CN114324901B - 一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法,包括载体,所述载体上设置有标记位点、T线、C线,所述标记位点含有与样本抗原发生特异性反应的被信号粒子标记的标记抗体,T线固定有与样本抗原和标记抗体发生双抗体夹心反应的捕获抗体,所述捕获抗体由与样本抗原的结合能力高低不同的两种抗体混合而成,C线固定有与标记抗体发生双抗体夹心反应的抗原‑抗体偶联物。T线上的捕获抗体由两种结合能力不同的抗体混合,延缓了HOOK效应的产生,C线上采用定向包被方法,对更高浓度的待测样本而言,在与样本抗原竞争标记抗体时抗原‑抗体偶联物能表现出更显著的竞争梯度,扩宽了C线的下降范围,扩展了对大分子蛋白的定量检测范围。
Description
技术领域
本发明属于体外诊断与免疫检测技术领域,尤其涉及一种扩展定量检测范围的试剂盒及检测方法。
背景技术
免疫分析法是利用抗原抗体特异性结合反应检测复杂样本中药物、激素、蛋白质、微生物等物质存在或者浓度的分析方法。按照反应机制的不同,免疫分析可以分为竞争法和非竞争法。其中非竞争法是将待测抗原与足够的标记抗体充分反应形成抗原-标记抗体偶联物,产生的信号强度与抗原的量成正比。竞争法是将待测抗原与定量标记抗原(直接竞争)或者固定抗原(间接竞争)竞争结合形成定量的特异性抗体-抗原偶联物,待测抗原的量越大,与抗体结合的标记抗原或者固定抗原的量越少,产生的信号强度越小,由此确定待测抗原的量。非竞争法中经典的双抗体夹心免疫反应的原理是以抗原为检测靶标,在固相载体的表面通过物理吸附或者化学检核的方式固定捕获抗体,溶液中抗原分别与标记抗体和捕获抗体结合,进而形成捕获抗体-抗原-标记抗体三元复合物,通过对标记抗体上标记物的检测,实现对抗原的定量检测。这种技术已经广泛应用于临床、环境、视频、海关等的检测中。当被测抗原的浓度较低时,双抗体夹心免疫检测的信号强度随待测抗原浓度增加呈现单调递增的关系;而当标本中的待测抗原浓度较高时,双抗体夹心免疫检测的信号强度将脱离现有线性关系增长缓慢,当标本中的待测抗原浓度继续升高时,信号强度逐渐趋于平缓甚至出现降低,从而使免疫检测失去准确定量高浓度待测抗原的能力,造成假阴性结果导致误诊。
上述现象称为HOOK效应,产生原因是因为当待测样本中抗原浓度很大时,一部分待测抗原与标记抗体部分处于游离状态,然后一起向检测线层析,占据检测线,与标记抗体偶联的抗原与检测线反应减少,因此检测线上信号值增长缓慢甚至出现降低的情况。
为减小夹心免疫分析中上述现象的影响,很多人做了研究工作,通过在同一反应体系中的两种可相互区别的固相载体上分别通过双抗体夹心法和竞争法测定样品浓度,如专利CN105785009B中提出一种定量检测试纸条,在标记垫上涂覆有与待测样本对应并与其发生抗原抗体反应的标记抗体或抗原,在检测线上包被有与待测样本发生抗原抗体反应的相应抗体或抗原;在质控线上包被与标记垫上的标记抗体或抗原发生抗原抗体结合反应的相应抗原或抗体,通过计算检测线与质控线的信号值之比得到检测用标准曲线,上述方法在一定范围内扩宽了定量检测的范围,但是由于质控线上用于捕获标记抗体或抗原的为固定抗原或抗体,而固相抗原或抗体与待测样本中的液相抗原或抗体结合标记抗体或抗原的机会是不平等的,接近顺序饱和法,即只有与待测抗原或抗体结合后剩余的标记抗体或抗原才会与固相抗原或抗体结合,当待测样本浓度超出一定范围后,质控线上的信号变化会趋向于平缓,其与检测线信号值的比值梯度变化不明显甚至出现下降,而针对一些大分子蛋白如HCG(人绒毛膜促性腺激素)、人免疫球蛋白如IgE、IgG等,其强阳性样本中的含量会高出正常人体内含量的103个数量级以上。以HCG为例,在一般孕妇怀孕时浓度可达到200000mIu/ml,远远超过了上述技术方案中的检测范围,现有的其他HCG定量检测试剂,线性范围均在10000mIu/ml附近,更高范围的检测均需要多步稀释至线性范围内进行检测后再通过乘以稀释倍数来计算得到理论的浓度值,不仅检测步骤复杂,容易形成操作误差,且临床上理论推导的结果会受到稀释液基质效应等因素的影响,而产生与真实高值样本含量的偏差。而HCG在孕早期,每日会成倍数增长,一般可达到200000miu/ml,且孕早期的HCG变化呈日倍增的情况,规律倍增能够有效判断胚胎发育情况,避免葡萄胎、宫外孕或胚胎发育不良等情况,故为确保检测方法简便、精确,对临床样本直接检测并显著地扩宽其检测范围,在免疫学检测领域至关重要。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足,提供一种扩展定量检测范围的试剂盒和检测方法,以克服现有的大分子蛋白定量检测范围窄的问题。
