ES2270991T3

ES2270991T3 - Sistemas basados en lipidos para el direccionado de agentes de diagnostico.

Info

Publication number: ES2270991T3
Application number: ES01921263T
Authority: ES
Inventors: Kent Jorgensen; Jesper Davidsen; Charlotte Vermehren; Sven Frokjaer; Ole G. Mouritsen
Original assignee: Liplasome Pharma ApS
Current assignee: Liplasome Pharma ApS
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: US20070134153A1; DE60126072D1; DK1272161T3; AU2001248302A1; JP2003530339A; JP2003530338A; EP1272225B1; ES2280355T3; DE60122304T2; ATE382333T1; ES2295149T3; US7368254B2; CY1106462T1; US7166297B2; WO2001076555A2; WO2001076556A2; EP1272161A2; WO2001076556A3; ATE336267T1; DE60126072T2

Abstract

Utilización de un sistema basado en lípidos que comprende un derivado de lípido y un marcador, teniendo dicho derivado de lípido (a) un grupo alifático con una longitud mínima de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) una fracción hidrofílica, siendo además dicho derivado de lípido un sustrato para PLA2 extracelular en la medida de que el radical orgánico puede ser fraccionado hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente sin afectar, de manera que el derivado de lípido del cual se ha fraccionado el radical orgánico es liberado en forma de un derivado lisolípido que no es un sustrato para lisofosfolipasa, llevando incluido dicho sistema en el mismo lipopolímeros o glicolípidos a efectos de presentar cadenas hidrofílicas en la superficie del sistema para la preparación de un compuesto de diagnóstico para detectar y/o cuantificar enfermedades o estados asociados con un incremento localizado de actividad de PLA2 extracelular en tejidos de mamíferos.

Description

Sistemas basados en lípidos para el direccionado de agentes de diagnóstico.

Sector técnico al que pertenece la invención

La presente invención se refiere al direccionado de agentes de diagnóstico (que se designarán a continuación, en general, como "marcadores") por utilización de compuestos basados en lípidos. La invención se refiere a la utilización de compuestos basados en lípidos para la preparación de un compuesto de diagnóstico que es útil en el diagnóstico de diferentes desórdenes que están asociados a niveles incrementados de actividad de PLA_{2} extracelular, o que resultan de la misma, en los tejidos enfermos, por ejemplo, en estados de cáncer, infecciosos e inflamatorios.

Antecedentes de la invención

La formación de imágenes para diagnóstico es ampliamente utilizada en medicina contemporánea. Requiere que se consiga una intensidad apropiada de señal de un área de interés a efectos de diferenciar ciertas estructuras con respecto a tejidos circundantes, con independencia de la técnica utilizada. Tal como se ha hecho observar por Torchilin (1996), la formación de la imagen comporta la relación entre las tres dimensiones espaciales de la zona de interés y una cuarta dimensión, el tiempo, que se relaciona tanto a la farmacocinética del agente, como al periodo necesario para captar la imagen. Las características físicas que se pueden utilizar para crear una imagen incluyen emisión o absorción de radiación, impulsos magnéticos nucleares y relajación, y transmisión o reflexión de ultrasonidos. De acuerdo con los principios físicos aplicados, las técnicas de formación de imágenes utilizadas en la actualidad incluyen \gamma-escintilografía (comportando la aplicación de materiales radio-activos que emiten radiaciones \gamma); resonancia magnética (MR, fenómeno basado en la transición entre diferentes niveles de energía de núcleos atómicos bajo la acción de una señal de radiofrecuencia); tomografía computerizada (CT, la técnica que utiliza radiación de ionización con ayuda de ordenadores para conseguir imágenes en sección del cuerpo e imágenes tridimensionales de áreas de interés); y ultrasonografía (US, técnica que utiliza irradiación con ultrasonidos y que se basa en la diferente velocidad a la que pasan los ultrasonidos a través de diferentes tejidos). Las cuatro técnicas de formación de imágenes difieren en sus principios físicos, sensibilidad, resolución (tanto espacial como temporal), capacidad de proporcionar imágenes sin incremento del contraste mediado por agentes, y algunos otros parámetros, tales como coste y seguridad. Usualmente, la formación de imágenes de diferentes órganos y tejidos para la detección temprana y localización de numerosas patologías no se puede conseguir satisfactoriamente sin agentes de contraste apropiados (ver más adelante) en diferentes procesos de formación de imágenes.

Para mejorar la formación de imágenes se utilizan agentes de contraste. Estos son sustancias capaces de absorber ciertos tipos de señales (irradación) en mucha mayor medida que los tejidos circundantes. Los agentes de contrastes son específicos para cada técnica de formación de imágenes (tabla 1), y como resultado de su acumulación en ciertos lugares de interés, estos lugares pueden ser fácilmente visualizados cuando se aplica la técnica apropiada de formación de imágenes.

TABLA 1

1

La concentración en tejidos que se debe conseguir para la formación satisfactoria de imágenes varía de unas técnicas a otras y según las fracciones de material de diagnóstico, ver tabla 1. En muchos casos, la formación de imágenes mediada por agentes de contraste se basa en la capacidad de ciertos tejidos (es decir, tejidos ricos en macrófagos) en absorber las substancias en partículas. Este procedimiento depende del tamaño de las partículas y se basa en delicado equilibrio entre partículas suficientemente pequeñas para entrar en el cuerpo o en los capilares linfáticos pero que, no obstante, son suficientemente grandes para ser retenidos dentro del tejido. En cualesquiera técnicas de formación de imágenes, se utilizan dos rutas de administración de agente de contraste principales: circulación sistémica y circulación local. Cada una tiene sus propias ventajas e inconvenientes. Al variar las características fisicoquímicas de un agente de contraste, o portador de contraste, la velocidad de desaparición del mismo del lugar de inyección, después de administración local, se puede modular. Una desventaja de la administración sistémica es que incrementa la exposición de órganos no direccionados a agente de contraste potencialmente tóxico.

Liposomas

Para facilitar la acumulación de agente de contraste en la zona requerida, se han sugerido diferentes micropartículas como portadores de los agentes de contraste. Entre estos portadores, adquieren una importancia especial los liposomas, vesículas de fosfolípido artificial microscópico, a causa de sus características fácilmente controladas y características farmacológicas satisfactorias. Muchos lípidos individuales y sus mezclas, una vez suspendidos en una fase acuosa, forman espontáneamente estructuras bicapa (liposomas) en las que las partes hidrofóbicas de sus moléculas están dirigidas hacia adentro, y las partes hidrofílicas están expuestas a la fase acuosa que las rodea. Existen varios tipos distintos de liposomas; cada uno de los tipos tiene características específicas y pueden ser preparados por métodos particulares. La clasificación usual de liposomas se basa en sus dimensiones y número de bicapas concéntricas que forman una sola vesícula (tales como vesículas multilaminares (MLV), vesículas unilaminares, LUV, vesículas unilaminares pequeñas (SUV)).los métodos para producir las LUV se pueden aumentar fácilmente a escala y se pueden utilizar para producción industrial de grandes lotes de liposomas con dimensiones predictibles y una estrecha distribución de tamaños.

Durante unas dos décadas, los liposomas se han reconocido como prometedores portadores para medicamentos y agentes de diagnóstico por las siguientes razones: (1) los liposomas son completamente biocompatibles; (2) pueden atrapar prácticamente cualquier medicamento o agente diagnóstico en su compartimiento interno de agua o en la propia membrana, dependiendo de las características fisicoquímicas del medicamento; (3) los agentes farmacéuticos incorporados en liposomas están protegidos contra el efecto inactivador de las condiciones externas, pero, al mismo tiempo, no provocan acciones secundarias indeseables; (4) los liposomas proporcionan también una oportunidad exclusiva de facilitar agentes farmacéuticos a las células o incluso dentro de compartimientos celulares individuales. Al pretender diferentes objetivos de suministro in vivo, las dimensiones, carga y características superficiales de los liposomas se pueden cambiar de forma fácil simplemente por adición de nuevos ingredientes a la mezcla de lípidos antes de la preparación del liposoma y/o por variación de los métodos de preparación.

Desafortunadamente, los liposomas fosfolípidos, si se introducen en la circulación, son secuestrados muy rápidamente por las células (tiempo usual de desaparición de la mitad dentro de 30 min) del sistema reticuloendotelial (RES). Las células del hígado son básicamente responsables, y la acción de secuestro depende relativamente de sus dimensiones, carga y composición de los liposomas. Los monocitos de la sangre periférica circulante pueden someter, también, los liposomas a endocitosis y, posteriormente, infiltrar tejidos y facilitar liposomas sometidos a endocitosis a ciertas áreas patológicas del cuerpo.

Hasta recientemente, el potencial de los liposomas como portadores de medicamentos ha estado limitado por la desaparición rápida de los liposomas del flujo sanguíneo. Por ejemplo, los liposomas convencionales pueden desaparecer mayoritariamente del flujo sanguíneo dentro de 1-2 horas después de administración intravenosa.

Se han propuesto una serie de enfoques para ampliar el tiempo de circulación de los liposomas. Dos de éstos han sido satisfactorios en la ampliación de la media vida de los liposomas en el flujo sanguíneo en periodos que llegan hasta 48-50 horas. En un enfoque, descrito en la patente USA nº 4.837.028, los liposomas son formulados con el gangliósido G_{M1} y predominantemente lípidos rígidos. En otro enfoque general, que se da a conocer en la patente USA nº 5.013.556, los liposomas son dotados de un recubrimiento de una capa de cadenas de polietilén glicol (PEG).

La formación de imágenes de los órganos más ricos en macrófagos de RES, hígado y bazo fue la que se llevó acabo, en primer lugar, con liposomas cargados de contraste, dado que los órganos RES son los objetivos naturales para los liposomas y se acumulan bien en aquellos después de la administración intravenosa. La formación de imágenes de diagnóstico del hígado y del bazo está destinada, habitualmente, a descubrir tumores y metástasis en estos órganos, así como ciertas irregularidades en el flujo sanguíneo y procesos inflamatorios. Se ha descrito la utilización de un mínimo de tres técnicas diferentes de formación de imágen es para este objetivo, a saber, imágenes \gamma, MR, y CT.

Formación de imágenes de tumores con liposomas de contraste

Un área de importante aplicación potencial de liposomas cargados de un agente de contraste es la formación de imágenes de tumores. El mecanismo principal de acumulación de liposomas en los tumores es por medio de extravasación con intermedio de capilares de tumores pasando hacia dentro del espacio intersticial. Igual que en muchos otros casos, la eficacia de dicha acumulación se puede incrementar fuertemente utilizando liposomas de circulación larga, con recubrimiento de PEG. Los agentes de formación de imágenes basados en liposomas han sido ya utilizados satisfactoriamente para formación de imágenes \gamma, MR, y CT y, formación sonográfica de tumores. Los liposomas marcados con indio 111 para formación de imágenes de tumores (VesCan®, Vestar, Inc.) se encuentran ya en pruebas clínicas de fase II-III.

También se pueden utilizar formulaciones de liposomas para la visualización de lugares de inflamación y de infección. La utilización de agentes de formación de imágenes de micropartículas para la visualización de lugares de infección y de inflamación se basa en la capacidad de las micropartículas en extravasarse desde la circulación y acularse en dichos lugares, de manera similar a lo que ya se ha descrito para tumores y tejidos infartados.

Los dos problemas principales relacionados con la utilización de liposomas para objetivos de formación de imágenes para diagnóstico, especialmente baja eficacia de los liposomas de contraste en la formación de imagen del tumor, se ha explicado, frecuentemente, por la desaparición rápida de los liposomas de la sangre y su incapacidad en acumularse en los tejidos enfermos. La presente invención se dirige a solucionar estos dos obstáculos.

Breve descripción de la invención

La presente invención está dirigida a sistemas de incremento de imágenes que son particularmente útiles en el diagnóstico de enfermedades, caracterizándose por actividad localizada de actividad extracelular PLA_{2}.

Tal como se ha indicado por Kaiser (1999), parece que se produce PLA_{2} por las células malignas. El teñido inmunohistoquímico de varios tejidos de cáncer, incluyendo cáncer de páncreas, mama y estómago, era positivo en cuanto a PLA_{2}. Una expresión y secreción incrementadas de PLA_{2} se observó en células de cáncer gástrico estimuladas por IL-6, y seis de cada 16 líneas celulares de carcinoma humano segregaron espontáneamente PLA_{2} en el sobrenadante de cultivo (Kaiser, 1999). Por lo tanto, parece bastante bien establecido que los niveles incrementados de actividad extracelular de PLA_{2} están asociados a tejidos cancerosos.

La actividad incrementada de PLA_{2} en tejidos tumorales, combinada con la observación de que los liposomas se acumulan en tumores por extravasación con intermedio de capilares tumorales hacia adentro del espacio intersticial, es base para la utilización de liposomas para favorecer la formación de imágenes de tumores que se da a conocer en esta descripción.

Además, la actividad extracelular PLA_{2} es elevada en ciertas zonas enfermas, tales como tejidos inflamatorios e infectados. De manera similar a lo que se observa con respecto a lugares de tejidos cancerosos, se ha observado que se extravasan micropartículas de la circulación y se acumulan en tejidos infectados, inflamados e infartados (Torchilin, 1998). No obstante, es importante observar que es posible discriminar entre infección y tumor utilizando, por ejemplo, ^{67}Ga liposomas cargados positivamente que se acumulan en tumores y no se acumulan en lugares de infección (Ogihara (1986) J Nucl Med 27, 1300-7).

Esta invención da a conocer un sistema de suministro de marcador del tipo indicado, en forma de portadores basados en líquidos, por ejemplo, liposomas o micelas, compuesto por una bicapa de lípido que forma eter-lípidos, tales como glicerofosfolípidos que contienen un enlace alquilo en posición 1 y un enlace acilo en la posición sn-2 en el núcleo de glicerol y que tienen cadenas de polímeros o de polisacáridos injertados al mismo. Además, el sistema portador puede contener componentes estabilizantes de la bicapa de lípido, por ejemplo, lipopolímeros, glicolípidos y esteroles que conducen a un tiempo de circulación vascular incrementado y, como consecuencia, una acumulación en los tejidos enfermos que constituyen el objetivo. Cuando los portadores alcanzan el lugar objetivo para el marcado, por ejemplo, células cancerosas, la hidrólisis catalizada por PLA^{2} del enlace acilo libera el marcador, típicamente liso eterlípidos y derivados con enlace éster. Al contrario que las encimas de fraccionamiento de alquilo que se encuentran casi ausentes en las células cancerosas, la actividad extracelular de PLA_{2} es elevada en tejidos cancerosos. Además, la actividad extracelular de PLA_{2} es elevada en zonas enfermas, tales como tejidos
inflamatorios.

La presente invención da a conocer la utilización de un sistema basado en lípidos que comprende un derivado lípido y un marcador, teniendo dicho derivado lípido (a) un grupo linfático con una longitud mínima de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene como mínimo 7 átomos de carbono y, (b) una fracción hidrofílica, siendo además dicho derivado lípido un substrato para que PLA^{2} extracelular en la medida que el radical orgánico puede ser separado hidrolíticamente por fraccionamiento, mientras que el grupo alifático sigue sustancialmente sin ser afectado, de manera que el derivado lípido, del que se ha separado el radical orgánico, es liberado en forma de un derivado lisolípido que no es substrado para lisofosfolipasa, llevando dicho sistema, incluido en el mismo, lipopolímeros o glicolípidos a afectos de presentar cadenas hidrofílicas en la superficie del sistema, para la preparación de un compuesto de diagnóstico para detectar y/o cuantificar enfermedades o estados asociados con un incremento localizado de la actividad de PLA_{2} extracelular en tejidos de mamíferos.

