ES2270991T3 - Sistemas basados en lipidos para el direccionado de agentes de diagnostico. - Google Patents
Sistemas basados en lipidos para el direccionado de agentes de diagnostico. Download PDFInfo
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Abstract
Utilización de un sistema basado en lípidos que comprende un derivado de lípido y un marcador, teniendo dicho derivado de lípido (a) un grupo alifático con una longitud mínima de 7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono, y (b) una fracción hidrofílica, siendo además dicho derivado de lípido un sustrato para PLA2 extracelular en la medida de que el radical orgánico puede ser fraccionado hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece sustancialmente sin afectar, de manera que el derivado de lípido del cual se ha fraccionado el radical orgánico es liberado en forma de un derivado lisolípido que no es un sustrato para lisofosfolipasa, llevando incluido dicho sistema en el mismo lipopolímeros o glicolípidos a efectos de presentar cadenas hidrofílicas en la superficie del sistema para la preparación de un compuesto de diagnóstico para detectar y/o cuantificar enfermedades o estados asociados con un incremento localizado de actividad de PLA2 extracelular en tejidos de mamíferos.
Description
Sistemas basados en lípidos para el direccionado
de agentes de diagnóstico.
La presente invención se refiere al direccionado
de agentes de diagnóstico (que se designarán a continuación, en
general, como "marcadores") por utilización de compuestos
basados en lípidos. La invención se refiere a la utilización de
compuestos basados en lípidos para la preparación de un compuesto de
diagnóstico que es útil en el diagnóstico de diferentes desórdenes
que están asociados a niveles incrementados de actividad de
PLA_{2} extracelular, o que resultan de la misma, en los tejidos
enfermos, por ejemplo, en estados de cáncer, infecciosos e
inflamatorios.
La formación de imágenes para diagnóstico es
ampliamente utilizada en medicina contemporánea. Requiere que se
consiga una intensidad apropiada de señal de un área de interés a
efectos de diferenciar ciertas estructuras con respecto a tejidos
circundantes, con independencia de la técnica utilizada. Tal como se
ha hecho observar por Torchilin (1996), la formación de la imagen
comporta la relación entre las tres dimensiones espaciales de la
zona de interés y una cuarta dimensión, el tiempo, que se relaciona
tanto a la farmacocinética del agente, como al periodo necesario
para captar la imagen. Las características físicas que se pueden
utilizar para crear una imagen incluyen emisión o absorción de
radiación, impulsos magnéticos nucleares y relajación, y transmisión
o reflexión de ultrasonidos. De acuerdo con los principios físicos
aplicados, las técnicas de formación de imágenes utilizadas en la
actualidad incluyen \gamma-escintilografía
(comportando la aplicación de materiales
radio-activos que emiten radiaciones \gamma);
resonancia magnética (MR, fenómeno basado en la transición entre
diferentes niveles de energía de núcleos atómicos bajo la acción de
una señal de radiofrecuencia); tomografía computerizada (CT, la
técnica que utiliza radiación de ionización con ayuda de ordenadores
para conseguir imágenes en sección del cuerpo e imágenes
tridimensionales de áreas de interés); y ultrasonografía (US,
técnica que utiliza irradiación con ultrasonidos y que se basa en
la diferente velocidad a la que pasan los ultrasonidos a través de
diferentes tejidos). Las cuatro técnicas de formación de imágenes
difieren en sus principios físicos, sensibilidad, resolución (tanto
espacial como temporal), capacidad de proporcionar imágenes sin
incremento del contraste mediado por agentes, y algunos otros
parámetros, tales como coste y seguridad. Usualmente, la formación
de imágenes de diferentes órganos y tejidos para la detección
temprana y localización de numerosas patologías no se puede
conseguir satisfactoriamente sin agentes de contraste apropiados
(ver más adelante) en diferentes procesos de formación de
imágenes.
Para mejorar la formación de imágenes se
utilizan agentes de contraste. Estos son sustancias capaces de
absorber ciertos tipos de señales (irradación) en mucha mayor
medida que los tejidos circundantes. Los agentes de contrastes son
específicos para cada técnica de formación de imágenes (tabla 1), y
como resultado de su acumulación en ciertos lugares de interés,
estos lugares pueden ser fácilmente visualizados cuando se aplica la
técnica apropiada de formación de imágenes.
La concentración en tejidos que se debe
conseguir para la formación satisfactoria de imágenes varía de unas
técnicas a otras y según las fracciones de material de diagnóstico,
ver tabla 1. En muchos casos, la formación de imágenes mediada por
agentes de contraste se basa en la capacidad de ciertos tejidos (es
decir, tejidos ricos en macrófagos) en absorber las substancias en
partículas. Este procedimiento depende del tamaño de las partículas
y se basa en delicado equilibrio entre partículas suficientemente
pequeñas para entrar en el cuerpo o en los capilares linfáticos
pero que, no obstante, son suficientemente grandes para ser
retenidos dentro del tejido. En cualesquiera técnicas de formación
de imágenes, se utilizan dos rutas de administración de agente de
contraste principales: circulación sistémica y circulación local.
Cada una tiene sus propias ventajas e inconvenientes. Al variar las
características fisicoquímicas de un agente de contraste, o portador
de contraste, la velocidad de desaparición del mismo del lugar de
inyección, después de administración local, se puede modular. Una
desventaja de la administración sistémica es que incrementa la
exposición de órganos no direccionados a agente de contraste
potencialmente tóxico.
Para facilitar la acumulación de agente de
contraste en la zona requerida, se han sugerido diferentes
micropartículas como portadores de los agentes de contraste. Entre
estos portadores, adquieren una importancia especial los liposomas,
vesículas de fosfolípido artificial microscópico, a causa de sus
características fácilmente controladas y características
farmacológicas satisfactorias. Muchos lípidos individuales y sus
mezclas, una vez suspendidos en una fase acuosa, forman
espontáneamente estructuras bicapa (liposomas) en las que las partes
hidrofóbicas de sus moléculas están dirigidas hacia adentro, y las
partes hidrofílicas están expuestas a la fase acuosa que las rodea.
Existen varios tipos distintos de liposomas; cada uno de los tipos
tiene características específicas y pueden ser preparados por
métodos particulares. La clasificación usual de liposomas se basa en
sus dimensiones y número de bicapas concéntricas que forman una
sola vesícula (tales como vesículas multilaminares (MLV), vesículas
unilaminares, LUV, vesículas unilaminares pequeñas (SUV)).los
métodos para producir las LUV se pueden aumentar fácilmente a
escala y se pueden utilizar para producción industrial de grandes
lotes de liposomas con dimensiones predictibles y una estrecha
distribución de tamaños.
Durante unas dos décadas, los liposomas se han
reconocido como prometedores portadores para medicamentos y agentes
de diagnóstico por las siguientes razones: (1) los liposomas son
completamente biocompatibles; (2) pueden atrapar prácticamente
cualquier medicamento o agente diagnóstico en su compartimiento
interno de agua o en la propia membrana, dependiendo de las
características fisicoquímicas del medicamento; (3) los agentes
farmacéuticos incorporados en liposomas están protegidos contra el
efecto inactivador de las condiciones externas, pero, al mismo
tiempo, no provocan acciones secundarias indeseables; (4) los
liposomas proporcionan también una oportunidad exclusiva de
facilitar agentes farmacéuticos a las células o incluso dentro de
compartimientos celulares individuales. Al pretender diferentes
objetivos de suministro in vivo, las dimensiones, carga y
características superficiales de los liposomas se pueden cambiar de
forma fácil simplemente por adición de nuevos ingredientes a la
mezcla de lípidos antes de la preparación del liposoma y/o por
variación de los métodos de preparación.
Desafortunadamente, los liposomas fosfolípidos,
si se introducen en la circulación, son secuestrados muy rápidamente
por las células (tiempo usual de desaparición de la mitad dentro de
30 min) del sistema reticuloendotelial (RES). Las células del
hígado son básicamente responsables, y la acción de secuestro
depende relativamente de sus dimensiones, carga y composición de
los liposomas. Los monocitos de la sangre periférica circulante
pueden someter, también, los liposomas a endocitosis y,
posteriormente, infiltrar tejidos y facilitar liposomas sometidos a
endocitosis a ciertas áreas patológicas del cuerpo.
Hasta recientemente, el potencial de los
liposomas como portadores de medicamentos ha estado limitado por la
desaparición rápida de los liposomas del flujo sanguíneo. Por
ejemplo, los liposomas convencionales pueden desaparecer
mayoritariamente del flujo sanguíneo dentro de 1-2
horas después de administración intravenosa.
Se han propuesto una serie de enfoques para
ampliar el tiempo de circulación de los liposomas. Dos de éstos han
sido satisfactorios en la ampliación de la media vida de los
liposomas en el flujo sanguíneo en periodos que llegan hasta
48-50 horas. En un enfoque, descrito en la patente
USA nº 4.837.028, los liposomas son formulados con el gangliósido
G_{M1} y predominantemente lípidos rígidos. En otro enfoque
general, que se da a conocer en la patente USA nº 5.013.556, los
liposomas son dotados de un recubrimiento de una capa de cadenas de
polietilén glicol (PEG).
La formación de imágenes de los órganos más
ricos en macrófagos de RES, hígado y bazo fue la que se llevó
acabo, en primer lugar, con liposomas cargados de contraste, dado
que los órganos RES son los objetivos naturales para los liposomas
y se acumulan bien en aquellos después de la administración
intravenosa. La formación de imágenes de diagnóstico del hígado y
del bazo está destinada, habitualmente, a descubrir tumores y
metástasis en estos órganos, así como ciertas irregularidades en el
flujo sanguíneo y procesos inflamatorios. Se ha descrito la
utilización de un mínimo de tres técnicas diferentes de formación de
imágen es para este objetivo, a saber, imágenes \gamma, MR, y
CT.
Un área de importante aplicación potencial de
liposomas cargados de un agente de contraste es la formación de
imágenes de tumores. El mecanismo principal de acumulación de
liposomas en los tumores es por medio de extravasación con
intermedio de capilares de tumores pasando hacia dentro del espacio
intersticial. Igual que en muchos otros casos, la eficacia de dicha
acumulación se puede incrementar fuertemente utilizando liposomas
de circulación larga, con recubrimiento de PEG. Los agentes de
formación de imágenes basados en liposomas han sido ya utilizados
satisfactoriamente para formación de imágenes \gamma, MR, y CT y,
formación sonográfica de tumores. Los liposomas marcados con indio
111 para formación de imágenes de tumores (VesCan®, Vestar, Inc.)
se encuentran ya en pruebas clínicas de fase
II-III.
También se pueden utilizar formulaciones de
liposomas para la visualización de lugares de inflamación y de
infección. La utilización de agentes de formación de imágenes de
micropartículas para la visualización de lugares de infección y de
inflamación se basa en la capacidad de las micropartículas en
extravasarse desde la circulación y acularse en dichos lugares, de
manera similar a lo que ya se ha descrito para tumores y tejidos
infartados.
Los dos problemas principales relacionados con
la utilización de liposomas para objetivos de formación de imágenes
para diagnóstico, especialmente baja eficacia de los liposomas de
contraste en la formación de imagen del tumor, se ha explicado,
frecuentemente, por la desaparición rápida de los liposomas de la
sangre y su incapacidad en acumularse en los tejidos enfermos. La
presente invención se dirige a solucionar estos dos obstáculos.
La presente invención está dirigida a sistemas
de incremento de imágenes que son particularmente útiles en el
diagnóstico de enfermedades, caracterizándose por actividad
localizada de actividad extracelular PLA_{2}.
Tal como se ha indicado por Kaiser (1999),
parece que se produce PLA_{2} por las células malignas. El teñido
inmunohistoquímico de varios tejidos de cáncer, incluyendo cáncer de
páncreas, mama y estómago, era positivo en cuanto a PLA_{2}. Una
expresión y secreción incrementadas de PLA_{2} se observó en
células de cáncer gástrico estimuladas por IL-6, y
seis de cada 16 líneas celulares de carcinoma humano segregaron
espontáneamente PLA_{2} en el sobrenadante de cultivo (Kaiser,
1999). Por lo tanto, parece bastante bien establecido que los
niveles incrementados de actividad extracelular de PLA_{2} están
asociados a tejidos cancerosos.
La actividad incrementada de PLA_{2} en
tejidos tumorales, combinada con la observación de que los liposomas
se acumulan en tumores por extravasación con intermedio de
capilares tumorales hacia adentro del espacio intersticial, es base
para la utilización de liposomas para favorecer la formación de
imágenes de tumores que se da a conocer en esta descripción.
Además, la actividad extracelular PLA_{2} es
elevada en ciertas zonas enfermas, tales como tejidos inflamatorios
e infectados. De manera similar a lo que se observa con respecto a
lugares de tejidos cancerosos, se ha observado que se extravasan
micropartículas de la circulación y se acumulan en tejidos
infectados, inflamados e infartados (Torchilin, 1998). No obstante,
es importante observar que es posible discriminar entre infección y
tumor utilizando, por ejemplo, ^{67}Ga liposomas cargados
positivamente que se acumulan en tumores y no se acumulan en
lugares de infección (Ogihara (1986) J Nucl Med 27,
1300-7).
Esta invención da a conocer un sistema de
suministro de marcador del tipo indicado, en forma de portadores
basados en líquidos, por ejemplo, liposomas o micelas, compuesto por
una bicapa de lípido que forma eter-lípidos, tales
como glicerofosfolípidos que contienen un enlace alquilo en posición
1 y un enlace acilo en la posición sn-2 en el
núcleo de glicerol y que tienen cadenas de polímeros o de
polisacáridos injertados al mismo. Además, el sistema portador
puede contener componentes estabilizantes de la bicapa de lípido,
por ejemplo, lipopolímeros, glicolípidos y esteroles que conducen a
un tiempo de circulación vascular incrementado y, como consecuencia,
una acumulación en los tejidos enfermos que constituyen el
objetivo. Cuando los portadores alcanzan el lugar objetivo para el
marcado, por ejemplo, células cancerosas, la hidrólisis catalizada
por PLA^{2} del enlace acilo libera el marcador, típicamente liso
eterlípidos y derivados con enlace éster. Al contrario que las
encimas de fraccionamiento de alquilo que se encuentran casi
ausentes en las células cancerosas, la actividad extracelular de
PLA_{2} es elevada en tejidos cancerosos. Además, la actividad
extracelular de PLA_{2} es elevada en zonas enfermas, tales como
tejidos
inflamatorios.
inflamatorios.
La presente invención da a conocer la
utilización de un sistema basado en lípidos que comprende un
derivado lípido y un marcador, teniendo dicho derivado lípido (a)
un grupo linfático con una longitud mínima de 7 átomos de carbono y
un radical orgánico que tiene como mínimo 7 átomos de carbono y, (b)
una fracción hidrofílica, siendo además dicho derivado lípido un
substrato para que PLA^{2} extracelular en la medida que el
radical orgánico puede ser separado hidrolíticamente por
fraccionamiento, mientras que el grupo alifático sigue
sustancialmente sin ser afectado, de manera que el derivado lípido,
del que se ha separado el radical orgánico, es liberado en forma de
un derivado lisolípido que no es substrado para lisofosfolipasa,
llevando dicho sistema, incluido en el mismo, lipopolímeros o
glicolípidos a afectos de presentar cadenas hidrofílicas en la
superficie del sistema, para la preparación de un compuesto de
diagnóstico para detectar y/o cuantificar enfermedades o estados
asociados con un incremento localizado de la actividad de PLA_{2}
extracelular en tejidos de mamíferos.
Por lo tanto, la presente invención aprovecha el
descubrimiento sorprendente de que los liposomas (y micelas)
incluyendo derivados lípidos que pueden ser reaccionados
específicamente y solamente de forma parcial por fosfolipasas
extracelulares y que, al mismo tiempo, incluyen lipopolímeros o
glicolípidos, tiene las propiedades de circular en el torrente
sanguíneo durante un tiempo suficientemente largo para alcanzar los
tejidos objetivo en los que la actividad de PLA_{2} extracelular
es elevada sin ser reconocidos por los sistemas reticuloendoteliales
del mamífero y sin penetrar en las paredes de las células, de
manera que los derivados lípidos de los liposomas son fraccionados
específicamente por PLA_{2} extracelular, a efectos de liberar
ingredientes de ampliación de la imagen en el lugar deseado.
Figura 1. Curvas de capacidad calorífica
obtenidas utilizando calorimetría de escaneado
diferencial. (a) Liposomas multilamelares, MLV (curva superior) y
unilamelar, LUV (curva inferior) constituidos por 1 mM
1-0-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC). (b) liposomas MLV (curva
superior) y LUV (curva inferior) constituidos por
dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC).
