모니터할 수 있다. 간략하면, 5000 루이스 폐암(LLC), P388 또는 P388-아드리아마이신 저항성 세포/웰은 별도로 10% FBS가 보충된 RPMI-1640 배지에서 96웰 편편한 미량 적정 플레이트위에 별도로 도말하고 5% CO2가습 대기하에 37℃에서 유지시킨다. 24시간 뒤에 세포는 다양한 농도의 빈 리포좀(EL없음), DPBS, 자유 에테르 지질 또는 리포좀성 에테르지질에 노출시키고 37℃ 에서 추가로 48시간 배양시킨다. ET-18-OCH3의 다양한 조성물로 처리된 세포는 50㎕ 냉각 트러클로로아세트산(50% TCA)를 첨가하여 고정하고 1시간동안 4℃에서 배양한다. 플레이트는 탈이온수로 5회 세척하고 대기하에 24시간 두어 건조시킨다. 100㎕ SRB(0.4%wt/vol in acetic acid)를 첨가하고 10 내지 15분간 실온에서 배양하였다. 결합 안된 SRB는 1% 아세트산으로 5회 세척함으로써 제거된다. 플레이트는 공기 건조시키고 결합된 SRB는 트리스 완충액으로 용해시키고 광학 밀도는 551nm에서 읽고 50% 성장 저해(GI50)은 다음의 식으로 계산된다
[수학식 1]
Figure pct00007
이때, 컨트롤 광학 밀도는 (C)이고, 테스트 광학 밀도는 (T)이고 0시간에서 광학 밀도는 (T0)이다.
결과는 표 2에 나타내는데 50% 성장 저해(GI50)를 얻기 위한 에테르 지질의 농도로 나타내는데 첫째 줄은 테스트 받는 조성물을; 둘째 줄은 각 조성물 성분의 몰 비율을; 셋째, 넷째 줄 그리고 다섯째 줄은 TLC, P388, P-388-AIR 배양 물에서 AI50의 데이터를 나타낸다. 각 조성물에 사용된 에테르 지질은 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린이다.
[표 2]
에테르 지질 조성물에 의해 쥐 암세포의 성장 저해(GI50)
Figure pct00008
[표 2b]
Figure pct00009
실시예 4
시험관에서 사람 암세포 성장 저해 연구
사람 A549 폐 암, MCF7과 MCF7/ADR 세포를 플레이트하고(웰당 5000 세포), 24사간 배양하고 72시간동안 다양한 농도의 리포좀 없는 또는 리포좀성 에테르 지질에 노출시킨다. 성장 저해는 SRB검사를 이용하여 결정될 수 있다. 에테르 지질을 포함하지 않는 컨트를 리포좀의 배양에서는 최고 60μM 까지 지질 농도에서 성장 저해를 일으키지 않았다. 결과는 표 3에 나타내었는데 이는 50% 성장저해를 얻을 수 있는 에테르 지질 농도를 나타내는데 첫째 줄은 테스트된 조성물을 나타내고 들째 줄은 조성물의 구성 분의 몰 비율을 나타내고 셋째, 넷째, 다섯째 줄은 각 A459, HCF7 그리고 MCF7/ADR 배양물을 나타낸다. 조성물에 이용된 에테르 지질은 1-O-옥타데실-2-O-메틸-sn-글리세로-3-포스포콜린이다.
[표 3]
에테르 지질 조성물에 의해 사람 암 세포의 성장 저해(GI50)
Figure pct00010
실시예 5
생체내 독성 연구
암컷C57/BL6쥐(5/group, 체중 20-22g) 집단은 꼬리 정맥을 통하여 다양한 약량의 자유(12.5-200mg/kg)에테르 지질과 리포좀성 에테르 지질(12.5-200mg/kg)/PBS를 주사하였다. 또한 에탄올도 별도의 쥐집단에 주사하였다. 쥐는 즉석 급성 독성에 대해 조사되었고; 결과는 표 4에 나타내었다.
[표 4]
생체내 독성
Figure pct00011
실시예 6
생체내 효과 연구
루이스 폐암 세포(LLC)는 ATCC에서 구입하여 RPMI 배지에서 유지시킨다. 암컷C57/BL6쥐(체중 18-22g) 네집단에 꼬리 정맥을 통하여 0.2㎖ 멸균 PBS에 현탁된 2×105세포를 기준일(0일)주사하였다. 1,3,5,7,9일에 종양에 주사한 후 제 1 과 제 2 집단에 25mg/㎖ 자유 EL 또는 리포좀성 EL를 꼬리 정맥을 통하여 제공하였다. 제 3과 제 4 집단에는 0.2㎖ PBS에 리포좀 없는 EL로된 동량의 에테르 지질을 투여하였다. 생체내 자유 에테르 지질과 리포좀성 에테르 지질의 항-전이 활성은 실험집단의 쥐 폐에서 나타난 종양 엉어리의 수에 기초하여 평가하였다. 결과는 도 1과 2에 나타낸다.
