JPH03252558A - 固相イムノアツセイ方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は被分析物のイムノアッセイ法及び装置、より詳
細には固相イムノアッセイ方法及び装置に関する。

〔従来の技術〕

免疫学的測定法は種々の臨床応用に非常に有用であるこ
とが知られている。該測定法に使用される抗体は抗原性
を示すリガンド物質（抗原）と選択的に結合する。抗体
は抗原と特異的に反応し、類似した性質を有する他の物
質から該抗原を識別することができる。

一方、最近、生体中の重要な生理活性を有するタンパク
質又はペプチドが、その生合成、代謝過程で１０テアー
ゼに代表される種々の酵素によるプロセシングを受けて
いることが、更にある疾患においては該プロセシングの
元通又は低下が報告されてきた。例えば、ベプチドホμ
モンとしてＡＣＴＨ（アドレノコルチコトロビックホル
モン）があり、肺癌細胞においてはその前躯体であるプ
ロＡＣＴＨの産生が著しく増加すること（Ｍ、Ｆ、　Ｓ
ｔｅｗａｒｔら、Ｂｒ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　、　　６
０．２０、（１９８９）Ｌ各種癌患者の尿中にはフィブ
ロネクチン断片が著しく増加すること（片山政彦ら、医
学のあゆみ、１５０．６９５（１９８９））が報告され
ている。その他のプロセシングの例としてはウロキナー
ゼと１０ウロキナーゼ、インスリンと１０インスリン、
筋肉型カルバスタンと赤血球型力μバスタチン、血液凝
固タンパクのＴ−カルボキシル化″等多数が挙げられる
（、　Ｊ、Ｆ、　Ｒｅｈｆｅ１ｄら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉ
ｅ　。

？’０１２５、（１９８８）、Ｄｏｃｈｅｒｔｙ、　Ｋ
ら、Ａｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、４４．
６２５　（１９８２））。

これらプロセシングを受ける前の物質と受けた後の物質
が同−試料中に存在することは特に生体由来成分にはよ
く観察されることで６Ｄ、上記物質の分別測定法の開発
は非常に重要である。例えはプロＡＣＴＨとＡＣＴＨの
分別測定法においては各々に特異性の高い抗体を用いる
ことで各々に特異的な免疫測定法が開発されている（Ｍ
、Ｆ、　Ｓｔｅｗａｒｔら、Ｂｒ、Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ
　、　　６０．２０（１９８９））。

しかし、この様なプロセシング前後の物質に各々特異な
抗体を得ることは大変まれなことであ夛、莫大な時間と
煩雑な操作を要し、しかも必ずしも目的とする抗体を取
得できるとは限らない。一般にはグロテアーゼによるプ
ロセシングを受ける前の物質には反応するがプロセシン
グ後の物質には反応しないような抗体は得られやすいが
、プロセシング後の物質には反応するが、プロセシング
前の物質には反応しないような抗体は得られにくく、プ
ロセシング前の物質にも同等の交差反応性を示す場合が
多い。従って、従来はこの様な分別測定を行うのに、例
えばプロセシング前の物質に特異的な抗体を用いた免疫
測蝋法によりプロセシング前の物質の量を測定し、一方
でプロセシングの有無に関係なく両物質に反応できる抗
体を用いた免疫測定法により全体量を測定し、この量か
ら前記プロセシング前の物質の量を差引くことでプロセ
シング後の物質の量を測定していた（　Ｂａｒｄｒａｍ
　Ｌ、らＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　、　１７５．５
３７　（１９８８））。

又、別の方法としては、この様な共存類似物質を特異吸
着剤によυ分画したサンプ／Ｉ／ｌ−用いて免疫学的に
測定する方法があった。例えば異常プロトロンビンの測
定においては硫酸バリウムの添加により正常プロトロン
ビン（Ｔ−カルボキシル化されている）を沈澱させ、残
った上澄中のプロトロンビン量を免疫測定することで異
常プロトロンビン（Ｔ−カルボキシル化されてい危い）
量を測定していた。

〔発明が解決しようとする課題〕

以上のごとく、非常に類似した抗原性を有する物質を各
々特異的に測定することは２種の測定系を用いた夛、試
料を前処理することが必要であシ、その操作、データ処
理の複雑さからよシ簡便で迅速で特異的な測定法の開発
が望まれていた。