Figura 2. Perfil de tiempo de reacción
característica a 41ºC para hidrólisis de fosfolipasa A_{2},
PLA_{2}, (A. piscivorus piscivorus) de liposomas
unilamelares 1-O-DPPC compuestos por
90% 1-O-DPPC y 10%
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350).
La reacción de hidrólisis de PLA_{2} es controlada por
fluorescencia intrínseca (línea continua) a partir del encima y
dispersión de luz estática a 90ºC (líneas de trazos) de la
suspensión de lípido. Después de añadir PLA_{2} a 800 seg a la
suspensión de liposomas equilibrada sigue un tiempo de retardo
característico, antes de un incremento brusco de la actividad
catalítica. Se tomaron muestras para HPLC antes de añadir el encima
y 20 minutos después del tiempo de retraso observado.
Figura 3. Cromatogramas por HPLC que ilustran el
efecto de hidrólisis de fosfolipasa A_{2} de liposomas compuestos
por 90% 1-O-DPPC y 10% de
1-O-DPPE-PEG350. Los
cromatogramas muestran la cantidad de
1-O-DPPC (100% línea continua)
antes de la añadidura de fosfolipasa A_{2} (A, piscivorus
piscivorus) a la suspensión de liposoma y la cantidad de
1-O-DPPC (75% línea de trazos)
después de la ráfaga de retardo.
Figura 4. Liberación controlada por PLA_{2}
del medicamento modelo fluorescente y/o calceína agente de contraste
a partir de liposomas compuestos por 25 \muM
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC) suspendida en tampón 10
mM HEPES (pH = 7,5), en función del tiempo. Se añadió 25 nM
fosfolipasa A_{2} (piscivorus piscivorus) a los 900 seg, siendo
la temperatura de 37ºC. El porcentaje de calceína liberada se
determina como % de liberación =
100(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}),
siendo I_{F(t)} la fluorescencia medida en el tiempo t
después de la adición del encima, siendo I_{B} la fluorescencia de
fondo, e I_{T} la fluorescencia total medida después de adición
de Triton X-100 que conduce a la liberación completa
de calceína al fraccionar los liposomas.
Figura 5. Liberación controlada por PLA_{2} de
la calceína fluorescente en la membrana objetivo de membranas no
hidrolizables (ver figura 11b), como función del tiempo para
liposomas compuestos por 25 \muM
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC) suspendida en tampón 10
nM HEPES (pH = 7,5). Se añadieron 25 nM de fosfolipasa A_{2} a los
0 seg y la temperatura era de 37ºC. El porcentaje de calceína
liberado se determina tal como se describe en la figura 4.
Figura 6. Perfil de hemólisis de células
normales de hemoglobina en presencia de liposomas compuestos por
100% 1-O-DPPC (cuadrados); 90%
1-O-DPPC y 10%
1-O-DPPE-PEG350
(triángulos); 90% 1-O-DPPC y 10%
1-O-DPPE-PEG2000
(círculos) y ET-18-OCH_{3}
(diamantes). Las concentraciones que proporcionan 5% de hemólisis
(H_{5}) se encontraban bastante por encima de 2 mM para liposomas
compuestos por 100% de 1-O-DPPC, y
para liposomas compuestos por 90%
1-O-DPPC con 10% de
DPPE-PEG350. El ensayo de hemólisis fue llevado a
cabo tal como se describe por Perkins y otros, 1997, Biochimica et
Biophysica Acta 1327, 61-68. De forma breve, cada
muestra fue diluida en serie con una solución salina con tampón de
fosfato (PBS), y se mezclaron 0,5 ml de cada suspensión diluida con
0,5 ml de hemoglobina humana lavada (RBC) [4% en PBS (v/v)]. La
muestra y la suspensión normal se colocaron en una incubadora de
37ºC y se agitó durante 20 horas. Se centrifugaron tubos a baja
velocidad (2000 x G) durante 10 minutos y 200 \mul del
sobrenadante fueron cuantificados por absorbancia a 550 nm. Se
definió 100 por cien de hemólisis como la cantidad máxima de
hemólisis obtenida del detergente Triton X-100. El
perfil de hemólisis de la figura 6 muestra un valor bajo de
hemólisis (por debajo de 5%) para liposomas 2 mM
1-O-DPPC y para liposomas
1-O-DPPC con 10%
1-O-DPPE-PEG350.
Figura 7. Perfiles de tiempo reacción
característicos a 41ºC para hidrólisis PLA_{2} (A. piscivorus
piscivorus) de liposomas unilamelares incorporados con 0,5 y 10%
de lipopolímeros
1-O-DPPE-PEG350. La
reacción de hidrólisis PLA_{2} es controlada por fluorescencia
intrínseca (línea continua) a partir del encima y 90% de dispersión
de luz estática (líneas de trazos) a partir de la suspensión.
Después de añadir PLA_{2} a la suspensión de liposomas
equilibrada sigue un tiempo de retardo característico antes de un
incremento brusco de la actividad catalítica.
Figura 8. Liberación controlada por PLA_{2}
del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de
contraste en la membrana objetivo de membranas no hidrolizables
D-O-SPC como función del tiempo para
micelas compuestas por 25 \muM
1-O-DPPE-PEG350
(línea de puntos), DSPE-PEG750 (línea de trazos),
1-O-DPPE-PEG2000
(línea continua) suspendidas en tampón 10 mM HEPES (pH = 7,5). Se
añadió fosfolipasa A_{2} (25 mM) a 1200 seg y la temperatura era
de 41ºC. El porcentaje de calceína liberada se determina tal como se
describe en la figura 4. La hidrólisis catalizada por PLA_{2} de
1-O-DPPE-PEG350
indujo la liberación más rápida y más elevada.
Figura 9. Cromatogramas HPLC que muestran el
efecto hidrólisis de fosfolipasa A_{2} de
DSPE-PEG750 (0,150 mM) compuesto por micelas. Los
cromatogramas muestran la cantidad de ácido esteárico generado antes
(línea continua) de la añadidura de fosfolipasa A_{2} (A.
piscivorus piscivorus) a la suspensión de micelas y la cantidad
de DSPE-PEG750 (línea de trazos) después de la
ráfaga de retardo. La línea de puntos muestra ácido esteárico puro
(0,4 mM). El porcentaje de hidrólisis se calculó en base al área
integrada de la norma de ácido esteárico (115850 unidades) y el
área integrada de la muestra (45630 unidades). La concentración del
ácido esteárico en la muestra fue calculada a (45630/115850 x 0,4
mM) 0,157 nM, lo cual significa que el 100% del
DSPE-PEG750 fue hidrolizado a liso-
SPE-PEG750 y ácido esteárico.
Figura 10. Describe el principio de direccionado
de medicamento de liposomas y/o agente de contraste, liberación y
absorción por encimas extracelulares.
- (I)
- Tejido patológico con capilares con fuga
- (II)
- Portador de medicamento de liposomas y/o agente de contraste
- (III)
- Célula objetivo y membrana objetivo
- (IV)
- Liberación y absorción de medicamento localizado y/o agentes de contraste por fosfolipasa extracelular A_{2}.
Figura 11(a). Ilustración esquemática del
principio de direccionado del medicamento de liposomas y/o agente
de contraste, comportando acumulación de los portadores de
medicamentos de liposomas y/o agente de contraste en tejidos
enfermos porosos y subsiguiente liberación de medicamento y/o agente
de contraste y transporte por la membrana objetivo con intermedio
de la actividad de PLA_{2} extracelular.
- (I)
- Tejido patológico con capilares con fuga
- (II)
- Liposomas portadores de agentes de contraste estabilizados por polímero, conjugados de lípidos,
- (III)
- Célula objetivo y membrana celular
- (IV)
- Agentes de contraste conjugados de lípidos (monoéter-lípido), proamplificadores (lípido), proactivadores (lípido)
- (V)
- medicamentos (éter-lisolípido y derivados de ácidos grasos), amplificadores (lisolípido + ácido graso), activadores de PLA_{2} (lisolípido + ácido graso).
Figura 11(b). Ilustración esquemática de
un sistema de modelo biofísico de base molecular, en el que los
fosfolípidos del medicamento y/o liposomas del portador del agente
de contraste, con intermedio de hidrólisis catalizada por
PLA_{2}, actúan como prodesestabilizantes en el lugar del
medicamento y/o portador de agente de contraste y como
proamplificadores en el lugar objetivo. Se incluye también la
posibilidad de ampliar el principio para incluir agentes de
contraste conjugados de lípidos y basados en lípidos.
- (I)
- Medicamento estabilizado por polímero y/o liposoma del portador de agente de contraste
- (II)
- Membrana de liposoma objetivo no degradable
- (III)
- Éter-lípidos no hidrolizables
- (IV)
- Proamplificador (lípido), agentes de contraste conjugados de lípidos (monoéter-lípidos), proactivador (lípidos)
- (IV)
- Amplificadores (lisolípidos + ácido graso), medicamentos (éter-lisolípidos y derivados de ácidos grasos), activadores de PLA_{2} (lisolípidos + ácido graso).
Figura 12(a). Liberación controlada por
PLA_{2} del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína en la
membrana objetivo en función del tiempo para diferentes compuestos
de los liposomas portadores. La temperatura es de 37ºC. En
comparación con simples barreras de DPPC, la velocidad de liberación
del medicamento modelo y/o agente de contraste se amplifica
notablemente para los portadores recubiertos con polímero, DPPC +
2,5 mol% DPPE-PEG2000. Un aumento adicional de la
velocidad de liberación se obtiene si el portador contiene también
un fosfolípido de cadena corta, DCPC, que actúa como activador local
para el encima. El porcentaje de calceína liberado queda
determinado como % Liberación =
100(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}),
en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida en el tiempo
t después de adición del encima, y I_{B} es la fluorescencia de
fondo, e I_{T} es la fluorescencia total medida después de la
adición de Triton X-100, lo que conduce a la
liberación completa de calceína al fraccionar los liposomas
objetivo. (b) Liberación controlada por PLA_{2} del medicamento
de modelo fluorescente y/o calceína del agente de contraste en la
membrana objetivo, como función del tiempo para diferentes
temperaturas. Al aumentar la temperatura, la velocidad de liberación
es incrementada debido a la mayor actividad del encima inducido por
cambios estructurales en el substrato bicapa de lípido del liposoma
portador. En el presente ensayo, se consigue, en todos los casos,
una liberación máxima de 70% aproximadamente. El añadido muestra el
tiempo de liberación de 50% de calceína, t_{50%}, como función de
la temperatura. La concentración del objetivo y liposomas portadores
son 25 \muM, y se añade PLA_{2} en una concentración de 25 nM
un tampón HEPES con pH = 7,5.
Figura 13. Liberación total, después de 20 min
del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de
contraste en la membrana objetivo como función de la añadidura de
cantidades crecientes de lisopalmetoil fosfolípido y ácido
palmítico, separadamente, en una mezcla 1:1. La concentración de las
membranas objetivo es de 25 \muM en un tampón HEPES con pH = 7,5
y a una temperatura de 39ºC.
Figura 14. Liberación controlada por PLA_{2}
del medicamento de modelo fluorescente y/o calceína del agente de
contraste a partir de liposomas compuestos por 25 \muM de 90%
molar de
1-0-hexadecyl-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC) y 10% molar
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350)
suspendido en un tampón 10 mM HEPPES (pH = 7,5) en función del
tiempo. 50 nM (línea recta), 1 nM (línea continua) y 0,02 nM (línea
de trazos) fosfolipasa A_{2} (A. piscivorus piscivorus)
fueron añadidos a los 300 seg, con una temperatura de 35,5ºC. El
porcentaje de calceína liberada se determina tal como se describe
en la figura 4.
Figura 15. Espectro de emisión de 1 mol%
bis-pi-DPC incorporado en liposomas
cargados negativamente (0,100 mM) antes (línea continua) y después
(línea de trazos) añadiendo 100 nM PLA_{2} (Agkistrodom
piscivorus piscivorus) a una suspensión de liposomas
equilibrada a 41ºC.
Figura 16. Perfil característico temporal de la
reacción a 41ºC para hidrólisis catalizada por fosfolipasa de rata
de liposoma cargados negativamente. La reacción catalítica fue
iniciada al añadir fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de
la suspensión de liposomas termostatizada, equilibrada durante 60
seg antes de la adición de fluido peritoneal. La reacción de
hidrólisis es controlada por fluorescencia de monómero (línea
continua) y fluorescencia eximer (línea de trazos) desde
bis-pi-DPC. Después de añadir fluido
peritoneal no diluido, a los 60 seg, a la suspensión equilibrada de
liposomas, se observó un incremento repentino en fluorescencia de
monómero y una disminución simultánea en florescencia eximer al
hidrolizarse el sustrato bis-pi-DPC.
El añadido muestra el perfil del tiempo de reacción de los primeros
120 seg.
Una de las características importantes de la
presente invención es la comprobación de que ciertos derivados
lípidos serán fraccionados por PLA_{2} extracelular, de manera
bien definida, en localizaciones extracelulares específicas de
tejido de mamíferos. Se ha descubierto que PLA_{2} extracelular es
capaz de fraccionamiento de derivados de lípido monoéter/monoéster,
a efectos de direccionar el objetivo en tejidos enfermos
relevantes.
Por lo tanto, los sistemas que amplifican la
imagen (liposomas o micelas) a utilizar en la presente invención se
basan en derivados de lípidos que tienen (a) un grupo alifático con
una longitud mínima de 7 átomos de carbono, y un radical orgánico
que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono y (b) una fracción
hidrofílica, siendo además dichos agentes de contraste conjugados
de lípidos un substrato para fosfolipasa extracelular A_{2}, en
la medida de que el radical orgánico puede ser fraccionado
hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático sigue
substancialmente no afectado, de manera que los agentes de contraste
conjugados de lípidos son liberados en forma de un derivado
lisolípido que no es un substrato para lisofosfolipasa, teniendo
incluidos dicho sistema lipopolímeros o glicolípidos, a efectos de
presentar cadenas hidrofílicas en la superficie del sistema.
Si bien los términos "lípido" y
"lisolípido" (en el contexto de fosfolípidos) serán términos
bien conocidos para los técnicos en la materia, se debe hacer
observar que dentro de la siguiente descripción y reivindicaciones,
el término "lípido" está destinado al significado de triésteres
de glicerol de la siguiente fórmula:
\melm{\delm{\para}{CH _{2} --- O --- R ^{C} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} --- O --- R ^{A} }}H --- O --- R^{B}
siendo R^{A} y R^{B} fracciones
de ácido graso
(C_{9-30}-alkil/alkileno/alkildieno/alkiltrieno/alkiltetraeno/-C(=O)-)
y R^{C} un ácido fosfatídico (PO_{2}-OH) o un
derivado de ácido fosfatídico. Por lo tanto, los grupos R^{A} y
R^{B} están enlazados al núcleo de glicerol a través de enlaces
éster.
El término "lisolípidos" está destinado a
significar un lípido que el grupo R^{B} de ácido graso no existe
(por ejemplo, segregado hidrolíticamente), es decir, un derivado de
glicerol de la fórmula anterior en la que R^{B} es hidrógeno,
pero en la que los otros sustituyentes están substancialmente no
afectados. La conversión de un lípido en un lisolípido puede tener
lugar bajo la acción de un enzima, específicamente bajo la acción
de PLA_{2} celular y también extracelular.
Los términos "derivado de lípido" y
"derivado de lisolípido" están destinados a cubrir posibles
derivados de los compuestos posibles anteriores dentro de los
grupos "lípido" y "lisolípido", respectivamente. Se
facilitan ejemplos de derivados de lípidos biológicamente activos y
derivados de lisolípidos en Houlihan, y otros, Med. Res. Rev., 15,
3, 157-223. Por lo tanto, tal como quedará evidente,
la extensión "derivados" se debe comprender en el sentido más
amplio.
Dentro de la presente solicitud, no obstante,
los derivados de lípidos y de lisolípidos deben cumplir ciertos
criterios funcionales (ver anterior) y/o exigencias estructurales.
Es particularmente relevante observar que los derivados adecuados
de lípidos son los que tienen (a) un grupo alifático de una longitud
mínima de 7, y preferentemente un mínimo de 9, átomos de carbonos y
un radical orgánico que tiene un mínimo de 7 átomos de carbono, y
(b) una fracción hidrofílica. Será evidente que el grupo alifático y
el radical orgánico corresponderán a las dos fracciones de ácido
graso en un lípido normal y que la fracción hidrofílica
corresponderá a la parte de fosfato de un fosfolípido o de un
bioisoéster del mismo.
