NO316206B1 - Eterlipid-liposomer og farmasöytiske sammensetninger av disse - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot eterhpid-liposomer og farmasøytiske sammenset-ninger inneholdende disse

Eterlipider er syntetiske analoger av blodplateaktivert faktor (PAF, l-O-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-fosfatocholin), en effektor som generelt antas å være involvert i forskjel-

lige fysiologiske prosesser, så som betennelse, immunrespons, allergiske reaksjoner og reproduksjon Eterlipider er blitt vist å være effektive antitumormidler i dyr, og antas å

være selektivt cytotoksiske for forskjellige cancerceller (se for eksempel Dietzfelbinger et al (1993), Zeizigetal (1993), Powis et al (1990), Berdel( 1991), Bhatia and Hadju

(1991), Reed et al (1991), Workman (1991), Workman et al (1991), Bazih and Dexter

(1990), Berdel (1990), Counsell et al (1990), Tritton and Hickman (1990), Muschiol et

al (1990), Layton et al (1980), Runge et al (1980), GB-PS 1 583 661, US-PS

3 752 886) Eterlipider er også blitt vist å være antimetastatiske og anti-invasive, og å ha evne til celledifferensienngsinduksjon Ingen av disse beskrivelsene beskriver liposo-

male eterlipider med de fordelaktige egenskapene ifølge oppfinnelsens liposomale formuleringer Flere eterlipider er for tiden brukt i kliniske forsøksstudier

Mekanismer for eterhpid-cytotoksisitet, som ikke er definitivt bestemt, ser ut til å innbe-

fatte virkning ved, og muligens ødeleggelse av, cellemembranen Den selektive cytotok-sisiteten til eterlipider kan involvere intracellulær akkumulering og differensial aktivitet av alkylspaltningsenzymer Eterlipider kan også være selektive inhibitorer av fosfatidyl-inositolfosfolipase C og proteinkinase C aktiviteter, samt fosfatidylcholin-biosyntesen

Eterlipider kan i tillegg til deres antitumoraktivitet være hemolytiske, dvs de kan lysere

røde blodceller Kliniske forsøksresultater viser at eterhpid-administrenng kan føre til hepatisk dysfunksjon og mavetarmforstyrrelser Visse liposomale formuleringer av eterlipider kan videre bufre disse toksisitetene

Et hposom med et lipidbilag omfattende et hodegruppe-denvatisert lipid og et eterhpid

er gitt hen Liposomet har fortrinnsvis en diameter som er fra høyere enn omtrent 50 nm til mindre enn omtrent 200 nm

Det hodegruppe-denvatiserte lipidet er fortrinnsvis en fosfatidyletanolamindikarboksyl-

syre Dikarboksylsyren, for eksempel, glutarsyre, sebasisk syre, ravsyre eller vinsyre, er fortrinnsvis glutarsyre Fosfatidyletanolamin (PE) kan være dipalrmtoylfosfatidyletanol-

amin (DPPE), palmitoyloleylfosfatidyletanolamm (POPE) eller dioleylfosfatidyletanol-

amin (DOPE) Det hodegruppe-denvatiserte lipidet er kan være DOPE-GA Hode-gruppe-denvatisert lipid kan, men behøver ikke å være et sirkulasjonsftemmende lipid Eterhpidet har den kjemiske formelen

hvor Ri er Yj Y2, Y2 er CH3 eller CO2H og Yi er

(C<H>2)ni(CH=CH)n2(CH2)n3(CH=CH)n4(CH2)n5(CH=CH)n6(CH2)n7(CH=CH)n8(-H2)n9 ni er hk 0 eller et tall fra 3 til 23, n3 er lik 0 eller et tall fra 1 til 21, n5 er hk 0 eller et tall 1 til 18, n7 er hk 0 eller et tall fra 1 til 15, n9 er hk 0 eller et tall fra 1 til 12, og hver av n2, n4, n6 og 8 er uavhengig hk 0 eller 1 Summen av nl+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 er hk et tall fra 3 til 23 Y2 er fortrinnsvis CH3, ogRi er fortnnnsvis (CH2)nlCH3, dvs et mettet hydrokarbon Foretrukket mettet hydrokarbon er Ri hk (CH2)i7CH3

Z er fortrinnsvis 0, men kan også være S R2 kan også være Yi Y2, og kan være den samme som, eller forskjellig fra, Ri Det er foretrukket at R2 er (C(Xi)nio(X2)nl l)nl2cx3x4x5 Hver »v xh x2. x3» ^ °S x5 er uavhengig hydrogen eller fluor, men er fortrinnsvis hydrogen nlO er hk 0,1 eller 2, ni 1 er hk 0,1 eller 2, og nl2 er lik 0 eller et tall fra 1 til 23, men er fortrinnsvis 0 Når nl2 er 0, er R2 CX3X4X5, X3, X4 og X5 og X5 er fortrinnsvis H, og R2 er CH3 Når ni2 ikke er 0 er summen av ni0 + ni 1 hk 2, ni2 er fortrinnsvis hk 1 og R2 er fortrinnsvis CH2CH3, CH2CF3 eller CF2CF3

R3 har formelen R5-P(0)2-0-Rg, R5 er O, S eller NH, men er fortrinnsvis 0, og Rg er CH2CH2N(CH3)3 (chohn) CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH, eller CH2CH2NHC(0)R7, med en fortrinnsvis chohn R3 er følgelig fortrinnsvis -0-P(0)2-0-CH2CH2N(C<H>3)3 R7 er Y2CH3 eller Y2C02H

Foretrukket eterhpid er følgelig

eterhpidet er l-0-oktadecyl-2-0-metyl-sn-glycero-3-fosfochohn ("ET-I8-OCH3")

Liposom ifølge oppfinnelsen kan også omfatte et nøytralt lipid, så som fosfatidylcholin (PC) PC er fortrinnsvis, dioleoyl fosfatidylcholin (DOPC) Liposomet kan også omfatte en sterol, fortnnnsvis kolesterol Liposomet kan også omfatte sirkulenngs-fremmende lipid, som kan omfatte et fosfatidyletanolamm og en dikarboksylsyre

I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen har liposomet et lipidbilag omfattende et eterhpid, et hodegruppe-denvatisert lipid, en sterol, og et nøytralt lipid Eterhpidene er fortrinnsvis ET-I8-OCH3, det hodegruppe-denvatiserte lipidet er en fosfatidyletanolamin-dikarboksylsyre, fortrinnsvis, DOPE-GA, sterolen er kolesterol og det natur-lige lipidet er en PC, mer foretrukket DOPC Bilaget generelt omfatter fortnnnsvis omtrent 20 molprosent av eterhpidet, omtrent 10 molprosent av hodegruppe-denvatisert lipid, omtrent 30 molprosent av sterolen og omtrent 40 molprosent nøytralt lipid Det er mest foretrukket at bilaget omfatter omtrent 20 molprosent "ET-I8-OCH3", omtrent 10 molprosent DOPE-GA, omtrent 30 molprosent kolesterol og omtrent 40 molprosent

DOPC

Liposomet kan omfatte et ytterligere bioaktivt middel som fortnnnsvis er et antimikro-bielt middel, et anti-neoplastisk middel, et anti-inflammatonsk middel, et terapeutisk lipid eller et hematopoetisk cellevekststimulerende middel Liposomet kan dehydreres