Por lo tanto, la presente invención aprovecha el descubrimiento sorprendente de que los liposomas (y micelas) incluyendo derivados lípidos que pueden ser reaccionados específicamente y solamente de forma parcial por fosfolipasas extracelulares y que, al mismo tiempo, incluyen lipopolímeros o glicolípidos, tiene las propiedades de circular en el torrente sanguíneo durante un tiempo suficientemente largo para alcanzar los tejidos objetivo en los que la actividad de PLA_{2} extracelular es elevada sin ser reconocidos por los sistemas reticuloendoteliales del mamífero y sin penetrar en las paredes de las células, de manera que los derivados lípidos de los liposomas son fraccionados específicamente por PLA_{2} extracelular, a efectos de liberar ingredientes de ampliación de la imagen en el lugar deseado.

Descripción de los dibujos

Figura 1. Curvas de capacidad calorífica obtenidas utilizando calorimetría de escaneado diferencial. (a) Liposomas multilamelares, MLV (curva superior) y unilamelar, LUV (curva inferior) constituidos por 1 mM 1-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC). (b) liposomas MLV (curva superior) y LUV (curva inferior) constituidos por dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC).

Figura 2. Perfil de tiempo de reacción característica a 41ºC para hidrólisis de fosfolipasa A_{2}, PLA_{2}, (A. piscivorus piscivorus) de liposomas unilamelares 1-O-DPPC compuestos por 90% 1-O-DPPC y 10% 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). La reacción de hidrólisis de PLA_{2} es controlada por fluorescencia intrínseca (línea continua) a partir del encima y dispersión de luz estática a 90ºC (líneas de trazos) de la suspensión de lípido. Después de añadir PLA_{2} a 800 seg a la suspensión de liposomas equilibrada sigue un tiempo de retardo característico, antes de un incremento brusco de la actividad catalítica. Se tomaron muestras para HPLC antes de añadir el encima y 20 minutos después del tiempo de retraso observado.

Figura 3. Cromatogramas por HPLC que ilustran el efecto de hidrólisis de fosfolipasa A_{2} de liposomas compuestos por 90% 1-O-DPPC y 10% de 1-O-DPPE-PEG350. Los cromatogramas muestran la cantidad de 1-O-DPPC (100% línea continua) antes de la añadidura de fosfolipasa A_{2} (A, piscivorus piscivorus) a la suspensión de liposoma y la cantidad de 1-O-DPPC (75% línea de trazos) después de la ráfaga de retardo.

Figura 4. Liberación controlada por PLA_{2} del medicamento modelo fluorescente y/o calceína agente de contraste a partir de liposomas compuestos por 25 \muM 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) suspendida en tampón 10 mM HEPES (pH = 7,5), en función del tiempo. Se añadió 25 nM fosfolipasa A_{2} (piscivorus piscivorus) a los 900 seg, siendo la temperatura de 37ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina como % de liberación = 100(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), siendo I_{F(t)} la fluorescencia medida en el tiempo t después de la adición del encima, siendo I_{B} la fluorescencia de fondo, e I_{T} la fluorescencia total medida después de adición de Triton X-100 que conduce a la liberación completa de calceína al fraccionar los liposomas.

Figura 5. Liberación controlada por PLA_{2} de la calceína fluorescente en la membrana objetivo de membranas no hidrolizables (ver figura 11b), como función del tiempo para liposomas compuestos por 25 \muM 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) suspendida en tampón 10 nM HEPES (pH = 7,5). Se añadieron 25 nM de fosfolipasa A_{2} a los 0 seg y la temperatura era de 37ºC. El porcentaje de calceína liberado se determina tal como se describe en la figura 4.

Figura 6. Perfil de hemólisis de células normales de hemoglobina en presencia de liposomas compuestos por 100% 1-O-DPPC (cuadrados); 90% 1-O-DPPC y 10% 1-O-DPPE-PEG350 (triángulos); 90% 1-O-DPPC y 10% 1-O-DPPE-PEG2000 (círculos) y ET-18-OCH_{3} (diamantes). Las concentraciones que proporcionan 5% de hemólisis (H_{5}) se encontraban bastante por encima de 2 mM para liposomas compuestos por 100% de 1-O-DPPC, y para liposomas compuestos por 90% 1-O-DPPC con 10% de DPPE-PEG350. El ensayo de hemólisis fue llevado a cabo tal como se describe por Perkins y otros, 1997, Biochimica et Biophysica Acta 1327, 61-68. De forma breve, cada muestra fue diluida en serie con una solución salina con tampón de fosfato (PBS), y se mezclaron 0,5 ml de cada suspensión diluida con 0,5 ml de hemoglobina humana lavada (RBC) [4% en PBS (v/v)]. La muestra y la suspensión normal se colocaron en una incubadora de 37ºC y se agitó durante 20 horas. Se centrifugaron tubos a baja velocidad (2000 x G) durante 10 minutos y 200 \mul del sobrenadante fueron cuantificados por absorbancia a 550 nm. Se definió 100 por cien de hemólisis como la cantidad máxima de hemólisis obtenida del detergente Triton X-100. El perfil de hemólisis de la figura 6 muestra un valor bajo de hemólisis (por debajo de 5%) para liposomas 2 mM 1-O-DPPC y para liposomas 1-O-DPPC con 10% 1-O-DPPE-PEG350.

Figura 7. Perfiles de tiempo reacción característicos a 41ºC para hidrólisis PLA_{2} (A. piscivorus piscivorus) de liposomas unilamelares incorporados con 0,5 y 10% de lipopolímeros 1-O-DPPE-PEG350. La reacción de hidrólisis PLA_{2} es controlada por fluorescencia intrínseca (línea continua) a partir del encima y 90% de dispersión de luz estática (líneas de trazos) a partir de la suspensión. Después de añadir PLA_{2} a la suspensión de liposomas equilibrada sigue un tiempo de retardo característico antes de un incremento brusco de la actividad catalítica.

Figura 8. Liberación controlada por PLA_{2} del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de contraste en la membrana objetivo de membranas no hidrolizables D-O-SPC como función del tiempo para micelas compuestas por 25 \muM 1-O-DPPE-PEG350 (línea de puntos), DSPE-PEG750 (línea de trazos), 1-O-DPPE-PEG2000 (línea continua) suspendidas en tampón 10 mM HEPES (pH = 7,5). Se añadió fosfolipasa A_{2} (25 mM) a 1200 seg y la temperatura era de 41ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se describe en la figura 4. La hidrólisis catalizada por PLA_{2} de 1-O-DPPE-PEG350 indujo la liberación más rápida y más elevada.

Figura 9. Cromatogramas HPLC que muestran el efecto hidrólisis de fosfolipasa A_{2} de DSPE-PEG750 (0,150 mM) compuesto por micelas. Los cromatogramas muestran la cantidad de ácido esteárico generado antes (línea continua) de la añadidura de fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) a la suspensión de micelas y la cantidad de DSPE-PEG750 (línea de trazos) después de la ráfaga de retardo. La línea de puntos muestra ácido esteárico puro (0,4 mM). El porcentaje de hidrólisis se calculó en base al área integrada de la norma de ácido esteárico (115850 unidades) y el área integrada de la muestra (45630 unidades). La concentración del ácido esteárico en la muestra fue calculada a (45630/115850 x 0,4 mM) 0,157 nM, lo cual significa que el 100% del DSPE-PEG750 fue hidrolizado a liso- SPE-PEG750 y ácido esteárico.

Figura 10. Describe el principio de direccionado de medicamento de liposomas y/o agente de contraste, liberación y absorción por encimas extracelulares.

(I): Tejido patológico con capilares con fuga

(II): Portador de medicamento de liposomas y/o agente de contraste

(III): Célula objetivo y membrana objetivo

(IV): Liberación y absorción de medicamento localizado y/o agentes de contraste por fosfolipasa extracelular A_{2}.

Figura 11(a). Ilustración esquemática del principio de direccionado del medicamento de liposomas y/o agente de contraste, comportando acumulación de los portadores de medicamentos de liposomas y/o agente de contraste en tejidos enfermos porosos y subsiguiente liberación de medicamento y/o agente de contraste y transporte por la membrana objetivo con intermedio de la actividad de PLA_{2} extracelular.

(I): Tejido patológico con capilares con fuga

(II): Liposomas portadores de agentes de contraste estabilizados por polímero, conjugados de lípidos,

(III): Célula objetivo y membrana celular

(IV): Agentes de contraste conjugados de lípidos (monoéter-lípido), proamplificadores (lípido), proactivadores (lípido)

(V): medicamentos (éter-lisolípido y derivados de ácidos grasos), amplificadores (lisolípido + ácido graso), activadores de PLA_{2} (lisolípido + ácido graso).

Figura 11(b). Ilustración esquemática de un sistema de modelo biofísico de base molecular, en el que los fosfolípidos del medicamento y/o liposomas del portador del agente de contraste, con intermedio de hidrólisis catalizada por PLA_{2}, actúan como prodesestabilizantes en el lugar del medicamento y/o portador de agente de contraste y como proamplificadores en el lugar objetivo. Se incluye también la posibilidad de ampliar el principio para incluir agentes de contraste conjugados de lípidos y basados en lípidos.

(I): Medicamento estabilizado por polímero y/o liposoma del portador de agente de contraste

(II): Membrana de liposoma objetivo no degradable

(III): Éter-lípidos no hidrolizables

(IV): Proamplificador (lípido), agentes de contraste conjugados de lípidos (monoéter-lípidos), proactivador (lípidos)

(IV): Amplificadores (lisolípidos + ácido graso), medicamentos (éter-lisolípidos y derivados de ácidos grasos), activadores de PLA_{2} (lisolípidos + ácido graso).

Figura 12(a). Liberación controlada por PLA_{2} del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína en la membrana objetivo en función del tiempo para diferentes compuestos de los liposomas portadores. La temperatura es de 37ºC. En comparación con simples barreras de DPPC, la velocidad de liberación del medicamento modelo y/o agente de contraste se amplifica notablemente para los portadores recubiertos con polímero, DPPC + 2,5 mol% DPPE-PEG2000. Un aumento adicional de la velocidad de liberación se obtiene si el portador contiene también un fosfolípido de cadena corta, DCPC, que actúa como activador local para el encima. El porcentaje de calceína liberado queda determinado como % Liberación = 100(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida en el tiempo t después de adición del encima, y I_{B} es la fluorescencia de fondo, e I_{T} es la fluorescencia total medida después de la adición de Triton X-100, lo que conduce a la liberación completa de calceína al fraccionar los liposomas objetivo. (b) Liberación controlada por PLA_{2} del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de contraste en la membrana objetivo, como función del tiempo para diferentes temperaturas. Al aumentar la temperatura, la velocidad de liberación es incrementada debido a la mayor actividad del encima inducido por cambios estructurales en el substrato bicapa de lípido del liposoma portador. En el presente ensayo, se consigue, en todos los casos, una liberación máxima de 70% aproximadamente. El añadido muestra el tiempo de liberación de 50% de calceína, t_{50%}, como función de la temperatura. La concentración del objetivo y liposomas portadores son 25 \muM, y se añade PLA_{2} en una concentración de 25 nM un tampón HEPES con pH = 7,5.

Figura 13. Liberación total, después de 20 min del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de contraste en la membrana objetivo como función de la añadidura de cantidades crecientes de lisopalmetoil fosfolípido y ácido palmítico, separadamente, en una mezcla 1:1. La concentración de las membranas objetivo es de 25 \muM en un tampón HEPES con pH = 7,5 y a una temperatura de 39ºC.

Figura 14. Liberación controlada por PLA_{2} del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de contraste a partir de liposomas compuestos por 25 \muM de 90% molar de 1-0-hexadecyl-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y 10% molar 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) suspendido en un tampón 10 mM HEPPES (pH = 7,5) en función del tiempo. 50 nM (línea recta), 1 nM (línea continua) y 0,02 nM (línea de trazos) fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus) fueron añadidos a los 300 seg, con una temperatura de 35,5ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se describe en la figura 4.

Figura 15. Espectro de emisión de 1 mol% bis-pi-DPC incorporado en liposomas cargados negativamente (0,100 mM) antes (línea continua) y después (línea de trazos) añadiendo 100 nM PLA_{2} (Agkistrodom piscivorus piscivorus) a una suspensión de liposomas equilibrada a 41ºC.

Figura 16. Perfil característico temporal de la reacción a 41ºC para hidrólisis catalizada por fosfolipasa de rata de liposoma cargados negativamente. La reacción catalítica fue iniciada al añadir fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada, equilibrada durante 60 seg antes de la adición de fluido peritoneal. La reacción de hidrólisis es controlada por fluorescencia de monómero (línea continua) y fluorescencia eximer (línea de trazos) desde bis-pi-DPC. Después de añadir fluido peritoneal no diluido, a los 60 seg, a la suspensión equilibrada de liposomas, se observó un incremento repentino en fluorescencia de monómero y una disminución simultánea en florescencia eximer al hidrolizarse el sustrato bis-pi-DPC. El añadido muestra el perfil del tiempo de reacción de los primeros 120 seg.

Descripción detallada de la invención

Una de las características importantes de la presente invención es la comprobación de que ciertos derivados lípidos serán fraccionados por PLA_{2} extracelular, de manera bien definida, en localizaciones extracelulares específicas de tejido de mamíferos. Se ha descubierto que PLA_{2} extracelular es capaz de fraccionamiento de derivados de lípido monoéter/monoéster, a efectos de direccionar el objetivo en tejidos enfermos relevantes.

Derivados de lípidos

Por lo tanto, los sistemas que amplifican la imagen (liposomas o micelas) a utilizar en la presente invención se basan en derivados de lípidos que tienen (a) un grupo alifático con una longitud mínima de 7 átomos de carbono, y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono y (b) una fracción hidrofílica, siendo además dichos agentes de contraste conjugados de lípidos un substrato para fosfolipasa extracelular A_{2}, en la medida de que el radical orgánico puede ser fraccionado hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático sigue substancialmente no afectado, de manera que los agentes de contraste conjugados de lípidos son liberados en forma de un derivado lisolípido que no es un substrato para lisofosfolipasa, teniendo incluidos dicho sistema lipopolímeros o glicolípidos, a efectos de presentar cadenas hidrofílicas en la superficie del sistema.

Si bien los términos "lípido" y "lisolípido" (en el contexto de fosfolípidos) serán términos bien conocidos para los técnicos en la materia, se debe hacer observar que dentro de la siguiente descripción y reivindicaciones, el término "lípido" está destinado al significado de triésteres de glicerol de la siguiente fórmula:

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- O --- R ^{C} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- O ---
R ^{A} }}

H --- O --- R^{B}

siendo R^{A} y R^{B} fracciones de ácido graso (C_{9-30}-alkil/alkileno/alkildieno/alkiltrieno/alkiltetraeno/-C(=O)-) y R^{C} un ácido fosfatídico (PO_{2}-OH) o un derivado de ácido fosfatídico. Por lo tanto, los grupos R^{A} y R^{B} están enlazados al núcleo de glicerol a través de enlaces éster.

El término "lisolípidos" está destinado a significar un lípido que el grupo R^{B} de ácido graso no existe (por ejemplo, segregado hidrolíticamente), es decir, un derivado de glicerol de la fórmula anterior en la que R^{B} es hidrógeno, pero en la que los otros sustituyentes están substancialmente no afectados. La conversión de un lípido en un lisolípido puede tener lugar bajo la acción de un enzima, específicamente bajo la acción de PLA_{2} celular y también extracelular.

Los términos "derivado de lípido" y "derivado de lisolípido" están destinados a cubrir posibles derivados de los compuestos posibles anteriores dentro de los grupos "lípido" y "lisolípido", respectivamente. Se facilitan ejemplos de derivados de lípidos biológicamente activos y derivados de lisolípidos en Houlihan, y otros, Med. Res. Rev., 15, 3, 157-223. Por lo tanto, tal como quedará evidente, la extensión "derivados" se debe comprender en el sentido más amplio.