Por lo tanto, el concepto general en que se basa
la presente invención es el de explotar el nivel incrementado de
actividad de PLA_{2} extracelular en áreas localizadas del cuerpo
de un mamífero, en particular tejidos externos, siendo los
derivados de lípidos, que se pueden utilizar dentro de la presente
invención, sustratos para PLA_{2} extracelular, es decir, los
derivados de lípidos deben ser capaces de soportar fraccionamiento
enzimático hidrolítico del radical orgánico correspondiente al ácido
graso en posición 2 en un lípido. El PLA_{2} extracelular es
sabido que pertenece a la clase del encima (EC) 3.1.1.4. Por lo
tanto, haciendo referencia a PLA_{2} (extracelular) se debe
comprender todas las enzimas extracelulares de esta clase, por
ejemplo, lipasas, que pueden inducir fraccionamiento hidrolítico del
radical orgánico correspondiente al ácido graso en la posición 2 en
un lípido. Una ventaja específica del sistema de ampliación de
imagen basada en lípidos (tales como liposomas y micelas) es que la
actividad de PLA_{2} extracelular queda significativamente
incrementada hacia substratos organizados en comparación con
substratos monómeros.
En vista de la exigencia de capacidad de
hidrólisis por PLA_{2} extracelular, es evidente que el radical
orgánico (por ejemplo, un grupo alifático) está preferentemente
enlazado con intermedio de una funcionalidad de éster que se puede
fraccionar por PLA_{2} extracelular, preferentemente de forma que
el grupo que es separado por fraccionamiento es un ácido
carboxílico.
Además, es una importante característica de la
presente invención que el grupo alifático (el grupo que corresponde
al ácido graso en posición 1 en un lípido) del derivado de lípido,
es decir, el derivado del isolípido después de fraccionamiento por
PLA_{2} extracelular, queda substancialmente sin afectar por la
acción del PLA_{2} extracelular. Por "substancialmente sin
afectar" se debe comprender que la integridad del grupo alifático
se ha conservado y que menos de 1% molar, preferentemente, menos de
0,1% molar del grupo alifático (grupo alifático en posición 1) se
ha fraccionado bajo la acción de PLA_{2} extracelular.
Asimismo, el derivado de lisolípido que resulta
del fraccionamiento hidrolítico del radical orgánico no debe ser,
en sí mismo, un substrato para lisofosfolipasa. La lisofosfolipasa
se sabe que pertenece a la clase de encima (EC) 3.1.1.5. Por lo
tanto, por referencia a lisofosfolipasa se debe comprender todos los
encimas de esta clase que catalizan la reacción
liso(fosfo)lípido + agua, dando lugar a fosfoglicerol
+ ácido graso. El término "no es substrato para
lisofosfolipasa" está destinado a significar que la
lisofosfolipasa tiene una actividad menor de 1% hacia el substrato,
en comparación con el ésterlípido correspondiente, es decir,
virtualmente no tiene actividad enzimática.
Son ejemplos adecuados de dichos derivados de
lisolípidos aquellos que no sufren fraccionamiento hidrolítico bajo
la acción de lisofosfolipasas. Por lo tanto, los derivados de
lisolípidos son, en particular, no lisolípidos, y los derivados de
lisolípidos, que tienen un enlace éster en posición 1 del lisolípido
o en la posición de un derivado de lisolípido que corresponde a la
posición 1 de un lisolípido.
Una clase preferente de derivados de lípidos
para incorporar en los sistemas de amplificación de imagen de la
invención se pueden representar por la siguiente fórmula:
\melm{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- R ^{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} --- X --- R ^{1} }}H --- Y --- R^{2}
en la
que
- X y Z son seleccionados independientemente entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2}, preferentemente entre O, NH, NMe y CH_{2}, en particular O;
- Y es -OC(O)-, estando entonces Y conectada a R^{2} con intermedio del átomo de oxígeno o del átomo de carbono del carbonilo, preferentemente con intermedio del átomo de carbono del carbonilo;
- R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};
- R^{2} es un radical orgánico que tiene como mínimo 7 átomos de carbono, tal como un grupo alifático que tiene una longitud mínima de 7, preferentemente como mínimo de 9 átomos de carbono, preferentemente un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2};
- Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}-(CH_{2}) _{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7-}(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n91}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un entero con un valor de 9 a 29, n1 es cero o un entero de 1 a 29, n3 es cero o un entero de 1 a 20, n5 es cero o un entero de 1 a 17, n7 es cero o un entero de 1 a 14, y n9 es cero o un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4, n6 y n8 es independientemente cero o 1, y Y^{2} es CH^{3} ó CO_{2}H; pudiendo estar cada uno de Y^{1}-Y^{2} sustituidos por halógeno o C_{1-4}-alkilo, pero preferentemente Y^{1}-Y^{2} no tiene sustituyente;
- R^{3} se ha seleccionado entre ácido fosfotídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisoésteres del ácido fosfatídico y derivados del mismo (entre otros, derivados de ácido fosfotídico a los que se ha acoplado, de forma covalente, un polímero hidrofílico o polisacárido).
Tal como se ha mencionado en lo anterior, las
realizaciones preferentes implican que Y es -OC(O)- en la que
Y está conectada a R^{2} con intermedio del átomo de carboxilo.
Las realizaciones más preferentes implican que X y Z son O y que Y
es -OC(O)- en la que Y está conectada a R^{2} con
intermedio del átomo de carboxilo. Esto significa que el derivado
lípido es un compuesto de tipo
1-monoéter-2-monoéster-fosfolípido.
Otro grupo preferente de derivados de lípidos es
aquel en el que el grupo X es S.
En una realización, R^{1} y R^{2} son unos
grupos alifáticos de fórmula Y^{1}-Y^{2} en la
que Y^{2} es CH_{3} ó CO_{2}H, pero preferentemente CH_{3},
y en la que Y^{1} es -(CH_{2})
_{n1}(CH=CH)_{n2}(CH_{2})_{n3}(CH=CH)_{n4-}(CH_{2})_{n5}(CH=CH)_{n6}(CH_{2})
_{n7}(CH=CH)_{n8}
(CH_{2})_{n91} siendo la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 un entero de 9 a 23; es decir, el grupo alifático Y^{1}-Y^{2} tiene una longitud de 10-24 átomos de carbono. n1 es igual a cero o es un entero de 1 a 23; n3 es igual a cero o es un entero de 1 a 20; n5 es igual a cero o es un entero de 1 a 17; n7 es igual a cero o es un entero de 1 a 14; n9 es igual a cero o es un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4 y n8 es independientemente igual a cero ó 1.
(CH_{2})_{n91} siendo la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 un entero de 9 a 23; es decir, el grupo alifático Y^{1}-Y^{2} tiene una longitud de 10-24 átomos de carbono. n1 es igual a cero o es un entero de 1 a 23; n3 es igual a cero o es un entero de 1 a 20; n5 es igual a cero o es un entero de 1 a 17; n7 es igual a cero o es un entero de 1 a 14; n9 es igual a cero o es un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4 y n8 es independientemente igual a cero ó 1.
En una realización, uno o varios de los grupos
alifáticos R^{1}/R^{2} o los grupos R^{3} incluyen un
marcador, por ejemplo, halógenos (bromo, iodo) o átomos de bario,
que son especialmente adecuados para formación de imágenes por
tomografía computerizada (CT), o son enriquecidos con isótopos
inestables, por ejemplo, ^{11}C que es particularmente útil para
los objetivos de escaneado de PET.
Los grupos alifáticos tales como R^{1} y
R^{2} en una realización preferentemente están saturados y también
no ramificados, es decir, preferentemente no tienen enlaces dobles
entre átomos de carbono adyacentes, siendo entonces iguales cada
uno de n2, n4, n6 y n8 a cero. De acuerdo con ello, y^{1} es
preferentemente (CH_{2})_{n1}. Más preferentemente (en
esta realización), R^{1} y R^{2} son, cada uno de ellos
independientemente, (CH_{2})_{n1}CH_{3} y más
preferentemente (CH_{2})_{17}CH_{3} ó
(CH_{2})_{15}CH_{3}. En realizaciones alternativas,
los grupos pueden tener uno o varios dobles enlaces, es decir,
pueden ser insaturados, y uno o varios de n2, n4, n6 y n8 pueden
ser iguales a 1. Por ejemplo, cuando el hidrocarburo insaturado
tiene un doble enlace, n2 es igual a 1, n4, n6 y n8 son, cada uno
de ellos, iguales a cero y Y^{1} es (CH_{2}) _{n1}
CH=(CH_{2})_{n3}. n1 es igual a cero o es un entero
comprendido entre 1 y 21, y n3 es también cero o es un entero de 1 a
20, no siendo por lo menos uno de n1 o n3 igual a cero.
En una realización específica, los derivados
lípidos son aquellos lípidos monoéter en los que X y Z son O,
R^{1} y R^{2} están independientemente seleccionados entre los
grupos alquilo, (CH_{2}) _{n}CH_{3} en los que n es 11, 12,
13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó 29,
preferentemente 14, 15, ó 16, en particular 14; Y es
-OC(O)-, estando entonces Y conectado a R^{2} con
intermedio del átomo de carbono del carbonilo.
Con respecto a la fracción hidrofílica (conocida
frecuentemente como "grupo de cabecera") que corresponde a
R^{3}, se cree que se puede utilizar un amplia variedad de grupos
que corresponden a ácido fosfotídico (PO_{2}-OH),
derivados de ácido fosfatídico y bioisoésteres de ácido fosfatídico
y derivados de los mismos. Tal como será evidente, la exigencia
crucial para R^{3} es que los grupo deben permitir el
fraccionamiento enzimático del grupo R^{2} (realmente
R^{2}-C(=O) ó R^{2}-OH) por
PLA_{2} extracelular. Los términos "bioisoésteres de ácido
fosfatídico y derivados de los mismos" implica, ciertamente, que
dichos grupos, tales como ácido fosfatídico, deben permitir el
fraccionamiento enzimático por PLA_{2} extracelular.
R^{3} se selecciona de manera típica entre
ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), fosfatidilcolina
(PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}N
(CH_{3})_{3}), fosftidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NH_{2}, N-metilfosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NCH_{2}, fosfatidilserina, fosfaditilinositol, y fosfatidilglicerol (PO_{2}-O-CH_{2}CHOHCH_{2}OH). Otros posibles derivados del ácido fosfatídico son aquellos en los que los ácidos dicarboxílicos, tales como ácido glutárico, sebásico, succínico y tartárico están acoplados al nitrógeno terminal de fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, etc.
(CH_{3})_{3}), fosftidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NH_{2}, N-metilfosfatidiletanolamina (PO_{2}-O-CH_{2}CH_{2}NCH_{2}, fosfatidilserina, fosfaditilinositol, y fosfatidilglicerol (PO_{2}-O-CH_{2}CHOHCH_{2}OH). Otros posibles derivados del ácido fosfatídico son aquellos en los que los ácidos dicarboxílicos, tales como ácido glutárico, sebásico, succínico y tartárico están acoplados al nitrógeno terminal de fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, etc.
En la realización específica, en la que una
fracción del derivado de lípido es también un lipopolímero o
glicolípido, un polímero hidrofílico o polisacárido está unido, de
manera típicamente covalente, a la parte de fosfatidil del derivado
de lípido.
Los polímeros hidrofílicos que de manera
adecuada pueden ser incorporados en los derivados de lípidos de la
invención, a efectos de formar lipopolímeros son aquellos que son
fácilmente solubles en agua, que se pueden acoplar de forma
covalente a un líquido formador de vesículas, y que son tolerados
in vivo sin efectos tóxicos (es decir, que son
biocompatibles). Los polímeros adecuados incluyen polietilén glicol
(PEG), ácido poliláctico (llamado también polilactida), ácido
poliglicólico (indicado también poliglicólido), copolímero de ácido
poliláctico-ácido poliglicólico, alcohol polivinílico,
polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina,
polihidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida,
polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizadas tales como
hidroximetilcelulosa o hidroxietilcelulosa.
Son polímeros preferentes los que tienen un peso
molecular comprendido, aproximadamente, entre 100 daltons y unos
10.000 daltons y, más preferentemente, entre unos 300 daltons y unos
5.000 daltons. En realizaciones especialmente preferentes, el
polímero es polietilenglicol que tiene un peso molecular
comprendido, aproximadamente, entre 100 y 5.000 daltons y, más
preferentemente, que tiene un peso molecular comprendido,
aproximadamente, entre 300 y 5.000 daltons. En una realización
especialmente preferente, el polímero es polietilenglicol de 750
daltons (PEG(750)). Los polímeros pueden ser también
definidos por el número de monómeros que comprenden; una
realización preferente de la presente invención utiliza polímeros de
un mínimo de unos tres monómeros, tales como polímeros PEG que
consisten en tres monómeros (aproximadamente 150 daltons).
Cuando el glicolípido o lipopolímero está
representado por una fracción del derivado de lípido, este derivado
de lípido (derivado de lípido con una cadena de polímero o de
polisacárido) constituye, de manera típica, 1-80%
molar, tal como 2-50% molar o 3-25%
molar del sistema total de lípido deshidratado. Para composiciones
micelulares, no obstante, la fracción puede ser incluso superior,
tal como 1-100% molar, tal como
10-100% molar, del sistema total de lípido
deshidratado.
Los polímeros preferentes a enlazar de forma
covalente con la parte fosfatidil (por ejemplo, con intermedio del
nitrógeno terminal de fosfatidiletanolamina) son polietilén glicol
(PEG), polilactida, ácido poliglicólico, copolímero de ácido
poliláctido-poliglicólico y alcohol
polivinílico.
Se debe comprender que R^{2} debe ser un
radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono (tales
como un grupo alifático que tiene una cierta longitud (como mínimo
7, preferentemente 9 átomos de carbono), siendo posible un grado
alto de variabilidad, por ejemplo R^{2} no debe ser necesariamente
un residuo de cadena larga, pero puede representar estructuras más
complejas.
De modo general, se cree que R^{2} puede ser o
bien inerte con respecto al entorno en el que se puede liberar por
PLA_{2} extracelular, o que R^{2} puede presentar un marcador
adecuado para la aplicación diagnóstica. De manera alternativa,
R^{2} puede jugar un papel farmacéuticamente activo, de manera
típica, como substancia medicamentosa auxiliar o como modificador
eficaz para el derivado de lisolípido y/o cualquier otra (segunda)
substancia medicamentosa presente en el entorno. En este último
caso, el sistema basado en lípido puede tener un efecto terapéutico
y también características útiles con respecto al método de
diagnóstico. En esta realización, el grupo R^{2} puede ser un
residuo de cadena larga, por ejemplo, un residuo de ácido graso (el
ácido graso incluirá un carbonilo del grupo Y). Esto ha sido
descrito con detalle en lo anterior. Son ejemplos interesantes de
substancias medicamentosas auxiliares como R^{2,} dentro de estos
subgrupos, los ácidos poliinsaturados, por ejemplo, oleico,
linoleico, linolénico, así como derivados de araquidonoilo
(incluyendo el carbonilo de Y), por ejemplo, prostaglandinas, tales
como prostaglandina E_{1}, como derivados de ácido araquidónico,
son conocidos reguladores de la acción de hormonas, incluyendo la
acción de prostaglandinas, tromboxanos, y leucotrinas. Son ejemplos
de modificadores de rendimiento, como R^{2}, aquellos que aumentan
la permeabilidad de la membrana de la célula objetivo y que
incrementan la actividad de PLA_{2} extracelular o los agentes de
contraste conjugados de lípidos o cualesquiera segundas substancias
medicamentosas. Son ejemplos los ácidos grasos de cadena corta
(C_{8-12}).
Por lo tanto, la presente invención se refiere
también a la utilización de un sistema basado en lípidos
simultáneamente para diagnóstico y para objetivos terapéuticos.
Se debe comprender que los diferentes ejemplos
de grupos R^{2} posibles son referenciados por el nombre de una
especie separada o discreta, en vez del nombre del radical. Además,
se debe comprender que los posibles ejemplos pueden incluir el
grupo carbonilo o grupo oxi del enlace, a través del cual el radical
orgánico está enlazado al esqueleto lípido (correspondiente a la
"Y" de la formula anterior). Esto se apreciará, desde luego,
por los técnicos en la materia.
Aunque no ha sido indicado específicamente la
fórmula general para los ejemplos adecuados de derivados lípidos a
utilizar dentro de la presente invención, se debe comprender que la
fracción de glicol de los derivados lípidos puede ser sustituida,
por ejemplo, para modificar la tasa de fraccionamiento por
PLA_{2} extracelular, o simplemente a efectos de modificar las
características de los liposomas que comprenden los derivados
lípidos.