Også beskrevet hen er en farmasøytisk sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og eterhpidhposomet ifølge oppfinnelsen Det er videre beskrevet en fremgangsmåte for administrering av et eterhpid til et dyr som omfatter administrenng til dyret av en farmasøytisk sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og et liposom som har et lipidbilag som omfatter et eterhpid og et hodegruppe-denvatisert lipid, idet eterhpidet har den kjemiske formelen

Dyret er fortnnnsvis et menneske Lipsomet har fortnnnsvis en diameter som er mindre enn omtrent 200 nm, mer foretrukket større enn omtrent 50 nm til mindre enn omtrent 200 nm

Et mettet hydrokarbon, fortnnnsvis (CH2)i7CH3 er koblet 11-posisjonen til eterhpidet gjennom O R2 er fortnnnsvis ( C( X\) n\ Q( X2) ni 1CX3X4X5, fortnnnsvis CH3 Den polare gruppen 1 3 posisjonen er fortnnnsvis fosforylchohn Eterhpidet er fortnnnsvis 1-0-oktadecyl-2-0-metyl-sn-glycero-3-fosfochohn (ET-18-OCH3)

Det hodegruppe-denvatiserte lipidet er fortnnnsvis en PE-dikarboksylsyre, mest foretrukket DOPE-GA Det denvatiserte lipidet kan være et sirkulasjonsfremmende lipid Bilaget omfatter fortnnnsvis kolesterol og et fosfatidylcholin, mest foretrukket EPC, POPC eller DOPC Liposomet kan også omfatte et sirkulasjonsfremmende lipid

I en spesielt foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter liposomet 20 molprosent av et eterhpid, fortnnnsvis ET-I8-OCH3, omtrent 10 molprosent DOPE-GA, omtrent 30 molprosent kolesterol og omtrent 40 molprosent DOPC

Fremgangsmåten kan anvendes for å administrere et eterhpid til et dyr som var påvirket av cancer, inkludert, men ikke begrenset til, carcinomer, leukemier, myelomer, neuro-blastomer, sarkomer 1 lunger, hjerne, ovane, tarm eller bryst En slik fremgangsmåte omfatter generelt administrenng til dyret ved en mengde av liposomet som omfatter en anti-neoplastisk effektiv mengde av eterhpidet Anti-neoplastiske effektive mengder av hposomalt eterhpid omfatter generelt fra omtrent 0,1 mg eterhpid pr kg kroppsvekt til dyret som blir behandlet til omtrent 1000 mg eterhpid pr kg kroppsvekt Den anti-neoplastiske effektive mengden av hposomalt eterhpid er fra omtrent 1 mg eterhpid pr kg kroppsvekt til omtrent 500 mg pr kg Det er mest foretrukket at den anti-cancereffektive mengden av eterhpidet er 200 mg pr kg kroppsvekt Anticancereffektive mengder av et hposomalt eterhpid kan administreres 1 flere admimstrennger Mutiple doser av et hposomalt eterhpid til hver dose omfatter en anti-cancereffektiv mengde av eterhpidet kan

også administreres Metastaser eller invasjon av cancer kan hemmes ved eterhpid-admimstrenng

Fremgangsmåtene kan også anvendes for å administrere et eterhpid til et dyr som har en inflammatonsk forstyrrelse, for eksempel en artnttbetmgelse, allergisk reaksjon eller astmatisk forstyrrelse En slik fremgangsmåte omfatter generelt administrering av en anti-inflammatonsk effektiv mengde av hposomal eterhpidet til dyret Anti-inflamma-sjonseffektive mengder av eterlipidene er generelt fra omtrent 0,1 mg av eterhpidet pr kg kroppsvekt til dyret behandlet til omtrent 1000 mg eterhpid pr kg kroppsvekt

Fremgangsmåten kan også omfatte administrering av et biologisk aktivt middel i tillegg til eterhpid-admmistrenngen Dette ytterligere biologisk aktive middelet som kan være assosiert, eller er uassoisert med liposomet er for eksempel, men ikke begrenset til, et anti-mikrobielt middel, anti-neoplastisk middel, anti-inflammatonsk middel, terapeutisk lipid eller hematopoetisk cellevekststimulerende middel

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

FIGUR 1.

Effekter av hposomal eterhpid på lungemetastaser i mus Liposomal formule-ring EPC/kolesterol/DPPE-GA/EL (4 3 12) Dose 25 mg/kg x 5 x-akse bufferkontroll, liposomkontroll (uten eterhpid), fri eterhpid, hposomal eterhpid, y-akse antall tumomoduler (gjennomsnittlig pluss sd)

FIGUR 2.

Effekter av hposomalt eterhpid på lungemetastaser i mus Liposomformulenng DOPC/Chol/DOPE-GA/EL (4 3 12) Dose 5 injeksjoner x-akse bufferkontroll, liposomkontroll, fri eterhpid, hposomalt eterhpid (25 mg/kg kroppsvekt dose), hposomal eterhpid (100 mg pr kg dose), y-akse antall tumomoduler

(gjennomsnittlig pluss sd)

Foreliggende oppfinnelse vedrører et liposom som har et lipidbilag omfattende et hode-gruppe-denvatisert lipid og et eterhpid Liposomer er selvoppstillende strukturer som omfatter ett eller flere lipidbilag hvor hvert omgir et vandig rom og omfatter to motstå-ende monolag av amfipatiske hpidmolekyler Disse omfatter en polar (hydrofil) hodegrupperegion kovalenthg koblet til én eller to ikke-polare (hydrofobe) acylkjeder Energetiske ugunstige kontakter mellom de hydrofobiske acylkj edene og det vandige mediet antas generelt å indusere at hpidmolekylene blir rearrangert slik at de polare hodegruppene blir orientert mot det vandige mediet, mens acylkjedene reonenterer mot det indre av bilaget En energetisk stabil struktur blir dannet der acylkjedene blir effektivt hemmet fra å komme i kontakt med det vandige mediet

Liposomene kan dannes ifølge forskjellige metoder (for en oversikt se for eksempel, Deamer and Uster(1983)) Disse metodene innbefatter uten begrensning Banghams metode for dannelse av multilamellære hposomer (MLV), Lenk's, Fountain's and Culhs1 metodene for å danne MLV med vesentlig lik interlamellær oppløsningsmiddelfordehng (se for eksempel US-PS 4 522 803,4 588 578,5 030 453, 5 169 637 og 4 975 282), og Paphadjopoulos et al revers-fase avdampningsmetode (US-PS 4 235 871) for fremstil-ling av ohgolamellære hposomer Umlamellære vesikler kan produseres fra MLV ifølge slike metoder som sonikenng (se Paphadjopoulos et al (1968)) eller ekstrusjon (US-PS 5 008 050 og US-PS 5 059-421) Eterhpidhposomet ifølge oppfinnelsen kan produseres ifølge fremgangsmåtene til hvilke som helst av disse beskrivelsene og innholdet er in-korporert hen som referanse

Forskjellige metoder, så som sonikenng, homogenisenng, French Press anvendelse, ma-ling og ekstrusjon kan anvendes for å størrelsesredusere liposomene, dvs å danne hposomer med mindre størrelse fra større hposomer Tangentiell strømningsfiltrenng (se WO89/008846), kan også anvendes for å regulansere størrelsen til liposomene, dvs å produsere hposomer som har en populasjon av hposomer med mindre størrelseshetero-genisitet, og en mer homogen, definert størrelsesfordeling Liposomet ifølge oppfinnelsen kan være unilamellært eller multilamellært, og har fortnnnsvis en diameter fra større enn omtrent 50 nm til mindre enn omtrent 200 nm