Dentro de la presente solicitud, no obstante, los derivados de lípidos y de lisolípidos deben cumplir ciertos criterios funcionales (ver anterior) y/o exigencias estructurales. Es particularmente relevante observar que los derivados adecuados de lípidos son los que tienen (a) un grupo alifático de una longitud mínima de 7, y preferentemente un mínimo de 9, átomos de carbonos y un radical orgánico que tiene un mínimo de 7 átomos de carbono, y (b) una fracción hidrofílica. Será evidente que el grupo alifático y el radical orgánico corresponderán a las dos fracciones de ácido graso en un lípido normal y que la fracción hidrofílica corresponderá a la parte de fosfato de un fosfolípido o de un bioisoéster del mismo.

Por lo tanto, el concepto general en que se basa la presente invención es el de explotar el nivel incrementado de actividad de PLA_{2} extracelular en áreas localizadas del cuerpo de un mamífero, en particular tejidos externos, siendo los derivados de lípidos, que se pueden utilizar dentro de la presente invención, sustratos para PLA_{2} extracelular, es decir, los derivados de lípidos deben ser capaces de soportar fraccionamiento enzimático hidrolítico del radical orgánico correspondiente al ácido graso en posición 2 en un lípido. El PLA_{2} extracelular es sabido que pertenece a la clase del encima (EC) 3.1.1.4. Por lo tanto, haciendo referencia a PLA_{2} (extracelular) se debe comprender todas las enzimas extracelulares de esta clase, por ejemplo, lipasas, que pueden inducir fraccionamiento hidrolítico del radical orgánico correspondiente al ácido graso en la posición 2 en un lípido. Una ventaja específica del sistema de ampliación de imagen basada en lípidos (tales como liposomas y micelas) es que la actividad de PLA_{2} extracelular queda significativamente incrementada hacia substratos organizados en comparación con substratos monómeros.

En vista de la exigencia de capacidad de hidrólisis por PLA_{2} extracelular, es evidente que el radical orgánico (por ejemplo, un grupo alifático) está preferentemente enlazado con intermedio de una funcionalidad de éster que se puede fraccionar por PLA_{2} extracelular, preferentemente de forma que el grupo que es separado por fraccionamiento es un ácido carboxílico.

Además, es una importante característica de la presente invención que el grupo alifático (el grupo que corresponde al ácido graso en posición 1 en un lípido) del derivado de lípido, es decir, el derivado del isolípido después de fraccionamiento por PLA_{2} extracelular, queda substancialmente sin afectar por la acción del PLA_{2} extracelular. Por "substancialmente sin afectar" se debe comprender que la integridad del grupo alifático se ha conservado y que menos de 1% molar, preferentemente, menos de 0,1% molar del grupo alifático (grupo alifático en posición 1) se ha fraccionado bajo la acción de PLA_{2} extracelular.

Asimismo, el derivado de lisolípido que resulta del fraccionamiento hidrolítico del radical orgánico no debe ser, en sí mismo, un substrato para lisofosfolipasa. La lisofosfolipasa se sabe que pertenece a la clase de encima (EC) 3.1.1.5. Por lo tanto, por referencia a lisofosfolipasa se debe comprender todos los encimas de esta clase que catalizan la reacción liso(fosfo)lípido + agua, dando lugar a fosfoglicerol + ácido graso. El término "no es substrato para lisofosfolipasa" está destinado a significar que la lisofosfolipasa tiene una actividad menor de 1% hacia el substrato, en comparación con el ésterlípido correspondiente, es decir, virtualmente no tiene actividad enzimática.

Son ejemplos adecuados de dichos derivados de lisolípidos aquellos que no sufren fraccionamiento hidrolítico bajo la acción de lisofosfolipasas. Por lo tanto, los derivados de lisolípidos son, en particular, no lisolípidos, y los derivados de lisolípidos, que tienen un enlace éster en posición 1 del lisolípido o en la posición de un derivado de lisolípido que corresponde a la posición 1 de un lisolípido.

Una clase preferente de derivados de lípidos para incorporar en los sistemas de amplificación de imagen de la invención se pueden representar por la siguiente fórmula:

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- Z --- R ^{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- X ---
R ^{1} }}

H --- Y --- R^{2}

en la que

: X y Z son seleccionados independientemente entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2}, preferentemente entre O, NH, NMe y CH_{2}, en particular O;

: Y es -OC(O)-, estando entonces Y conectada a R^{2} con intermedio del átomo de oxígeno o del átomo de carbono del carbonilo, preferentemente con intermedio del átomo de carbono del carbonilo;

: R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

: R^{2} es un radical orgánico que tiene como mínimo 7 átomos de carbono, tal como un grupo alifático que tiene una longitud mínima de 7, preferentemente como mínimo de 9 átomos de carbono, preferentemente un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2};

: Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2}) _{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7-}(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n91}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un entero con un valor de 9 a 29, n1 es cero o un entero de 1 a 29, n3 es cero o un entero de 1 a 20, n5 es cero o un entero de 1 a 17, n7 es cero o un entero de 1 a 14, y n9 es cero o un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4, n6 y n8 es independientemente cero o 1, y Y^{2} es CH^{3} ó CO_{2}H; pudiendo estar cada uno de Y^{1}-Y^{2} sustituidos por halógeno o C_{1-4}-alkilo, pero preferentemente Y^{1}-Y^{2} no tiene sustituyente;

: R^{3} se ha seleccionado entre ácido fosfotídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisoésteres del ácido fosfatídico y derivados del mismo (entre otros, derivados de ácido fosfotídico a los que se ha acoplado, de forma covalente, un polímero hidrofílico o polisacárido).

Tal como se ha mencionado en lo anterior, las realizaciones preferentes implican que Y es -OC(O)- en la que Y está conectada a R^{2} con intermedio del átomo de carboxilo. Las realizaciones más preferentes implican que X y Z son O y que Y es -OC(O)- en la que Y está conectada a R^{2} con intermedio del átomo de carboxilo. Esto significa que el derivado lípido es un compuesto de tipo 1-monoéter-2-monoéster-fosfolípido.

Otro grupo preferente de derivados de lípidos es aquel en el que el grupo X es S.

En una realización, R^{1} y R^{2} son unos grupos alifáticos de fórmula Y^{1}-Y^{2} en la que Y^{2} es CH_{3} ó CO_{2}H, pero preferentemente CH_{3}, y en la que Y^{1} es -(CH_{2}) _{n1}(CH=CH)_{n2}(CH_{2})_{n3}(CH=CH)_{n4-}(CH_{2})_{n5}(CH=CH)_{n6}(CH_{2}) _{n7}(CH=CH)_{n8}
(CH_{2})_{n91} siendo la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 un entero de 9 a 23; es decir, el grupo alifático Y^{1}-Y^{2} tiene una longitud de 10-24 átomos de carbono. n1 es igual a cero o es un entero de 1 a 23; n3 es igual a cero o es un entero de 1 a 20; n5 es igual a cero o es un entero de 1 a 17; n7 es igual a cero o es un entero de 1 a 14; n9 es igual a cero o es un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4 y n8 es independientemente igual a cero ó 1.

En una realización, uno o varios de los grupos alifáticos R^{1}/R^{2} o los grupos R^{3} incluyen un marcador, por ejemplo, halógenos (bromo, iodo) o átomos de bario, que son especialmente adecuados para formación de imágenes por tomografía computerizada (CT), o son enriquecidos con isótopos inestables, por ejemplo, ^{11}C que es particularmente útil para los objetivos de escaneado de PET.

Los grupos alifáticos tales como R^{1} y R^{2} en una realización preferentemente están saturados y también no ramificados, es decir, preferentemente no tienen enlaces dobles entre átomos de carbono adyacentes, siendo entonces iguales cada uno de n2, n4, n6 y n8 a cero. De acuerdo con ello, y^{1} es preferentemente (CH_{2})_{n1}. Más preferentemente (en esta realización), R^{1} y R^{2} son, cada uno de ellos independientemente, (CH_{2})_{n1}CH_{3} y más preferentemente (CH_{2})_{17}CH_{3} ó (CH_{2})_{15}CH_{3}. En realizaciones alternativas, los grupos pueden tener uno o varios dobles enlaces, es decir, pueden ser insaturados, y uno o varios de n2, n4, n6 y n8 pueden ser iguales a 1. Por ejemplo, cuando el hidrocarburo insaturado tiene un doble enlace, n2 es igual a 1, n4, n6 y n8 son, cada uno de ellos, iguales a cero y Y^{1} es (CH_{2}) _{n1} CH=(CH_{2})_{n3}. n1 es igual a cero o es un entero comprendido entre 1 y 21, y n3 es también cero o es un entero de 1 a 20, no siendo por lo menos uno de n1 o n3 igual a cero.

En una realización específica, los derivados lípidos son aquellos lípidos monoéter en los que X y Z son O, R^{1} y R^{2} están independientemente seleccionados entre los grupos alquilo, (CH_{2}) _{n}CH_{3} en los que n es 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29, preferentemente 14, 15, ó 16, en particular 14; Y es -OC(O)-, estando entonces Y conectado a R^{2} con intermedio del átomo de carbono del carbonilo.

Con respecto a la fracción hidrofílica (conocida frecuentemente como "grupo de cabecera") que corresponde a R^{3}, se cree que se puede utilizar un amplia variedad de grupos que corresponden a ácido fosfotídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisoésteres de ácido fosfatídico y derivados de los mismos. Tal como será evidente, la exigencia crucial para R^{3} es que los grupo deben permitir el fraccionamiento enzimático del grupo R^{2} (realmente R^{2}-C(=O) ó R^{2}-OH) por PLA_{2} extracelular. Los términos "bioisoésteres de ácido fosfatídico y derivados de los mismos" implica, ciertamente, que dichos grupos, tales como ácido fosfatídico, deben permitir el fraccionamiento enzimático por PLA_{2} extracelular.

R^{3} se selecciona de manera típica entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), fosfatidilcolina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}N
(CH_{3})_{3}), fosftidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NH_{2}, N-metilfosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NCH_{2}, fosfatidilserina, fosfaditilinositol, y fosfatidilglicerol (PO_{2}-O-CH_{2}CHOHCH_{2}OH). Otros posibles derivados del ácido fosfatídico son aquellos en los que los ácidos dicarboxílicos, tales como ácido glutárico, sebásico, succínico y tartárico están acoplados al nitrógeno terminal de fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, etc.

En la realización específica, en la que una fracción del derivado de lípido es también un lipopolímero o glicolípido, un polímero hidrofílico o polisacárido está unido, de manera típicamente covalente, a la parte de fosfatidil del derivado de lípido.

Los polímeros hidrofílicos que de manera adecuada pueden ser incorporados en los derivados de lípidos de la invención, a efectos de formar lipopolímeros son aquellos que son fácilmente solubles en agua, que se pueden acoplar de forma covalente a un líquido formador de vesículas, y que son tolerados in vivo sin efectos tóxicos (es decir, que son biocompatibles). Los polímeros adecuados incluyen polietilén glicol (PEG), ácido poliláctico (llamado también polilactida), ácido poliglicólico (indicado también poliglicólido), copolímero de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizadas tales como hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.

Son polímeros preferentes los que tienen un peso molecular comprendido, aproximadamente, entre 100 daltons y unos 10.000 daltons y, más preferentemente, entre unos 300 daltons y unos 5.000 daltons. En realizaciones especialmente preferentes, el polímero es polietilenglicol que tiene un peso molecular comprendido, aproximadamente, entre 100 y 5.000 daltons y, más preferentemente, que tiene un peso molecular comprendido, aproximadamente, entre 300 y 5.000 daltons. En una realización especialmente preferente, el polímero es polietilenglicol de 750 daltons (PEG(750)). Los polímeros pueden ser también definidos por el número de monómeros que comprenden; una realización preferente de la presente invención utiliza polímeros de un mínimo de unos tres monómeros, tales como polímeros PEG que consisten en tres monómeros (aproximadamente 150 daltons).

Cuando el glicolípido o lipopolímero está representado por una fracción del derivado de lípido, este derivado de lípido (derivado de lípido con una cadena de polímero o de polisacárido) constituye, de manera típica, 1-80% molar, tal como 2-50% molar o 3-25% molar del sistema total de lípido deshidratado. Para composiciones micelulares, no obstante, la fracción puede ser incluso superior, tal como 1-100% molar, tal como 10-100% molar, del sistema total de lípido deshidratado.

Los polímeros preferentes a enlazar de forma covalente con la parte fosfatidil (por ejemplo, con intermedio del nitrógeno terminal de fosfatidiletanolamina) son polietilén glicol (PEG), polilactida, ácido poliglicólico, copolímero de ácido poliláctido-poliglicólico y alcohol polivinílico.

Se debe comprender que R^{2} debe ser un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono (tales como un grupo alifático que tiene una cierta longitud (como mínimo 7, preferentemente 9 átomos de carbono), siendo posible un grado alto de variabilidad, por ejemplo R^{2} no debe ser necesariamente un residuo de cadena larga, pero puede representar estructuras más complejas.

De modo general, se cree que R^{2} puede ser o bien inerte con respecto al entorno en el que se puede liberar por PLA_{2} extracelular, o que R^{2} puede presentar un marcador adecuado para la aplicación diagnóstica. De manera alternativa, R^{2} puede jugar un papel farmacéuticamente activo, de manera típica, como substancia medicamentosa auxiliar o como modificador eficaz para el derivado de lisolípido y/o cualquier otra (segunda) substancia medicamentosa presente en el entorno. En este último caso, el sistema basado en lípido puede tener un efecto terapéutico y también características útiles con respecto al método de diagnóstico. En esta realización, el grupo R^{2} puede ser un residuo de cadena larga, por ejemplo, un residuo de ácido graso (el ácido graso incluirá un carbonilo del grupo Y). Esto ha sido descrito con detalle en lo anterior. Son ejemplos interesantes de substancias medicamentosas auxiliares como R^{2,} dentro de estos subgrupos, los ácidos poliinsaturados, por ejemplo, oleico, linoleico, linolénico, así como derivados de araquidonoilo (incluyendo el carbonilo de Y), por ejemplo, prostaglandinas, tales como prostaglandina E_{1}, como derivados de ácido araquidónico, son conocidos reguladores de la acción de hormonas, incluyendo la acción de prostaglandinas, tromboxanos, y leucotrinas. Son ejemplos de modificadores de rendimiento, como R^{2}, aquellos que aumentan la permeabilidad de la membrana de la célula objetivo y que incrementan la actividad de PLA_{2} extracelular o los agentes de contraste conjugados de lípidos o cualesquiera segundas substancias medicamentosas. Son ejemplos los ácidos grasos de cadena corta (C_{8-12}).

Por lo tanto, la presente invención se refiere también a la utilización de un sistema basado en lípidos simultáneamente para diagnóstico y para objetivos terapéuticos.

Se debe comprender que los diferentes ejemplos de grupos R^{2} posibles son referenciados por el nombre de una especie separada o discreta, en vez del nombre del radical. Además, se debe comprender que los posibles ejemplos pueden incluir el grupo carbonilo o grupo oxi del enlace, a través del cual el radical orgánico está enlazado al esqueleto lípido (correspondiente a la "Y" de la formula anterior). Esto se apreciará, desde luego, por los técnicos en la materia.

Aunque no ha sido indicado específicamente la fórmula general para los ejemplos adecuados de derivados lípidos a utilizar dentro de la presente invención, se debe comprender que la fracción de glicol de los derivados lípidos puede ser sustituida, por ejemplo, para modificar la tasa de fraccionamiento por PLA_{2} extracelular, o simplemente a efectos de modificar las características de los liposomas que comprenden los derivados lípidos.