Un grupo específico de compuestos útiles para el
sistema basado en lípidos consiste en derivados lípidos de la
siguiente fórmula:
\melm{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- R ^{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} --- X --- R ^{1} }}H --- Y --- R^{2}
en la
que
- X y Z son seleccionados independientemente entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), S(O)_{2}, preferentemente entre O, NH, NMe y CH_{2}, en particular O;
\newpage
- Y es -OC(O)-, estando entonces Y conectado a R^{2} a través de oxígeno o del átomo de carbono del carbonilo, preferentemente a través del átomo de carbono del carbonilo;
- R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};
- R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;
- en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4}- (CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n5}-(CH_{2})_{n7-}(CH=CH)_{n8F}- (CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un entero comprendido entre 9 y 29; n1 es cero o un entero de 1 a 29, n3 es cero o un entero de 1 a 20, n5 es cero o un entero de 1 a 17, n7 es cero o un entero de 1 a 14, y n9 es cero o un entero de 1 a 11; siendo cada uno de n2, n4, n6 y n8 independientemente cero o 1; y Y^{2} es CH_{3} ó CO_{2}H; en las que cada uno de Y^{1}-Y^{2} independientemente podrá ser sustituido por halógeno o C_{1-4}alquilo, pero preferentemente Y^{1}-Y^{2} es no sustituido,
- R_{3} es seleccionado entre derivados de ácido fosfatídico a los que está acoplado un polímero hidrofílico o un polisacárido. El polímero hidrofílico o el polisacárido se selecciona de manera típica y preferente entre polietilén glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico, polivinilo alcohol, polivinilpirrolidona, polimetoxazolina, polietiloxazolina, polinidroxipropil metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida, y celulosas derivatizads, en particular de polietilén glicol, ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico-ácido poliglicólico y alcohol polivinílico.
Son subgrupos específicos aquellos en los que X
y Z son O, R^{1} y R^{2} seleccionados independientemente entre
grupos alquilo, (CH_{2})_{n} CH_{3}, en el que n es 11,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ó
29, preferentemente 14 ó 16, \gamma es -OC(O)-, estando
entonces Y conectado a R_{2} con intermedio del átomo de carbono
del carbonilo.
Un grupo específico de compuestos son
polietilenoxido-1-O-palmitil-sn-2-palmitoil-fosfatidil
etanolamina, DPPE-PEG, y
polietilenoxido-1-O-sn-2-estearoil-fosfatidiletanolamina,
DSPE-PEG, con peso molecular PEG de 100 a 10.000
daltons, en particular de 300-5.000 daltons.
El término "sistema de incremento de imagen
basado en lípidos" comprende estructuras macromoleculares que,
como componente principal, incluyen lípidos o derivados de lípidos.
Son ejemplos adecuados de los mismos los liposomas y micelas. Se
cree en la actualidad que los liposomas ofrecen el campo de
aplicaciones más amplio, habiendo sido descritos de forma más
detallada a continuación. Si bien los liposomas habitualmente se
cree que son un sistema preferente basado en lípido, también se
cree que los sistemas micelulares ofrecen interesantes
realizaciones comprendidas en la presente invención.
En una importante variante que se puede combinar
ventajosamente con las realizaciones que se han descrito, el
derivado de lípidos se incluye en liposomas como componente único o
lo que es más habitual, en combinación con otros componentes (otros
lípidos, esteroles, etc.). Por lo tanto, los sistemas basados en
lípidos que se describen adoptan preferentemente la forma de
liposamas en los que los liposomas están constituidos por capas que
comprenden el derivado de lípido y el marcador.
Cuando se utiliza en esta descripción, el
término "marcador" está destinado a significar una especie que
es capaz de ser administrada al cuerpo del mamífero y que es
detectada por medios extracorporales para formación de imágenes de
tejidos vivos. El marcador puede ser seleccionado entre
radiomarcadores, tales como radioisótopos y compuestos marcados por
radioisótopos; compuestos radiopacos; compuestos fluorescentes, etc.
Los marcadores más específicos son ^{111}In, ^{99n}Tc,
^{67}Ga, ``C, Gd, Mn, óxido de hierro, argón, nitrógeno, iodo,
bromo y bario.
Son marcadores adecuados para escintografía de
rayos gamma los radionucleidos de diagnóstico, tales como
^{111}In, ^{99n}Tc, ^{67}Ga. A efectos prácticos, los
radionucleótidos son acomplejados con, por ejemplo, quelatantes
tales como ácido dietilén triamin pentaacético (DTPA),
hexametilpropilenamina oxima (HMPAO), ácido diisopropil
iminodiacético (DISIDA), o incluso proteínas tales como albúminas de
suero humano (HSA). De manera alternativa, DTPA o compuestos
quelatantes similares pueden ser derivatizados por la incorporación
de un grupo hidrofóbico, que puede anclar la fracción quelatante
sobre la superficie del liposoma durante o después de la preparación
del liposoma.
Son marcadores adecuados para rayos X
verografina, ioxaglato, iohexol, iopromida, iomeprol, iopamidol,
iopentol, iodixanol, ioversol, diferentes medios de contraste no
iónicos, etc, que se pueden incorporar en liposomas y se pueden
utilizar tanto para formación de imágenes por rayos X del hígado y
el bazo, y para formación de imágenes CT.
Son marcadores apropiados para formación de
imágenes por resonancia magnética (MR) los iones paramagnéticos
tales como Gd y Mn, y óxido de hierro acoplados a diferentes
moléculas portadoras. Por ejemplo, el complejo de ácido gadolinio
dietilentriamina pentaacético, se ha demostrado que es un agente de
contraste efectivo para formación de imágenes MR de metástasis de
hígado, bazo y hepáticas.
Son marcadores adecuados para formación de
imágenes por tomografía computerizada CT el iodo, bromo, bario,
etc.
Otros ejemplos de marcadores adecuados se
facilitan, frecuentemente, por el método de formación de imágenes
seleccionado o de detección, describiéndose ejemplos de ello, de
manera detallada, en el Handbook of medical imaging, vol. 1, 2, 3,
SPIE Press, Washington USA, 2000, edd, Beutel. Konden y van Metter.
Se conocen "liposomas" como estructuras autoensamblantes que
comprenden una o varias bicapas de lípidos, cada uno de los cuales
rodea un compartimiento acuoso y comprende dos monocapas en
oposición de moléculas de lípido anfipático. Los lípidos
anfipáticos (en este caso, entre otros, derivados de lípidos)
comprenden un grupo de cabecera polar (hidrofílico) (que
corresponde al sustituyente R^{3} en los derivados de lípidos)
enlazado de forma covalente a uno o dos grupos alifáticos no
polares (hidrofóbicos) (correspondiendo a R^{1} y R^{2} en los
derivados de lípidos). Los derivados energéticamente desfavorables,
entre los grupos hidrofóbicos y en medio acuoso, se cree que, en
general, inducen a las moléculas de lípidos a reagruparse de manera
tal que los grupos de cabecera polares son orientados hacia el
medio acuoso, mientras que los grupos hidrofóbicos se reorientan
hacia el interior de la bicapa. Una estructura energéticamente
estable es formada en la que los grupos hidrofóbicos están
protegidos de manera efectiva contra el contacto con el medio
acuoso.
Tal como se comprenderá por lo anterior, los
sistemas basados en lípidos, por ejemplo, liposomas, son
particularmente útiles para la incorporación de marcadores.
Los liposomas pueden tener una bicapa de lípidos
única (liposomas unilamelares "ULV"), o bicapas de lípidos
múltiples (liposomas multilamelares "MLV") y se pueden preparar
por una serie de métodos (ver un resumen, por ejemplo, en la obra
de Deamer y Uster, Liposomes, Marcel Dekker, N.Y., 1983,
27-52). Estos métodos incluyen métodos de Bangham
para preparar liposomas multilamelares (MLV) métodos; de Lenk,
Fountain y Cullis para preparar MLV con distribución de soluto
interlamelar substancialmente igual (ver, por ejemplo, US 4.522.803,
US 4.588.578, US 5.030.453, US 5.169.637, y US 4.975.282); y el
método de evaporación en fase inversa de Papahadjopoulos y otros
(US 4.235.871) para preparar liposomas oligolamelares. Los ULV
pueden ser producidos a partir de MLV, por métodos tales como
sonicación (ver Papahadjopoulos y otros, Biochem. Biophys. Acta,
135, 624 (1968)) o extrusión (US 5.008.050 y US 5.059.421). El
liposoma de esta invención puede ser producido por cualquiera de
los métodos indicados.
Se pueden utilizar diferentes metodologías,
tales como sonicación, homogeneización, aplicación de French Press,
y maturación para preparar liposomas de dimensiones más reducidas a
partir de liposomas más grandes. Se puede utilizar la extrusión
(ver US 5.008.050) para reducir las dimensiones de los liposomas, es
decir, producir liposomas con unas dimensiones medias
predeterminadas forzando los liposomas, bajo presión, a través de
poros de filtro de dimensiones definidas y seleccionadas. También
se puede utilizar filtrado de flujo tarjencial (ver WO 89/08846)
para regularizar las dimensiones de los liposomas, es decir, para
producir liposomas con una población de liposomas que tienen menor
heterogeneidad de dimensiones, y que tienen una distribución más
homogénea y definida de dimensión. También se pueden determinar las
dimensiones de los liposomas por una serie de técnicas, tales como
dispersión de luz casi eléctrica, y con equipos, tales como por
ejemplo, los dimensionadores de partículas Nicomp®, que se
encuentra dentro del alcance de los técnicos ordinarios en la
materia.
Es interesante observar que los derivados de
lípidos de la presente invención pueden constituir la parte
principal de un sistema basado en lípidos aunque este sistema sea
un sistema de liposomas. Este hecho reside en la similitud
estructural (pero no funcional) entre los derivados de lípidos de la
presente invención y los lípidos. Así, por ejemplo, se cree que los
derivados de lípidos para la presente invención pueden ser el único
constituyente de liposomas, es decir, hasta 100% molar de los
liposomas totales deshidratados pueden quedar constituidos por los
derivados de lípidos. Esto contrasta con los lisolípidos de monoéter
conocidos que pueden constituir solamente una parte menor de los
liposomas.
De manera típica, tal como se describirá en
detalle más adelante, los liposomas incluyen ventajosamente otros
constituyentes que pueden tener o no efectos farmacéuticos, pero que
la harán más estable la estructura de los liposomas (o
alternativamente, más inestables) o que protegerán los liposomas
contra su alineación y, por lo tanto, incrementaran el tiempo de
circulación y, de este modo, mejoraran el rendimiento global de un
producto farmacéutico que incluya el liposoma.
En el caso anterior se cree que los derivados de
lípidos específicos constituirán típicamente de
15-100% molar, tal como de 50-100%
molar, preferentemente 75-100% molar y, en
particular, 90-100% molar, basado en el liposoma
total deshidratado.
Los liposomas pueden ser unilamelares o
multilamelares. Algunos liposomas preferentes son unilamelares y
tienen diámetros de menos de unos 200 nm, más preferentemente desde
un valor por encima de 50 nm hasta un valor inferior
aproximadamente a 200 nm.
Los liposomas son preparados típicamente, tal
como se conoce en esta técnica, por un método que comprende las
siguientes etapas: (a) disolver el derivado del lípido en un
disolvente orgánico; (b) eliminar el disolvente orgánico de la
solución de derivado de lípido de la etapa (a); y (c) hidratar el
producto de la etapa (b) con un disolvente acuoso a efectos de
formar liposomas.
El método comprende, además, la etapa de añadir
un marcador al disolvente orgánico de la etapa (a) o a la fase
acuosa de la etapa (c). De manera alternativa, se pueden cargar en
los liposomas marcadores ionizables formando, en primer lugar, los
liposomas, estableciendo un potencial electroquímico, por ejemplo,
mediante un ingrediente de pH, a través de la bicapa de liposomas
más externa y luego añadiendo un marcador ionizable al medio acuoso
externo al liposoma (ver por ejemplo los documentos US 5.077.056 y
WO 86/01102).
A continuación el método puede comprender una
etapa de extrusión de los liposomas producidos en la etapa (c) a
través de un filtro para producir liposomas de ciertas dimensiones,
por ejemplo, 100 nm.
Los sistemas de partículas basados en lípidos,
es decir liposomas y micelas, con dimensiones que cubren una amplia
gama de valores se pueden preparar de acuerdo con las técnicas antes
mencionadas. Dependiendo de la ruta de administración, las
dimensiones adecuadas para las aplicaciones farmacéuticas se
encontrarán normalmente en un gamma de 20-10.000
nm, en particular en una gama de valores de 30-1000
nm. Dimensiones en la gama de 50-200 nm son
normalmente preferentes porque los liposomas de esta gama de
dimensiones se cree que, en general, circulan durante mayor tiempo
por el sistema vascular de los mamíferos que los liposomas más
grandes que son reconocidos más rápidamente por los sistemas
reticuloendoteliales de los mamíferos ("RES") y, por lo tanto,
eliminados más rápidamente de la circulación. La circulación
vascular más larga aumenta las probabilidades de que el sistema de
lípidos-bases llegue al lugar deseado, por ejemplo,
los tumores o las inflamaciones.
Se cree que un sistema de amplificación de
imagen, tal como se ha definido en las realizaciones de esta
invención, que está adaptada para su administración por vía
intravenosa e inyección intramuscular, los liposomas deben tener,
preferentemente, un tamaño medio de partículas de unos 100 nm. Por
lo tanto, este tamaño de partículas debe encontrarse, en general,
en una gama de 50-200 nm.
Además, para un sistema de amplificación de
imágenes adaptado para su administración por inyección subcutánea,
los liposomas deberían tener, preferentemente, unas dimensiones
medias de partículas de 100 a 5.000 nm y entonces los liposomas
pueden ser de capa única o de múltiples capas.
Una de las ventajas de la inclusión de derivados
de lípidos en los liposomas es que la estructura de los liposomas,
en particular cuando se estabiliza, tal como se describe a
continuación, tendrá el tiempo de circulación vascular mucho más
largo que los derivados de lípidos y marcador como compuestos
separados. Además los derivados de lípidos y el marcador serán más
o menos inertes o incluso "invisibles" cuando están
"empaquetados" en liposomas en los que se incluyen
lipopolímeros o glicolípidos. Esto significa también que se puede
suprimir cualquier efecto potencialmente desventajoso, por ejemplo,
efectos hemolíticos.
Los liposomas deben actuar, preferentemente,
como componentes inertes hasta que reaccionan en el área de interés,
por ejemplo, áreas enfermas o tejidos cancerosos, infectados o
afectados por inflamaciones. Tal como se describe a continuación,
los liposomas pueden incluir una serie de otros constituyentes. En
particular un sistema de amplificación, de imagen de acuerdo con la
invención, puede contener además un componente que controla la
liberación del marcador, agentes controladores de la actividad
PLA_{2} extracelular o agentes para el incremento de la
permeabilidad, por ejemplo, lípidos de cadena corta y
lipopolímeros/glicolípidos.
Dos grupos muy importantes de compuestos a
incluir en los liposomas como modificadores son los lipopolímeros y
glicolípidos, estabilizantes del compuesto, tales como lipopolímeros
(por ejemplo polietilenoxido-dipalmitoilfosfatidil
etanolamina, DPPE-PEG,
polietilenoxido-distearoilfosfatidiletanolamina,
DSPE-PEG), con peso molecular de PEG 100 a 1.000
Daltons. Se ha mostrado que los lipopolímeros funcionan como
estabilizantes para el liposoma, es decir, el lipopolímero
incrementa el tiempo de circulación y, lo que es más interesante en
el presente contexto, como activadores de PLA_{2} extracelular.
El efecto estabilizante se describirá a continuación.
Las superficies externas de los liposomas se
cree que son dotadas de un recubrimiento de proteínas de suero,
tales como opsoninas, en los sistemas circulatorios de mamíferos.
Se cree que la eliminación de liposomas se puede inhibir
modificando la superficie externa de los liposomas, de manera tal
que se inhibe la unión de proteínas del suero a los mismos. Se cree
que se consigue una efectiva modificación superficial, es decir,
alteraciones en las superficies externas de los liposomas que
resultan en la inhibición de la opsonización y absorción RES, al
incorporar en las bicapas de liposomas lípidos cuyos grupos polares
principales has sido derivatizados por acoplamiento a los mismos de
una fracción química que puede inhibir la unión de las proteínas
del suero a los liposomas, de manera tal que el comportamiento
farmacocinético de los liposomas en los sistemas circulatorios de
los mamíferos queda alterado y la actividad de PLA_{2}
extracelular se incrementa, tal como se ha descrito anteriormente
para los lipopolímeros.