本発明は、この様な抗原を共存する類似抗原物質の影響
を受けることなく簡便にただ一つの装置で検出するため
の改良された固相イムノアッセイ方法及び装置の提供を
目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、液体試料
中における被分析物の存在の有無、又は量を該被分析物
と抗原性が類似した共存物の存在下で免疫学的に測定す
る分析装置に関し、該液体試料を受入れるのに適したア
プリケーション部と、該アプリケーション部から連絡す
る該共存物質を特異的に結合し得る固定化された分離剤
を含むセバレーＶヨン部と、更に該セバレーＶヨン部か
ら連絡する少なくとも一つの表示部を有する担体を包含
し、該表示部には分析物と結合し得る結合剤が固定化さ
れておシ、該アプリケーション部と該セパレーシヨン部
と該表示部が、該アプリケーション部に添加された液体
が該セバレーＶヨン部を通過し更に該表示部を通って流
れるように配置されていることを更に含有する。又、本
発明の第２の発明は、液体試料中における分析物の存在
の有無、又は量を該分析物と抗原性が類似した共存物の
存在下で免疫学的に測定する分析方法に関し、アプリケ
ーション部に該試料を添加する工程から表示部において
シグナ／Ｌ／ヲ検出するまでの工程を包含し、該試料が
まずアプリケーション部にある標識された試薬を浴解し
、この混合物が次にセパレーション部に流入され、核部
では共存物質が分離剤に結合され、反応後の該混合液が
表示部に流入され、核部に含まれる分析物と結合し得る
結合剤と被分析物及び／又は標識された試薬からなる複
合体が形成され、ここより発生されるシグナルを検出す
ることを更に含有する。

本発明によれば類似抗原物質存在下における、目的抗原
の存在の有無、又は量を測定するための装置及び方法が
提供される。本発明者は、鋭意研究を重ねた結果、少な
くともアプリケーション部、セパレーション部及び表示
部を備え、これらがこの順に相互に毛管流によって連絡
しておシ、これによって抗原が毛管流により流動する装
置を用いるとき、試料を微量添加するのみで表示部にシ
グナルが発生し、その度合は該試料中に含まれる類似抗
原物質に影響されることなく目的抗原の有無、又は量を
正確に反映し、かくして非常に簡便な操作で類似抗原物
質存在下で目的抗原の特異的な測定を行い得ることを見
出した。

本発明における装置は、液体試料が表示部を通って流れ
込む様に配置された吸収部を更に有していても良く、又
アプリケーション部が被分析物と反応し得る標識された
試薬を含有していてもよい。標識された試薬は、被分析
物と反応し得る物質であれば良く、榛識物は例えば金属
コイド、フテツクス、酵素、螢光物質、発光物質、色素
尋である。更に本発明の装置は表示部において、陰性コ
ントロール及び／又は陽性コントローｌｖを表示し得る
部位を包含していても良い。

被分析物と結合剤と分離剤と標識された試薬の屈合せと
し７ては、抗原及び／又社抗体からなる群よシ選択する
のが最も簡便である。

本発明における望ましい夾施様式であるサンドイッチ型
アッセイ装置について図面に沿って説明するが、本発明
装置はこれに限定されるものではない。本発明の装置の
一例を第１図（正面図）、及び第２図（側断面図）に示
す。第３図は本発明方法による分析中の状態を示す側断
面図である。なお各図において符号１ｏは装置、１１は
カバー　１２は吸収性基本担体、１３は不活性基材、１
４はシール、１５は乾燥標識抗体パッド、１６はセパ−
ジョン部、１７は表示部（６）、１８は表示部（Ｅ３）
、１９は表示部（Ｐ）、２゜は吸収部、２１はアプリケ
ーション部、２２は液体試料、２３け第１の末端、２４
は第りの末端を示す。

この装置は−・定の長さの吸水性基本担体１２を有して
おり、液体試料の移動が開始される第１の末端２３及び
移動が終了する第２の末＠２４がある。上記一定の長さ
の基本担体１２にはアプリケーション部２１、セパレー
ション８１６、表示部１７゜１８．１９、吸収部２ｏが
含まれる。表示部（ロ）１７は抗原及び標識された抗体
とは反応せず陰性コントロー／Ｌ／’ｉ表示する。表示
部（８）　１８は抗原とは反応するが標識された抗体と
Ｌ反応せず、試料中の抗原の存在を表示する。