为实现上述目的,本发明的技术方案是这样实现的,一种扩展定量检测范围的试剂盒,包括载体,所述载体上设置有标记位点、检测位点(T线)和质控位点(C线),所述标记位点含有与样本抗原发生特异性反应被信号粒子标记的抗体(以下简称标记抗体),T线固定有与样本抗原发生特异性反应的捕获抗体,捕获抗体是由两种与样本抗原结合能力不同的抗体混合包被而成,C线固定有与标记抗体发生双抗体夹心反应的抗原-抗体偶联物。
所述信号粒子包括但不限于荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒,其中荧光粒子又包括荧光微球、时间分辨荧光微球、量子点荧光微球,本发明中优选荧光微球,荧光微球的粒径为100-800nm。
所述标记抗体和捕获抗体分别结合样本抗原的不同点位,形成标记抗体-抗原-捕获抗体偶联物(双抗体夹心);C线上的抗原-抗体偶联物与标记抗体结合形成标记抗体-抗原-抗体偶联物。
T线上的捕获抗体中,结合能力高的抗体与结合能力低的抗体混合摩尔比例为1:1-1:20。
C线上的抗体可以为T线上捕获抗体的任一一种,也可以为不同的捕获抗体。
所述样本通常是指被怀疑含有待测抗原的生物材料,包括但不限于血液、尿液等,样本中的抗原具有两个或多个结合位点,即样本抗原为大分子蛋白。
所述载体优选微流控芯片,包括相互扣合的盖片和底片,盖片沿样本流动方向分别设有加样孔、微通道和废液槽,底片正对微通道的区域沿样本流动方向依次设置有标记区和检测区,所述T线和C线沿样本流动方向依次设置在检测区内,样本经加样孔流入微通道,流经标记区后进入检测区进行生化反应,最终流入废液槽后终止反应,反应时间为2-10min。
所述载体上的T线和C线预先包被有亲和素/链霉亲和素用于偶联生物素化的抗体或抗原,T线上的捕获抗体为生物素化的两种结合能力不同的抗体按比例混合均匀而成,C线上的抗原-抗体偶联物为生物素化的单克隆抗体和游离的抗原偶联而成。
所述C线上抗体与抗原的摩尔比为1:0.5-1:5。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒(载体上设置标记位点、T线和C线)定量检测大分子蛋白的检测方法:
S1,标准曲线的绘制:将一系列浓度的待测样本标准品分别用上述试剂盒反应2-10分钟,得到所述T线和C线的信号值之比;重复上述步骤3-5次,得到T线和C线的信号值之比的平均值,以其为纵坐标、待测样本标准品的浓度为横坐标得到标准曲线;
S2,向试剂盒中滴加定量的待测样本,使样本与本发明中的试剂盒反应2-10分钟后,得到T线和C线的信号值之比;
S3,通过对比标准曲线上的纵坐标值得到待测样本的浓度。
上述检测方法中步骤S3采用预设有步骤S1中得到的标准曲线的相应定量检测仪。
作为本发明的另一种实现手段,所述载体上只设置有T线和C线,使用试剂盒时,先将定量的标记抗体与待测抗原混合后再滴加到所述载体上,T线固定有与样本抗原发生特异性反应的捕获抗体,捕获抗体是由两种与样本抗原结合能力不同的抗体混合包被而成,C线固定有与标记抗体发生特异性反应的抗原-抗体偶联物。
利用上述试剂盒定量检测大分子蛋白的检测方法:
S1,标准曲线的绘制:将一系列浓度的待测样本标准品分别与定量的标记抗体溶液混合形成混合溶液,将上述混合溶液流经试剂盒反应2-10分钟,得到所述检测位点和质控位点的信号值之比;重复上述步骤3-5次,得到检测位点和质控位点的信号值之比的平均值,以其为纵坐标、待测样本标准品的浓度为横坐标得到标准曲线;
S2,将待测样本与标记抗体混合,形成二者的混合溶液;
S3,向试剂盒中滴加定量的待测样本,使样本与本发明中的试剂盒反应2-10分钟后,得到检测位点和质控位点的信号值之比;