Se han diseñado preparados de liposomas que
evitan la absorción rápida de RES y que, por lo tanto, tienen una
vida media incrementada en el torrente sanguíneo. Los liposomas
STEALTH® (Liposome Technology Inc., Menlo Park, Calif.) incluyen
lípidos injertados de polietilenglicol (PEG) a % molar
aproximadamente del liposoma total deshidratado. La presencia de
polímeros en la superficie exterior del liposoma disminuye la
absorción de liposomas por los órganos del RES. Las membranas del
liposomas pueden ser construidas, a efectos de resistir los efectos
de alteración del tensoactivo contenido en las mismas. Por ejemplo,
una membrana de liposoma que contiene como constituyentes lípidos
derivatizados con un polímero hidrofílico (es decir, soluble en
agua) tiene normalmente una mayor estabilidad. El componente
polímero de la bicapa de lípido protege el liposoma contra la
absorción por el RES y, por lo tanto, se prolonga el tiempo de
circulación de los liposomas en el torrente sanguíneo.
Los polímeros hidrofílicos adecuados para su
utilización en lipopolímeros son aquellos que son fácilmente
solubles en agua, que se pueden acoplar de forma covalente a un
lípido que forma una vesícula y que son tolerados in vivo
con efectos tóxicos (es decir, son biocompatibles). Los polímeros
adecuados incluyen politilén glicol (PEG), ácido poliláctico
(también designado poliláctida), ácido poliglicólico (llamado
también poliglicólido), un copolímero de ácido poliláctico-ácido
poliglicólico y alcohol polivinílico. Son polímeros preferentes los
que tienen un peso molecular desde 100 ó 120 daltons hasta unos
5.000 ó 10.000 daltons y, más preferentemente, desde unos 300
daltons a unos 5.000 daltons. En una realización especialmente
preferente, el polímero es polietilenglicol que tiene un peso
molecular de 100 a 5.000 daltons aproximadamente y, más
preferentemente, tiene un peso molecular desde 300 a 5.000 daltons
aproximadamente. En una realización especialmente preferente el
polímero es politilenglicol de 750 daltons (PEG (750)). Los
polímeros pueden ser también definidos por el número de monómeros;
una realización preferente de la presente invención utiliza
polímeros de un mínimo de tres monómeros, tal como polímeros PEG
que consisten en tres monómeros (aproximadamente 150 daltons). Otros
polímeros hidrofílicos, que pueden ser adecuados para su
utilización en la presente invención incluyen polivinilpirrolidona,
polimetoxazolina, polietiloxazolina, polindroxipropil
metacrilamida, polimetacrilamida, polidimetilacrilamida y celulosas
derivatizadas, tales como hidroximetrilcelulosa o
hidroxietilcelulosa.
Los glicolípidos son lípidos a los que está
fijada de forma covalente una cadena de polisacárido hidrofílico.
Se apreciará que los glicolípidos pueden ser utilizados como
lipopolímeros, si bien los lipopolímeros habitualmente presentan
los resultados más prometedores.
En general, se cree que el contenido de
lipopolímero se encontrará ventajosamente en una gama de
1-50% molar, tal como 2-25%, en
particular 2-15% molar basado en el liposoma total
deshidratado.
Los liposomas bicapa o multicapa pueden contener
también otros componentes, tales como otros lípidos, compuestos
esterolicos, polímeros-ceramidas como
estabilizantes y compuestos de direccionado, etc.
Los liposomas que comprenden derivados lípidos
pueden consistir (en principio), exclusivamente de los derivados de
lípidos. No obstante, a efectos de modificar los liposomas se
pueden incluir también "otros lípidos". Otros lípidos se
seleccionan por su capacidad de adaptar conformaciones de envasado
compatibles con los componentes derivados de lípidos de la bicapa,
de manera que la totalidad de los lípidos constituyentes están
envasados de manera densa y se inhibe la liberación de los
derivados de lípidos de la bicapa. Los factores basados en lípidos
que contribuyen a conformaciones de empaquetado compatibles, son
bien conocidas por los técnicos en la materia, e incluyen, sin
limitación, longitud de la cadena de ácilo y grado de insaturación,
así como las dimensiones y carga del grupo principal. De acuerdo
con ello, otros lípidos adecuados, incluyendo varias
fosfatidiletanolaminas ("PE"), tales como
fosfatidiletanolamina de huevo ("EPE") o dioloil
fosfatidiletanolamina ("DOPE"), se puede seleccionar por los
técnicos en la materia sin experimentación extensa. Los lípidos
pueden ser modificados de diferentes maneras, por ejemplo,
derivatización del grupo principal con ácidos dicarboxílicos, tales
como ácido glutárico, sebácico, succínico o tartárico,
preferentemente el ácido dicarboxílico es ácido glutárico
("GA"). De acuerdo con ello, entre los lípidos derivatizados
del grupo principal adecuados se incluyen ácidos
fosfatidiletanolamina-dicarboxílico, tales como
ácido dipalmitoil, fosfatidiletanolamina-glutárico
("DPPE-GA"), ácido palmitoiloleil
fosfatidiletanolamina-glutárico
("POPE-GA"), y ácido
dioleoil fosfatidiletanolamina-glutárico ("DOPE-GA"). Más preferentemente, el lípido derivatizado es DOPE-GA.
dioleoil fosfatidiletanolamina-glutárico ("DOPE-GA"). Más preferentemente, el lípido derivatizado es DOPE-GA.
El contenido total de "otros lípidos" se
encontrará típicamente en una gama de 0-30 mol%, en
particular 1-10 mol% basado en el liposoma total
deshidratado.
El compuesto esterólico incluido en el liposoma
puede afectar, en general, la fluidez de las bicapas de lípidos. De
acuerdo con ello, las interacciones de esterol con grupos de
hidrocarburos circundantes inhiben, en general, la emigración de
estos grupos desde la bicapa. Un ejemplo de compuesto esterólico
(esterol) a incluir en el liposoma es colesterol, pero una serie de
otros compuestos esterólicos son también posibles. Se cree en
general que el contenido de compuesto esterólico, en caso de que
exista, se encontrará en una gama de 0-25% molar,
en particular 0-10%, tal como 0-5%
molar basado en el liposoma deshidratado total.
Los polímeros-ceramidas son
estabilizantes que mejoran el tiempo de circulación vascular. Son
ejemplos los derivados de polietilén glicol de ceramidas
(PEG-ceramidas), en particular aquellas en las que
el peso molecular del polietilén glicol es de 100 a 5.000. Se cree,
en general, que el contenido del polímero-ceramidas
se encuentra en una gama de 0-30% molar, en
particular 0-10% molar basado en el liposoma total
deshidratado.
Otros ingredientes pueden constituir
0-2% molar, en particular 0-1%
molar, basado en el liposoma deshidratado total.
De acuerdo con una realización de la presente
invención, la bicapa de lípido de un liposoma contienen lípidos
derivatizados con polietilén glicol (PEG), tal que las cadenas de
PEG se extienden desde la superficie interna de la bicapa de lípido
al espacio interior encapsulado por el liposoma y se extienden desde
el exterior de la bicapa de lípido hacia adentro del entorno
circundante (ver, por ejemplo, US 5882.679 y figuras 10 y 11).
Una variedad de métodos de acoplamiento para
preparar lípidos que forman vesículas derivatizados con un polímero
hidrofílico biocompatible, tal como polietilén glicol, se conocen
en este sector (ver, por ejemplo, US 5.213.804; US 5.013.556).
Los componentes lípidos derivatizados de
lisosomas, según la presente invención, pueden incluir
adicionalmente un enlace lípido-polímero labil, tal
como un péptido, éster o enlace disulfuro que puede ser fraccionado
en condiciones fisiológicas selectivas, tal como en presencia de
enzimas de peptidasa o de esterasa o de agentes reductores. La
utilización de dichos enlaces para acoplar polímeros a los
fosfolípidos permite conseguir elevados niveles en sangre de dichos
liposomas durante varias horas después de administración, seguido de
fraccionamiento de los enlaces reversibles y eliminación del
polímero de la bicapa de liposoma exterior. Los liposomas sin
polímero son sometidos, a continuación, a absorción rápida por el
sistema RES (ver, por ejemplo, US 5.356.633).
Además, los liposomas, según la presente
invención pueden contener moléculas que no son polímeros, unidas al
exterior del liposoma, tal como haptenos, enzimas, anticuerpos o
fragmentos de anticuerpos, citoquinas y hormonas (ver, por ejemplo,
US 5.527 528), y otras proteínas pequeñas, polipéptidos, fracciones
de polisacáridos de azúcares individuales o moléculas que no son de
proteínas que confieren una característica enzimática o de
reconocimiento superficial específica al liposoma. Ver la solicitud
publicada PCT WO 94/21235. Las moléculas superficiales que
direccionan preferentemente el liposoma a órganos específicos o
tipos de células se indican en esta descripción como "moléculas
de direccionamiento" e incluyen, por ejemplo, anticuerpos y
fracciones de azúcares, por ejemplo, gangliósidos o los basados en
manosa y galactosa, que direccionan el liposoma a células
específicas que comportan antígenos específicos (receptores de
fracciones de azúcar). Las técnicas para acoplar moléculas
superficiales a los liposomas son conocidas en este sector (ver, por
ejemplo, US 4.762.915).
El liposoma puede ser deshidratado, almacenado y
posteriormente reconstituido de manera tal que una parte
substancial de su contenido interno se retiene. La deshidratación de
los liposomas requiere, en general, la utilización de un protector
hidrofílico de secado, tal como un azúcar disacárido, tanto en la
superficie interior como en la superficie exterior de las bicapas
de liposomas (ver US 4.880.635). Este compuesto hidrofílico se cree
que, en general, impide la reestructuración de los lípidos en el
liposoma, de manera que las dimensiones y contenido se mantienen
durante el proceso de sacado y a través de la rehidratación
subsiguiente. Son características apropiadas para estos protectores
de secado que sean aceptadores fuertes de enlaces de hidrógeno y que
posean características estereoquímicas que conservan la separación
intramolecular de los componentes de la bicapa de liposomas. De
manera alternativa, el protector de secado puede ser omitido si la
preparación de liposoma no es congelada antes de la deshidratación
y permanece suficiente agua en la preparación después de la
deshidratación.
El sistema basado en lípidos puede ser utilizado
para diagnóstico de una serie de enfermedades, por ejemplo, de
manera típica, las que se pueden seleccionar entre cáncer, por
ejemplo, cáncer de cerebro, de mama, de pulmón, de colon o de
ovario, o bien, leucemia, linfoma, sarcoma, carcinoma y estados
inflamatorios.
Tal como se ha mencionado en lo anterior, los
liposomas que comprenden los derivados de lípidos de la presente
invención incluyen también un marcador. El marcador puede estar
enlazado de forma covalente a las moléculas derivadas de lípidos o
puede estar incorporado, lo que ocurre más frecuentemente, en
sistemas basados en lípidos, por ejemplo, en el interior de una
micela de liposoma o en la parte de la membrana, o una micela o
liposoma. En una realización específica, el sistema de ampliación
de imagen basado en lípidos descrito anteriormente adopta la forma
de liposomas que comprenden el marcador. El sistema basado en
lípidos puede haber incluido, en otra realización, una segunda
substancia medicamentosa (ingredientes farmacéuticamente activos)
que pueden tener un efecto farmacéutico individual o sinérgico en
combinación con el derivado de lípido y los derivados de
lisolípidos, de manera que el sistema de bases de lípidos tiene un
efecto dual, es decir, la administración direccionada de un
marcador igual que un medicamento o mezcla de medicamentos.
Teniendo en cuenta lo anterior, la presente
invención da a conocer también un sistema de amplificación de
imagen que adopta la forma de liposomas, y en el que se incorpora
una segunda substancia medicamentosa.
Una posible "segunda substancia
medicamentosa" es cualquier compuesto o composición de materias
que se pueden utilizar a mamíferos, preferentemente humanos. Estos
agentes pueden tener actividad biológica en mamíferos. Entre las
segundas substancias medicamentosas que pueden ser asociadas a los
liposomas se incluyen, sin que ellas sirvan de limitación: agentes
antivirales, tales como aciclovir, zidovudine, y los interferones;
agentes antibacterianos, tales como aminoglicósidos cefalosporinas,
y tetraciclinas; agentes antifúngicos, tales como antibióticos de
polieno, imidazoles, y triazoles; agentes antimetabólicos, tales
como ácido fólico, y análogos de purina y pirimidina; agentes
antineoplásticos, tales como los antibióticos de antraciclina, y
alcaloides de plantas; esteroles, tales como colesterol;
carbohidratos, por ejemplo, azúcares y almidones; aminoácidos,
péptidos, proteínas tales como proteínas receptoras de células,
inmunoglobulinas, enzimas, hormonas, neurotransmisores y
glicoproteínas; tintes; compuestos midriáticos; broncodilatadores;
anastésicos locales; y similares. Las segundas substancias
medicamentosas especialmente interesantes se seleccionan entre (i)
agentes antitumorales, tales como derivados de antraciclina,
cisplatina, paclitaxel, 5-fluoracil, exisulin, ácido
cis-retinoico, sulfuro de suldinac y vincristina,
(ii) antibióticos y antifúngicos, y (iii) agentes antiflamatorios,
tales como esteroides y no esteroides. En particular, los
esteroides pueden tener también el efecto estabilizante en los
liposomas.
La presente invención se refiere, también, a la
utilización de cualesquiera de los sistemas de amplificación de
imagen basados en lípidos, que se describen como compuestos
diagnóstico y medicamentos combinados, y a la utilización de
cualquiera de los sistemas de amplificación de imágenes basados en
lípidos, que se describen para la preparación de un medicamento
para el tratamiento de enfermedades o estados asociados con un
incremento localizado en la actividad de fosfolipasa A2
extracelular en tejidos de mamíferos. Estas enfermedades o estados
se seleccionan de manera típica entre cáncer, por ejemplo, cáncer de
cerebro, de mama, de pulmón, de colon, o de ovario, o bien
leucemia, linfoma, sarcoma, carcinoma y estados inflamatorios.
También se prevé, en la presente invención, un
compuesto farmacéutico que comprende un portador farmacéuticamente
aceptable, el derivado lípido y un marcador.
El término "portadores farmacéuticamente
aceptables", tal como se utiliza en esta descripción, son los
medios generalmente aceptables para utilizar con la administración
de lípidos y con liposomas, incluyendo formulaciones de
medicamentos de liposomas a mamíferos, incluyendo humanos.
Los portadores farmacéuticamente aceptables son
formulados, en general, de acuerdo con una serie de factores que se
encuentran dentro del alcance de los técnicos en la materia, para
determinar y adaptarse, sin que ello constituya limitación a: los
agentes específicos de contraste conjugados de lípidos y/o segunda
substancia medicamentosa utilizada, el preparado de liposomas, su
concentración, estabilidad y biodisponibilidad pretendida; la
enfermedad, desorden o condición objeto de tratamiento con el
compuesto de liposoma; el sujeto, su edad, talla y estado general;
y la ruta de administración pretendida del compuesto, por ejemplo,
nasal, oral, oftálmica, subcutánea, intramamaria, intraperitoneal,
intravenosa, o intramuscular. Se incluyen entre los portadores
farmacéuticamente aceptables típicos, utilizados en administración
medicamentosa por vía parenteral, por ejemplo, D5W, una solución
acuosa que contiene 5% en peso en volumen de dextrosa, y solución
salina fisiológica. Los portadores farmacéuticamente aceptables
pueden contener ingredientes adicionales, por ejemplo, los que
aumentan la estabilidad de los ingredientes activos, incluyendo
conservantes y antioxidantes.
El liposoma o derivado de lípido es formulado de
manera típica en el medio de dispersión, por ejemplo, un medio
acuoso farmacéuticamente aceptable.
Para aplicaciones normales de diagnóstico, se
administra preferentemente, por vía intravenosa, una cierta
cantidad del compuesto que comprende el marcador, típicamente de 0,1
a 1000 mg aproximadamente de derivado de lípido por kilo de cuerpo
del mamífero.
El compuesto farmacéutico es administrado,
preferentemente, por vía parenteral por inyección, infusión o
implantación (vía intravenosa, intramuscula, intrarticular,
subcutánea o similares) en formas de dosificación, formulaciones o,
por ejemplo, dispositivos de administración adecuados o implantes
que contienen portadores, y coadyuvantes farmacéuticamente
aceptables convencionales, no tóxicos.
La formulación y preparado de dichos compuestos
son bien conocidos por los expertos en el sector de las
formulaciones farmacéuticas. Se pueden encontrar formulaciones
específicas en el libro de texto titulado "Remington's
Pharmaceutical Sciences".
Por lo tanto, los compuestos farmacéuticos, de
acuerdo con la invención, puede comprender el sistema de
lípido-bases en forma de una inyección estéril.