참고문헌
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014

Claims (46)

  1. 에테르 지질, 스테롤, 중성지질, 머리기-유도된 지질로 구성된 지질이중층을 가지는 리포좀에 있어서, 에테르 지질은 다음의 화학식을 갖고:
    [화학식 1]
    Figure pct00015
    이때, R1은 Y1Y2이고,
    Y2는 CH3또는 CO2H이며,
    Y1은 (CH)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9이고;
    이때, n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9의 합은 3 내지 23의 정수와 같고, n1은 0 이거나 또는 3 내지 23의 정수이고,
    n3은 0이거나 또는 1 내지 21의 정수이며,
    n5는 0이거나 또는 1 내지 18의 정수이고,
    n7은 0이거나 또는 1 내지 15의 정수이며,
    n9는 0이거나 또는 1 내지 12의 정수이고,
    n2, n4, n6, n8각각은 0 또는 1이고;
    이때, Z는 O 또는 S이며;
    이때 R2는 Y1Y2또는 (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5이고;
    이때. 각 X1, X2, X3, X4, X5는 수소 또는 프로린이며,
    n10은 0 , 1 또는 2이고, n11은 0, 1 또는 2이고,
    n12는 0 또는 1 내지 23의 정수이며,
    n12가 0이 아닌 경우, n10과 n11의 합은 2이고;
    이때, R3은 R5-P(O)2-O-R5이며,
    R5는 O, S 또는 NH이고,
    R6는 CH2CH2N(CH3)3, CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH 또는 CH2CH2NHC(O)R7이며; R7은 Y2CH3또는 Y2CO2H이고;
    이때, 머리기-유도된 지질은 5몰% 내지 20몰% 지질이중층으로 이루어지고, 에테르 지질은 10몰%, 내지 30몰%, 지질이중층으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 리포좀.
  2. 제 1 항에 있어서, 리포좀의 직경은 200nm이하인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  3. 제 2 항에 있어서, 리포좀의 직경은 50nm이상 내지 200nm이하인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  4. 제 1 항에 있어서, Y2는 CH3인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  5. 제 4 항에 있어서, R1은 (CH2)n1CH3인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  6. 제 5 항에 있어서, R1은 (CH2)17CH3인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  7. 제 1 항에 있어서, Z는 O(산소)인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  8. 제 1 항에 있어서, R2는 (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  9. 제 8 항에 있어서, n12는 0인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  10. 제 9 항에 있어서, R2는 CH3인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  11. 제 8 항에 있어서, n12는 1인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  12. 제 11 항에 있어서, R2는 CH2CH3, CH2CF3또는 CF2CF3인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  13. 제 1 항에 있어서, R3은 O-P(O)2-0-R5인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  14. 제 13 항에 있어서, R3은 -0-P(O)2-O-CH2CH3N(CH3)3인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  15. 제 1항에 있어서, 에테르 지질은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 리포좀.
    [화학식 2]
    Figure pct00016
  16. 제 1 항에 있어서, 머리기-유도된 지질은 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  17. 제 16 항에 있어서, 포스파티딜에탄올아민은 디올레일 포스파티딜에탄올아민인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  18. 제 16 항에 있어서, 디카르복실산은 글루타르산인 것을 특정으로 하는 리포좀.
  19. 제 16 항에 있어서, 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산은 디올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타르산인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  20. 제 1 항에 있어서, 머리기-유도된 지질은 순환-강화 지질인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  21. 제 1 항에 있어서, 스테롤은 콜레스테롤인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  22. 제 1 항에 있어서, 중성지질은 포스파티딜콜린인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  23. 제 22 항에 있어서, 포스파티딜콜린은 디올레일 포스파티딜콜린인 것을 특징으로 하는 리포좀.
  24. 제 1 항에 있어서, 순환-강화 지질로 구성된 것을 특징으로 하는 리포좀.
  25. 제 1 항에 있어서, 에테르 지질은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 리포좀.
    [화학식 2]
    Figure pct00017
  26. 제 1 항에 있어서, 이중층은 20몰% 에테르 지질, 10몰% 디올레일 포스파딜에탄올아민-글루타르산, 30몰% 콜레스테롤, 40몰% 디올레일 포스파티딜콜린으로 구성된 것을 특징으로 하는 리포좀.