S4,通过对比标准曲线上的纵坐标值得到待测样本的浓度。
对于本领域技术人员来说,即使不明了本发明的检测原理,同样能够实施、再现本发明,即本发明的检测原理是否清楚明了,都不影响本发明的实施和再现。本发明的一种扩展定量检测范围的试剂盒,其检测原理在于:
样本检测时,样本依次流经标记位点、T线和C线,样本抗原在标记位点与标记抗体结合形成带标记的抗原-抗体偶联物然后流动至T线被捕获抗体捕获形成带标记的抗体-抗原-抗体偶联物滞留在T线产生信号值,而未被结合的标记抗体流动至C线与C线上的抗原-抗体偶联物结合产生信号值。
T线上包被物质为对样本抗原表现出结合能力不同的两种抗体混合物。结合能力强的抗体在样本抗原较低浓度或痕量浓度时,表现出较高的捕获能力,但是由于其结合能力强,对样本抗原浓度的变化相对灵敏,若仅使用结合能力强的抗体,在样本浓度超出一定范围时,易提前进入等价带或HOOK区,使T/C值的梯度变化变缓,检测精度降低,而低结合力抗体对低浓度样本抗原表现出低的捕获能力或者捕获抗原的低敏感性,随着样本浓度增加,其低结合力的特性较好的延迟了HOOK效应的发生,使T线的信号值波峰后延,这样有利于T/C比值的线性范围延展,初步扩宽了试剂盒的检测范围;
C线采用抗原-抗体偶联,相对于直接包被抗原而言,抗原被定向包被于检测区,形成固相包被-抗体-抗原这种更为立体的空间构象,这样使得抗原暴露出的其他表位呈空间有序性排列,且这种空间有序性能够在这种立体的空间构象中充分展现,对更高浓度的待测样本而言,在与样本抗原竞争标记抗体时抗原-抗体偶联物能表现出更显著的竞争梯度,使C线捕获标记抗体的量与样本浓度的负相关性呈现出更有序的梯度下降,并持续至更高浓度时,仍表现出十分显著的竞争关系和灵敏性。进而显著地扩展C线负相关性信号的宽度。最终通过T线与C线的信号值之比显著提高样本的检测范围。
通过上述技术方案得到的一种扩展定量检测范围的试剂盒和检测方法,其有益效果是:
1、在T线上包被捕获抗体、C线上包被抗原-抗体偶联物,通过检测仪检测,并计算T/C信号值之比与标准曲线对照得到对应的样本浓度,比值计算不设置HOOK点,为检测仪通用计算方式,较现有技术,计算方式更简单,且比值计算还能够显著降低试剂的系统内误差,提高检测的精密度。
2、在T线上包被结合能力高低不同的两种抗体混合物,使T线即延迟了HOOK效应的发生,同时又不影响T线的灵敏度;进一步有利于T/C比值的线性范围延展。
3、C线采用抗体-抗原偶联定向包被法,相对于C线单纯包被抗原而言,抗原表露出的表位空间构象更为立体、有序、充分,当样本浓度较高时,表现出更显著的竞争梯度,从而有效克服T线上HOOK效应对检测结果的影响,使检测范围得到更显著地扩展。
4、实现了一步加样检测,无需倍比稀释,操作简单,避免了因稀释产生的误差,精确度高。
附图说明
图1是采用实施例1和对比例1中的微流控芯片测定HCG的T线信号值与HCG浓度关系的曲线图。
图2是采用实施例1和对比例1的微流控芯片测定HCG的C线信号值与HCG浓度关系的曲线图(样本浓度范围在10-60000mIU/mL)。
图3是采用实施例1和对比例1的微流控芯片测定HCG的C线信号值与HCG浓度关系的曲线图(样本浓度范围在60000-200000mIU/mL)。
图4是采用实施例1和对比例1的微流控芯片测定HCG的T/C信号值比随HCG浓度变化的趋势图及线性拟合曲线。
图1-图4中,横坐标为信号值,纵坐标为样本浓度。
具体实施方式
需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、操作简便、诊断快速的定量检测大分子蛋白的试剂盒和检测方法,为使本发明的目的、技术方案及效果更加明确、清楚,以下结合实施例及附图对本发明进一步详细说明。
实施例1:用本发明中的试剂盒检测样本中HCG抗原浓度
1、材料和仪器
样本浓度范围在10-200000mIU/mL之间、样本序号为N1-N13的13组HCG抗原标准样本(由HCG抗原稀释而成,具体浓度见表1)。
天津中新科炬生物制药股份有限公司生产的F10Pro型荧光免疫分析仪,计时器(如秒表)和移液器。