Un grupo específico de compuestos útiles para el sistema basado en lípidos consiste en derivados lípidos de la siguiente fórmula:

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- Z --- R ^{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- X ---
R ^{1} }}

H --- Y --- R^{2}

en la que

: X y Z son seleccionados independientemente entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), S(O)_{2}, preferentemente entre O, NH, NMe y CH_{2}, en particular O;

\newpage

: Y es -OC(O)-, estando entonces Y conectado a R^{2} a través de oxígeno o del átomo de carbono del carbonilo, preferentemente a través del átomo de carbono del carbonilo;

: R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

: R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;

: en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}- (CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n5}-(CH_{2})_{n7-}(CH=CH)_{n8F}- (CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un entero comprendido entre 9 y 29; n1 es cero o un entero de 1 a 29, n3 es cero o un entero de 1 a 20, n5 es cero o un entero de 1 a 17, n7 es cero o un entero de 1 a 14, y n9 es cero o un entero de 1 a 11; siendo cada uno de n2, n4, n6 y n8 independientemente cero o 1; y Y^{2} es CH_{3} ó CO_{2}H; en las que cada uno de Y^{1}-Y^{2} independientemente podrá ser sustituido por halógeno o C_{1-4}alquilo, pero preferentemente Y^{1}-Y^{2} es no sustituido,

: R_{3} es seleccionado entre derivados de ácido fosfatídico a los que está acoplado un polímero hidrofílico o un polisacárido. El polímero hidrofílico o el polisacárido se selecciona de manera típica y preferente entre polietilén glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, polivinilo alcohol, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polinidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizads, en particular de polietilén glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico y alcohol polivinílico.

Son subgrupos específicos aquellos en los que X y Z son O, R^{1} y R^{2} seleccionados independientemente entre grupos alquilo, (CH_{2})_{n} CH_{3}, en el que n es 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29, preferentemente 14 ó 16, \gamma es -OC(O)-, estando entonces Y conectado a R_{2} con intermedio del átomo de carbono del carbonilo.

Un grupo específico de compuestos son polietilenoxido-1-O-palmitil-sn-2-palmitoil-fosfatidil etanolamina, DPPE-PEG, y polietilenoxido-1-O-sn-2-estearoil-fosfatidiletanolamina, DSPE-PEG, con peso molecular PEG de 100 a 10.000 daltons, en particular de 300-5.000 daltons.

Derivados lípidos formulados como liposomas y micelas

El término "sistema de incremento de imagen basado en lípidos" comprende estructuras macromoleculares que, como componente principal, incluyen lípidos o derivados de lípidos. Son ejemplos adecuados de los mismos los liposomas y micelas. Se cree en la actualidad que los liposomas ofrecen el campo de aplicaciones más amplio, habiendo sido descritos de forma más detallada a continuación. Si bien los liposomas habitualmente se cree que son un sistema preferente basado en lípido, también se cree que los sistemas micelulares ofrecen interesantes realizaciones comprendidas en la presente invención.

En una importante variante que se puede combinar ventajosamente con las realizaciones que se han descrito, el derivado de lípidos se incluye en liposomas como componente único o lo que es más habitual, en combinación con otros componentes (otros lípidos, esteroles, etc.). Por lo tanto, los sistemas basados en lípidos que se describen adoptan preferentemente la forma de liposamas en los que los liposomas están constituidos por capas que comprenden el derivado de lípido y el marcador.

Cuando se utiliza en esta descripción, el término "marcador" está destinado a significar una especie que es capaz de ser administrada al cuerpo del mamífero y que es detectada por medios extracorporales para formación de imágenes de tejidos vivos. El marcador puede ser seleccionado entre radiomarcadores, tales como radioisótopos y compuestos marcados por radioisótopos; compuestos radiopacos; compuestos fluorescentes, etc. Los marcadores más específicos son ^{111}In, ^{99n}Tc, ^{67}Ga, ``C, Gd, Mn, óxido de hierro, argón, nitrógeno, iodo, bromo y bario.

Son marcadores adecuados para escintografía de rayos gamma los radionucleidos de diagnóstico, tales como ^{111}In, ^{99n}Tc, ^{67}Ga. A efectos prácticos, los radionucleótidos son acomplejados con, por ejemplo, quelatantes tales como ácido dietilén triamin pentaacético (DTPA), hexametilpropilenamina oxima (HMPAO), ácido diisopropil iminodiacético (DISIDA), o incluso proteínas tales como albúminas de suero humano (HSA). De manera alternativa, DTPA o compuestos quelatantes similares pueden ser derivatizados por la incorporación de un grupo hidrofóbico, que puede anclar la fracción quelatante sobre la superficie del liposoma durante o después de la preparación del liposoma.

Son marcadores adecuados para rayos X verografina, ioxaglato, iohexol, iopromida, iomeprol, iopamidol, iopentol, iodixanol, ioversol, diferentes medios de contraste no iónicos, etc, que se pueden incorporar en liposomas y se pueden utilizar tanto para formación de imágenes por rayos X del hígado y el bazo, y para formación de imágenes CT.

Son marcadores apropiados para formación de imágenes por resonancia magnética (MR) los iones paramagnéticos tales como Gd y Mn, y óxido de hierro acoplados a diferentes moléculas portadoras. Por ejemplo, el complejo de ácido gadolinio dietilentriamina pentaacético, se ha demostrado que es un agente de contraste efectivo para formación de imágenes MR de metástasis de hígado, bazo y hepáticas.

Son marcadores adecuados para formación de imágenes por tomografía computerizada CT el iodo, bromo, bario, etc.

Otros ejemplos de marcadores adecuados se facilitan, frecuentemente, por el método de formación de imágenes seleccionado o de detección, describiéndose ejemplos de ello, de manera detallada, en el Handbook of medical imaging, vol. 1, 2, 3, SPIE Press, Washington USA, 2000, edd, Beutel. Konden y van Metter. Se conocen "liposomas" como estructuras autoensamblantes que comprenden una o varias bicapas de lípidos, cada uno de los cuales rodea un compartimiento acuoso y comprende dos monocapas en oposición de moléculas de lípido anfipático. Los lípidos anfipáticos (en este caso, entre otros, derivados de lípidos) comprenden un grupo de cabecera polar (hidrofílico) (que corresponde al sustituyente R^{3} en los derivados de lípidos) enlazado de forma covalente a uno o dos grupos alifáticos no polares (hidrofóbicos) (correspondiendo a R^{1} y R^{2} en los derivados de lípidos). Los derivados energéticamente desfavorables, entre los grupos hidrofóbicos y en medio acuoso, se cree que, en general, inducen a las moléculas de lípidos a reagruparse de manera tal que los grupos de cabecera polares son orientados hacia el medio acuoso, mientras que los grupos hidrofóbicos se reorientan hacia el interior de la bicapa. Una estructura energéticamente estable es formada en la que los grupos hidrofóbicos están protegidos de manera efectiva contra el contacto con el medio acuoso.

Tal como se comprenderá por lo anterior, los sistemas basados en lípidos, por ejemplo, liposomas, son particularmente útiles para la incorporación de marcadores.

Los liposomas pueden tener una bicapa de lípidos única (liposomas unilamelares "ULV"), o bicapas de lípidos múltiples (liposomas multilamelares "MLV") y se pueden preparar por una serie de métodos (ver un resumen, por ejemplo, en la obra de Deamer y Uster, Liposomes, Marcel Dekker, N.Y., 1983, 27-52). Estos métodos incluyen métodos de Bangham para preparar liposomas multilamelares (MLV) métodos; de Lenk, Fountain y Cullis para preparar MLV con distribución de soluto interlamelar substancialmente igual (ver, por ejemplo, US 4.522.803, US 4.588.578, US 5.030.453, US 5.169.637, y US 4.975.282); y el método de evaporación en fase inversa de Papahadjopoulos y otros (US 4.235.871) para preparar liposomas oligolamelares. Los ULV pueden ser producidos a partir de MLV, por métodos tales como sonicación (ver Papahadjopoulos y otros, Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) o extrusión (US 5.008.050 y US 5.059.421). El liposoma de esta invención puede ser producido por cualquiera de los métodos indicados.

Se pueden utilizar diferentes metodologías, tales como sonicación, homogeneización, aplicación de French Press, y maturación para preparar liposomas de dimensiones más reducidas a partir de liposomas más grandes. Se puede utilizar la extrusión (ver US 5.008.050) para reducir las dimensiones de los liposomas, es decir, producir liposomas con unas dimensiones medias predeterminadas forzando los liposomas, bajo presión, a través de poros de filtro de dimensiones definidas y seleccionadas. También se puede utilizar filtrado de flujo tarjencial (ver WO 89/08846) para regularizar las dimensiones de los liposomas, es decir, para producir liposomas con una población de liposomas que tienen menor heterogeneidad de dimensiones, y que tienen una distribución más homogénea y definida de dimensión. También se pueden determinar las dimensiones de los liposomas por una serie de técnicas, tales como dispersión de luz casi eléctrica, y con equipos, tales como por ejemplo, los dimensionadores de partículas Nicomp®, que se encuentra dentro del alcance de los técnicos ordinarios en la materia.

Es interesante observar que los derivados de lípidos de la presente invención pueden constituir la parte principal de un sistema basado en lípidos aunque este sistema sea un sistema de liposomas. Este hecho reside en la similitud estructural (pero no funcional) entre los derivados de lípidos de la presente invención y los lípidos. Así, por ejemplo, se cree que los derivados de lípidos para la presente invención pueden ser el único constituyente de liposomas, es decir, hasta 100% molar de los liposomas totales deshidratados pueden quedar constituidos por los derivados de lípidos. Esto contrasta con los lisolípidos de monoéter conocidos que pueden constituir solamente una parte menor de los liposomas.

De manera típica, tal como se describirá en detalle más adelante, los liposomas incluyen ventajosamente otros constituyentes que pueden tener o no efectos farmacéuticos, pero que la harán más estable la estructura de los liposomas (o alternativamente, más inestables) o que protegerán los liposomas contra su alineación y, por lo tanto, incrementaran el tiempo de circulación y, de este modo, mejoraran el rendimiento global de un producto farmacéutico que incluya el liposoma.

En el caso anterior se cree que los derivados de lípidos específicos constituirán típicamente de 15-100% molar, tal como de 50-100% molar, preferentemente 75-100% molar y, en particular, 90-100% molar, basado en el liposoma total deshidratado.

Los liposomas pueden ser unilamelares o multilamelares. Algunos liposomas preferentes son unilamelares y tienen diámetros de menos de unos 200 nm, más preferentemente desde un valor por encima de 50 nm hasta un valor inferior aproximadamente a 200 nm.

Los liposomas son preparados típicamente, tal como se conoce en esta técnica, por un método que comprende las siguientes etapas: (a) disolver el derivado del lípido en un disolvente orgánico; (b) eliminar el disolvente orgánico de la solución de derivado de lípido de la etapa (a); y (c) hidratar el producto de la etapa (b) con un disolvente acuoso a efectos de formar liposomas.

El método comprende, además, la etapa de añadir un marcador al disolvente orgánico de la etapa (a) o a la fase acuosa de la etapa (c). De manera alternativa, se pueden cargar en los liposomas marcadores ionizables formando, en primer lugar, los liposomas, estableciendo un potencial electroquímico, por ejemplo, mediante un ingrediente de pH, a través de la bicapa de liposomas más externa y luego añadiendo un marcador ionizable al medio acuoso externo al liposoma (ver por ejemplo los documentos US 5.077.056 y WO 86/01102).

A continuación el método puede comprender una etapa de extrusión de los liposomas producidos en la etapa (c) a través de un filtro para producir liposomas de ciertas dimensiones, por ejemplo, 100 nm.

Los sistemas de partículas basados en lípidos, es decir liposomas y micelas, con dimensiones que cubren una amplia gama de valores se pueden preparar de acuerdo con las técnicas antes mencionadas. Dependiendo de la ruta de administración, las dimensiones adecuadas para las aplicaciones farmacéuticas se encontrarán normalmente en un gamma de 20-10.000 nm, en particular en una gama de valores de 30-1000 nm. Dimensiones en la gama de 50-200 nm son normalmente preferentes porque los liposomas de esta gama de dimensiones se cree que, en general, circulan durante mayor tiempo por el sistema vascular de los mamíferos que los liposomas más grandes que son reconocidos más rápidamente por los sistemas reticuloendoteliales de los mamíferos ("RES") y, por lo tanto, eliminados más rápidamente de la circulación. La circulación vascular más larga aumenta las probabilidades de que el sistema de lípidos-bases llegue al lugar deseado, por ejemplo, los tumores o las inflamaciones.

Se cree que un sistema de amplificación de imagen, tal como se ha definido en las realizaciones de esta invención, que está adaptada para su administración por vía intravenosa e inyección intramuscular, los liposomas deben tener, preferentemente, un tamaño medio de partículas de unos 100 nm. Por lo tanto, este tamaño de partículas debe encontrarse, en general, en una gama de 50-200 nm.

Además, para un sistema de amplificación de imágenes adaptado para su administración por inyección subcutánea, los liposomas deberían tener, preferentemente, unas dimensiones medias de partículas de 100 a 5.000 nm y entonces los liposomas pueden ser de capa única o de múltiples capas.

Una de las ventajas de la inclusión de derivados de lípidos en los liposomas es que la estructura de los liposomas, en particular cuando se estabiliza, tal como se describe a continuación, tendrá el tiempo de circulación vascular mucho más largo que los derivados de lípidos y marcador como compuestos separados. Además los derivados de lípidos y el marcador serán más o menos inertes o incluso "invisibles" cuando están "empaquetados" en liposomas en los que se incluyen lipopolímeros o glicolípidos. Esto significa también que se puede suprimir cualquier efecto potencialmente desventajoso, por ejemplo, efectos hemolíticos.

Los liposomas deben actuar, preferentemente, como componentes inertes hasta que reaccionan en el área de interés, por ejemplo, áreas enfermas o tejidos cancerosos, infectados o afectados por inflamaciones. Tal como se describe a continuación, los liposomas pueden incluir una serie de otros constituyentes. En particular un sistema de amplificación, de imagen de acuerdo con la invención, puede contener además un componente que controla la liberación del marcador, agentes controladores de la actividad PLA_{2} extracelular o agentes para el incremento de la permeabilidad, por ejemplo, lípidos de cadena corta y lipopolímeros/glicolípidos.

Dos grupos muy importantes de compuestos a incluir en los liposomas como modificadores son los lipopolímeros y glicolípidos, estabilizantes del compuesto, tales como lipopolímeros (por ejemplo polietilenoxido-dipalmitoilfosfatidil etanolamina, DPPE-PEG, polietilenoxido-distearoilfosfatidiletanolamina, DSPE-PEG), con peso molecular de PEG 100 a 1.000 Daltons. Se ha mostrado que los lipopolímeros funcionan como estabilizantes para el liposoma, es decir, el lipopolímero incrementa el tiempo de circulación y, lo que es más interesante en el presente contexto, como activadores de PLA_{2} extracelular. El efecto estabilizante se describirá a continuación.

Las superficies externas de los liposomas se cree que son dotadas de un recubrimiento de proteínas de suero, tales como opsoninas, en los sistemas circulatorios de mamíferos. Se cree que la eliminación de liposomas se puede inhibir modificando la superficie externa de los liposomas, de manera tal que se inhibe la unión de proteínas del suero a los mismos. Se cree que se consigue una efectiva modificación superficial, es decir, alteraciones en las superficies externas de los liposomas que resultan en la inhibición de la opsonización y absorción RES, al incorporar en las bicapas de liposomas lípidos cuyos grupos polares principales has sido derivatizados por acoplamiento a los mismos de una fracción química que puede inhibir la unión de las proteínas del suero a los liposomas, de manera tal que el comportamiento farmacocinético de los liposomas en los sistemas circulatorios de los mamíferos queda alterado y la actividad de PLA_{2} extracelular se incrementa, tal como se ha descrito anteriormente para los lipopolímeros.

