JPS6315165A - 均質速度イムノアツセイにおける拡張された表面の検量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、イムノアッセイに関し、さらに詳しくは拡張
された表面（ｅｘｔｅｎｄｅｄ　　５ｕｒｆａｃｅ）、
例えば、均質速度イムノアッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏ
ｕｓ　　ｒａｔｅ　　ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）におい
て使用するマイクロウェル（ｍｉ　ｃ　ｒ　ｏｗｅ　ｌ
　ｌ）の拡張された表面を検量する方法を提供する。

イムノアッセイは、一般に、流体、例えば、体液の試料
、例えば、尿、血液、大脳を髄液、それらの成分などの
中の配位子（ｌｉｇａｎｄ）または配位子結合相手を検
出する方法の一般的部類を呼ぶ。このような技術は、抗
体と抗原またはハプテン、以後それぞれおよび互換的に
配位子結合相手（ｌｉｇａｎｄ　　ｂｏｎｄｉｎｇ　　
ｐａｒｔｎｅｒ）または配位子（ｌｉｇａｎｄ）、　と
の間の反応の特異性に預る。知られているように、体液
試料中のこのような物質の検出は、個体の卸康状Ｔ；の
臨床的指示を提供し、そして種々の病気の状態の診断お
よび予防を促進する。

したがって、臨床的に関連する情報をできるだけ早期の
提供するために、感度および特異性を増大するアッセイ
の技術的開発が絶えずなされている。これらの技術的開
発とともに、同一試料の反復アッセイを実施するとき生
ずるもののような経費を減少することが要求されている
。アッセイの反復は、信傾するに値する結果を生成する
ために十分な量を欠くアッセイの１種または２種以上の
成分を見張るためにしばしば実施される。

多くのイムノアッセイは拡張された固体の表面を使用し
、この表面はその上に検出すべき配位子または配位子結
合相手を溶液から捕捉するために生物学的に活性な分子
、すなわち、配位子または配位子結合相手またはその上
に固定化された他の型の受容体を有する。拡張された表
面は、本発明の目的に対して、すべての非粒子の表面、
すなわち、多数のビーズ、例えば、ラテックス粒子など
に関連するものを排除するすべての表面を意味すると定
義すべきである。したがって、このような拡張された表
面は、それらの個々の組成または形状を無視して、例え
ば、マイクロタイター型ウェルの表面、パドル（ｐａｄ
ｄｌｅ）の表面、試験管、顕微鏡のスライドまたは他の
このような表面を包含する。

例えば、尿中のｈＣＧについての典型的なサンドイッチ
アッセイにおいて、表面は、ｈＣＧの第１エピトープと
の４．ν異性捕捉反応のために、ポリクローナルまたは
モノクローナルの起源の抗体をその使用に固定化して有
することができる。その後、ｈＣＧとまた反応性である
が、第２エビ）−ブ部位に存在し、そして関連した検出
可能な部位を有する：ｔＳ２抗体を捕捉したｈＣＧと反
応させる。あるいは、溶液相反応は固相または捕捉反応
の前に、あるいはそれと同時に実施することができる０
次いで、表面上に捕捉された。あるいは溶液相から除去
された標識を検出し、モしてもとの試料中のｈｃＧの存
在に定量的にあるいは定性的に関係ずけることができる
。

しかしながら、このような拡張された表面に関連する共
通する困難は、このような表面上の生物学的に活性な分
子の固定化（被覆、結合または適用）に関係する技術的
困難から生ずる。今日まで、拡張された表面上のこのよ
うな分子の固定化は、不一致の結合強さおよび特異性を
有する分子の表面被膜を生成した。さらに、表面の物質
は、しばしば、物理的不均質性を現わし、これは表面に
おける、あるいは表面を通る相互作用を測定するとき不
一致を生ずる。

本発明の１つの面において、本発明は、固定化された生
物学的に活性な分子の結合活性または４シ異性における
表面対表面の作用を実質的に排除する方法を提供する。

本発明の他の面において、イムノアッセイにおいて使用
する拡張された表面を形成する物質に関連することがで
ある、物理的不均質性の作用を同定および／または実質
的に排除する方法を提供する。