Et "hodegruppe-denvatisert" lipid er et lipid som, når til stede i et hposomalt lipidbilag med et eterhpid, kan bufre toksisiteten til eterlipider, dvs kan redusere eterhpidets toksisitet slik at det er generelt mindre toksisk enn den frie formen til eterhpidet Hode-gruppe-denvatiserte lipider er generelt amfipatiske lipider som omfatter én eller flere hydrofobe acylkjeder og en polar hodegruppe hvor det er koblet en kjemisk del Acylkjedene inneholder vanligvis fra 4 til 24 karbonatomer og kan være mettede eller innet-tede Foretrukne acylkjeder kan tilpasses kompatible pakkekonfigurasjoner med hydrofobe deler av andre lipider som er tilstede i bilaget, og som kan reagere med et eterhpid slik at fngjønng av eterhpidet fra bilaget blir inhibert og eterhpid-toksisiteten bufret Foretrukne polare grupper utgjør for eksempel etanolamin hvortil kjemiske deler kan bh koblet Egnede kjemiske deler er slike som dikarboksylsyrer, ganghosider, polyetylen-glykoler, polyalkyletere og lignende, fortnnnsvis dikarboksylsyrer, som kan kobles til polare grupper og som kan gi opphav til hodegruppe-denvatiserte lipider Metoder for identifisering av kjemiske deler egnede for koblmg til grupper, så som etanolamin, for eksempel ved å utsette denvatiserte lipider for in vitro og in vivo toksisitetstesting, er velkjente for fagfolk innenfor dette området Fremgangsmåter for kobling av kjemiske deler til polare grupper er også velkjent for fagfolk innenfor dette området

Foretrukne acylkjeder, som innbefatter pahmtat og oleatkjeder, inneholder fra 16 til 20 karbonatomer Det er mer foretrukket at én eller flere av acylkjedene, så som en oleat-kjede, er umettet Den foretrukne polare gruppen er etanolamin Deler foretrukket for kobling av etanolamin er dikarboksylsyrer, inkludert de som er mettede eller umettede, og som har fra 4 til 24 karbonatomer, så som glutarsyre, sebacisk syre, ravsyre og vinsyre Mer foretrukket er det at dikarboksylsyren er glutarsyre Foretrukne hodegruppe-denvatiserte lipider er følgelig fosfatidyletanolammdikarboksylsyrer så som dipalmitoylfosfatidyletanolamin-glutarsyre (DPPE-GA), palmitoyloleoylfosfatidyletanolamin-glutarsyre ((POPE-GA) og dioleoylfosfatidyletanolamin-glutarsyre (DOPE-GA) Det denvatiserte lipidet er fortnnnsvis DOPE-GA Det hodegruppe-denvatiserte lipidet omfatter vanligvis fra omtrent 5 molprosent til omtrent 50 molprosent av hposomets lipidbilag

Toksisitetsbufrende kapasiteter til hodegruppe-denvatiserte lipider kan bestemmes ifølge et antall in vitro og in vivo testemetoder som er velkjente for fagfolk innenfor dette området For eksempel kan eterhpid-indusert rød blodcelle (RBC) hemolyse bh undersøkt in vitro ved kombinenng av et eterhpid med en RBC suspensjon, inkubenng av kombinasjonen og deretter kvantifisenng av prosentandelen RBC lysenng ved spek-trofotometn Data presentert nedenfor viser at konsentrasjonen av fri eterhpid som induserer hemolyse av 5% av en RBC suspensjon (HI5) var 5,2 mikromolar, mens HI5-ver-diene for eterlipider 1 hposomer som også har et hodegruppe-denvatisert lipid, vanerte fra 8,9 mikromolar til 106 mikromolar

I tillegg kan LD50 for eterlipider bestemmes in vivo ved å injisere forskjellige eterhpiddoser inn 1 prøvegrupper av egnede forsøksdyr, for eksempel mus Antall dyr som dør 1 hver gruppe blir bestemt, og eterhpiddosen hvorved 50% av dyrene dør bestemmes Data presentert nedenfor viser at ved liposomale eterhpiddoser på 100 og 130 mg av eterhpid/kg kroppsvekt døde ingen av de behandlede dyrene, mens ved 100 mg/kg dose av fh eterhpid døde 5 av 5 mus 1 den testede gruppen LD50 for fri eterhpid (ET-18-OCH3) var omtrent 32,2 mg av eterhpidet pr kg kroppsvekt, mens LD50 for hposomalt eterhpid var høyere enn 130 mg pr kg

Det terapeutiske vinduet "TW" er hk HI5/GI50 ("GI50" er hk dosen til et middel som induserer 50% vekstinhibenng 1 en populasjon av celler eksponert for middelet) Generelt når et bioaktivt middel TW er mindre enn 1, kan middelet ikke administreres for å oppnå 50% vekstinhibenng uten å forårsake generelt uakseptable hemolysenivåer Når TW er omtrent 1 eller høyere kan det bioaktive middelet bh administrert uten å indusere generelle uakseptable hemolysenivåer Større TW verdi, desto mer terapeutisk effektivt er middelet som blir testet Eterhpidliposomer med bilag omfattende hodegruppedenva-tiserte lipider kan ha TW som er høyere enn 1 TW til et eterhpid 1 et hposomalt bilag også omfattende et hodegruppe-denvatisert lipid er høyere enn omtrent 1,5, mer foretrukket er høyere enn omtrent 2 og enda mer foretrukket høyere enn omtrent 3

Følgende tabell presenterer TW for frie og liposomale eterlipider (l-O-oktadecyl-2-O-metyl-sn-glycero-3-fosfochohn) 1 sammenheng med A549 og MCF7 humane cancerceller

Data presentert 1 eksemplene nedenfor viser at den hemolytiske aktiviteten til EL reduseres ved h<p>osomallnneslutning med et hodegruppe-denvatisert lipid Eterhpidkonsentrasjonene som induserer 50% røde blodcelle-hemolyser (HI50) var fri EL, 13 nm, EL-Lip-1,43 um, EL-Lip-2, >180 um Eterhpidkonsentrasjonene som induserer 50% vekstinhibenng av A549 cancercellene (GI50) var like fri EL, 10,2 um, EL-Lip-1,12,4 um, EL-Lip-2,14,1 um Den anti-metastatiske aktiviteten til fri EL og EL-lip-1 mot Lewis lungecancer 1 mus ble sammenlignet EL-Lip-1 ble funnet å inhibere spontane lungemetastaser, mens fri EL bare hadde begrenset effektivitet (kontroll 28 ± 4,9 lungeno-duler, fri EL 27,5 ± 5, EL-Lip-1 8,1 ± 6,5)

Hodegruppe-denvatiserte lipider kan også være sirkulasjonsfremmende lipider, dvs modifikasjoner rettet mot hpidtoksisitetsbufnng kan også være rettet mot sirkulasjons-forsterkmng, denvatiserte lipider kan inhibere klanng av hposomer fra sirkulasjonssy-stemene til dyr som de er blitt administrert til Liposomer antas generelt å bh fjernet fra dyrets legeme ved hjelp av retikuloendotelsystemet (RES) Unngåelse av RES fjerning betyr at frekvensen av hposom-admimstrenng kan reduseres og at mindre av et hposom-assosiert bioaktivt middel må administreres for å oppnå ønskede serumnivåer av a For-sterkede sirkulasjonstider kan også muliggjøre målsøking av liposomene til lkke-rest-mneholdende vev Liposomets ytre overflater antas å bh belagt med serumproteiner, så som opsoniner, i dyrets sirkulasjonssystem