表示部伊）１９は抗原とは反応しないが標識された抗体
と反応し、陽性コントロー／Ｌ／′ｆ、表示する。

セパレーション部１６は類似抗原とは反応するが目的抗
原とは反応しない抗体が固定されている。アプリケーシ
ョン部２１には乾燥した標識抗体を含むパッド１５が存
在する。又、これら基本担体は不活性基材１３上に保持
され、更にカバー１１で覆われている。

本装置１０を使用するに当っては、一定量の試験すべき
液体試料２２をシーｌ′ｖ１４を取シ除いたあとのアプ
リケーション部２１へ添加する。

次いで液体試料は乾燥標識抗体パッド１５に達し、標識
抗体を溶出し、セパレーション部１６、表示部１７．１
８．１９と進み、最終的に吸収部２０へと達する。セパ
レーション部に固定された類似抗原特異抗体と共存する
類似抗原が反応し、トラップされる。試料成分及び標識
抗体は更に表示部へと進み核部に固定化された特異抗体
と反応し、目的抗原及び目的抗原と標識抗体の複合体は
固定化抗体と反応し、トラップされる。続いて試料中の
未反応成分は吸収部へと運び去られる。一方、標識抗体
は表示部中の標識抗体特異結合成分と反応し、トラップ
される。′未反応の標識抗体は吸収部へ移動する。

試料中に目的抗原があれば、アプリケーション部で抗原
−標識抗体複合体を生じ、該複合体は表示部１８．１９
で結合剤にトラップされシグナｌ′ｖが得られる。一方
、抗原の存在しない場合は表示部１９にのみ標識抗体が
トラップされ、表示部１８でのシグナルは発生せず、抗
原が存在しないことを示すと共に表示部１９でシグナル
が得られ、これは標識抗体の移動が完了したことを示し
装置が正常に作動したことを示すコントロールとなる。

また、表示部１７には通常結合するものはなくシグナル
は得られず、もしここにシグナルを発生した時は、非特
異的反応によるものであり、これもまた装置が正常に働
いたか否かを示すコントロールとなる。

一方、試料中に類似抗原が存在していてもとれはセパレ
ーション部にトラップされ、表示部での目的抗原の検出
に影１１を与えることはない。

本発明の標識試薬は当該技術分野で一般に知られたもの
をよく知られた方法で用いることができる。最も望まれ
るのは金フロイド標識である。直怪４０〜８０ｎｍの範
囲の粒子が適している。

固型支持体は試料から被分析物を吸収することができ、
かつ湿潤した際、被分析物及び標識試薬を毛管作用によ
って固型支持体の第１の木繊から第２の末端へ流動させ
ることができるものである。代表例としてはガラスセイ
ン、セルロース、ナイロンろ紙、ニトロセルロースなト
カ挙げられ、特に好ましいのはニトロセルロースである
。これらはまたガラス−プラスチック、金属などの適・
当な不活性基材上にコーティングし接着すると５とがで
きる。

吸収部は七μロース繊維のパッド、セルローススポンジ
あるいは他の液体の吸収可能な高容量親水性材料であ夛
える。

標識抗体を含ませるパッドはろ紙のような液体吸収剤で
あシえる。

〔実施例〕

以下に実施例によシ、本発明を更に具体的に説明するが
本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例　１ 尿中フィブロネクチン（ＦＮ　）の断片の検出のための
第１図および第２図に示したようなサンドイッチ型７ツ
セイ装置を作製し使用した。ポリスチレンの０．５　Ｘ
　８　ｒｘのストリップにまず両面テープを貼付し、こ
れに平均孔径が５）１ｍのニトロセルロース（ニス・ア
ンド・ニス）ｔ−更に貼付した。抗ＦＮモノクローナ〜
抗体ＦＮ３Ｑを表示部１８に５声ｔ（ＩＭ９７ｍｌ＞ス
ポットし、続けて抗ＦＮモノクロナール抗体ＦＮ４及び
ＦＮ　９の混合物をセパレーション部１６に５（２ｖ／
ｒｎＩりスポットし、更にウサギ抗マウスＩｇ（）抗体
を表示部１９に５　ｆｉ９１０岬／ｍｅ）スポットしこ
れらを空気乾燥した。続いて３％ＢＳＡでニトロセμロ
ースをブロックし空気乾燥した。次いで金コロイド標識
抗ＦＮモノクローナル抗体ＦＮＩＯ（５声ｔ）をろ紙パ
ッドに加え空気乾燥した後にアプリケーション部２１の
中へ設置し九。