Para preparar este compuesto, se dispersan los agentes de contraste
adecuados, conjugados de lípidos en un vehículo líquido
parenteralmente aceptable que de forma conveniente puede comprender
agentes de suspensión, solubilización, estabilización, ajuste de pH
y/o dispersión. Entre los vehículos aceptables que se pueden
utilizar se encuentran agua, agua ajustada a un pH adecuado por
elección de la cantidad apropiada de ácido clorhídrico, hidróxido
sódico o un tampón adecuado, 1,3-butanediol,
solución de Ringer y una solución de cloruro sódico isotónica. La
formulación acuosa puede contener, también, uno o varios
conservantes, por ejemplo, metilo, etilo o n-propil
p-hidroxibenzoato.
Cuando se desea el diagnóstico de un tumor o
neoplasma, la administración efectiva de un marcador encapsulado en
liposomas, con intermedio del torrente sanguíneo, requiere que el
liposoma sea capaz de penetrar en la capa endotelial continua (pero
"con fugas") y membrana de basamento subyacente que rodee los
vasos que suministran sangre al tumor. Los lisosomas de dimensiones
menores se ha observado que son más eficaces en la extravasación en
tumores a través de la barrera celular endotelial y membrana de base
substrato que separa células capilares de las células
tumorales.
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "tumores sólidos" son los que crecen en un lugar
anatómico distinto del torrente sanguíneo (en contraste con los
tumores transportados por la sangre, tal como leucemias). Los
tumores sólidos requieren una formación de pequeños vasos sanguíneos
y capilares para nutrir el tejido tumoral creciente.
De acuerdo con la presente invención, el
marcador escogido es atrapado dentro de un liposoma de acuerdo con
la presente invención; los lisosomas son formulados para que tengan
un tamaño conocido a efectos de penetrar en las barreras del
endotelio y de la membrana de substrato. La formulación de liposomas
resultante puede ser administrada parenteralmente a un sujeto que
necesita dicho tratamiento, preferentemente por administración
intravenosa. Los tumores caracterizados por un incremento agudo en
permeabilidad de la vasculatura en la zona del crecimiento del
tumor son particularmente adecuados por tratamiento por los
presentes métodos. Los liposomas se degradarán eventualmente debido
a la acción de lipasa en el lugar del tumor, o se pueden hacer
permeables, por ejemplo, mediante radiación térmica o ultrasónica.
El marcador es liberado, a continuación, en una forma solubilizada
transportable, biodisponible. Aunque el marcador no haya sido
liberado, el solo hecho de que el liposoma esté concentrado en el
tejido de interés hace factible el diagnóstico. Además, una pequeña
elevación de temperatura, tal como se observa frecuentemente en
tejido enfermo, puede incrementar adicionalmente la estimulación de
PLA_{2} extracelular.
La enfermedad o estado a diagnosticar se
caracteriza por tener un nivel elevado de PLA_{2} en un mamífero,
lo que es provocado frecuentemente por tejidos malignos, por
ejemplo, seleccionados entre el grupo que consiste en cáncer
cerebral, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer
de ovario, linfomas, sarcomas y carcinoma. El tejido maligno es
típicamente el tumor primario. El tejido maligno es,
alternativamente, células metastásicas que se originan del tumor
primario.
En caso de que se desee direccionado específico
del lugar de la inflamación, la administración efectiva por
liposomas de un marcador requiere que el liposoma tenga una larga
media vida de la sangre, y que sea capaz de penetrar en la capa de
células endoteliales continuas y en la membrana de base situada por
debajo que rodea los vasos sanguíneos adyacentes al lugar de la
inflamación. Los liposomas de tamaños menores se ha observado que
son más eficaces en la extravasación, a través de la barrera celular
endotelial y hacia el interior de las zonas inflamadas asociadas.
No obstante, la limitada capacidad portadora de marcador de
preparados convencionales de liposomas pequeños ha limitado su
efectividad para dichos objetivos.
De acuerdo con la presente invención, el
marcador escogido es atrapado dentro de un liposoma de acuerdo con
la presente invención; los liposomas son formulados de dimensiones
conocidas para penetrar en barreras del endotelio y de membranas de
base. La formulación de liposomas resultante se puede administrar
parenteralmente a un sujeto a diagnosticar, preferentemente, por
administración intravenosa. Las regiones inflamadas, caracterizadas
por un incremento agudo de permeabilidad de la vasculatura en la
región de inflamación, son particularmente adecuadas para
direccionado por los presentes métodos.
Es sabido que la actividad de PLA_{2}
extracelular es anormalmente alta en zonas del cuerpo del mamífero
con enfermedades de cáncer, inflamación, etc. La presente invención
ha proporcionado una forma de explotar este hecho, y se cree que la
actividad de PLA_{2} extracelular debe ser como mínimo 25%
superior en las zonas enfermas del cuerpo (determinadas en el
entorno extracelular) en comparación con un área normal comparativa.
No obstante, se prevé que el nivel de actividad de PLA_{2}
extracelular es frecuentemente mucho más elevado, por ejemplo, un
mínimo de 100%, por ejemplo, un mínimo de 200%, tal como, como
mínimo 400%. Esto significa que el diagnóstico de un mamífero,
puede ser llevado a cabo solamente con la influencia mínima en
tejidos que tienen un nivel "normal" de actividad de PLA_{2}
extracelular.
El marcador puede ser adaptado para que sea
detectable y opcionalmente cuantificable por un método de detección
seleccionado entre el grupo que consiste en tomografía por emisión
de positrones (PET), rayos X, escintografía de rayos gamma,
formación de imágenes por resonancia magnética (MR), formación de
imágenes por tomografía computerizada (CT) y ultrasonografía.
La presente invención se ilustrará por los
siguientes ejemplos.
Los ejemplos muestran la preparación y pruebas
de preparados de liposomas. La preparación de compuestos para
utilización en diagnósticos se puede preparar tal como se describe
en este documento.
Se prepararon liposomas completamente
hidratados, unilamelares, con una estrecha distribución de
dimensiones a partir de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC) y
di-hexodecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(DPPC). Se obtuvo DPPC de lípidos Avanti Polar y
1-O-DPPC se sintetizó en el
laboratorio de los inventores. De modo breve, se disolvieron
cantidades pesadas de DPPC ó
1-O-DPPC en cloroformo. El
disolvente fue eliminado por una corriente suave de N_{2} y las
películas de lípido fueron secadas durante la noche a baja presión
para eliminar cantidades de trazas de disolvente. Se prepararon
vesículas multilamelares por dispersión de los lípidos secos en una
solución tampón, conteniendo 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1
mM NaN^{3}, 30 \muM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA. Las vesículas
multilamelares fueron extrusionadas diez veces por dos filtros de
policarbonato con dimensiones de poros 100 nm, apilados, tal como se
describe en Mayer y otros, Biochim. Biophysm. Acta, 858,
161-168.
Se obtuvieron curvas de capacidad calorífica
utilizando un calorímetro de escaneado diferencial
N-DSC II (Calorimetry Sciences Corp., Provo) del
tipo de compensación de potencia con un volumen de celdas de 0,34
mL. Antes del escaneado, la suspensión de liposoma fue equilibrada
durante 50 min en el calorímetro a la temperatura inicial. Se
utilizó una proporción de escaneo de +10ºC/h. La concentración de
lípidos era de 1 mM. La transición gel a fluido de los liposomas
multilamelares (MLV) se caracteriza como transición aguda de primer
orden, reflejada por un pico estrecho en las curvas de capacidad
calorífica mostradas en las figuras 1a y 1b (curvas superiores)
para 1-O-DPPC y DPPC. El pico agudo
refleja el comportamiento de transición de liposomas de laminas
múltiples y está en contraste con la transición gel a fluido más
amplia, observada para liposomas unilamelares (LUV) (Pedersen y
otros, 1996, Biophys. J. 71, 554-560), tal como se
muestra en las figuras 1a y 1b (curvas inferiores) para los
liposomas unilamelares extrusionados
1-O-DPPC y DPPC.
Se aisló fosfolipasa A_{2} (PLA_{2} de
Agikistrodon piscivorus piscivorus) de veneno de serpiente
purificado, de acuerdo con un procedimiento de Maraganore y otros,
J. Biol. Chem. 259, 13839-13843. Este enzima
PLA_{2} pertenece a la clase de bajo peso molécular de enzimas
secretoras de 14 kD que muestran similitud estructural con la
fosfolipasa A_{2} extracelular humana, indicando un mecanismo
molecular común de la hidrólisis catalizada por fosfolipasa en el
interfaz lípido-membrana (Wery y otros, Nature
352,79-82; Honger y otros, Biochemistry 35,
9003-9006, Vermehren y otros, Biochimica et
Biophysica Acta 1373, 27-36). Se prepararon
liposomas unilamelares completamente hidratados con una
distribución de tamaño estrecha a partir de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC) y a partir de
1-O-DPPC con 5 y 10% molar
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350) de
5 y 10% molar de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-2000](1-O-DPPE-PEG-2000)
tal como se ha descrito anteriormente. Las condiciones de ensayo
para el perfil del tiempo de reacción de PLA_{2}, que se han
mostrado en la figura 2, y el tiempo de retardo y la hidrólisis
porcentual indicada en la tabla 1, fueron: 0,15 mM liposomas
unilamelares, 150 mM PLA_{2}, 150 mM KLC, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1
mM NaN_{3}, 30 \muM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA.
Composición | Tiempo de retardo (seg) | 1-O-DPPC (%) |
100% 1-O-DPPC | 583 | 79 |
95% 1-O-DPPC/5% 1-O-DPPE-PEG350 | 128 | 73 |
90% 1-O-DPPC/10% 1-O-DPPE-PEG350 | 26 | 75 |
95% 1-O-DPPC/5% 1-O-DPPE-PEG2000 | 450 | 56 |
90% 1-O-DPPC/10% 1-O-DPPE-PEG2000 | 20 | 89 |
La reacción catalítica fue iniciada añadiendo
8,9 \mul de una solución de 42 \muM PLA_{2} (150 nM) a 2,5
ml de la suspensión de liposomas termostatizada (0,150 mM)
equilibrada durante 800 seg antes de la adición de PLA_{2}. El
comportamiento característico de ráfaga-retardo de
PLA_{2} hacia los liposomas está señalado por un incremento
brusco en la fluorescencia intrínseca de PLA_{2} a 340 nm después
de excitación a 285 nm, seguido de una disminución simultánea en la
dispersión de luz a 90ºC, desde la suspensión de líquido (HÆnger y
otros, Biochemistry 35, 9003-9006). Se tomaron
muestras para análisis HPLC de la cantidad restante de
1-O-DPPC no hidrolizado, y como
consecuencia la cantidad de
1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina
(liso-1-O-PPC.)
generado se tomaron antes de añadir PLA_{2} y 1200 seg después del
tiempo de retardo observado. Se retiraron partes alícuotas de 100
\mul de la suspensión de lípidos y se mezclaron con rapidez con 1
ml de solución cloroformo/metanol/ácido acético (2:4:1) por el
orden indicado, para interrumpir la reacción enzimática. La
solución fue lavada con 1 ml de agua y 20 \mul de la fase orgánica
pesada fueron utilizados para HPLC. Los cromatogramas 20 \mul de
HPLC de la figura 3 muestra las cantidades de
1-O-DPPC antes y después (t=2.050
seg) de la añadidura de PLA_{2} (t=800 seg) a la suspensión de
liposomas. Se llevó a cabo análisis HPLC utilizando una columna de
5 \mum de diol, una fase móvil compuesta por
cloroformo/metanol/agua (730:230.30, v/v) y un detector de
dispersión de luz por evaporación. La producción de la hidrólisis
catalizada por PLA_{2} de lípidos de
1-O-DPPC a
liso-1-O-P/C. fue
medida por HPLC (ver tabla 1). La fluorescencia intrínseca del
enzima y la dispersión de luz a 90ºC se midieron en función del
tiempo, tal como se ha mostrado en la figura 2.
Se prepararon liposomas multilamelares
1-O-DPPC en presencia de calceína
fluorescente, en una concentración autoequilibrante de 20 mM por
hidratación de una película de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
en una solución tampón de HEPES a pH=7,5 durante una hora a 10ºC
por encima de la fase de la temperatura de transición. Se formaron
liposomas unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares
diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100
nm. Los liposomas unilamelares fueron enfriados con rapidez a una
temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los
liposomas 1-O-DPPC conteniendo
calceína fueron separados de la calceína libre, utilizando una
columna cromatográfica llena de Sephadex G-50.
Las condiciones de ensayo para la liberación de
calceína inducida por PLA_{2} fueron 25 \muM de liposomas
unilaminares 1-O-DPPC, 25 nM
PLA_{2}, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5 ó 8,0), 1 mM NaM_{3},
30 \muM CaCI_{2}, y 10 \muM EDTA. Se añadió PLA_{2} a los
90 seg a 2,5 ml de la suspensión de liposomas
1-O-DPPC termostatizada,
equilibrada durante un mínimo de 20 min a 37ºC antes de la adición
de PLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se determinó del
modo siguiente: % liberación = 100 x
(I_{F(t)}-I_{B})/(I_{T}-I_{B}),
en la que I_{F(t)} es la fluorescencia medida al tiempo t
después de la adición de la enzima, I_{B} es la fluorescencia de
fondo e I_{T} es la fluorescencia total medida después de la
añadidura de triton X-100, que conduce a la
liberación completa de calceína por fractura de los liposomas
1-O-DPPC. El PLA_{2} indujo una
liberación total de 90% de la calceína atrapada en los liposomas
1-O-DPPC, tal como se muestra en la
figura 4.
Se prepararon liposomas objetivos con membrana
modelo multilamelares, en presencia de calceína fluorescente, en
una concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una
película de
1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
(D-O-SPC) en una solución tampón
HEPES a pH=7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura
de transición de fase (T_{m}=55ºC). Se prepararon liposomas
unilamelares por extrusión de los liposomas objetivo multilamelares
diez veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100
nm. Los liposomas unilamelares fueron enfriados rápidamente a una
temperatura por debajo de la temperatura de transición y los
liposomas que contenían calceína fueron separados de la calceína
libre utilizando una columna cromatográfica llena de Sephadex
G-50. Los liposomas portadores unilamelares
compuestos de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
fueron preparados tal como se ha descrito anteriormente. La
calceína liberada de los liposomas objetivo se determina por
medición de la intensidad fluorescente a 520 nm, después de
excitación a 492 nm.
Las concentraciones de liposomas
D-O-SPC y
1-O-DPPC fueron de 25 \muM. Se
añadió PLA_{2} de veneno de serpiente (Agkistrodon piscivorus
piscivorus) (25 nM) para iniciar la reacción hidrolítica que
conduce a la formación de
1-O-hexadecil-2-hidroxi-sn-glicero-3-fosfocolina
(liso-1-O-PPC.) y
productos de hidrólisis de ácidos grasos. Al liberar calceína de
los liposomas D-O-SPC, debido a la
incorporación de
liso-1-O-PPC. que
no forma bicapa y productos de hidrólisis de ácidos grasos en la
membrana de lípido del objetivo, se observó un incremento lineal de
la fluorescencia a 520 nm, después de excitación a 492 nm, cuando la
calceína se diluye en el medio de tampón circundante, tal como se
muestra en la figura 5. El porcentaje del medicamento modelo y/o de
la calceína del agente de contraste liberador se determina tal como
se ha descrito anteriormente (ver ejemplo 3).
Se prepararon liposomas unilamelares
completamente hidratados con una estrecha distribución de tamaños a
partir de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC), y de
1-O-DPPC con 5% molar de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350](1-O-DPPE-PEG350)
o con 5% molar de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-2000
(1-O-DPPE-PEG 2000).
Los lípidos fueron hidratados en una solución salina con tampón de
fosfato (PBS). Se incluyó
1-O-octadecil-2-O-metil-sn-glicero-3-fosfocolina
(ET-18-OCH_{3}) en PBS en el
ensayo como referencia.
El ensayo de hemólisis fue llevado a cabo tal
como se describe por Perkins y otros, Biochim. et Biophys. Acta
1327, 61-68. En pocas palabras, cada una de las
muestras fue diluida serialmente con PBS, y 0,5 ml de cada una de
las suspensiones diluidas de liposomas
1-O-DPPC fueron mezclados con 0,5 ml
de células humanas de hematíes lavadas (RBC) [4% en PBS (v/v)]. A
efectos de control, se mezclaron 0,5 ml de la suspensión de células
de hematíes con 0,5 ml de solución tampón (control de hemólisis
negativo) o bien, 0,5 ml de agua (control de hemólisis positivo).
Las muestras y los estándares fueron situados en una incubadora a
37ºC y se agitó durante 20 horas. Los tubos fueron centrifugados a
baja velocidad (2000 x G) durante 10 min formando gránulos de RBC.