根据本发明改进技术方案制备的用于检测HCG抗原浓度的微流控芯片(所述芯片包括相互扣合的盖片和底片,盖片沿样本流动方向分别设有加样孔、微通道和废液槽,底片正对微通道的区域沿样本流动方向依次设置有标记区和检测区,标记区固定干燥有荧光微球标记的HCG抗体,所述T线和C线沿样本流动方向依次设置在检测区内,其中T线包被有与标记区HCG抗体结合位点不同的两种HCG抗体,其中一种结合能力高,另一种结合能力低,摩尔比为1:3;C线包被有摩尔比为1:3的HCG抗体与抗原。
2、方法
取上述不同浓度的HCG抗原标准样本35μL滴加到微流控芯片上,4分钟后于荧光免疫分析仪中判读检测结果。每个浓度点重复测定3次取平均值,分别记录T线信号、C线信号、T/C比值。
3、检测结果
表1 本发明检测结果
检测结果如表1所示,HCG样本浓度在小于10000mIU/mL时,T线随着样本浓度的增加而增大,大于10000mIU/mL时,信号值出现短暂的等价带(平缓期),随后出现HOOK效应,见图1;C线在小于10000 mIU/mL时,信号值在检测样本相对浓度低的情况下,C线能够保持相对稳定的信号值,样本浓度在10000mIU/mL-60000mIU/mL时,C线信号值随着样本浓度增加逐渐降低,呈规则负相关弧线,见图2;样本浓度大于60000 mIU/mL时C线信号值仍然随样本浓度升高而显著降低,见图3;利用T线信号值与C线信号值的比值进行计算,结果显示检测范围在10-200000mIU/mL之间时,T/C随着样本浓度增加不断升高,体现出良好的梯度,见图4(线性拟合R值为:0.999)。
对比例1:用现有技术制备的试剂盒检测样本中HCG抗原浓度
1、材料和仪器
样本序号为N1-N13、样本浓度范围在10-200000mIU/mL之间的HCG抗原标准样本(由HCG抗原稀释而成,具体浓度与实施例1中的分别对应)。
天津中新科炬生物制药股份有限公司生产的F10Pro型荧光免疫分析仪,计时器(如秒表)和移液器。
采用现有技术制备的用于检测HCG抗原浓度的微流控芯片(所述芯片包括相互扣合的盖片和底片,盖片沿样本流动方向分别设有加样孔、微通道和废液槽,底片正对微通道的区域沿样本流动方向依次设置有标记区和检测区,标记区固定干燥有荧光微球标记的HCG抗体,所述T线和C线沿样本流动方向依次设置在检测区内,其中T线包被有与标记区HCG抗体结合位点不同的HCG抗体,浓度为0。08mg/ml,C线包被有HCG抗原,浓度为0.03mg/ml。)
2、方法
取上述不同浓度的HCG抗原标准样本35μL滴加到微流控芯片上,4分钟后于荧光免疫分析仪中判读检测结果。每个浓度点重复测定3次取平均值,分别记录T线信号、C线信号、T/C比值。
3、检测结果
表2 对比方法检测结果
检测结果如表2所示,T线信号值随样本浓度变化趋势如图1,均表现为正相关-等价带-负相关HOOK,不同的是,T线信号值随样本浓度增加在5000mIU/mL以内出现明显上升,大于5000mIU/mL时出现短暂的等价带随后产生HOOK效应,见图1;样本浓度在1000mIU/mL以内时,C线信号值急速下降,样本浓度在1000-60000mIU/mL时,C线信号值下降坡度减缓,但总体仍呈下降趋势,见图2;样本浓度在大于60000mIU/mL时,C线信号值下降趋势变化不显著,见图3;利用T线信号值与C线信号值的比值进行计算,样本浓度范围在10-10000 mIU/mL时,线性趋势良好,样本浓度范围在10000-60000mIU/mL时,T/C仍继续增长但趋势变缓,样本浓度超出60000mIU/mL时,T/C呈下降趋势,不再适用于HCG的定量检测,见图4。
综上,本发明更能突破性的扩展HCG的检测范围,对于孕周期出现高值样本,不用采用市场上超出检测范围通过采用倍比稀释进行计算推断浓度值的方式,本方法能够采用一步加样,通过仪器进行T/C计算以检测浓度范围在10-200000mIU/mL内的样本,该方法对目前市场上HCG上限范围10000mIU/mL附近可扩展到200000 mIU/mL,扩展了一个数量级的检测范围,效果显著。
本方法还适用于高浓度抗体如IgE、IgG的样本检测,均可扩展检测的线性范围。