Uten å være begrenset av teorien antas det at hposomfjerning kan bh inhibert ved modi-fisering av den ytre overflaten til liposomene slik at binding av serumproteiner dertil generelt bh inhibert Effektiv overflate modifikasjon, dvs endringer i den ytre overflaten til liposomene som resulterer i lnhibenng av opsonisenng og RES opptak antas å bh oppnådd ved inkorporering inn i liposomale bilag lipider hvor polare hodegrupper er blitt denvatisert ved kobling dertil av en kjemisk del som kan inhibere bindingen av serumproteiner til hposomer slik at den farmakokinetiske atferden til liposomene i sirkula-sjonssystemene til dyrene blir endret (se for eksempel Blume et al (1993), Gabizon et al (1993), Park et al (1992), Woodle et al US-PS5-013 556, US-PS 4 837 028, og US-PS 08/065 928, inngitt mai 21, 1993)

Eterhpid har følgende kjemiske formel

hvor R] er Y\Y2, Y2 er CH3 eller C02H og Y\ er

(CH2)ni(CH=CH)n2^

(C-H2)n9 ni er Uk 0 eller et tall fra 3 Ul 23, n3 er lik 0 eller et tall fra 1 til 21, n5 er hk 0 eller et tall 1 til 18, n7 er hk 0 eller et tall fra 1 til 15, n9 er hk 0 eller et tall fra 1 til 12, og hver av n2, n4, n6 og 8 er uavhengig hk 0 eller 1 Summen av

nl+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 er hk et tall fra 3 til 23 Et hydrokarbon er følge-lig koblet gjennom et O-atom 11 posisjonen til glycerolskjelettet til eterhpidet Hydrokarbonet kan ha en terminal CH3 eller C02H gruppe, og det er foretrukket at den termi-nale gruppen er en metylgruppe Hydrokarbonet er fortrinnsvis mettet, dvs det er fortrinnsvis ingen dobbeltbindinger mellom ved siden av liggende karbonatomer, hver av

n2, n4, n6 og n8 er hk 0 og Rj er (CH2)nlCH3 Det er mer foretrukket at er R\ er (CH2)i7CH3

Alternativt kan hydrokarbonet ha én eller flere dobbeltbindinger, dvs det kan være umettet, og én eller flere av n2, n4, n6 og n8 kan være hk 1 Når det umettede hydrokarbonet har en dobbeltbinding er n2 hk 1, n4, n6 og n8 er hver hk 0 og Y\ er (CH2)nlCH=CH(CH2)n3 ni er null eller et tall fra 1 til 21, og n3 er også 0 eller et tall fra 1 til 21, og minst en av ni eller n3 er ikke hk 0 Når hydrokarbonet har to dobbeltbindinger er n2 og n4 hver hk 1, n6 og n8 er hver hk 0 og er (C<H>2)niCH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5 ni og n5 er hver uavhengig 0 eller et tall fra 1 til 18, og n3 er et tall fra 1 til 16 Når hydrokarbonet har tre dobbeltbindinger er n2, n4 og n6 hver hk 1, n8 er hk 0 og Yj er

(C<H>2)nlCH=CH(CH2)n3CH=CH(CH2)n5<C>H=CH (CH2)n7 ni og n7 er hver uavhengig 0 eller et tall fra 1 til 15, og n3 og n5 er hver lik et tall fra 1 til 15 Når det umettede hydrokarbonet har 4 dobbeltbindinger er hver av n2, n4, n6 og n8 hk 1, og Yj er (C<H>2)nlCH=CH(C<H>2)n3CH=CH(C<H>2)n5CH=CH(CH2)n7CH=CH(CH2)n9 ni og n9 er hver uavhengig 0 eller et tall fra 1 til 2, n3, n5 og n7 er hver uavhengig et tall fra 1 Ul 12

Z er fortnnnsvis O, men kan også være S R2 kan også være Y\ Y2 og kan være hk eller forskjellig fra Ri Det er foretrukket at R2 er (C(Xi)nio(X2)ni l)n12cX3X4X5 Hver av Xi, X2, X3, X4 og X5 er uavhengig H eller F, men er fortnnnsvis H, nlO er hk 0,1 eller 2, ni 1 er hk null, 1 eller 2, og nl2 er hk 0 eller et tall fra 1 til 23 Det er foretrukket at nl2 er hk null og 1 det tilfellet er R2 CX3X4X5 X3, X4 og X5 er fortnnnsvis H og R2 er fortnnnsvis CH3 Når nl2 ikke er 0 er summen av nlO og ni 1 2, nl2 er fortnnnsvis hk 1 og R2 kan være CH2CH3, CH2CF3 eller CF2CF3

R3 er R5-P(0)2"0-R5, R5 O, S eller NH, men fortnnnsvis 0 Rg kan være CH2CH2N(CH3)3 (fosforylchohn) CH2CH2NH2 (fosforylsenn), CH2CH(OH)CH2OH (fosforylglycerol), eller CH2CH2NHC(0)R7, men er fortnnnsvis fosforylchohn R3 er derfor fortnnnsvis, men ikke nødvendigvis -0-P(0)2-0-CH2CH2N(CH3)3 R7 er Y2CH3 eller Y2C02H

Foretrukket eterhpid er følgelig

dvs 1 -0-actadecyl-2-0-metyl-sn-glycero-3-fosfochohn ("ET-18-OCH3")

Liposomet kan omfatte ytterligere lipider, dvs en eller flere lipider 1 tillegg til hode-gruppe-denvatisert lipid og eterhpid Ytterligere lipider blir valgt etter deres evne til å innta kompatible acylkjede-pakkende konformasjoner med andre komponenter av hpid-bilaget slik at lipidbestanddelene blir tett pakket og fngjønng av lipidene fra bilaget bhr inhibert Lipidbaserte faktorer som bidrar til kompatible pakkende konformasjoner er velkjent for fagfolk innenfor dette området Slike faktorer innbefatter, uten begrensning, acylkjedelengden og grad av lkke-metning, samt hodegruppestørrelsen og ladningen Egnede ytterligere lipider kan følgelig lett bh valgt av fagfolk innenfor dette området

Foretrukne ytterligere lipider innbefatter nøytrale lipider så som fosfatidylchohner (PC) eggfosfatidylchohn (EPC), palmitoyloleoylfosfatidylchohn (POPC) og dioleoylfosfatidylchohn (DOPC) Foretrukne PC har en eller to acylkjeder, så som DOPC som har to umettede kjeder Bilag ifølge liposomet ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en sterol Steroler påvirker generelt fluiditeten til hpidbilagene (se for eksempel Lewis and McElhaney (1992) og Darnell et al (1986)) Sterohnteraksjonene med omgivende hyd-rokarbonkjeder inhiberer generelt emigrenng av disse kjedene fra bilaget Sterolkompo-nenten ifølge oppfinnelsens bilag er fortnnnsvis kolesterol Sterolen kan også være kole-sterolsulfat eller kolesterolhemisuccinat Liposomet kan også omfatte et sirkulasjonsfremmende lipid, dvs et slikt lipid 1 tillegg til hodegruppe-denvatisert lipid som kan, men ikke nødvendigvis er et sirkulasjonsfremmende lipid