Se cuantificaron 200 \mul del sobrenadante por absorbancia a 550
nm, utilizando un espectrofotómetro Perkin-Elmer
320. Se definió hemólisis a 100 por cien como la magnitud máxima de
hemólisis obtenida a partir del detergente Triton
X-100. El perfil de hemólisis, de la figura 6,
muestra un valor bajo de hemólisis (por debajo de 5 por cien) para
liposomas 2 mM 1-O-DPPC. La figura 6
muestra también que concentraciones bajas de
ET-18-OCH_{3} inducen un grado
significativo de hemólisis.
Se prepararon liposomas unilamelares
completamente hidratados con una estrecha distribución de tamaños a
partir de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfocolina
(1-O-DPPC) y
1-O-DPPC con 5 ó 10% molar de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350),
tal como se describe en el ejemplo 2. Las condiciones de ensayo para
las mediciones del retardo de PLA_{2} fueron liposomas
unilamelares 0,15 mM, 150 nM PLA_{2}, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH
= 7,5), 1 mM NaN^{3}, 30 \muM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA. La
reacción catalítica fue iniciada añadiendo 8,9 \mul de una
solución de 42 \muM PLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de
liposomas termostatizados, equilibrada para 800 seg a 41ºC antes de
la añadidura de PLA_{2}. El tiempo trascurrido, antes del inicio
de la actividad enzimática rápida, se determina por el incremento
brusco de la fluorescencia intrínseca desde PLA_{2} a 340 nm,
después de excitación a 285 nm. Los resultados mostrados en la
figura 7 muestran una disminución significativa del tiempo de
retardo cuando se incorporan 5 y 10% molar de
1-O-DPPE-PEG_{350}
en los liposomas 1-O-DPPC.
Se prepararon micelas a partir de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350),
di-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-750 (DSPE-PEG750) ó
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-2000
(1-O-DPPE-PEG2000).
En pocas palabras, cantidades pesadas de los lípidos polímeros
fueron disueltas en cloroformo. El disolvente fue eliminado
mediante una corriente suave de N_{2}. Las películas de lípido
fueron secadas, a continuación, durante una noche a presión
reducida para eliminar las cantidades de disolvente en magnitud de
trazas. Se prepararon micelas dispersando los lípidos de polímero
secos en una solución tampón, conteniendo 150 mM KCL, 10 mM HEPES
(pH 7,5), 1 mM NaN_{3}, 30 IIM CaCl_{2} y 10 \muM EDTA.
Se prepararon liposomas objetivo con membrana
modelo, de tipo multilamelar, en presencia de medicamentos de
modelos fluorescentes y/o calceína de agente de contraste en una
concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una
película de
1,2-O-dioctadecil-sn-glicero-3-fosfatidilcolinas
(D-O-SPC) en una solución tampón de
HEPES a pH=7,5, durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura
de transición de fase (T_{m}=55ºC). Se prepararon liposomas
unilamelares por extrusión de los liposomas multilamelares diez
veces a través de dos filtros apilados de policarbonato de 100 nm.
Los liposomas unilamelares fueron enfriados con rapidez a una
temperatura por debajo de la temperatura de transición, y los
liposomas conteniendo calceína fueron separados de la calceína
libre, utilizando una columna cromatográfica llena de Sephadex
G-50. Las micelas compuestas de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350),
di-octadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-750 (DSPE-PEG750) ó
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-2000
(1-O-DPPE-PEG2000)
fueron preparadas tal como se describen en el ejemplo 7. La
liberación de calceína del liposoma objetivo se determina por
medición de la intensidad fluorescente a 520 nm después de
excitación a 492 nm.
Las concentraciones de
D-O-SPC y micelas de lípido polímero
fueron de 25 \muM. Se añadió PLA_{2} de veneno de serpiente
(Agkistrodon piscivorus piscivorus) (25 nM) para iniciar la acción
hidrolítica que conduce a la formación inmediata del
liso-1-O-PPE y a los
productos libres de la hidrólisis de ácido graso. Al ser liberada
calceína de los liposomas de
D-O-SPC, debido a la incorporación
del
polímero-liso-1-O-lípido
que no forma bicapa y ácido graso en la membrana de lípido
objetivo, se observó un incremento lineal de la fluorescencia a 520
nm, después de excitación a 492 nm, cuando la calceína se diluye en
el medio tampón circundante, tal como se muestra en la figura 8. El
porcentaje de calceína liberada se determina tal como se describe en
el ejemplo 3. La hidrólisis catalizada por PLA_{2} de
1-O-DPPE-PEG350
indujo la velocidad de liberación más rápida, mientras que el DPPE
con la cadena de polímero más larga (PEG2000), fijada al grupo de
cabecera, indujo la velocidad más lenta de liberación.
La hidrólisis de las micelas compuestas
DSPE-PEG750 fue seguida por análisis de la cantidad
de ácido esteárico generada. La reacción catalítica fue iniciada
por adición de 8,9 \muL de una solución de 42 \muM PLA_{2}
(150 nM) a 2,5 ml de una suspensión de micelas termostatizada de
DSPE-PEG750 (0,150 mM) equilibrada a 45ºC durante
600 segundos antes de la adición de PLA_{2}. El comportamiento de
ráfaga característica de PLA_{2} hacia las micelas está señalado
por un incremento brusco de la fluorescencia intrínseca de
PLA_{2} a 340 nm, después de excitación a 285 nm seguido de un
incremento simultáneo en la dispersión de luz a 90º de la
suspensión de lípido (HÆnger y otros, Biochemistry 35,
9003-9006). Se tomaron muestras para análisis HPLC
de la cantidad de ácido esteárico generada antes de añadir PLA_{2}
y 100 seg después del retardo de tiempo observado. Los
cromatogramas de HPLC de la figura 9 muestran la cantidad de ácido
esteárico generada 100 seg después del retardo de tiempo observado
(10 seg) a 45ºC. La cantidad de ácido esteárico 0,156 mM generada
por hidrólisis era igual al 100% de la hidrólisis del
polímero-lípidos DSPE-PEG750. El
análisis HPLC fue realizado utilizando una columna de 5 \mum
diol, una fase móvil compuesta de
cloroformo-metanol-agua
(750:230:30, v/v) y un detector de dispersión de luz por evaporación
(ver ejemplo 2).
Los liposomas con recubrimiento de polímero
pueden actuar como sistemas versátiles de suministro de marcador
debido al largo tiempo de circulación vascular y al direccionado
pasivo por los vasos sanguíneos con fugas en tejidos enfermos. En
estos ejemplos, se describe un sistema modelo experimental
ilustrando un nuevo principio para suministro mejorado y
programable de producto medicamentoso y/o agente de contraste que
aprovecha la ventaja de una elevada actividad de la fosfolipasa
extracelular A_{2} en los tejidos objetivo enfermos. La
fosfolipasa A_{2} hidroliza un proamplificador basado en lípidos
en el liposoma portador, produciendo
liso-fosfolípidos y ácidos grasos libre que se
muestran de forma sinérgica conduciendo a una desestabilización de
liposomas incrementada y liberación de agente medicamentoso, al
mismo tiempo que se mejora la permeabilidad de la membrana
objetivo. El sistema propuesto se puede hacer termosensible y ofrece
una forma racional para desarrollar sistemas de suministro
inteligentes de medicamentos y agentes de contraste basados en
liposomas, al incorporar en los proamplificadores basados en
lípidos específicos del portador, prodesestabilizadores o en los
promedicamentos que automáticamente quedan activados por la
fosfolipasa A_{2} solamente en los lugares objetivo enfermos,
tales como tejidos inflamados, infectados o cancerosos.
El medicamento y/o agente de contraste adopta la
farmacocinética alterada del portador de liposomas y, en principio,
puede ser direccionado a los tejidos enfermos utilizando una
combinación de factores fisicoquímicos y patofisiológicos en los
lugares del portador de liposomas y en la membrana objetivo,
respectivamente. Los liposomas incorporados con glicolípidos o
lipopolímeros, tales como polietilén-glicol (PEG)
lípidos, conocidos como liposomas, muestran estabilidad mejorada en
el sistema vascular, posiblemente debido a la protección estérica
provocada por el recubrimiento de polímero. El tiempo de circulación
prolongado de estos liposomas, combinado con porosidad vascular
incrementada de tejidos enfermos han constituido la base para
resultados clínicos positivos para sistemas específicos, incluyendo
medicamentos anticáncer, tales como doxorubicina, así como
medicamentos antibacterianos y anti inflamatorios, e igualmente,
sistemas de suministro de agentes de contraste específicos para
objetivos de formación de imágenes (por ejemplo, agentes de
formación de imágenes MR basados en Mn) Niesman y otros, J.
Liposome Res. 4, 939-957, Koenig y Brown, Invest.
Radiol. 20, 297; Basic y otros, Magn. Reson. Med. 13,
44-61; Niesman y otros, Invest. Radiol. 25,
545-551.
Los liposomas son sistemas de lípidos
autoensamblados y su estabilidad es controlada, por lo tanto, en
gran medida, por interacciones físicas no específicas. La
comprensión del control molecular de las características físicas de
los liposomas es, por lo tanto, importante para la manipulación y
adecuación de las características de los liposomas, con respecto a
los objetivos específicos de suministro de medicamentos. Como
ejemplo, la transición de fase de lípido, inducida térmicamente,
gel-fluido, ha sido explotada y optimizada en forma
de sistemas de diseño para liberación mejorada de medicamentos
debido a la hipertermia. Recientemente, liposomas PEG fusogénicos
programables, conteniendo mitoxantrona, que es un medicamento
anticáncer, han sido construidos utilizando la liberación con
retardo en el tiempo de lípidos estabilizantes bicapa de los
liposomas que se acumulan en los lugares tumorales por
extravasación. Sería deseable si se pudiera diseñar un sistema de
suministro de un agente medicamentoso y/o de agente de contraste
inteligentes y versátiles, que tiene incorporado un mecanismo
virtual doble de disparo de simultáneamente (i) liberación mejorada
de medicamento selectivamente en los tejidos objetivo y (ii)
transporte mejorado del medicamento y/o agente de contraste en las
células enfermas. Este principio se ha ilustado esquemáticamente en
la figura 11a.
Por medio de los ejemplos, se describe el
desarrollo de un sistema modelo biofísico experimental simple y
operativo que soporta dicho mecanismo dual para su disparo en los
lugares patológicos objetivo. El modelo supone elevada actividad de
fosfolipasa A_{2} extracelular en los lugares enfermos, tal como
en el caso de tejidos inflamados y cancerosos, en los que el nivel
de PLA_{2} extracelular se puede ampliar varias veces. Por
exposición a PLA_{2} extracelular, los fosfolípidos de los
liposomas PEG se ha demostrado que sufren hidrólisis incrementada
en comparación con liposomas desnudos convencionales. Esto lleva a
la desestabilización del liposoma y a la liberación mejorada del
medicamento encapsulado. Los productos de hidrólisis,
liso-fosfolípidos y ácidos grasos libres actúan, a
su vez, como mejoradores de absorción para la permeación de
medicamentos y/o agentes de contraste, a través de las membranas
objetivo. De esta manera, los fosfolípidos del liposoma portador se
comportan como prodesestabilizantes en el lugar del portador y como
proamplificadores en el lugar de la membrana objetivo. Los detalles
moleculares de este principio se muestran esquemáticamente en la
figura 11b.
El sistema de modelo experimental consiste en
liposomas desnudos, portadores de liposomas recubiertos de polímero
y una membrana objetivo modelo. El portador es un liposoma
unilamelar de 100 nm, preparado a base de lípidos de dipalmitoil
fosfatidicolina (DPPC) con 2,5% molar de lipopolímero del tipo de
dipalmitoil fosfatidiletanolamina
(DPPE)-PEG_{2000}. La membrana objetivo es otro
liposoma preparado a base de
1,2-dioctadecil-sn-glicero-fosfatidilcolina
(D-O-SPC), que es un fosfolípido en
el que los enlaces acilo de las cadenas estearoilo son enlaces éter.
En contraste con DPPC, D-O-SPC es
inerte hacia la hidrólisis catalizada por PLA_{2}, imitando de
esta manera la estabilidad de una membrana celular objetivo intacta
hacia la degradación por sus propias enzimas. El ensayo
experimental, que permite separar en sí mismo simultáneamente la
investigación del efecto de los desestabilizantes en los liposomas
portadores y el efecto de los amplificadores en la membrana
objetivo, comporta atrapar un medicamento y/o agente de contraste
modelo de calceína fluorescente, soluble en agua, en una
concentración autorreguladora, en el interior del liposoma objetivo
no hidrolizable, en vez de hacerlo en el liposoma portador. El
nivel mejorado de PLA_{2} extracelular en la membrana objetivo
puede ser simulado entonces añadiendo PLA_{2} extracelular para
iniciar la reacción hidrolítica en una suspensión del portador y de
liposomas objetivo. La permeación de calceína a través de la
membrana objetiva D-O-SPC es
controlada, a continuación, por el incremento de la fluorescencia.
A efectos de investigar el efecto de la presencia de los
PEG-lípidos en el liposoma portador, se llevó a
cabo un experimento similar con liposomas desnudos de DPPC
convencionales, que se pueden utilizar ventajosamente para
direccionado de órganos ricos en macrófagos de RES, tal como hígado
y bazo. Además, a efectos de comparar y discriminar el efecto
incrementador de la permeabilidad de los
liso-fosfolípidos con respecto al de los ácidos
grasos libres, se llevaron a cabo experimentos sin enzimas en los
que se añadieron liso-fosfolípidos y ácidos grasos
libres simultáneamente o separadamente a los liposomas objetivo.
En la figura 12a se han mostrado los resultados
de la liberación de calceína como función del tiempo, después de la
añadidura de PLA_{2} al sistema. El trascurso temporal de la
reacción del PLA_{2} específico utilizado como comportamiento
característico de ráfaga de retardo con un llamado retardo de
tiempo, que puede ser utilizado convenientemente como medida de la
actividad enzimática. Se observaron una notable disminución del
tiempo de retardo y un incremeno simultáneo de la velocidad de
liberación, cuando los liposomas del portador contienen los
lipopolímeros DPPE-PEG_{2000}, de acuerdo con
anteriores descubrimientos de la degradación incrementada de
PLA_{2} extracelular de liposomas con recubrimiento de
polímero.
Estos resultados sugieren que los productos de
la hidrólisis catalizada por PLA_{2} de los lípidos de DPPC del
portador de DPPC-liposoma,
liso-fosfolípido y ácido graso libre, que se
producen en una mezcla 1:1, se incorporan en la membrana objetivo,
como conduciendo a un gran incremento de la permeabilidad de la
membrana. Estos productos, que tienen una solubilidad muy baja en
agua, son conocidos, debido a sus formas moleculares no
cilíndricas, como inductores de un campo de esfuerzo de curvatura en
la membrana de separación de fase lateral, a pequeña escala, que
induce defectos de membrana y una permeabilidad incrementada. Esto
queda soportado por los datos de la figura 13, que muestran que la
adición de liso-fosfolípido o ácido graso
separadamente al presente sistema objetivo, en ausencia de
PLA_{2}, conduce a una mayor velocidad de liberación de calceína,
a través de la membrana objetivo. No obstante, el descubrimiento
principal es que si se añaden simultáneamente
liso-fosfolípido y ácido graso libre en una mezcla
1:1, se observa un notable incremento de la velocidad de
liberación, tal como se ha mostrado en la figura 13. Esto sugiere
vivamente que los dos activadores actúan de forma sinérgica,
remarcando de esta manera la posibilidad única de explotar
hidrólisis catalizada por PLA_{2} para la desestabilización
combinada del liposoma portador y mejora del transporte del
medicamento a través de la membrana objetivo. El efecto sinérgico
aumenta adicionalmente por el hecho de que PLA_{2} extracelular
es activado por sus propios productos de hidrólisis, revelando los
fosfolípidos degradables del liposoma portador como un cierto tipo
de proactivadores.
Se debe observar que el efecto del presente
sistema, modelo de suministro de medicamento y/o agente de
contraste, con utilización de lípidos como proincrementadores y
prodesestabilizadores con intermedio de la actividad PLA_{2}
extracelular es dinámico y se refiere a una escala de tiempo
intrínseca. Esta escala de tiempo es el tiempo de retención
efectivo de los liposomas portadores cerca de la membrana objetivo.