Se han diseñado preparados de liposomas que evitan la absorción rápida de RES y que, por lo tanto, tienen una vida media incrementada en el torrente sanguíneo. Los liposomas STEALTH® (Liposome Technology Inc., Menlo Park, Calif.) incluyen lípidos injertados de polietilenglicol (PEG) a % molar aproximadamente del liposoma total deshidratado. La presencia de polímeros en la superficie exterior del liposoma disminuye la absorción de liposomas por los órganos del RES. Las membranas del liposomas pueden ser construidas, a efectos de resistir los efectos de alteración del tensoactivo contenido en las mismas. Por ejemplo, una membrana de liposoma que contiene como constituyentes lípidos derivatizados con un polímero hidrofílico (es decir, soluble en agua) tiene normalmente una mayor estabilidad. El componente polímero de la bicapa de lípido protege el liposoma contra la absorción por el RES y, por lo tanto, se prolonga el tiempo de circulación de los liposomas en el torrente sanguíneo.

Los polímeros hidrofílicos adecuados para su utilización en lipopolímeros son aquellos que son fácilmente solubles en agua, que se pueden acoplar de forma covalente a un lípido que forma una vesícula y que son tolerados in vivo con efectos tóxicos (es decir, son biocompatibles). Los polímeros adecuados incluyen politilén glicol (PEG), ácido poliláctico (también designado poliláctida), ácido poliglicólico (llamado también poliglicólido), un copolímero de ácido poliláctico-ácido poliglicólico y alcohol polivinílico. Son polímeros preferentes los que tienen un peso molecular desde 100 ó 120 daltons hasta unos 5.000 ó 10.000 daltons y, más preferentemente, desde unos 300 daltons a unos 5.000 daltons. En una realización especialmente preferente, el polímero es polietilenglicol que tiene un peso molecular de 100 a 5.000 daltons aproximadamente y, más preferentemente, tiene un peso molecular desde 300 a 5.000 daltons aproximadamente. En una realización especialmente preferente el polímero es politilenglicol de 750 daltons (PEG (750)). Los polímeros pueden ser también definidos por el número de monómeros; una realización preferente de la presente invención utiliza polímeros de un mínimo de tres monómeros, tal como polímeros PEG que consisten en tres monómeros (aproximadamente 150 daltons). Otros polímeros hidrofílicos, que pueden ser adecuados para su utilización en la presente invención incluyen polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polindroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida y celulosas derivatizadas, tales como hidroximetrilcelulosa o hidroxietilcelulosa.

Los glicolípidos son lípidos a los que está fijada de forma covalente una cadena de polisacárido hidrofílico. Se apreciará que los glicolípidos pueden ser utilizados como lipopolímeros, si bien los lipopolímeros habitualmente presentan los resultados más prometedores.

En general, se cree que el contenido de lipopolímero se encontrará ventajosamente en una gama de 1-50% molar, tal como 2-25%, en particular 2-15% molar basado en el liposoma total deshidratado.

Los liposomas bicapa o multicapa pueden contener también otros componentes, tales como otros lípidos, compuestos esterolicos, polímeros-ceramidas como estabilizantes y compuestos de direccionado, etc.

Los liposomas que comprenden derivados lípidos pueden consistir (en principio), exclusivamente de los derivados de lípidos. No obstante, a efectos de modificar los liposomas se pueden incluir también "otros lípidos". Otros lípidos se seleccionan por su capacidad de adaptar conformaciones de envasado compatibles con los componentes derivados de lípidos de la bicapa, de manera que la totalidad de los lípidos constituyentes están envasados de manera densa y se inhibe la liberación de los derivados de lípidos de la bicapa. Los factores basados en lípidos que contribuyen a conformaciones de empaquetado compatibles, son bien conocidas por los técnicos en la materia, e incluyen, sin limitación, longitud de la cadena de ácilo y grado de insaturación, así como las dimensiones y carga del grupo principal. De acuerdo con ello, otros lípidos adecuados, incluyendo varias fosfatidiletanolaminas ("PE"), tales como fosfatidiletanolamina de huevo ("EPE") o dioloil fosfatidiletanolamina ("DOPE"), se puede seleccionar por los técnicos en la materia sin experimentación extensa. Los lípidos pueden ser modificados de diferentes maneras, por ejemplo, derivatización del grupo principal con ácidos dicarboxílicos, tales como ácido glutárico, sebácico, succínico o tartárico, preferentemente el ácido dicarboxílico es ácido glutárico ("GA"). De acuerdo con ello, entre los lípidos derivatizados del grupo principal adecuados se incluyen ácidos fosfatidiletanolamina-dicarboxílico, tales como ácido dipalmitoil, fosfatidiletanolamina-glutárico ("DPPE-GA"), ácido palmitoiloleil fosfatidiletanolamina-glutárico ("POPE-GA"), y ácido
dioleoil fosfatidiletanolamina-glutárico ("DOPE-GA"). Más preferentemente, el lípido derivatizado es DOPE-GA.

El contenido total de "otros lípidos" se encontrará típicamente en una gama de 0-30 mol%, en particular 1-10 mol% basado en el liposoma total deshidratado.

El compuesto esterólico incluido en el liposoma puede afectar, en general, la fluidez de las bicapas de lípidos. De acuerdo con ello, las interacciones de esterol con grupos de hidrocarburos circundantes inhiben, en general, la emigración de estos grupos desde la bicapa. Un ejemplo de compuesto esterólico (esterol) a incluir en el liposoma es colesterol, pero una serie de otros compuestos esterólicos son también posibles. Se cree en general que el contenido de compuesto esterólico, en caso de que exista, se encontrará en una gama de 0-25% molar, en particular 0-10%, tal como 0-5% molar basado en el liposoma deshidratado total.

Los polímeros-ceramidas son estabilizantes que mejoran el tiempo de circulación vascular. Son ejemplos los derivados de polietilén glicol de ceramidas (PEG-ceramidas), en particular aquellas en las que el peso molecular del polietilén glicol es de 100 a 5.000. Se cree, en general, que el contenido del polímero-ceramidas se encuentra en una gama de 0-30% molar, en particular 0-10% molar basado en el liposoma total deshidratado.

Otros ingredientes pueden constituir 0-2% molar, en particular 0-1% molar, basado en el liposoma deshidratado total.

De acuerdo con una realización de la presente invención, la bicapa de lípido de un liposoma contienen lípidos derivatizados con polietilén glicol (PEG), tal que las cadenas de PEG se extienden desde la superficie interna de la bicapa de lípido al espacio interior encapsulado por el liposoma y se extienden desde el exterior de la bicapa de lípido hacia adentro del entorno circundante (ver, por ejemplo, US 5882.679 y figuras 10 y 11).

Una variedad de métodos de acoplamiento para preparar lípidos que forman vesículas derivatizados con un polímero hidrofílico biocompatible, tal como polietilén glicol, se conocen en este sector (ver, por ejemplo, US 5.213.804; US 5.013.556).

Los componentes lípidos derivatizados de lisosomas, según la presente invención, pueden incluir adicionalmente un enlace lípido-polímero labil, tal como un péptido, éster o enlace disulfuro que puede ser fraccionado en condiciones fisiológicas selectivas, tal como en presencia de enzimas de peptidasa o de esterasa o de agentes reductores. La utilización de dichos enlaces para acoplar polímeros a los fosfolípidos permite conseguir elevados niveles en sangre de dichos liposomas durante varias horas después de administración, seguido de fraccionamiento de los enlaces reversibles y eliminación del polímero de la bicapa de liposoma exterior. Los liposomas sin polímero son sometidos, a continuación, a absorción rápida por el sistema RES (ver, por ejemplo, US 5.356.633).

Además, los liposomas, según la presente invención pueden contener moléculas que no son polímeros, unidas al exterior del liposoma, tal como haptenos, enzimas, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, citoquinas y hormonas (ver, por ejemplo, US 5.527 528), y otras proteínas pequeñas, polipéptidos, fracciones de polisacáridos de azúcares individuales o moléculas que no son de proteínas que confieren una característica enzimática o de reconocimiento superficial específica al liposoma. Ver la solicitud publicada PCT WO 94/21235. Las moléculas superficiales que direccionan preferentemente el liposoma a órganos específicos o tipos de células se indican en esta descripción como "moléculas de direccionamiento" e incluyen, por ejemplo, anticuerpos y fracciones de azúcares, por ejemplo, gangliósidos o los basados en manosa y galactosa, que direccionan el liposoma a células específicas que comportan antígenos específicos (receptores de fracciones de azúcar). Las técnicas para acoplar moléculas superficiales a los liposomas son conocidas en este sector (ver, por ejemplo, US 4.762.915).

El liposoma puede ser deshidratado, almacenado y posteriormente reconstituido de manera tal que una parte substancial de su contenido interno se retiene. La deshidratación de los liposomas requiere, en general, la utilización de un protector hidrofílico de secado, tal como un azúcar disacárido, tanto en la superficie interior como en la superficie exterior de las bicapas de liposomas (ver US 4.880.635). Este compuesto hidrofílico se cree que, en general, impide la reestructuración de los lípidos en el liposoma, de manera que las dimensiones y contenido se mantienen durante el proceso de sacado y a través de la rehidratación subsiguiente. Son características apropiadas para estos protectores de secado que sean aceptadores fuertes de enlaces de hidrógeno y que posean características estereoquímicas que conservan la separación intramolecular de los componentes de la bicapa de liposomas. De manera alternativa, el protector de secado puede ser omitido si la preparación de liposoma no es congelada antes de la deshidratación y permanece suficiente agua en la preparación después de la deshidratación.

Liposomas derivados de lípidos como sistemas portadores de marcadores

El sistema basado en lípidos puede ser utilizado para diagnóstico de una serie de enfermedades, por ejemplo, de manera típica, las que se pueden seleccionar entre cáncer, por ejemplo, cáncer de cerebro, de mama, de pulmón, de colon o de ovario, o bien, leucemia, linfoma, sarcoma, carcinoma y estados inflamatorios.

Tal como se ha mencionado en lo anterior, los liposomas que comprenden los derivados de lípidos de la presente invención incluyen también un marcador. El marcador puede estar enlazado de forma covalente a las moléculas derivadas de lípidos o puede estar incorporado, lo que ocurre más frecuentemente, en sistemas basados en lípidos, por ejemplo, en el interior de una micela de liposoma o en la parte de la membrana, o una micela o liposoma. En una realización específica, el sistema de ampliación de imagen basado en lípidos descrito anteriormente adopta la forma de liposomas que comprenden el marcador. El sistema basado en lípidos puede haber incluido, en otra realización, una segunda substancia medicamentosa (ingredientes farmacéuticamente activos) que pueden tener un efecto farmacéutico individual o sinérgico en combinación con el derivado de lípido y los derivados de lisolípidos, de manera que el sistema de bases de lípidos tiene un efecto dual, es decir, la administración direccionada de un marcador igual que un medicamento o mezcla de medicamentos.

Teniendo en cuenta lo anterior, la presente invención da a conocer también un sistema de amplificación de imagen que adopta la forma de liposomas, y en el que se incorpora una segunda substancia medicamentosa.

Una posible "segunda substancia medicamentosa" es cualquier compuesto o composición de materias que se pueden utilizar a mamíferos, preferentemente humanos. Estos agentes pueden tener actividad biológica en mamíferos. Entre las segundas substancias medicamentosas que pueden ser asociadas a los liposomas se incluyen, sin que ellas sirvan de limitación: agentes antivirales, tales como aciclovir, zidovudine, y los interferones; agentes antibacterianos, tales como aminoglicósidos cefalosporinas, y tetraciclinas; agentes antifúngicos, tales como antibióticos de polieno, imidazoles, y triazoles; agentes antimetabólicos, tales como ácido fólico, y análogos de purina y pirimidina; agentes antineoplásticos, tales como los antibióticos de antraciclina, y alcaloides de plantas; esteroles, tales como colesterol; carbohidratos, por ejemplo, azúcares y almidones; aminoácidos, péptidos, proteínas tales como proteínas receptoras de células, inmunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmisores y glicoproteínas; tintes; compuestos midriáticos; broncodilatadores; anastésicos locales; y similares. Las segundas substancias medicamentosas especialmente interesantes se seleccionan entre (i) agentes antitumorales, tales como derivados de antraciclina, cisplatina, paclitaxel, 5-fluoracil, exisulin, ácido cis-retinoico, sulfuro de suldinac y vincristina, (ii) antibióticos y antifúngicos, y (iii) agentes antiflamatorios, tales como esteroides y no esteroides. En particular, los esteroides pueden tener también el efecto estabilizante en los liposomas.

La presente invención se refiere, también, a la utilización de cualesquiera de los sistemas de amplificación de imagen basados en lípidos, que se describen como compuestos diagnóstico y medicamentos combinados, y a la utilización de cualquiera de los sistemas de amplificación de imágenes basados en lípidos, que se describen para la preparación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades o estados asociados con un incremento localizado en la actividad de fosfolipasa A2 extracelular en tejidos de mamíferos. Estas enfermedades o estados se seleccionan de manera típica entre cáncer, por ejemplo, cáncer de cerebro, de mama, de pulmón, de colon, o de ovario, o bien leucemia, linfoma, sarcoma, carcinoma y estados inflamatorios.

Preparados farmacéuticos y utilizaciones en diagnósticos

También se prevé, en la presente invención, un compuesto farmacéutico que comprende un portador farmacéuticamente aceptable, el derivado lípido y un marcador.

El término "portadores farmacéuticamente aceptables", tal como se utiliza en esta descripción, son los medios generalmente aceptables para utilizar con la administración de lípidos y con liposomas, incluyendo formulaciones de medicamentos de liposomas a mamíferos, incluyendo humanos.

Los portadores farmacéuticamente aceptables son formulados, en general, de acuerdo con una serie de factores que se encuentran dentro del alcance de los técnicos en la materia, para determinar y adaptarse, sin que ello constituya limitación a: los agentes específicos de contraste conjugados de lípidos y/o segunda substancia medicamentosa utilizada, el preparado de liposomas, su concentración, estabilidad y biodisponibilidad pretendida; la enfermedad, desorden o condición objeto de tratamiento con el compuesto de liposoma; el sujeto, su edad, talla y estado general; y la ruta de administración pretendida del compuesto, por ejemplo, nasal, oral, oftálmica, subcutánea, intramamaria, intraperitoneal, intravenosa, o intramuscular. Se incluyen entre los portadores farmacéuticamente aceptables típicos, utilizados en administración medicamentosa por vía parenteral, por ejemplo, D5W, una solución acuosa que contiene 5% en peso en volumen de dextrosa, y solución salina fisiológica. Los portadores farmacéuticamente aceptables pueden contener ingredientes adicionales, por ejemplo, los que aumentan la estabilidad de los ingredientes activos, incluyendo conservantes y antioxidantes.

El liposoma o derivado de lípido es formulado de manera típica en el medio de dispersión, por ejemplo, un medio acuoso farmacéuticamente aceptable.

Para aplicaciones normales de diagnóstico, se administra preferentemente, por vía intravenosa, una cierta cantidad del compuesto que comprende el marcador, típicamente de 0,1 a 1000 mg aproximadamente de derivado de lípido por kilo de cuerpo del mamífero.

El compuesto farmacéutico es administrado, preferentemente, por vía parenteral por inyección, infusión o implantación (vía intravenosa, intramuscula, intrarticular, subcutánea o similares) en formas de dosificación, formulaciones o, por ejemplo, dispositivos de administración adecuados o implantes que contienen portadores, y coadyuvantes farmacéuticamente aceptables convencionales, no tóxicos.