なお、ＦＮ　４、ＦＮ　９、ＦＮ　ｌ　０１ＦＮ　３０
は特開昭６３−２１９３９３号公報中に開示されている
様に、囮の゛各す−モリシノ分解物〔バイオケミカル　
アンド　バイオフイジカｉｖ　ｖサーチコミュニケーシ
ョンズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈ７ａ。

Ｒｅｓ、　ＣＯｍｍｕｎｅ　）第１１６巻、第５３４〜
５４０頁（１９８３）　、ｊを特異的に認識するモノク
ローナμ抗体であシ（表１）、ＦＮ９祉ｊＦＮのＮ末端
をＦＮ　４はＦＮ　＋７）　Ｃ末端を、１１’Ｎ１０及
びＦＮ３０はＦＮの中間部をそれぞれ認識する。

表 ＦＮ９　　　　　　　　　　ドメイン１ＦＮＩ　　　　
　　　　　ドメイン６ ＦＮ　１０　　　　　　　　　ドメイン４ＦＮ　３０　
　　　　　　　　　ドメイン４次いでアプリケーション
部２１に種々の割合でｔｉ′Ｎ断片及び完全型ＦＮｉ含
んだ尿試料と本分析を容易にするために０．２％トリト
ンＸ−１００及びＴＢＳからなる希釈液を１：１に混合
した液を加えた。液体のフロントを約５分間にわたって
装置の吸収部まで進行させ、試料物質及び金コロイド標
識抗体を表示部まで移動させた。その結果、完全型ＦＮ
の存在の有無に関係なく断片ＦＮを含む尿試料は全て表
示部に赤色のスポットを得た。一方、セパレーション部
を含まない装置で同様の検討を行ったところ、完全型Ｆ
Ｎを含む尿試料では断片ＦＮの有無に関係なく赤色スポ
ットが得られ、陽性と判定されてしまった。このように
ＦＮ断片持異的な完全型Ｆ’Ｈの存在の有無に影響され
ない測定方法及び装置が完成した。

〔発明の効果〕

本発明は類似抗原存在下でイムノアッセイを行うのに容
易に使用できる装置及び方法を提供するという点で有利
である。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明装置の一例の正面図、第２図はその側断
面図、第３図は該装置を用いて、本発明方法によル分析
中の状態を示す側断面図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料中における被分析物の存在の有無、又は量
   を、該被分析物と抗原性が類似した共存物質の存在下で
   免疫学的に測定する装置において、該液体試料を受入れ
   るのに適したアプリケーシヨン部と、該アプリケーシヨ
   ン部から連絡する該共存物質を特異的に結合し得る固定
   化された分離剤を含むセパレーシヨン部と、更に該セパ
   レーシヨン部から連絡する少なくとも一つの表示部を有
   する担体を包含し、該表示部には分析物と結合し得る結
   合剤が固定化されており、該アプリケーシヨ部と該セパ
   レーシヨン部と該表示部が、該アプリケーション部に添
   加された液体が該セパレーシヨン部を通過し更に該表示
   部を通つて流れるように配置されていることを特徴とす
   る分析装置。 ２、前記液体が前記表示部を通つて流れ込むように配置
   された吸収部を更に有する請求項１記載の装置。 ３、前記アプリケーション部が分析物と反応し得る標識
   された試薬を更に含有する請求項１記載の装置。 ４、前記表示部において陰性コントロール及び／又は陽
   性コントロールを表示し得る部位を更に包含する請求項
   １記載の装置。 ５、液体試料中における分析物の存在の有無又は量を該
   分析物と抗原性が類似した共存物質の存在下で免疫学的
   に測定する方法において、アプリケーション部に該試料
   を添加する工程から表示部においてシグナルを検出する
   までの工程を包含し、該試料がまずアプリケーション部
   にある標識された試薬を溶解し、この混合液が次にセパ
   レーシヨン部に流入され、該部では共存物質が分離剤に
   結合され、反応後の該混合液が表示部に流入され、該部
   に含まれる分析物と結合剤と被分析物及び／又は標識さ
   れた試薬からなる複合体が形成され、ここより発生され
   るシグナルを検出することを特徴とする分析方法。