Cuanto más rápidamente resulta activo el enzima, más rápida es la
liberación del medicamento y/o agente de contraste y mayor es la
absorción del medicamento y/o agente de contraste durante el tiempo
que el portador se encuentra cerca del objetivo. Además, cuanto más
rápidamente funciona el enzinma, más fácilmente queda a disposición
para hidrólisis de otros liposomas que son portadores de
medicamentos que se aproximan al lugar objetivo enfermo. Una vez se
ha establecido que la actividad de PLA_{2} extracelular se puede
utilizar para controlar la liberación de medicamentos, se abren
varias rutas racionales para mejoras inteligentes del sistema de
suministro propuesto de medicamento y/o agente de contraste, a
través de la utilización de mecanismos bien conocidos de la
alteración de la actividad PLA_{2} extracelular por manipulación
de las propiedades físicas de la bicapa de lípido a la que se sabe
que el enzima es sensible, de ello resulta la estrategia de
modificar ciertas características físicas de los liposomas
portadores, sin cambiar significativamente su tiempo de circulación
vascular. Se ilustrará este principio general demostrando los
efectos tanto de un factor físico-químico, la
composición de lípido del portador, como de un factor ambiental
(termodinámico), la temperatura local en el lugar objetivo.
Los fosfolípidos de cadena corta, tales como
didecanoil fosfatidilcolina (DCPC), activan el PLA_{2}
extracelular. El efecto de la permeación de calceína, a través de
las membranas objetivo inducidas por la incorporación de una
pequeña cantidad de DCPC en las liposomas PEG portadoras se muestra
también en la figura 12.a. La liberación es muy rápida debido a una
activación casi instantánea del enzima. Los inventores han
descubierto además que el PLA_{2} extracelular resulta
desactivado (no se muestran datos) cuando se incorpora una cantidad
grande de colesterol (\approx20 mol %) en los liposomas. Como
contraste, los inventores han descubierto que una pequeña cantidad
de colesterol (\approx3 mol %) activa PLA_{2} extracelular.
Estos descubrimientos significativos son de particular interés,
puesto que el tiempo de circulación en sangre de los liposomas PEG
se ha informado que es casi el mismo sin colesterol que con grandes
cantidades de colesterol.
Se sabe que la temperatura tiene un efecto
notable, y principalmente no lineal en la activación de PLA_{2}
extracelular en la zona de la transición de fase
gel-fluido de bicapas de fosfolípido saturadas. Este
efecto no es provocado por cambios en el enzima, sino por notables
cambios estructurales laterales en la bicapa de lípido. Es posible
aprovechar la ventaja de este efecto en el presente sistema de
suministro de medicamento y/o agente de contraste, tal como se
sugiere por los datos de la figura 12b. Al aproximarse la
temperatura a la temperatura de transición en 41ºC, la velocidad de
liberación de calceína queda aumentada progresivamente, tal como se
cuantifica por el tiempo de liberación de 50% de calceína t_{50%},
que se ha mostrado en el añadido de la figura 12b. Se ha sugerido
con anterioridad que se podría aprovechar la hipertermia para
aumentar la liberación del medicamento, y que se podría utilizar el
calentamiento local en áreas tumorales predefinidas para
desestabilizar localmente los liposomas portadores de medicamentos
al aprovechar el carácter de fugas incrementadas de liposomas en su
situación de fase. En el nuevo sistema de modelo de suministro de
medicamentos y/o agente de contraste que se propone en este
documento, estas posibilidades termosensibles son integradas y
explotadas por completo con intermedio o de la sensibilidad térmica
de PLA_{2} extracelular a las características físicas del
liposoma portador. En contraste con el caso en el que el efecto
térmico puede ser alcanzado solamente por un incremento local de
temperatura utilizando fuentes de calentamiento externas en un lugar
tumoral predeterminado de ciertas dimensiones mínimas, la
liberación controlada por PLA_{2} será aumentada en todos los
lugares en los que la temperatura y la concentración de PLA_{2}
extracelular son elevados, por ejemplo en tejidos inflamados, con
independencia de las dimensiones de la zona enferma y sin requerir
una localización previa de los tejidos enfermos.
Se obtuvieron, DPPC, DCPC,
D-O-SPC, y
DPPE-PEG_{2000} de Avanti Polar Lipidos. El
lipopolímero DPPE-PEG^{2000} contiene 45
monómeros en la cadena de polímero de PEG. El PLA_{2} de veneno de
serpiente purificado (Agkistrodon piscivorus piscivorus) fue
un generoso regalo del dr. R.L. Biltonen. Este enzima de PLA_{2}
pertenece a la clase de enzimas secretores de bajo peso molecular,
14 kD que muestran similitud estructural a la fosfolipasa A_{2}
extracelular humana. Los liposomas objetivo multilaminares en
presencia de calceína fluorescente en concentración
autoequilibrante de 20 mM se prepararon por hidratación de una
película de D-O-SPC en una solución
tampón de HEPES a pH = 7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la
temperatura de transición de fase T_{m} = 55ºC. Los liposomas
unilaminares fueron preparados extrusionando los liposomas
multilaminares diez veces a través de dos filtros de policarbonato
de 100 nm apilados. Los liposomas unilaminares fueron enfriados
rápidamente a una temperatura por debajo de la temperatura de
transición, y los liposomas conteniendo calceína fueron separados
de la calceína libre utilizando una columna cromatográfica llena de
Sephadex G-50. Los liposomas portadores
unilaminares de DPPC, DCPC y DPPE- PEG_{2000} fueron preparados de
manera similar T_{m}=41ºC). La liberación de calceína de los
liposomas objetivo es determinada por medición de la intensidad
fluorescente a 520 nm después de excitación a 492 nm. Todas las
mediciones son llevadas a cabo a temperaturas en las que los
lípidos, tanto del portador como de los liposomas objetivo se
encuentran en estado de gel.
Liposomas multilamelares
1-O-DPPC con 10% molar de
1-O-DPPE-PEG350
fueron preparados en presencia de calceína fluorescente en
concentración autoequilibrante de 20 mM por hidratación de una
película de 90% de
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-nn-glicero-3-fosfocolina
y 10%
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350] en una solución de tampón HEPES a
pH=7,5 durante una hora a 10ºC por encima de la temperatura de
transición de fase. Los liposomas unilamelares fueron constituidos
por extrusión de los liposomas multilamelares diez veces a través
de dos filtros de policarbonato apilados de 100 nm. Los liposomas
unilamelares fueron enfriados rápidamente a una temperatura por
debajo de la temperatura de transición y los liposomas conteniendo
calceína fueron separados de la calceína libre utilizando una
columna cromatográfica llena de
Sefadez G-50.
Sefadez G-50.
Las condiciones de ensayo para la liberación de
calceína inducida por PLA_{2} fueron liposomas unilamelares 25
\muM, 50, 1 y 0,02 nM PLA_{2}, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5),
1 mM NaN_{3}, 30 \muM CaCl_{2}, y 10 \muM EDTA. Se añadió
PLA_{2} a 2,5 ml de la suspensión de lípido termostatizado
equilibrada durante un mínimo de 300 seg a 35,5ºC antes de la
adición del PLA_{2}. El porcentaje de calceína liberada se
determina del modo siguiente: % Liberación = 100 x
(I_{F(t)} - I_{B})/(I_{T -} I_{B}), en la que
I_{F(t)} es la fluorescencia medida en el tiempo t después
de adición de la enzima, I_{B} es la fluorescencia de fondo, e
I_{T} es la fluorescencia total medida después de adición de
Triton X-100 que conduce a la liberación completa
de calceína por fraccionamiento de los liposomas
1-O-DPPC. La figura 14 muestra que
la liberación inducida de calceína fue la más lenta cuando de
añadió solamente 0,02 nM PLA_{2} a la suspensión de liposomas.
Grupos de ratones (n = 5/grupo; peso
18-22 g) fueron tratados i.v. con tampón (PBS),
ET-18-OCH_{3} (50 mg/kg), y
liposomas compuestos de 1-O-DPPC con
5 mol%
1-O-DPPE-PEG2000
(68,7 y 137,5 mg/kg). 30 minutos después de la inyección, se
recogieron 100 \mul de sangre en tubos heparinizados
directamente de ratones decapitados anestesiados con CO_{2}. La
sangre fue centrifugada a 500 x G durante 10 minutos, y el plasma se
retiró y almacenó a -20ºC hasta el análisis.
El grado de hemólisis fue medido por absorbancia
a 550 nm utilizando un espectrofotómetro de barrido
Perkin-Elmer 320. Se mezclaron 25 \mul de
plasma con 2,5 ml de PBS o 2,5 ml de tritón X-100 al
10%. Se definió el 100 por cien de hemólisis como la cantidad
máxima de hemólisis obtenida del plasma de ratones tratados con PBS
mezclado con Triton X-100 al 10% y 0 por cien como
plasma de ratones tratados con PBS mezclados con PBS.
El perfil de hemólisis de la tabla 2 muestra un
bajo valor de hemólisis para los ratones tratados con 2 mM
liposomas compuestos de 1-O-DPPC con
5 mol%
1-O-DPPE-PEG2000.
Los ratones tratados con
ET-18-OCH_{3} murieron dentro de
un período de 30 minutos.
Tratamiento | PBS | ET-18-OCH_{3} | 1-O-DPPC | 1-O-DPPE- |
50 mg/kg | con 5 mol % | PEG2000 | ||
68,7 mg/kg | 137,5 mg/kg | |||
Hemólisis | 1,7% (\pm 0,2) | ND (muertos) | 4,0% (\pm2,4) | 6,6% (\pm0,7) |
Supervivientes (30 minutos) | 3/3 | 0/5 | 5/5 | 5/5 |
Tal como se utiliza en esta descripción, el
término "tumores sólidos" son los que crecen en un lugar
anatómico distinto de la corriente sanguínea (en contraste con
tumores transportados por la sangre tal como leucemias). Los
tumores sólidos requieren la formación de pequeños vasos sanguíneos
y capilares para nutrir el tejido tumoral creciente.
Se preparó fluido peritoneal libre de células de
ratas con inflamación aguda inducida por caseína inyectando 5 ml de
caseinato sódico al 1% en la cavidad peritoneal de una rata macho
SRPD, con un peso de 250-260 g. La rata fue
sacrificada por desangrado después de 24 horas, y el fluido
inflamatorio fue recogido del peritoneo y centrifugado a 1500 G
durante 20 minutos a efectos de obtener fluido peritoneal libre de
células.
Liposomas unilaminares negativamente cargados y
completamente hidratados, con una estrecha distribución de tamaños,
fueron preparados a partir de 89% mol
di-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoglicerol
(DPPG), 10 mol%
1-O-hexadecil-2-hexadecanoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilén
glicol)-350]
(1-O-DPPE-PEG350) y
1% mol
1,2-bis-(1-pirenedecanoil)-sn-glicero-3-fosfocolina
(bis-py-DPC). El
bis-py-DPC es un sustrato de PLA2
con dos fluoróforos de pireno adyacentes que forman dímeros de
estado excitado (exímeros) emitiendo a 470 nm cuando tiene lugar la
excitación en 342 nm. La hidrólisis catalizada por fosfolipasa
separa los dos fluoróforos, que a continuación emiten a 380 nm
(monómeros).
La figura 15 muestra los espectros de emisión
obtenidos después de excitación en 342 nm de
bis-py-DPC incorporado en liposomas
cargados negativamente (0,100 mM) antes y después de añadir 100 nM
de PLA_{2} (Agkistrodon piscivorus piscivorus). El cambio
observado en el espectro de emisión después de hidrólisis mediada
por fosfolipasa es utilizado en un ensayo continuo, midiendo la
emisión del exímero a 470 nm simultáneamente con la emisión del
monómero en 380 nm después de excitación en 342 nm. La figura 16
muestra el perfil del tiempo de reacción de la hidrólisis
catalizada por fósfolipasa A_{2} de rata de los liposomas cargados
negativamente. La reacción catalítica fue iniciada por añadidura de
fluido peritoneal libre de células a 2,5 ml de una suspensión de
liposomas termostatizada equilibrada para 60 segundos antes de la
edición de PLA_{2}. El comportamiento típico de
retardo-ráfaga de la fosfolipasa es señalado por un
incremento brusco en la fluorescencia del monómero en 380 nm y una
disminución subsiguiente en la fluorescencia del exímero, tal como
se muestra en el inserto de la figura 16.
Las condiciones de ensayo para el perfil de
tiempo de reacción de PLA_{2} que se muestra en la figura 16
fueron: 0,100 mM de liposomas unilaterales cargados negativamente,
100 \mul de fluido peritoneal libre de células sin diluir, 10 mM
HEPES (pH 7,5), 5 mM CaCl_{2}, y 150 mM NaCl.
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Claims (12)
1. Utilización de un sistema basado en lípidos
que comprende un derivado de lípido y un marcador, teniendo dicho
derivado de lípido (a) un grupo alifático con una longitud mínima de
7 átomos de carbono y un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7
átomos de carbono, y (b) una fracción hidrofílica, siendo además
dicho derivado de lípido un sustrato para PLA_{2} extracelular en
la medida de que el radical orgánico puede ser fraccionado
hidrolíticamente, mientras que el grupo alifático permanece
sustancialmente sin afectar, de manera que el derivado de lípido
del cual se ha fraccionado el radical orgánico es liberado en forma
de un derivado lisolípido que no es un sustrato para
lisofosfolipasa, llevando incluido dicho sistema en el mismo
lipopolímeros o glicolípidos a efectos de presentar cadenas
hidrofílicas en la superficie del sistema para la preparación de un
compuesto de diagnóstico para detectar y/o cuantificar enfermedades
o estados asociados con un incremento localizado de actividad de
PLA_{2} extracelular en tejidos de mamíferos.
2. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el marcador es seleccionado
entre el grupo que consiste en ^{111}In, ^{99m}Tc, ^{67}Ga,
^{11}C; Gd, Mn, óxido de hierro, argón, nitrógeno, yodo, bromo y
bario.
3. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el derivado de lípido tiene
la siguiente fórmula:
\melm{\delm{\para}{CH _{2} --- Z --- R ^{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{2} --- X --- R ^{1} }}H --- Y --- R^{2}
en la
que
- X y Z independientemente son seleccionados entre O, CH_{2}, NH, NMe, S, S(O), y S(O)_{2};
- Y es -OC(O)-, conectándose a continuación Y a R^{2} con intermedio del oxígeno o átomo de carbono del carbonilo;
- R^{1} es un grupo alifático de fórmula Y^{1}Y^{2};
- R^{2} es un radical orgánico que tiene, como mínimo, 7 átomos de carbono;
- en la que Y^{1} es -(CH_{2})_{n1}-(CH=CH)_{n2}-(CH_{2})_{n3}-(CH=CH)_{n4} -(CH_{2})_{n5}-(CH=CH)_{n6}-(CH_{2})_{n7-}(CH=CH)_{n8r}-(CH_{2})_{n9}, y la suma de n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 es un entero de 9 a 29; n1 es cero o un entero de 1 a 29, n3 es cero o un entero de 1 a 20, n5 es cero o un entero de 1 a 17, n7 es cero o un entero de 1 a 14, y n9 es cero o un entero de 1 a 11; y cada uno de n2, n4, n6 y n8 es independientemente 0 ó 1 y Y^{2} es CH_{3} o CO_{2}H; de manera que cada uno de Y^{1}-Y^{2} independientemente pueden estar sustituidos por halógeno o C_{1-4} alquilo,
- R^{3} es seleccionado entre ácido fosfatídico (PO_{2}-OH), derivados de ácido fosfatídico y bioisoésteres a ácido fosfático y derivados del mismo.
4. Utilización, según la reivindicación 3, en la
que R^{2} es un grupo alifático de una longitud de un mínimo de 7
átomos de carbono.
5. Utilización, según la reivindicación 4, en la
que R^{2} es un grupo de fórmula Y^{1}Y^{2}.
6. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el promedicamento constituye
15-100% molar del sistema total basado en lípidos
deshidratado.
7. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el sistema basado en lípidos
adopta la forma de liposomas en la que se incorpora una segunda
sustancia medicamentosa.
8. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el marcador está enlazado
de forma covalente al derivado de lípido.
9. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que la enfermedad o estado
caracterizado por tener un elevado nivel de PLA_{2} en un
mamífero, es provocado por tejidos malignos, por ejemplo,
seleccionados entre el grupo que consiste en cáncer cerebral,
cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de
ovario, linfoma, sarcoma y carcinoma.
10. Utilización, según la reivindicación 9, en
la que los tejidos malignos son el tumor primario.
11. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones 9 a 10, en la que el tejido maligno son células
metastásicas que se originan del tumor primario.
12. Utilización, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en la que el marcador es detectable
y/o cuantificado por un método seleccionado entre el grupo que
consiste en tomografía con emisión de positrones (PET), rayos X,
escintigrafía-gamma, formación de imágenes por
resonancia magnética (MR), formación de imágenes por tomografía
computerizada (CT) y ultrasonografía.
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