Liposom ifølge oppfinnelsen har fortrinnsvis et bilag omfattende et eterhpid, et hode-gruppe-denvatisert lipid, en sterol og et nøytralt lipid Eterhpidet er fortnnnsvis ET-18-OCH3, hodegruppe-denvatisert lipid er en PE-dikarboksylsyre, sterol er kolesterol og det nøytrale lipidet er en PC Det er mest foretrukket at PE dikarboksylsyren er DOPE-GA og PC er DOPC Bilaget kan omfatte fra omtrent 10 til omtrent 30 molprosent eterhpid, fra omtrent 5 til omtrent 20 molprosent hodegruppedenvatisert lipid, fra omtrent 10 til omtrent 50 molprosent sterol og fra omtrent 10 til omtrent 50 molprosent nøytralt lipid I en spesielt foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen omfatter bilaget omtrent 20 molprosent ET-I8-OCH3, omtrent 10 molprosent DOPE-GA, omtrent 30 molprosent kolesterol og omtrent 40 molprosent DOPC

Liposomet kan omfatte et ytterligere bioaktivt middel, dvs et bioaktivt middel 1 tillegg til eterhpid "Et bioaktivt middel" er en hvilken som helst forbindelse eller sammensetning som kan bh administrert til dyr, fortrinnsvis mennesker Slike midler kan ha biologisk aktivitet 1 dyr Midlene kan også anvendes diagnostisk 1 dyrene Bioaktive midler innbefatter terapeutiske og biUeddannende midler Bioaktive midler som kan være assosiert med hposomer innbefatter, men er ikke begrenset til antivirale midler så som acyklovir, zidovudin og interferoner, antibaktenelle midler så som aminoglykosider, cefalosponner og tetracykhner, antisoppmidler så som polyen antibiotika, lmidazoler og tnazoler, antimetabohtiske midler så som folinsyre og punn og pynmidinanaloger, anti-neoplastiske midler så som anthracykhn antibiotika og plantealkaloider, steroler så som kolesterol, karbohydrater, for eksempel sukkere og stivelser, aminosyrer, peptider, proteiner så som cellereseptorproteiner, lmmunoglobuhner, enzymer, hormoner, neuro-transmtttere ag glykoproteiner, farvestoffer, radiomarkører så som radioisotyper og ra-dioisotopmerkede forbindelser, radiopakkforbindelser, fluroescensforbindelser, mydn-atiske forbindelser, bronchodilatorer, lokal anestesi, og lignende Liposomale bioaktive middel formuleringer kan forsterke den terapeutiske indeksen til det bioaktive middelet, for eksempel ved bufhng av middelets toksisitet Liposomer kan også redusere raten hvorved et bioaktivt middel blir fjernet fra sirkulasjonen til dyrene Den liposomale formuleringen til de bioaktive midlene kan bety at mmdre av middelet behøver å bh administrert for å oppnå ønsket effekt Ytterligere bioaktive midler fordelaktige for liposomet innbefatter anti-mikrobielle, anti-inflammatonske og anti-neoplastiske midler, eller terapeutiske lipider, for eksempel, ceramider Det er mest foretrukket at det ytterligere bioaktive middelet er et anti-neoplastisk middel

Liposomene kan appliseres med én eller flere biologisk aktive midler ved oppløsning av middelet 1 lipidet eller den vandige fasen anvendt for å danne liposomene Alternativt kan de loniserbare bioaktive midlene bh applisert 1 liposomer ved først å danne liposomene, etablere et elektrokjemisk potensiale, for eksempel ved en pH-gradient over det ytterste liposomale bilaget, og deretter tilsetning av det loniserbare middelet til det vandige mediet 1 det ytre 1 forhold til liposomet (se Bally et al US-PS 5 077 056 og WO86/01102)

Liposom kan dehydreres, lagres og deretter gjenopprettes slik at en vesentlig del av det indre innholdet blir beholdt i liposomene Liposomal dehydrenng krever vanligvis anvendelse av et hydrofilt tørkebeskyttelsesmiddel (se US-PS 4 229 360 og 4 880 635) Denne hydrofile forbmdelsen antas generelt å forhindre rearrangement av lipidene i liposomet slik at størrelsen og innholdet blir opprettholdt i løpet av tørkeprosedyren og i løpet av rehydrenngen slik at liposomene kan bh gjenopprettet Hensiktsmessige kvali-teter for slike tørkebeskyttelsesmidler er at de er sterke hydrogenbinding aksepterer og har stereokjemiske trekk som bevarer det intramolekylære rommet til hposombilags-komponentene Sakkandsukkeret, fortnnnsvis mono- og disakkander, er egnede tørke-beskyttelsesmidler for liposomer Alternativt kan tørkebeskyttelsesmiddelet bh utelatt dersom hposompreparatet ikke blir frosset før dehydrenng, og tilstrekkelig vann forblir i preparatet etter dehydrenngen

Også gitt hen er en farmasøytisk sammensetning som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og liposom ifølge oppfinnelsen "Farmasøytiske akseptable bærere" som anvendt hen skal anvendes sammen med administrenng av lipider og liposomer, inkludert liposomale bioaktive middelformulennger, til dyr, inkludert mennesker Farmasøytiske akseptable bærere blir generelt formulert ifølge et antall faktorer som hører inn under det som er kjent for fagfolk, inkludert uten begrensning det bestemte liposomale bioaktive middelet som anvendes, konsentrasjonen derav, stabilitet og antatt biotilgjengehg-het, sykdommen, tilstanden eller forstyrrelsen som blir behandlet med liposomal sammensetningen, individet, alderen, størrelsen og den generelle tilstanden, og sammenset-ningens antatte administrenngsvei, for eksempel nasal, oral, oftalmisk, topisk, transder-mal, vaginal, subkutan, i bryst, intrapentonealt, intravenøst eller intramuskulært (se for eksempel Nairn (1985)) Vanlige farmasøytisk akseptable bærere anvendt i den parente-rale bioaktive middeladmimstrenngen innbefatter for eksempel D5W, en vandig oppløs-ning inneholdende 5 vektprosent i volumdekstrose og fyiologisk saltvann Farmasøytisk akseptable bærere kan inneholde ytterligere ingredienser, for eksempel de som forster-ker stabiliteten til de aktive ingrediensene inkludert, så som konservenngsmidler og an-tioksidenngsmidler

Et erhpid kan administreres til et dyr ved å administrere til dyret en farmasøytisk sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer og et liposom med et lipidbilag som omfatter et hodegruppe-denvatisert lipid og eterhpidet Eterhpidet har den kjemiske formelen

Dyret er fortnnnsvis et menneske, og eterhpidet blir administrert intravenøst Liposomet har fortnnnsvis en diameter som er mindre erm omtrent 200 nm, mer foretrukket er fra høyere enn omtrent 50 nm til mindre enn omtrent 200 nm

Det hodegruppe-denvatiserte lipidet er fortnnnsvis en fosfatidyletanolamin-dikarboksylsyre, idet syren fortnnnsvis er glutarsyre og PE er fortnnnsvis DPPE, POPE eller DOPE Det er mer foretrukket at det hodegruppe-denvatiserte lipidet er DOPE-GA Det hode-gruppe-modifiserte lipidet kan også være et sirkulasjonsfremmende lipid