上述技术方案仅体现了本发明技术方案的优选技术方案,本技术领域的技术人员对其中某些部分所可能做出的一些变动均体现了本发明的原理,属于本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种扩展定量检测范围的试剂盒,包括载体,所述载体上设置有标记位点、T线、C线,其特征在于,所述标记位点含有与样本抗原发生特异性反应的被信号粒子标记的标记抗体,T线固定有与样本抗原和标记抗体发生双抗体夹心反应的捕获抗体,所述捕获抗体由与样本抗原的结合能力高低不同的两种抗体混合而成,C线固定有与标记抗体发生双抗体夹心反应的抗原-抗体偶联物。
2.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于,所述载体为微流控芯片,包括相互扣合的盖片和底片,盖片沿样本流动方向分别设有加样孔、微通道和废液槽,底片正对微通道的区域沿样本流动方向依次设置有标记区和检测区,所述T线和C线沿样本流动方向依次设置在检测区内,样本经加样孔流入微通道,流经标记区后进入检测区进行生化反应,最终流入废液槽后中止反应,反应时间为2-10min。
3.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于,所述T线上结合能力高的抗体与结合能力低的抗体混合摩尔比例为1:1-1:20。
4.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于,所述C线上抗体与抗原的摩尔比为1:0.5-1:5。
5.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于, C线上的抗原-抗体偶联物为生物素化的抗体和特异性抗原偶联而成。
6.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于,所述载体上的T线和C线预先包被有亲和素/链霉亲和素。
7.根据权利要求1所述扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于,所述信号粒子包括但不限于荧光粒子、磁微粒、乳胶微粒中的一种。
8.一种定量检测大分子蛋白的检测方法,其特征在于,采用权利要求1-7中任一试剂盒进行检测,所述检测方法包括如下步骤:
S1,标准曲线的绘制:将一系列浓度的待测样本标准品分别用上述试剂盒反应2-10分钟,得到所述T线和C线的信号值之比;重复上述步骤3-5次,得到T线和C线的信号值之比的平均值,以其为纵坐标、待测样本标准品的浓度为横坐标得到标准曲线;
S2,向试剂盒中滴加定量的待测样本,使样本与试剂盒反应2-10分钟后,得到T线和C线的信号值之比;
S3,通过对比标准曲线上的纵坐标值得到待测样本的浓度。
9.一种扩展定量检测范围的试剂盒,其特征在于,采用权利要求1-7中任一试剂盒,取消载体上标记位点,所述载体上只设置有T线和C线,T线固定有与样本抗原发生特异性反应的捕获抗体,捕获抗体是由与样本抗原的结合能力高低不同的两种抗体混合包被而成,C线固定有与标记抗体发生特异性反应的抗原-抗体偶联物。
10.一种定量检测大分子蛋白的检测方法,其特征在于,采用权利要求9中的试剂盒进行检测,所述检测方法如下步骤:
S1,标准曲线的绘制:将一系列浓度的待测样本标准品分别与定量的标记抗体溶液混合形成混合溶液,将上述混合溶液流经试剂盒反应2-10分钟,得到所述T线和C线的信号值之比;重复上述步骤3-5次,得到T线和C线的信号值之比的平均值,以其为纵坐标、待测样本标准品的浓度为横坐标得到标准曲线;
S2,将待测样本与标记抗体混合,形成二者的混合溶液;
S3,向试剂盒中滴加定量的与标记抗体混合的待测样本,使样本与试剂盒反应2-10分钟后,得到T线和C线的信号值之比;
S4,通过对比标准曲线上的纵坐标值得到待测样本的浓度。
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2022
- 2022-03-07 CN CN202210216477.8A patent/CN114324901B/zh active Active
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