  27. 제 1 항에 있어서, 추가 생체활성물질로 구성된 것을 특징으로 하는 리포좀.
  28. 제 1 항에 따른 리포좀 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 구성된 것을 특징으로 하는 리포좀.
  29. 에테르 지질을 동물에 투여하는 방법에 있어서, 상기 방법은 리포좀 및 제약학적으로 수용가능한 담체로 구성된 제약학적 조성물을 동물에 투여하는 것으로 이루어지며, 상기 리포좀은 에테르 지질, 스테롤, 중성지질, 머리기-유도된 지질로 구성된 지질이증층을 갖고, 이때, 에테르 지질은 다음의 화학식을 가지며,
    [화학식 1]
    Figure pct00018
    이때, R1은 Y1Y2이고,
    Y2는 CH3또는 CO2H이며,
    Y1은 (CH2)n1(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(CH2)n9이고;
    이때, n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9의 합은 3 내지 23의 정수와 같으며, n1은 0이거나 또는 3 내지 23의 정수이고,
    n3은 0이거나 또는 1 내지 21의 정수이며,
    n5는 0이거나 또는 1 내지 18의 정수이고,
    n7은 0이거나 또는 1 내지 15의 정수이며,
    n9는 0이거나 또는 1 내지 12의 정수이고,
    n2, n4, n6, n8은 각각 0 또는 1이며;
    이때, Z는 O 또는 S이고;
    이때, R2는 Y1Y2또는 (C(X1)n10(X2)n11)n12CX3X4X5이며,
    이때: 각 X1, X2, X3, X4, X5는 수소 또는 프로린이고,
    n10은 0 , 1 또는 2이며, n11은 0, 1 또는 2이고,
    n12는 0 또는 1 내지 23의 정수이며,
    n12가 0이 아닌 경우, n10과 n11의 합은 2이고;
    이때, R3은 R5-P(O)2-O-R6이며,
    R5는 O, S 또는 NH이고,
    R6은 CH2CH2N(CH3)3, CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH 또는 CH2CH2NHC(O)R7이며, R7은 Y2CH3또는 Y2CO2H이고;
    이때, 머리기-유도된 지질은 5몰% 내지 20몰% 지질이중층으로 이루어지고 에테르 지질은 10몰% 내지 30몰% 지질이중층으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 동물은 암에 걸리고, 이때 에테르 지질의 항암 효과량이 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 암은 폐, 뇌, 결장, 난소 또는 유방 암인 것을 특징으로하는 방법.
  32. 제 30 항에 있어서, 에테르 지질의 항암 효과량은 동물의 체중 kg당 에테르 지질 0.1mg이 되고, 상기 동물에 투여되는 제약학적 조성물은 체중 kg당 에테르 지질 1000mg이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 29 항에 있어서, 동물은 염증질환에 걸리고, 이때 에테르 지질의 항염증 효과량이 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 염증질환은 관절염 질환, 천식 또는 알레르기 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 에테르 지질의 항염증 효과량은 동물의 체중 kg당 에테르 지질 0.1mg이 되고, 상기 동물에 투여되는 제약학적 조성물은 체중 kg당 에테르 지질 1000mg이 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제 29 항에 있어서, 동물에 추가로 생체활성물질이 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 추가의 생체활성물질은 항-신조직형성 물질, 항-미생물제, 항-염증제, 치료요법적 지질 또는 조혈세포 성장 촉진제인 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 29 항에 있어서, 리포좀은 50nm이상 200nm이하의 직겨을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 29 항에 있어서, R1은 (CH2)17CH3인 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제 29 항에 있어서, R2는 CH3인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 29 항에 있어서, R3은 -O-P(O)2-O-CH2CH2N(CH3)3인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제 29 항에 있어서, 에테르 지질은 다음과 같은 것을 특징으로 하는 방법.
    [화학식 2]
    Figure pct00019
  43. 제 29 항에 있어서, 머리기-유도된 지질은 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산인 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 포스파티딜에탄올아민-디카르복실산은 디올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타르산인 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제 38 항에 있어서, 이중층은 20몰% 에테르 지질, 10몰% 디올레일 포스파티딜에탄올아민-글루타르산, 30몰% 콜레스테롤, 40몰% 디올레일 포스파티딜콜린으로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제 29 항에 있어서, 리포좀은 순환-강화 지질로 구성된 것을 특징으로 하는 방법.
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