La formulación y preparado de dichos compuestos son bien conocidos por los expertos en el sector de las formulaciones farmacéuticas. Se pueden encontrar formulaciones específicas en el libro de texto titulado "Remington's Pharmaceutical Sciences".

Por lo tanto, los compuestos farmacéuticos, de acuerdo con la invención, puede comprender el sistema de lípido-bases en forma de una inyección estéril. Para preparar este compuesto, se dispersan los agentes de contraste adecuados, conjugados de lípidos en un vehículo líquido parenteralmente aceptable que de forma conveniente puede comprender agentes de suspensión, solubilización, estabilización, ajuste de pH y/o dispersión. Entre los vehículos aceptables que se pueden utilizar se encuentran agua, agua ajustada a un pH adecuado por elección de la cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido sódico o un tampón adecuado, 1,3-butanediol, solución de Ringer y una solución de cloruro sódico isotónica. La formulación acuosa puede contener, también, uno o varios conservantes, por ejemplo, metilo, etilo o n-propil p-hidroxibenzoato.

Cuando se desea el diagnóstico de un tumor o neoplasma, la administración efectiva de un marcador encapsulado en liposomas, con intermedio del torrente sanguíneo, requiere que el liposoma sea capaz de penetrar en la capa endotelial continua (pero "con fugas") y membrana de basamento subyacente que rodee los vasos que suministran sangre al tumor. Los lisosomas de dimensiones menores se ha observado que son más eficaces en la extravasación en tumores a través de la barrera celular endotelial y membrana de base substrato que separa células capilares de las células tumorales.

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "tumores sólidos" son los que crecen en un lugar anatómico distinto del torrente sanguíneo (en contraste con los tumores transportados por la sangre, tal como leucemias). Los tumores sólidos requieren una formación de pequeños vasos sanguíneos y capilares para nutrir el tejido tumoral creciente.

De acuerdo con la presente invención, el marcador escogido es atrapado dentro de un liposoma de acuerdo con la presente invención; los lisosomas son formulados para que tengan un tamaño conocido a efectos de penetrar en las barreras del endotelio y de la membrana de substrato. La formulación de liposomas resultante puede ser administrada parenteralmente a un sujeto que necesita dicho tratamiento, preferentemente por administración intravenosa. Los tumores caracterizados por un incremento agudo en permeabilidad de la vasculatura en la zona del crecimiento del tumor son particularmente adecuados por tratamiento por los presentes métodos. Los liposomas se degradarán eventualmente debido a la acción de lipasa en el lugar del tumor, o se pueden hacer permeables, por ejemplo, mediante radiación térmica o ultrasónica. El marcador es liberado, a continuación, en una forma solubilizada transportable, biodisponible. Aunque el marcador no haya sido liberado, el solo hecho de que el liposoma esté concentrado en el tejido de interés hace factible el diagnóstico. Además, una pequeña elevación de temperatura, tal como se observa frecuentemente en tejido enfermo, puede incrementar adicionalmente la estimulación de PLA_{2} extracelular.

La enfermedad o estado a diagnosticar se caracteriza por tener un nivel elevado de PLA_{2} en un mamífero, lo que es provocado frecuentemente por tejidos malignos, por ejemplo, seleccionados entre el grupo que consiste en cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, linfomas, sarcomas y carcinoma. El tejido maligno es típicamente el tumor primario. El tejido maligno es, alternativamente, células metastásicas que se originan del tumor primario.

En caso de que se desee direccionado específico del lugar de la inflamación, la administración efectiva por liposomas de un marcador requiere que el liposoma tenga una larga media vida de la sangre, y que sea capaz de penetrar en la capa de células endoteliales continuas y en la membrana de base situada por debajo que rodea los vasos sanguíneos adyacentes al lugar de la inflamación. Los liposomas de tamaños menores se ha observado que son más eficaces en la extravasación, a través de la barrera celular endotelial y hacia el interior de las zonas inflamadas asociadas. No obstante, la limitada capacidad portadora de marcador de preparados convencionales de liposomas pequeños ha limitado su efectividad para dichos objetivos.

De acuerdo con la presente invención, el marcador escogido es atrapado dentro de un liposoma de acuerdo con la presente invención; los liposomas son formulados de dimensiones conocidas para penetrar en barreras del endotelio y de membranas de base. La formulación de liposomas resultante se puede administrar parenteralmente a un sujeto a diagnosticar, preferentemente, por administración intravenosa. Las regiones inflamadas, caracterizadas por un incremento agudo de permeabilidad de la vasculatura en la región de inflamación, son particularmente adecuadas para direccionado por los presentes métodos.

Es sabido que la actividad de PLA_{2} extracelular es anormalmente alta en zonas del cuerpo del mamífero con enfermedades de cáncer, inflamación, etc. La presente invención ha proporcionado una forma de explotar este hecho, y se cree que la actividad de PLA_{2} extracelular debe ser como mínimo 25% superior en las zonas enfermas del cuerpo (determinadas en el entorno extracelular) en comparación con un área normal comparativa. No obstante, se prevé que el nivel de actividad de PLA_{2} extracelular es frecuentemente mucho más elevado, por ejemplo, un mínimo de 100%, por ejemplo, un mínimo de 200%, tal como, como mínimo 400%. Esto significa que el diagnóstico de un mamífero, puede ser llevado a cabo solamente con la influencia mínima en tejidos que tienen un nivel "normal" de actividad de PLA_{2} extracelular.

El marcador puede ser adaptado para que sea detectable y opcionalmente cuantificable por un método de detección seleccionado entre el grupo que consiste en tomografía por emisión de positrones (PET), rayos X, escintografía de rayos gamma, formación de imágenes por resonancia magnética (MR), formación de imágenes por tomografía computerizada (CT) y ultrasonografía.

La presente invención se ilustrará por los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Los ejemplos muestran la preparación y pruebas de preparados de liposomas. La preparación de compuestos para utilización en diagnósticos se puede preparar tal como se describe en este documento.

Ejemplo 1 Preparación de liposomas

Se prepararon liposomas completamente hidratados, unilamelares, con una estrecha distribución de dimensiones a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y di-hexodecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DPPC). Se obtuvo DPPC de lípidos Avanti Polar y 1-O-DPPC se sintetizó en el laboratorio de los inventores. De modo breve, se disolvieron cantidades pesadas de DPPC ó 1-O-DPPC en cloroformo. El disolvente fue eliminado por una corriente suave de N_{2} y las películas de lípido fueron secadas durante la noche a baja presión para eliminar cantidades de trazas de disolvente. Se prepararon vesículas multilamelares por dispersión de los lípidos secos en una solución tampón, conteniendo 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN^{3}, 30 \muM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA. Las vesículas multilamelares fueron extrusionadas diez veces por dos filtros de policarbonato con dimensiones de poros 100 nm, apilados, tal como se describe en Mayer y otros, Biochim. Biophysm. Acta, 858, 161-168.

Se obtuvieron curvas de capacidad calorífica utilizando un calorímetro de escaneado diferencial N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp., Provo) del tipo de compensación de potencia con un volumen de celdas de 0,34 mL. Antes del escaneado, la suspensión de liposoma fue equilibrada durante 50 min en el calorímetro a la temperatura inicial. Se utilizó una proporción de escaneo de +10ºC/h. La concentración de lípidos era de 1 mM. La transición gel a fluido de los liposomas multilamelares (MLV) se caracteriza como transición aguda de primer orden, reflejada por un pico estrecho en las curvas de capacidad calorífica mostradas en las figuras 1a y 1b (curvas superiores) para 1-O-DPPC y DPPC. El pico agudo refleja el comportamiento de transición de liposomas de laminas múltiples y está en contraste con la transición gel a fluido más amplia, observada para liposomas unilamelares (LUV) (Pedersen y otros, 1996, Biophys. J. 71, 554-560), tal como se muestra en las figuras 1a y 1b (curvas inferiores) para los liposomas unilamelares extrusionados 1-O-DPPC y DPPC.

Ejemplo 2 Mediciones de perfil de reacción de fosfolipasa A_{2} de veneno de serpiente purificado y tiempo de retardo

Se aisló fosfolipasa A_{2} (PLA_{2} de Agikistrodon piscivorus piscivorus) de veneno de serpiente purificado, de acuerdo con un procedimiento de Maraganore y otros, J. Biol. Chem. 259, 13839-13843. Este enzima PLA_{2} pertenece a la clase de bajo peso molécular de enzimas secretoras de 14 kD que muestran similitud estructural con la fosfolipasa A_{2} extracelular humana, indicando un mecanismo molecular común de la hidrólisis catalizada por fosfolipasa en el interfaz lípido-membrana (Wery y otros, Nature 352,79-82; Honger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006, Vermehren y otros, Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36). Se prepararon liposomas unilamelares completamente hidratados con una distribución de tamaño estrecha a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y a partir de 1-O-DPPC con 5 y 10% molar 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) de 5 y 10% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-2000](1-O-DPPE-PEG-2000) tal como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de ensayo para el perfil del tiempo de reacción de PLA_{2}, que se han mostrado en la figura 2, y el tiempo de retardo y la hidrólisis porcentual indicada en la tabla 1, fueron: 0,15 mM liposomas unilamelares, 150 mM PLA_{2}, 150 mM KLC, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN_{3}, 30 \muM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA.

TABLA 1 Tiempo de retardo y porcentaje de hidrólisis de 1-O-DPPC a 41ºC determinado por HPLC. La concentración de lípido era de 0,150 mM en un tampón HEPES 10mM (pH = 7,5)

Composición	Tiempo de retardo (seg)	1-O-DPPC (%)
100% 1-O-DPPC	583	79
95% 1-O-DPPC/5% 1-O-DPPE-PEG350	128	73
90% 1-O-DPPC/10% 1-O-DPPE-PEG350	26	75
95% 1-O-DPPC/5% 1-O-DPPE-PEG2000	450	56
90% 1-O-DPPC/10% 1-O-DPPE-PEG2000	20	89

La reacción catalítica fue iniciada añadiendo 8,9 \mul de una solución de 42 \muM PLA_{2} (150 nM) a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizada (0,150 mM) equilibrada durante 800 seg antes de la adición de PLA_{2}. El comportamiento característico de ráfaga-retardo de PLA_{2} hacia los liposomas está señalado por un incremento brusco en la fluorescencia intrínseca de PLA_{2} a 340 nm después de excitación a 285 nm, seguido de una disminución simultánea en la dispersión de luz a 90ºC, desde la suspensión de líquido (HÆnger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Se tomaron muestras para análisis HPLC de la cantidad restante de 1-O-DPPC no hidrolizado, y como consecuencia la cantidad de 1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-1-O-PPC.) generado se tomaron antes de añadir PLA_{2} y 1200 seg después del tiempo de retardo observado. Se retiraron partes alícuotas de 100 \mul de la suspensión de lípidos y se mezclaron con rapidez con 1 ml de solución cloroformo/metanol/ácido acético (2:4:1) por el orden indicado, para interrumpir la reacción enzimática. La solución fue lavada con 1 ml de agua y 20 \mul de la fase orgánica pesada fueron utilizados para HPLC. Los cromatogramas 20 \mul de HPLC de la figura 3 muestra las cantidades de 1-O-DPPC antes y después (t=2.050 seg) de la añadidura de PLA_{2} (t=800 seg) a la suspensión de liposomas. Se llevó a cabo análisis HPLC utilizando una columna de 5 \mum de diol, una fase móvil compuesta por cloroformo/metanol/agua (730:230.30, v/v) y un detector de dispersión de luz por evaporación. La producción de la hidrólisis catalizada por PLA_{2} de lípidos de 1-O-DPPC a liso-1-O-P/C. fue medida por HPLC (ver tabla 1). La fluorescencia intrínseca del enzima y la dispersión de luz a 90ºC se midieron en función del tiempo, tal como se ha mostrado en la figura 2.

Ejemplo 3 Liberación inducida por fosfolipasa A_{2} de un medicamento de modelo soluble en agua, encapsulado y/o agente de contraste

Se prepararon liposomas multilamelares 1-O-DPPC en presencia de calceína fluorescente, en una concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una película de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina en una solución tampón de HEPES a pH=7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la fase de la temperatura de transición. Se formaron liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm. Los liposomas unilamelares fueron enfriados con rapidez a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas 1-O-DPPC conteniendo calceína fueron separados de la calceína libre, utilizando una columna cromatográfica llena de Sephadex G-50.

Las condiciones de ensayo para la liberación de calceína inducida por PLA_{2} fueron 25 \muM de liposomas unilaminares 1-O-DPPC, 25 nM PLA_{2}, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5 ó 8,0), 1 mM NaM_{3}, 30 \muM CaCI_{2}, y 10 \muM EDTA. Se añadió PLA_{2} a los 90 seg a 2,5 ml de la suspensión de liposomas 1-O-DPPC termostatizada, equilibrada durante un mínimo de 20 min a 37ºC antes de la adición de PLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determinó del modo siguiente: % liberación = 100 x (I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida al tiempo t después de la adición de la enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo e I_{T} es la fluorescencia total medida después de la añadidura de triton X-100, que conduce a la liberación completa de calceína por fractura de los liposomas 1-O-DPPC. El PLA_{2} indujo una liberación total de 90% de la calceína atrapada en los liposomas 1-O-DPPC, tal como se muestra en la figura 4.

Ejemplo 4 Incremento de permeabilidad controlada por fosfolipasa A_{2} de una membrana objetivo modelo

Se prepararon liposomas objetivos con membrana modelo multilamelares, en presencia de calceína fluorescente, en una concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una película de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (D-O-SPC) en una solución tampón HEPES a pH=7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase (T_{m}=55ºC). Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas objetivo multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm. Los liposomas unilamelares fueron enfriados rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición y los liposomas que contenían calceína fueron separados de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica llena de Sephadex G-50. Los liposomas portadores unilamelares compuestos de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina fueron preparados tal como se ha descrito anteriormente. La calceína liberada de los liposomas objetivo se determina por medición de la intensidad fluorescente a 520 nm, después de excitación a 492 nm.

Las concentraciones de liposomas D-O-SPC y 1-O-DPPC fueron de 25 \muM. Se añadió PLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la reacción hidrolítica que conduce a la formación de 1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina (liso-1-O-PPC.) y productos de hidrólisis de ácidos grasos. Al liberar calceína de los liposomas D-O-SPC, debido a la incorporación de liso-1-O-PPC. que no forma bicapa y productos de hidrólisis de ácidos grasos en la membrana de lípido del objetivo, se observó un incremento lineal de la fluorescencia a 520 nm, después de excitación a 492 nm, cuando la calceína se diluye en el medio de tampón circundante, tal como se muestra en la figura 5. El porcentaje del medicamento modelo y/o de la calceína del agente de contraste liberador se determina tal como se ha descrito anteriormente (ver ejemplo 3).

Ejemplo 5 Ensayo de hemólisis

Se prepararon liposomas unilamelares completamente hidratados con una estrecha distribución de tamaños a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC), y de 1-O-DPPC con 5% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350](1-O-DPPE-PEG350) o con 5% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-2000 (1-O-DPPE-PEG 2000). Los lípidos fueron hidratados en una solución salina con tampón de fosfato (PBS). Se incluyó 1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina (ET-18-OCH_{3}) en PBS en el ensayo como referencia.