Et mettet hydrokarbon, fortnnnsvis CH3(CH2)i7- er koblet 11 posisjonen av eterhpidet gjennom en O, fortnnnsvis er en metylgruppe koblet i 2 posisjonen gjennom en NO, og fortnnnsvis er den polare gruppen i 3 posisjonen fosforylchohn Det foretrukne eterhpidet er følgelig l-0-oktadecyl-2-0-metyl-3-sn-glycero-fosfochohn ("ET-I8-OCH3") Liposomets lipidbilag omfatter også en sterol, fortnnnsvis, kolesterol og et nøytralt lipid, så som PC, og fortnnnsvis DOPC Bilaget kan også omfatte et sirkulasjonsfremmende lipid

Liposomet anvendt 1 fremgangsmåten har fortnnnsvis et lipidbilag omfattende ET-18-OCH3 DOPE-GA kolesterol og DOPC Det er mer foretrukket at bilaget omfatter omtrent 40 molprosent DOPC, omtrent 30 molprosent kolesterol, omtrent 10 molprosent DOPE-GA og omtrent 20 molprosent eterhpid

Eterhpidene antas generelt å være selektivt cytotoksiske overfor tumorcellene Fremgangsmåten kan følgelig anvendes for å behandle dyr som er påvirket med cancer, inkludert, men ikke begrenset til, et karcinom, leukemi, myelom, neuroblastom eller et sar-kom 1 lunge, hjerne, ovane, tarm eller bryst Generelt kan liposomale eterlipider anvendes for å behandle cancerformer behandlet med fri, dvs lkke-hposomale, eterlipider Innkapsling av et eterhpid 1 et liposom kan denmot forsterke dets terapeutiske indeks og derfor gjøre det liposomale eterhpidet til en mer effektiv behandling Fremgangsmåten blir praktisert ved administrenng til dyret av en anti-neoplastisk effektiv mengde av det liposomale eterhpidet ifølge oppfinnelsen Administrering av det liposomale eterhpidet kan inhibere metastaser i cancerholdige celler, eller deres invasjon av vev

I foreliggende oppfinnelse utgjør "anti-cancer effektive mengder" av de liposomale eterhpidene mengder som effektivt inhiberer, lindrer, gjør mindre eller forhindrer etable-ring, vekst, metastaser eller invasjon av en eller flere cancere i dyr som har fått administrert eterhpidene Cancereffektive mengder blir generelt valgt i henhold til et antall faktorer, for eksempel alder, størrelse og den generelle tilstanden til individet, canceren som blir behandlet og den antatte admimstrenngsveien, og bestemt ifølge forskjellige metoder, for eksempel, doseomfattende forsøk, som er velkjente for fagfolk innenfor dette området Anti-neoplastiske effektive mengder av det liposomale eterhpidet ifølge oppfinnelsen ventes generelt å være omtrent de samme som slike mengder av fne, lkke-hposomale eterlipider og varierer fra omtrent 0,1 mg eterhpid pr kg kroppsvekt til dyret som blir behandlet til omtrent 1000 mg av eterhpidet pr kg kroppsvekt Den anti-neoplastiske effektive mengden av eterhpidet er fra omtrent 1 mg eterhpid pr kg kroppsvekt til omtrent 500 mg pr kg Det er mer foretrukket at den anticancereffektive mengden av det liposomale eterhpidet er fra omtrent 5 mg/kg til omtrent 100 mg/kg

Fremgangsmåten kan også anvendes for å administrere et eterhpid til et dyr påvirket av en anti-inflammatonsk forstyrrelse Inflammatonske forstyrrelser som kan behandles ifølge fremgangsmåten i denne oppfinnelsen innbefatter uten begrensning artntt tilstander så som unnsyregikt, reumatoid artntt, filiær artntt og Lymes sykdom, astmatiske forstyrrelser, allergiske reaksjoner og lignende Dyr blir behandlet for slike forstyrrelser ved administrenng av en anti-inflammatonsk effektiv mengde av eterhpidet til dyret

Betennelse er en prosess med cytologiske og histologiske reaksjoner som oppstår i på-virkede blodårer og omgivende vev, i respons til skade (se for eksempel Stedman's Medical Dictionary (Illustrated) (1982)) Betennelsesresponser så som stimuli innbefatter lokale reaksjoner og resulterende morfologiske forandnnger, ødeleggelse eller fjem-bare skadematenaler og aktivering av reparenngsmekamsmer Betennelse kan følgelig

være en del av prosessen hvorved dyrene leger seg selv Betennelse kan imidlertid også oppstå i respons til unormale fysiologiske stimuli og kan forårsake problemer i kroppen Ledd, for eksempel, blir betente ved artnttilstander så som unnsyregikt, filiær artntt, reumatoid artntt og Lymes sykdom (se for eksempel Stedman's Medical Dictionary (illustrated), supra, sidene 123-124) Disse tilstandene karaktenseres av ekstravasasjon av cellene, dvs bevegelse av celler fra sirkulasjonen og inn i det betente området Mid-

ler som inhiberer slik ekstravasasjon, eller som ellers kan inhibere lnflammatonske responser på unormale fysiologiske stimuli, kan anvendes for å lindre betennelse

En "anti-inflammasjonseffektiv mengde" av et hposomalt eterhpid er en hvilken som helst mengde av eterhpidet som effektivt kan lindre, inhibere eller forhindre lnflamma-tonske responser eller reaksjoner hos dyr påvirket av tilstander kjennetegnet ved unor-mal betennelse, dvs betennelse som er etter respons på unormale fysiologiske stimuh og som ikke er del av dyrets normale reparenngsprosess i respons til en skade Anti-inflammatonsk effektive mengder av eterlipider er generelt fra omtrent 0,1 mg eterhpid pr kg kroppsvekt av dyret som behandles til omtrent 1000 mg eterhpid pr kg kroppsvekt

Fremgangsmåten kan også omfatte admimstrenng av et ytterligere biologisk aktivt middel til et dyr, dvs et biologisk aktivt middel i tillegg til eterhpidet som blir administrert Dette ytterligere biologisk aktive middelet, for eksempel et antimikrobiell middel, anti-inflammatonsk middel, anti-neoplastisk middel, terapeutisk lipid eller hematopoetisk cellevekststimulerende middel kan være assosiert, eller uassosiert, med liposomet "Assosiasjon" av et biologisk aktivt middel med et liposom betyr mneslutmng av middelet i et vandig rom eller lipidbilag til liposomet, eller assosiasjon, for eksempel, ved hjelp av kompleksdannelse, av middelet med overflaten til det indre eller ytre monolaget til bilaget Det ytterligere biologisk aktive middelet assosiert med liposomet er fortnnnsvis et anti-neoplastisk middel, så som et anthracykhn antibiotika, antimetabolitt eller vinka alkaloid Uassosierte bioaktive midler kan bh administrert sammen med, eller ved forskjellige tidspunkter enn hposoma-dministrenngen Foretrukne uassosierte biologisk aktive midler er røde blodcelle-vekststimulerende midler, for eksempel erytro-poetin, eller interleukin-3 (IL-3) og granulocyt/makrofag kolonistimulerende faktor

(GM-CSF)

Foreliggende oppfinnelse vedrører et liposom kjennetegnet ved at det har et lipidbilag omfattende et eterhpid og et hode-gruppe-denvatisert lipid, i det eterhpidet har følgende kjemiske formel hvor Ri er Y1Y2, Y2 er CH3 eller CO2H og Yi er

(CH2)nl(CH=CH)n^ H2)n9.