El ensayo de hemólisis fue llevado a cabo tal como se describe por Perkins y otros, Biochim. et Biophys. Acta 1327, 61-68. En pocas palabras, cada una de las muestras fue diluida serialmente con PBS, y 0,5 ml de cada una de las suspensiones diluidas de liposomas 1-O-DPPC fueron mezclados con 0,5 ml de células humanas de hematíes lavadas (RBC) [4% en PBS (v/v)]. A efectos de control, se mezclaron 0,5 ml de la suspensión de células de hematíes con 0,5 ml de solución tampón (control de hemólisis negativo) o bien, 0,5 ml de agua (control de hemólisis positivo). Las muestras y los estándares fueron situados en una incubadora a 37ºC y se agitó durante 20 horas. Los tubos fueron centrifugados a baja velocidad (2000 x G) durante 10 min formando gránulos de RBC. Se cuantificaron 200 \mul del sobrenadante por absorbancia a 550 nm, utilizando un espectrofotómetro Perkin-Elmer 320. Se definió hemólisis a 100 por cien como la magnitud máxima de hemólisis obtenida a partir del detergente Triton X-100. El perfil de hemólisis, de la figura 6, muestra un valor bajo de hemólisis (por debajo de 5 por cien) para liposomas 2 mM 1-O-DPPC. La figura 6 muestra también que concentraciones bajas de ET-18-OCH_{3} inducen un grado significativo de hemólisis.

Ejemplo 6 Incremento de la actividad de fosfolipasa A_{2} por lípidos 1-O-DPPC injertados con polímero

Se prepararon liposomas unilamelares completamente hidratados con una estrecha distribución de tamaños a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (1-O-DPPC) y 1-O-DPPC con 5 ó 10% molar de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), tal como se describe en el ejemplo 2. Las condiciones de ensayo para las mediciones del retardo de PLA_{2} fueron liposomas unilamelares 0,15 mM, 150 nM PLA_{2}, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN^{3}, 30 \muM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA. La reacción catalítica fue iniciada añadiendo 8,9 \mul de una solución de 42 \muM PLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de liposomas termostatizados, equilibrada para 800 seg a 41ºC antes de la añadidura de PLA_{2}. El tiempo trascurrido, antes del inicio de la actividad enzimática rápida, se determina por el incremento brusco de la fluorescencia intrínseca desde PLA_{2} a 340 nm, después de excitación a 285 nm. Los resultados mostrados en la figura 7 muestran una disminución significativa del tiempo de retardo cuando se incorporan 5 y 10% molar de 1-O-DPPE-PEG_{350} en los liposomas 1-O-DPPC.

Ejemplo 7 Preparación de micelas compuestas de 1-O-DPPE-PEG350, DSPE-PEG750 y 1-O-DPPE-PEG2000

Se prepararon micelas a partir de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-750 (DSPE-PEG750) ó 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-2000 (1-O-DPPE-PEG2000). En pocas palabras, cantidades pesadas de los lípidos polímeros fueron disueltas en cloroformo. El disolvente fue eliminado mediante una corriente suave de N_{2}. Las películas de lípido fueron secadas, a continuación, durante una noche a presión reducida para eliminar las cantidades de disolvente en magnitud de trazas. Se prepararon micelas dispersando los lípidos de polímero secos en una solución tampón, conteniendo 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN_{3}, 30 IIM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA.

Ejemplo 8 Incremento de permeabilidad de membranas de modelo diana, controladas por hidrólisis de fosfolipasa A_{2} de micelas

Se prepararon liposomas objetivo con membrana modelo, de tipo multilamelar, en presencia de medicamentos de modelos fluorescentes y/o calceína de agente de contraste en una concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una película de 1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolinas (D-O-SPC) en una solución tampón de HEPES a pH=7,5, durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase (T_{m}=55ºC). Se prepararon liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm. Los liposomas unilamelares fueron enfriados con rapidez a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas conteniendo calceína fueron separados de la calceína libre, utilizando una columna cromatográfica llena de Sephadex G-50. Las micelas compuestas de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-750 (DSPE-PEG750) ó 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-2000 (1-O-DPPE-PEG2000) fueron preparadas tal como se describen en el ejemplo 7. La liberación de calceína del liposoma objetivo se determina por medición de la intensidad fluorescente a 520 nm después de excitación a 492 nm.

Las concentraciones de D-O-SPC y micelas de lípido polímero fueron de 25 \muM. Se añadió PLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la acción hidrolítica que conduce a la formación inmediata del liso-1-O-PPE y a los productos libres de la hidrólisis de ácido graso. Al ser liberada calceína de los liposomas de D-O-SPC, debido a la incorporación del polímero-liso-1-O-lípido que no forma bicapa y ácido graso en la membrana de lípido objetivo, se observó un incremento lineal de la fluorescencia a 520 nm, después de excitación a 492 nm, cuando la calceína se diluye en el medio tampón circundante, tal como se muestra en la figura 8. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se describe en el ejemplo 3. La hidrólisis catalizada por PLA_{2} de 1-O-DPPE-PEG350 indujo la velocidad de liberación más rápida, mientras que el DPPE con la cadena de polímero más larga (PEG2000), fijada al grupo de cabecera, indujo la velocidad más lenta de liberación.

Ejemplo 9 Hidrólisis de micelas compuestas por DSPE-PEG750

La hidrólisis de las micelas compuestas DSPE-PEG750 fue seguida por análisis de la cantidad de ácido esteárico generada. La reacción catalítica fue iniciada por adición de 8,9 \muL de una solución de 42 \muM PLA_{2} (150 nM) a 2,5 ml de una suspensión de micelas termostatizada de DSPE-PEG750 (0,150 mM) equilibrada a 45ºC durante 600 segundos antes de la adición de PLA_{2}. El comportamiento de ráfaga característica de PLA_{2} hacia las micelas está señalado por un incremento brusco de la fluorescencia intrínseca de PLA_{2} a 340 nm, después de excitación a 285 nm seguido de un incremento simultáneo en la dispersión de luz a 90º de la suspensión de lípido (HÆnger y otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Se tomaron muestras para análisis HPLC de la cantidad de ácido esteárico generada antes de añadir PLA_{2} y 100 seg después del retardo de tiempo observado. Los cromatogramas de HPLC de la figura 9 muestran la cantidad de ácido esteárico generada 100 seg después del retardo de tiempo observado (10 seg) a 45ºC. La cantidad de ácido esteárico 0,156 mM generada por hidrólisis era igual al 100% de la hidrólisis del polímero-lípidos DSPE-PEG750. El análisis HPLC fue realizado utilizando una columna de 5 \mum diol, una fase móvil compuesta de cloroformo-metanol-agua (750:230:30, v/v) y un detector de dispersión de luz por evaporación (ver ejemplo 2).

Ejemplo 10 Ejemplos modelo

Los liposomas con recubrimiento de polímero pueden actuar como sistemas versátiles de suministro de marcador debido al largo tiempo de circulación vascular y al direccionado pasivo por los vasos sanguíneos con fugas en tejidos enfermos. En estos ejemplos, se describe un sistema modelo experimental ilustrando un nuevo principio para suministro mejorado y programable de producto medicamentoso y/o agente de contraste que aprovecha la ventaja de una elevada actividad de la fosfolipasa extracelular A_{2} en los tejidos objetivo enfermos. La fosfolipasa A_{2} hidroliza un proamplificador basado en lípidos en el liposoma portador, produciendo liso-fosfolípidos y ácidos grasos libre que se muestran de forma sinérgica conduciendo a una desestabilización de liposomas incrementada y liberación de agente medicamentoso, al mismo tiempo que se mejora la permeabilidad de la membrana objetivo. El sistema propuesto se puede hacer termosensible y ofrece una forma racional para desarrollar sistemas de suministro inteligentes de medicamentos y agentes de contraste basados en liposomas, al incorporar en los proamplificadores basados en lípidos específicos del portador, prodesestabilizadores o en los promedicamentos que automáticamente quedan activados por la fosfolipasa A_{2} solamente en los lugares objetivo enfermos, tales como tejidos inflamados, infectados o cancerosos.

El medicamento y/o agente de contraste adopta la farmacocinética alterada del portador de liposomas y, en principio, puede ser direccionado a los tejidos enfermos utilizando una combinación de factores fisicoquímicos y patofisiológicos en los lugares del portador de liposomas y en la membrana objetivo, respectivamente. Los liposomas incorporados con glicolípidos o lipopolímeros, tales como polietilén-glicol (PEG) lípidos, conocidos como liposomas, muestran estabilidad mejorada en el sistema vascular, posiblemente debido a la protección estérica provocada por el recubrimiento de polímero. El tiempo de circulación prolongado de estos liposomas, combinado con porosidad vascular incrementada de tejidos enfermos han constituido la base para resultados clínicos positivos para sistemas específicos, incluyendo medicamentos anticáncer, tales como doxorubicina, así como medicamentos antibacterianos y anti inflamatorios, e igualmente, sistemas de suministro de agentes de contraste específicos para objetivos de formación de imágenes (por ejemplo, agentes de formación de imágenes MR basados en Mn) Niesman y otros, J. Liposome Res. 4, 939-957, Koenig y Brown, Invest. Radiol. 20, 297; Basic y otros, Magn. Reson. Med. 13, 44-61; Niesman y otros, Invest. Radiol. 25, 545-551.

Los liposomas son sistemas de lípidos autoensamblados y su estabilidad es controlada, por lo tanto, en gran medida, por interacciones físicas no específicas. La comprensión del control molecular de las características físicas de los liposomas es, por lo tanto, importante para la manipulación y adecuación de las características de los liposomas, con respecto a los objetivos específicos de suministro de medicamentos. Como ejemplo, la transición de fase de lípido, inducida térmicamente, gel-fluido, ha sido explotada y optimizada en forma de sistemas de diseño para liberación mejorada de medicamentos debido a la hipertermia. Recientemente, liposomas PEG fusogénicos programables, conteniendo mitoxantrona, que es un medicamento anticáncer, han sido construidos utilizando la liberación con retardo en el tiempo de lípidos estabilizantes bicapa de los liposomas que se acumulan en los lugares tumorales por extravasación. Sería deseable si se pudiera diseñar un sistema de suministro de un agente medicamentoso y/o de agente de contraste inteligentes y versátiles, que tiene incorporado un mecanismo virtual doble de disparo de simultáneamente (i) liberación mejorada de medicamento selectivamente en los tejidos objetivo y (ii) transporte mejorado del medicamento y/o agente de contraste en las células enfermas. Este principio se ha ilustado esquemáticamente en la figura 11a.

Por medio de los ejemplos, se describe el desarrollo de un sistema modelo biofísico experimental simple y operativo que soporta dicho mecanismo dual para su disparo en los lugares patológicos objetivo. El modelo supone elevada actividad de fosfolipasa A_{2} extracelular en los lugares enfermos, tal como en el caso de tejidos inflamados y cancerosos, en los que el nivel de PLA_{2} extracelular se puede ampliar varias veces. Por exposición a PLA_{2} extracelular, los fosfolípidos de los liposomas PEG se ha demostrado que sufren hidrólisis incrementada en comparación con liposomas desnudos convencionales. Esto lleva a la desestabilización del liposoma y a la liberación mejorada del medicamento encapsulado. Los productos de hidrólisis, liso-fosfolípidos y ácidos grasos libres actúan, a su vez, como mejoradores de absorción para la permeación de medicamentos y/o agentes de contraste, a través de las membranas objetivo. De esta manera, los fosfolípidos del liposoma portador se comportan como prodesestabilizantes en el lugar del portador y como proamplificadores en el lugar de la membrana objetivo. Los detalles moleculares de este principio se muestran esquemáticamente en la figura 11b.

El sistema de modelo experimental consiste en liposomas desnudos, portadores de liposomas recubiertos de polímero y una membrana objetivo modelo. El portador es un liposoma unilamelar de 100 nm, preparado a base de lípidos de dipalmitoil fosfatidicolina (DPPC) con 2,5% molar de lipopolímero del tipo de dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE)-PEG_{2000}. La membrana objetivo es otro liposoma preparado a base de 1,2-dioctadecil-sn-glicero-fosfatidilcolina (D-O-SPC), que es un fosfolípido en el que los enlaces acilo de las cadenas estearoilo son enlaces éter. En contraste con DPPC, D-O-SPC es inerte hacia la hidrólisis catalizada por PLA_{2}, imitando de esta manera la estabilidad de una membrana celular objetivo intacta hacia la degradación por sus propias enzimas. El ensayo experimental, que permite separar en sí mismo simultáneamente la investigación del efecto de los desestabilizantes en los liposomas portadores y el efecto de los amplificadores en la membrana objetivo, comporta atrapar un medicamento y/o agente de contraste modelo de calceína fluorescente, soluble en agua, en una concentración autorreguladora, en el interior del liposoma objetivo no hidrolizable, en vez de hacerlo en el liposoma portador. El nivel mejorado de PLA_{2} extracelular en la membrana objetivo puede ser simulado entonces añadiendo PLA_{2} extracelular para iniciar la reacción hidrolítica en una suspensión del portador y de liposomas objetivo. La permeación de calceína a través de la membrana objetiva D-O-SPC es controlada, a continuación, por el incremento de la fluorescencia. A efectos de investigar el efecto de la presencia de los PEG-lípidos en el liposoma portador, se llevó a cabo un experimento similar con liposomas desnudos de DPPC convencionales, que se pueden utilizar ventajosamente para direccionado de órganos ricos en macrófagos de RES, tal como hígado y bazo. Además, a efectos de comparar y discriminar el efecto incrementador de la permeabilidad de los liso-fosfolípidos con respecto al de los ácidos grasos libres, se llevaron a cabo experimentos sin enzimas en los que se añadieron liso-fosfolípidos y ácidos grasos libres simultáneamente o separadamente a los liposomas objetivo.

En la figura 12a se han mostrado los resultados de la liberación de calceína como función del tiempo, después de la añadidura de PLA_{2} al sistema. El trascurso temporal de la reacción del PLA_{2} específico utilizado como comportamiento característico de ráfaga de retardo con un llamado retardo de tiempo, que puede ser utilizado convenientemente como medida de la actividad enzimática. Se observaron una notable disminución del tiempo de retardo y un incremeno simultáneo de la velocidad de liberación, cuando los liposomas del portador contienen los lipopolímeros DPPE-PEG_{2000}, de acuerdo con anteriores descubrimientos de la degradación incrementada de PLA_{2} extracelular de liposomas con recubrimiento de polímero.

Estos resultados sugieren que los productos de la hidrólisis catalizada por PLA_{2} de los lípidos de DPPC del portador de DPPC-liposoma, liso-fosfolípido y ácido graso libre, que se producen en una mezcla 1:1, se incorporan en la membrana objetivo, como conduciendo a un gran incremento de la permeabilidad de la membrana. Estos productos, que tienen una solubilidad muy baja en agua, son conocidos, debido a sus formas moleculares no cilíndricas, como inductores de un campo de esfuerzo de curvatura en la membrana de separación de fase lateral, a pequeña escala, que induce defectos de membrana y una permeabilidad incrementada. Esto queda soportado por los datos de la figura 13, que muestran que la adición de liso-fosfolípido o ácido graso separadamente al presente sistema objetivo, en ausencia de PLA_{2}, conduce a una mayor velocidad de liberación de calceína, a través de la membrana objetivo. No obstante, el descubrimiento principal es que si se añaden simultáneamente liso-fosfolípido y ácido graso libre en una mezcla 1:1, se observa un notable incremento de la velocidad de liberación, tal como se ha mostrado en la figura 13. Esto sugiere vivamente que los dos activadores actúan de forma sinérgica, remarcando de esta manera la posibilidad única de explotar hidrólisis catalizada por PLA_{2} para la desestabilización combinada del liposoma portador y mejora del transporte del medicamento a través de la membrana objetivo. El efecto sinérgico aumenta adicionalmente por el hecho de que PLA_{2} extracelular es activado por sus propios productos de hidrólisis, revelando los fosfolípidos degradables del liposoma portador como un cierto tipo de proactivadores.

Se debe observar que el efecto del presente sistema, modelo de suministro de medicamento y/o agente de contraste, con utilización de lípidos como proincrementadores y prodesestabilizadores con intermedio de la actividad PLA_{2} extracelular es dinámico y se refiere a una escala de tiempo intrínseca. Esta escala de tiempo es el tiempo de retención efectivo de los liposomas portadores cerca de la membrana objetivo. Cuanto más rápidamente resulta activo el enzima, más rápida es la liberación del medicamento y/o agente de contraste y mayor es la absorción del medicamento y/o agente de contraste durante el tiempo que el portador se encuentra cerca del objetivo. Además, cuanto más rápidamente funciona el enzinma, más fácilmente queda a disposición para hidrólisis de otros liposomas que son portadores de medicamentos que se aproximan al lugar objetivo enfermo. Una vez se ha establecido que la actividad de PLA_{2} extracelular se puede utilizar para controlar la liberación de medicamentos, se abren varias rutas racionales para mejoras inteligentes del sistema de suministro propuesto de medicamento y/o agente de contraste, a través de la utilización de mecanismos bien conocidos de la alteración de la actividad PLA_{2} extracelular por manipulación de las propiedades físicas de la bicapa de lípido a la que se sabe que el enzima es sensible, de ello resulta la estrategia de modificar ciertas características físicas de los liposomas portadores, sin cambiar significativamente su tiempo de circulación vascular. Se ilustrará este principio general demostrando los efectos tanto de un factor físico-químico, la composición de lípido del portador, como de un factor ambiental (termodinámico), la temperatura local en el lugar objetivo.

Los fosfolípidos de cadena corta, tales como didecanoil fosfatidilcolina (DCPC), activan el PLA_{2} extracelular. El efecto de la permeación de calceína, a través de las membranas objetivo inducidas por la incorporación de una pequeña cantidad de DCPC en las liposomas PEG portadoras se muestra también en la figura 12.a. La liberación es muy rápida debido a una activación casi instantánea del enzima. Los inventores han descubierto además que el PLA_{2} extracelular resulta desactivado (no se muestran datos) cuando se incorpora una cantidad grande de colesterol (\approx20 mol %) en los liposomas. Como contraste, los inventores han descubierto que una pequeña cantidad de colesterol (\approx3 mol %) activa PLA_{2} extracelular. Estos descubrimientos significativos son de particular interés, puesto que el tiempo de circulación en sangre de los liposomas PEG se ha informado que es casi el mismo sin colesterol que con grandes cantidades de colesterol.

Se sabe que la temperatura tiene un efecto notable, y principalmente no lineal en la activación de PLA_{2} extracelular en la zona de la transición de fase gel-fluido de bicapas de fosfolípido saturadas. Este efecto no es provocado por cambios en el enzima, sino por notables cambios estructurales laterales en la bicapa de lípido. Es posible aprovechar la ventaja de este efecto en el presente sistema de suministro de medicamento y/o agente de contraste, tal como se sugiere por los datos de la figura 12b. Al aproximarse la temperatura a la temperatura de transición en 41ºC, la velocidad de liberación de calceína queda aumentada progresivamente, tal como se cuantifica por el tiempo de liberación de 50% de calceína t_{50%}, que se ha mostrado en el añadido de la figura 12b. Se ha sugerido con anterioridad que se podría aprovechar la hipertermia para aumentar la liberación del medicamento, y que se podría utilizar el calentamiento local en áreas tumorales predefinidas para desestabilizar localmente los liposomas portadores de medicamentos al aprovechar el carácter de fugas incrementadas de liposomas en su situación de fase. En el nuevo sistema de modelo de suministro de medicamentos y/o agente de contraste que se propone en este documento, estas posibilidades termosensibles son integradas y explotadas por completo con intermedio o de la sensibilidad térmica de PLA_{2} extracelular a las características físicas del liposoma portador. En contraste con el caso en el que el efecto térmico puede ser alcanzado solamente por un incremento local de temperatura utilizando fuentes de calentamiento externas en un lugar tumoral predeterminado de ciertas dimensiones mínimas, la liberación controlada por PLA_{2} será aumentada en todos los lugares en los que la temperatura y la concentración de PLA_{2} extracelular son elevados, por ejemplo en tejidos inflamados, con independencia de las dimensiones de la zona enferma y sin requerir una localización previa de los tejidos enfermos.

Se obtuvieron, DPPC, DCPC, D-O-SPC, y DPPE-PEG_{2000} de Avanti Polar Lipidos. El lipopolímero DPPE-PEG^{2000} contiene 45 monómeros en la cadena de polímero de PEG. El PLA_{2} de veneno de serpiente purificado (Agkistrodon piscivorus piscivorus) fue un generoso regalo del dr. R.L. Biltonen. Este enzima de PLA_{2} pertenece a la clase de enzimas secretores de bajo peso molecular, 14 kD que muestran similitud estructural a la fosfolipasa A_{2} extracelular humana. Los liposomas objetivo multilaminares en presencia de calceína fluorescente en concentración autoequilibrante de 20 mM se prepararon por hidratación de una película de D-O-SPC en una solución tampón de HEPES a pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase T_{m} = 55ºC. Los liposomas unilaminares fueron preparados extrusionando los liposomas multilaminares diez veces a través de dos filtros de policarbonato de 100 nm apilados. Los liposomas unilaminares fueron enfriados rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los liposomas conteniendo calceína fueron separados de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica llena de Sephadex G-50. Los liposomas portadores unilaminares de DPPC, DCPC y DPPE- PEG_{2000} fueron preparados de manera similar T_{m}=41ºC). La liberación de calceína de los liposomas objetivo es determinada por medición de la intensidad fluorescente a 520 nm después de excitación a 492 nm. Todas las mediciones son llevadas a cabo a temperaturas en las que los lípidos, tanto del portador como de los liposomas objetivo se encuentran en estado de gel.

Ejemplo 11 Ensayo de liberación dependiente de la concentración de fosfolipasa A2

Liposomas multilamelares 1-O-DPPC con 10% molar de 1-O-DPPE-PEG350 fueron preparados en presencia de calceína fluorescente en concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una película de 90% de 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-nn-glicero-3-fosfocolina y 10% 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] en una solución de tampón HEPES a pH=7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de transición de fase. Los liposomas unilamelares fueron constituidos por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas unilamelares fueron enfriados rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de transición y los liposomas conteniendo calceína fueron separados de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica llena de
Sefadez G-50.

Las condiciones de ensayo para la liberación de calceína inducida por PLA_{2} fueron liposomas unilamelares 25 \muM, 50, 1 y 0,02 nM PLA_{2}, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN_{3}, 30 \muM CaCl_{2}, y 10 \muM EDTA. Se añadió PLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de lípido termostatizado equilibrada durante un mínimo de 300 seg a 35,5ºC antes de la adición del PLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determina del modo siguiente: % Liberación = 100 x (I_{F(t)} - I_{B})/(I_{T -} I_{B}), en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida en el tiempo t después de adición de la enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, e I_{T} es la fluorescencia total medida después de adición de Triton X-100 que conduce a la liberación completa de calceína por fraccionamiento de los liposomas 1-O-DPPC. La figura 14 muestra que la liberación inducida de calceína fue la más lenta cuando de añadió solamente 0,02 nM PLA_{2} a la suspensión de liposomas.

Ejemplo 12 Hemólisis in vivo

Grupos de ratones (n = 5/grupo; peso 18-22 g) fueron tratados i.v. con tampón (PBS), ET-18-OCH_{3} (50 mg/kg), y liposomas compuestos de 1-O-DPPC con 5 mol% 1-O-DPPE-PEG2000 (68,7 y 137,5 mg/kg). 30 minutos después de la inyección, se recogieron 100 \mul de sangre en tubos heparinizados directamente de ratones decapitados anestesiados con CO_{2}. La sangre fue centrifugada a 500 x G durante 10 minutos, y el plasma se retiró y almacenó a -20ºC hasta el análisis.

El grado de hemólisis fue medido por absorbancia a 550 nm utilizando un espectrofotómetro de barrido Perkin-Elmer 320. Se mezclaron 25 \mul de plasma con 2,5 ml de PBS o 2,5 ml de tritón X-100 al 10%. Se definió el 100 por cien de hemólisis como la cantidad máxima de hemólisis obtenida del plasma de ratones tratados con PBS mezclado con Triton X-100 al 10% y 0 por cien como plasma de ratones tratados con PBS mezclados con PBS.

El perfil de hemólisis de la tabla 2 muestra un bajo valor de hemólisis para los ratones tratados con 2 mM liposomas compuestos de 1-O-DPPC con 5 mol% 1-O-DPPE-PEG2000. Los ratones tratados con ET-18-OCH_{3} murieron dentro de un período de 30 minutos.

TABLA 2 Porcentaje de hemólisis, \pm error estándar, después de 30 minutos y número de ratones supervivientes en cada grupo

Tratamiento	PBS	ET-18-OCH_{3}	1-O-DPPC	1-O-DPPE-
		50 mg/kg	con 5 mol %	PEG2000
			68,7 mg/kg	137,5 mg/kg
Hemólisis	1,7% (\pm 0,2)	ND (muertos)	4,0% (\pm2,4)	6,6% (\pm0,7)
Supervivientes (30 minutos)	3/3	0/5	5/5	5/5

Tal como se utiliza en esta descripción, el término "tumores sólidos" son los que crecen en un lugar anatómico distinto de la corriente sanguínea (en contraste con tumores transportados por la sangre tal como leucemias). Los tumores sólidos requieren la formación de pequeños vasos sanguíneos y capilares para nutrir el tejido tumoral creciente.

Ejemplo 13 Hidrólisis de liposomas cargados negativamente de fosfolipasa A2 en fluido peritoneal de rata libre de células

Se preparó fluido peritoneal libre de células de ratas con inflamación aguda inducida por caseína inyectando 5 ml de caseinato sódico al 1% en la cavidad peritoneal de una rata macho SRPD, con un peso de 250-260 g. La rata fue sacrificada por desangrado después de 24 horas, y el fluido inflamatorio fue recogido del peritoneo y centrifugado a 1500 G durante 20 minutos a efectos de obtener fluido peritoneal libre de células.

Liposomas unilaminares negativamente cargados y completamente hidratados, con una estrecha distribución de tamaños, fueron preparados a partir de 89% mol di-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol (DPPG), 10 mol% 1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén glicol)-350] (1-O-DPPE-PEG350) y 1% mol 1,2-bis-(1-pirenedecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina (bis-py-DPC). El bis-py-DPC es un sustrato de PLA2 con dos fluoróforos de pireno adyacentes que forman dímeros de estado excitado (exímeros) emitiendo a 470 nm cuando tiene lugar la excitación en 342 nm. La hidrólisis catalizada por fosfolipasa separa los dos fluoróforos, que a continuación emiten a 380 nm (monómeros).

La figura 15 muestra los espectros de emisión obtenidos después de excitación en 342 nm de bis-py-DPC incorporado en liposomas cargados negativamente (0,100 mM) antes y después de añadir 100 nM de PLA_{2} (Agkistrodon piscivorus piscivorus). El cambio observado en el espectro de emisión después de hidrólisis mediada por fosfolipasa es utilizado en un ensayo continuo, midiendo la emisión del exímero a 470 nm simultáneamente con la emisión del monómero en 380 nm después de excitación en 342 nm. La figura 16 muestra el perfil del tiempo de reacción de la hidrólisis catalizada por fósfolipasa A_{2} de rata de los liposomas cargados negativamente. La reacción catalítica fue iniciada por añadidura de fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de una suspensión de liposomas termostatizada equilibrada para 60 segundos antes de la edición de PLA_{2}. El comportamiento típico de retardo-ráfaga de la fosfolipasa es señalado por un incremento brusco en la fluorescencia del monómero en 380 nm y una disminución subsiguiente en la fluorescencia del exímero, tal como se muestra en el inserto de la figura 16.

Las condiciones de ensayo para el perfil de tiempo de reacción de PLA_{2} que se muestra en la figura 16 fueron: 0,100 mM de liposomas unilaterales cargados negativamente, 100 \mul de fluido peritoneal libre de células sin diluir, 10 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM CaCl_{2}, y 150 mM NaCl.

Referencias

Torchilin, V.P. (1998) Liposomes as carrieres of contrast agents for in vivo diagnostics. In: Lasic and Papahadjopoulos (eds.) Medical Applications of Liposomes. Elsevier Science p. 515-543.

Kaiser, E. (1999) Phospholipase A2: its usefulness in laboratory diagnostics.Crit Rev Clin Lab Sci 36(2):65-163.

Claims

1. Utilización de un sistema basado en lípidos que comprende un derivado de lípido y un marcador, teniendo dicho derivado de lípido (a) un grupo alifático con una longitud mínima de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) una fracción hidrofílica, siendo además dicho derivado de lípido un sustrato para PLA_{2} extracelular en la medida de que el radical orgánico puede ser fraccionado hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente sin afectar, de manera que el derivado de lípido del cual se ha fraccionado el radical orgánico es liberado en forma de un derivado lisolípido que no es un sustrato para lisofosfolipasa, llevando incluido dicho sistema en el mismo lipopolímeros o glicolípidos a efectos de presentar cadenas hidrofílicas en la superficie del sistema para la preparación de un compuesto de diagnóstico para detectar y/o cuantificar enfermedades o estados asociados con un incremento localizado de actividad de PLA_{2} extracelular en tejidos de mamíferos.

2. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el marcador es seleccionado entre el grupo que consiste en ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga, ^{11}C; Gd, Mn, óxido de hierro, argón, nitrógeno, yodo, bromo y bario.

3. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el derivado de lípido tiene la siguiente fórmula:

\melm{\delm{\para}{CH _{2} 
--- Z --- R ^{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2}  --- X ---
R ^{1} }}

H --- Y --- R^{2}

en la que

: X y Z independientemente son seleccionados entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2};

: Y es -OC(O)-, conectándose a continuación Y a R^{2} con intermedio del oxígeno o átomo de carbono del carbonilo;

: R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};

: en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4} -(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7-}(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un entero de 9 a 29; n1 es cero o un entero de 1 a 29, n3 es cero o un entero de 1 a 20, n5 es cero o un entero de 1 a 17, n7 es cero o un entero de 1 a 14, y n9 es cero o un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4, n6 y n8 es independientemente 0 ó 1 y Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; de manera que cada uno de Y^{1}-Y^{2} independientemente pueden estar sustituidos por halógeno o C_{1-4} alquilo,

: R^{3} es seleccionado entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisoésteres a ácido fosfático y derivados del mismo.

4. Utilización, según la reivindicación 3, en la que R^{2} es un grupo alifático de una longitud de un mínimo de 7 átomos de carbono.

5. Utilización, según la reivindicación 4, en la que R^{2} es un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2}.

6. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el promedicamento constituye 15-100% molar del sistema total basado en lípidos deshidratado.

7. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el sistema basado en lípidos adopta la forma de liposomas en la que se incorpora una segunda sustancia medicamentosa.

8. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el marcador está enlazado de forma covalente al derivado de lípido.

9. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la enfermedad o estado caracterizado por tener un elevado nivel de PLA_{2} en un mamífero, es provocado por tejidos malignos, por ejemplo, seleccionados entre el grupo que consiste en cáncer cerebral, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de ovario, linfoma, sarcoma y carcinoma.

10. Utilización, según la reivindicación 9, en la que los tejidos malignos son el tumor primario.

11. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en la que el tejido maligno son células metastásicas que se originan del tumor primario.

12. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el marcador es detectable y/o cuantificado por un método seleccionado entre el grupo que consiste en tomografía con emisión de positrones (PET), rayos X, escintigrafía-gamma, formación de imágenes por resonancia magnética (MR), formación de imágenes por tomografía computerizada (CT) y ultrasonografía.