hvor summen av ni +2n2 +n3 +2n4 +n5 +2n6 +n7 +2n8 +n9 er hk et tall fra 3 til 23, ni er null eller et tall fra 3 til 23, n3 er 0 eller et tall fra 1 til 21, n5 er 0 eller et tall fra 1 til 18, n7 er 0 eller et tall fra 0 til 15, n9 er 0 eller et tall fra 1 til 12, og hver av n2, n4, n6 og 8 er uavhengig 0 eller 1,

idet Z er 0 eller S,

idet R2 er Y! Y2 eller (C(Xi)ni0(X2)nl 1^^X3X4X5,

hvor hver av Xi, X2, X3, X4 og X5 er uavhengig H eller F, ni0 er hk 0,1 eller 2, ni 1 er 0,1 eller 2, og ni 2 er 0 eller et tall fra 1 til 23, og summen av ni 0 + ni 1 er hk 2 når ni2 ikke er 0,

idet R3 har formelen R5-P(0)2-0-R6, R5 er O, S eller NH, Re er CH2CH2N(CH3)3, CH2CH2N<H>2, CH2CH(OH)CH2OH eller CH2CH2NHC(0)R7 og hvor R7 er Y2CH3 eller Y2CO2H

Oppfinnelsen vedrører også en farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og liposomet ifølge krav 1

Oppfinnelsen vil forstås bedre ut fra følgende eksempler

EKSEMPLER

Eksempel 1

Preparering

Kjemikalier eterhpid (EL), eggfosfatidylchohn (EPC), distearoylfosfatidylchohn (DSPC), dipalmitoylfosfatidyletanolamin-glutarsyre (DPPE-GA), palmitoyloleoylfosfa-tidyletanolamin-glutarsyre (POPE-GA), og dioleylfosfatidyletanolamin-glutarsyre (DOPE-GA) ble oppnådd fra Avanti Polar Lipids (Birmingham, Alabama) Kolesterol (Chol) ble oppnådd fra Sigma Chemical Company USA Dulbeccos fosfatbufret saltvann (D-PBS) ble oppnådd fra Gibco BRL Life Technologies Inc (Grand Island, New York, USA) Alle andre reagenser hadde den høyest mulige tilgjengelige renheten

Li<p>osomer "Tomme" liposomer ble dannet ifølge oppløsningsmiddel avdampningsme-

toden Liposomer inneholdende EL ble dannet ved først å oppløse EL i kloroform og blanding i EPC/Chol, DOPC/Chol eller DSPC/Chol ved forskjellige mol-forhold, med og uten 10-molprosent av enten DPPE-GA, POPE-GA eller DOPE-GA i kloroform og metanol (2 1 v/v) Det organiske oppløsningsmiddelet ble fjernet under vakuum ved anvendelse av en roterende avdamper og tynn tørket film ble hydrert med en bufferoppløs-

nmg av DPBS De resulterende preparatene ble ekstrudert 10 ganger gjennom 0,1 um dobbelt "stacked" Nucleopore filteret ved anvendelse av en ekstrudenngsinnretning (Lipex Biomembrane Vancouver, BC, Canada) Størrelsene på liposomene ble bestemt ved lysspredning med en Nicomp Model 370 Submicron Particle Sizer I alle studiene hadde liposomene en gjennomsnittlig diameter på mellom 96-126 nm

Eksempel 2

Rød blodcelle (RBC) hemolyseanalyse

En 4% suspensjon av røde blodceller (RBC), 0,5 ml vasket tre ganger i PBS ble inkubert

med forskjellige konsentrasjoner (fortynnet i sene) av "tomme" liposomer, dvs hposo-

mer uten eterlipider eller biologisk aktive midler, fri (ikke-liposomalt) eterhpid, dannet som beskrevet ovenfor Disse prøvene ble vortex behandlet på en 37°C agitator 120 ti-

mer og ble deretter sentnfugert 110 minutter ved 3000 omdreininger per minutt 0,2 ml av den resulterende supernatanten ble fortynnet til 1 ml med vann, og prosentandel he-

molyse i prøven ble kvantifisert ved spektrofotometnsk granskning ved 550 nm Fngjø-

nng av hemoglobin ved hypotomsk lysenng av et likt antall RBC i vann ble tatt som 100% positiv kontroll, PBS virket som negativ kontroll Eterhpidet anvendt i formulenngene var l-0-oktadecyl-2-0-metyl-sn-glycero-3-fosfochohn (ET-I8-O-CH3)

Resultater fra disse studiene er presentert 1 tabell 1 (se nedenfor), og den første kolonnen indikerer komponenter av formuleringen testet for hemolytisk aktivitet, midtre kolonne indikerer molare forhold til de respektive komponentene og den tredje kolonnen indike-

rer hpidkonsentrasjon (mikromolar) for 5% hemolyse ble observert (HI5)

Eksempel 3

In vitro munn cancercellevekst inhiberingsstudier

Den spesifikke inhibenngen av in vitro proliferasjon av forskjellige cancerceller ved fin, liposomal-ET-18-OCH3 eller tom (EL-fn) liposomer ble registrert i en sulforhodamin B (SRB) analyse 5000 Lewis lungecancer (LLC), P388 eller P388-adriamycin resistente (ADR) celler/brønn ble separat sådd ut på 96 brønn flatbunnet mikrotiterskåler i et RPMI-1640 medium supplert med 10% FBS og oppbevart ved 37°C i en fuktet atmos-fære på 5% CC"2 Etter 24 timer ble cellene eksponert for forskjellige konsentrasjoner av enten tomme (EL-fne) liposomer, DPBS, fritt eterhpid eller hposomalt-eterhpid og dyrket i ytterligere 48 timer ved 37°C Celler behandlet med forskjellige formuleringer av ET-18-OCH3 ble fiksert ved tilsetning av 50 ul kald 50% (v/vol) tnkloreddiksyre (TCA) og inkubert ved 4°C 11 time Skålene ble skylt 5 ganger med deionisert vann og lufttørket over natt 100 ul SRB (0,4% v/vol 11% eddiksyre) ble tilsatt og inkubert ved romtemperatur i 10-15 minutter Ubundet SRB ble fjernet ved vasking 5 ganger med 1% eddiksyre Skålene ble lufttørket og bundet SRB ble oppløst med tris buffer og optiske tettheter ble avlest ved 551 nm og 50% vekstinhibenng (GI50) ble beregnet ifølge formelen 50 x ((T - TO)/(C-TO)) = 50, hvor kontrolloptisk tetthet er (C), testoptisk tetthet (T) og optisk tetthet ved tid 0 er (TO)

Resultatene er presentert 1 tabell 2 (se nedenfor) som konsentrasjon av eterhpid som oppnådde 50% vekstinhibenng (GI50) og første kolonne indikerer sammensetningen av formulenngen som ble testet, den andre kolonnen indikerer de molare forholdene til de respektive formulenngskomponentene og tredje, fjerde og femte kolonne er GI5Q data for LLC, P388 og P388-ADR kulturer Eterhpidet anvendt 1 formulenngene var l-O-oktadecyl-2-0-metyl-sn-glycero-3-fosfocholm

Eksempel 4

In vitro humane cancercellevekstinhiberingsstudier

Human A549 lungecancer (MCF7 og MCF7/ADR celler ble sådd ut (5000 celler per

brønn) og etter 24 timers inkubasjon ble de eksponert for forskjellige konsentrasjoner av eterhpid, enten fritt eller hposomalt, 172 timer Vekstinhibenngen ble bestemt ved anvendelse av SRB-analysen Inkubasjon med kontrolhposomer, ikke inneholdende eterh-

pid, forårsaket ikke vekstinhibenng ved hpidkonsentrasjoner opptil 60 um Resultatene er presentert i tabell 3 (se nedenfor) som konsentrasjonen av eterhpid som førte til opp-

nåelse av 50% vekstinhibenng (GI50), hvor den første kolonnen indikerer sammensetningen av formulenngen som ble testet, den andre kolonnen indikerer det molare forhol-

det til formulenngsbestanddelene og tredje, fjerde og femte kolonner indikerer resultater for A549, MCF7 og MCF7/ADR kulturer Eterhpidet anvendt 1 formulenngene var l-O-oktadecyl-2-0-metyl-sn-glycero-3-fosfochohn

Eksempel 5

In vivo toksisitetsstudier

Grupper av hunn C57/BL6 mus (5/gruppe, vekt 20-22 g) ble injisert med forskjellige doser av fri (12,5-200 mg/kg) og liposomal-eterhpid (12,5-200 mg/kg) i PBS via nålevenen Etanol ble også injisert i en separat gruppe av mus Musene ble observert for øye-blikkelig, akutt toksisitet og resultatene er presentert i tabell 4 (se nedenfor)

Eksempel 6

In vtvo effektivitetsstudier

Lewis lungecancer celler (LLC) ble oppnådd fra ATCC og opprettholdt i RMPI medium Fire grupper (10/gruppe) hunn C57/BL6 mus (kroppsvekt 18-22 g) ble injisert med 2 x 10^ celler LLC suspendert 10,2 ml steol PBS via nålevenen på dag 0 På da-gene 1, 3,5,7, 9 etter tumonnjeksjon mottok første og andre grupper enten 25 mg/kg fri EL eller hposomal-EL via nålevenen Tredje og fjerde grupper ble administrert enten med samme mengde lipid dosert som EL-fhe liposomer eller med 0,2 ml PBS In vivo anti-metastatisk aktivitet til fri og hposomal EL ble vurdert på grunnlag av antall tumor-noduler til stede i lungene til eksperimentelle grupper av mus Resultatene er presentert i figurene 1 og 2

Siterte referanser

U S- patentdokumenter

4 159 988,4 163 748,4 235 871,4 382 035,4 522 803,4 588 578, 4 734 225, 4 804 789,4 837 028,4 920 016,4 975 282,5 008 050, 5 013 556,5 030 453, 5 059 421,5 077 056, 5 169 637,3 752 886

Utenlandske patentdokumenter

WO89/008846,1 583 661,4 132 345

Andre

Bazill and Dexter, Cancer Res 50 7505 (1990)

Berdel,Br J Cancer 64 208(1991)

Berdel, Onkologie 13 245 (1990)

Bhaha and Hadju, Lipids 26(12) 1424 (1991)

BLume et al, Biochim Biophys Acta U1149U 180(1993)

Damell et al, Molecular Cell Biology Scientific American Books Inc (1986), New York,s 573-575

Deamer and Uster, "Liposome Preparation Methods and Mechanisms," in Liposomes (M Ostro, ed), Marcel Dekker, Inc New York (1983), s 27-52

Dietzfelbinger et al, Cancer Res 53 3747 91993)

Gabizon et al, Pharm Res 10(5) 703 91993)

Layton et al, Eur J Cancer 16 64 (1980)

Lewis and McElhaney, The Mesomorphic Phase Behavior of Lipid Bilayers, "in The StructureofBiologicalMembranes(P Yeggle, ed), CRC Press, Inc (1992), Boca Raton,Fl s 73-165, på s 123-126

Muschiol et al, Lipids 22(11) 930 (1987)

Naim, in Remington's Pharmaceutical Science (A Gennaro, ed), Mack Publishing Co, Easton,PA,(1985),s 1492-1517

Papahadjopoulos et al, Biochem Biophys Acta 135 624 (1968)

Park et al, Biochim Biophys Acta 1108 257(1992)

Powis et al, Cancer Res 52 2835 (1992)

Powis et al, Cancer Res 50 2203 (1990)

Reed et al, Life Sei 49 1221 (1991)

Runge et al, JNCI, 64(6) 1301 (1980)

Stedman's Medical Dictionary (illustrated) (24th edition, J V Basmajian et al, eds ), Williams and Wilkms, Baltimore, MD (1982), s 707-708

Tntton and Hickman, Cancer Cells 2(4) 95 (1990) Workman, Cancer Cells 3(8) 315 (1991)

Workman et al, Biochem Pharmacol 41(2) 319(1991) Zeisig et al, Anti-Cancer Drugs 4 57 (1993)

Claims (14)

1 Liposom, karakterisert ved at det har et lipidbilag omfattende et eterhpid og et hode-gruppe-denvatisert lipid, i det eterhpidet har følgende kjemiske formel hvor Ri er Yi Y2, Y2 er CH3 eller C02H og Yi er H2)n9» hvor summen av ni +2n2 +n3 +2n4 +n5 +2n6 +n7 +2n8 +n9 er hk et tall fra 3 til 23, ni er null eller et tall fra 3 til 23, n3 er 0 eller et tall fra 1 til 21, n5 er 0 eller et tall fra 1 til 18, n7 er 0 eller et tall fra 0 til 15, n9 er 0 eller et tall fra 1 til 12, og hver av n2, n4, n6 og 8 er uavhengig 0 eller 1, idet Z er 0 eller S, idet R2 er YiY2 eller (C(Xi)nl0(X2)nl l)nl2CX3X4X5, hvor hver av Xi, X2, X3, X4 og X5 er uavhengig H eller F, nlO er hk 0,1 eller 2, ni 1 er 0,1 eller 2, og nl2 er 0 eller et tall fra 1 til 23, og summen av nlO + ni 1 er hk 2 når ni 2 ikke er 0, idet R3 har formelen R5-P(0)2-0-R6, R5 er O, S eller NH, R$ er CH2CH2N(CH3)3, CH2CH2NH2, CH2CH(OH)CH2OH eller CH2CH2NHC(0)R7 og hvor R7 er Y2CH3 eller Y2C02H

2 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved at liposomet har en diameter som er større enn omtrent SO nm til mindre enn omtrent 200 nm

3 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved at Rf er (CH2)17CH3

4 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved atZerO

5 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved at eterhpidet er

6 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved at det hodegruppe-denvatiserte lipidet er en fosfatidyletanolamin-dikarboksylsyre

7 Liposom ifølge krav 6, karakterisert ved at fosfatidyletanolamin er dioleoylfosfatidyletanolamin

8 Liposom ifølge krav 6, karakterisert ved at fosfatidyletanolamin-dikarboksylsyre erdioleoylfosfatidyletanolamin-glutarsyre

9 Liposom ifølge krav l, karakterisert ved at bilaget omfatter en sterol som er kolesterol

10 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved at bilaget omfatter et nøytralt lipid som er et fosfatidylcholin

11 Liposom ifølge krav 10, karakterisert ved at fosfati-dylchohnet er dioleoylfosfatidylchohn

12 Liposom ifølge krav 1, karakterisert ved at det videre omfatter en sterol og et nøytralt lipid

13 Liposom ifølge krav 12, karakterisert ved at bilaget omfatter omtrent 20 molprosent eterhpid, omtrent 10 molprosent av et hodegruppe-denvatisert lipid som er en fosfatidyletanolamin-glutarsyre, omtrent 30 molprosent kolesterol og omtrent 40 molprosent av et fosfatidylcholin som er dioleoylfosfatidylchohn

14 Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer og liposomet ifølge krav 1