認識されているように、拡張された表面を使用し、均質
的な方法でなされるイムノアッセイはほんのわずかであ
る、すなわち、操作を用いないイムノアッセイは水相お
よび固相の分離を含む０分離工程を用いる方法、溶液か
ら溶液への動き、遠心などを用いる浸漬法は不均質と呼
ばれる。不均質イムノアッセイは、一般に１時間を消費
しかつ潜在的に誤差を導入しうるので、分離工程により
要求される追加の操作のたに、好ましさに劣る。

不都合なことには、拡張された表面を使用する均質アッ
セイは、拡張された表面上に捕捉されなかった標識物質
を無視するとき固有な困難を生ずるので、通常要求され
る感度のレベルで実施することは困難である。

均質イムノアッセイを使用して、要求される操作工程の
数を減少することが望ましい。また、そうでなければ終
点が発生するまでの待機によって影響をされうる結果を
より速く達成するために、速度イムノアッセイを実施す
ることが望ましい。

均質イムノアッセイおよび速度イムノアッセイの組み合
わせは、溶液相の反応または溶液相中に分散した粒状物
質の表面上で起こる反応を利用することによって普通に
達成されてきた。均質イムノアッセイおよび速度イムノ
アッセイの組み合わせは、拡張された固体の表面では普
通に達成されてきていない、これが達成されない主要な
理由の１つは、表面体表面の変動を補償することが困難
であるからである。

本発明の１つのなお他の面は、拡張された表面に関連す
る表面対表面の不均質性の作用を克服し、これによって
拡張された表面を利用しかつ反応速度論に基づいて実施
される均質イムノアッセイ、例えば、速度イムノアッセ
イをより大きい精度で実施できる方法を提供することで
ある。

さらになお他の面は、同一表面上でイムノアッセイで実
施する前に拡張された表面の活性を標準化し、これによ
ってイムノアッセイの結果を補正できる方法を提供する
ことである。

本発明の原理および面に従えば、表面上の生物学的に活
性な分子の被膜および拡張された表面それ自体に関連す
る物理的不均質性の作用の一方または両者の不一致を同
定しかつ補正する方法が提供される。これらの方法は、
理想的には試料のイムノア、ツセイを実施する前に、問
題の拡張された表面上で検量アッセイ（ｃａｌｉｇｒａ
ｔ　ｉ　ｏｎａｓｓａｙ）を実施することを含む。

最も有用であるためには、本発明の検量法は、有利には
、拡張された表面上の生物学的に活性な分子の活性の消
費または消耗を回避し、これによって同一拡張された表
面上の実際のアッセイの引続〈実施を可能とする。この
方法は、有利には、反応速度論のアッセイに適用し、そ
して一般に、理想的には同一アッセイの実施前に、既知
量の検量試薬の添加を含む。検量試薬および検量アッセ
イは試料の添加後に実施できるが、これは高い範囲の試
料が検量試薬の添加前に表面を消耗することがあるので
、好ましさに劣る。

反応速度論すなわち速度イムノアッセイでは、好ましい
方法は既知の活性の検量試薬を添加し、次いでこの検量
試薬は拡張された表面上に固定化された生物学的に活性
な分子によって検出可能に捕捉されうるようになるであ
ろう、この添加は試料の添加前に実施し、これによって
拡張された表面上の固定化された生物学的に活性な分子
の活性および均一性は同一の拡張された表面上の試料の
イムノアッセイの実施前に評価することができる。使用
する検量試薬の量は十分に少なくし、これによって拡張
された表面上の固定化された生物学的に活性な分子が検
量反応によって消耗されないようにしなくてはならない
。検が反応を試料のアッセイ前あるいは、好ましさに劣
るが、試料のアッセイに引続いて実施するとき、試料の
イムノアッセイにおいて使用するレベルと異なるレベル
で使用する必要はない。

本発明の方法は、有利には、水性試料からの配位子また
は配位子結合相手の捕捉のための拡張された表面を使用
する種々の異なるイムノアッセイ系を使用するとき有用
である。知られているように、種々の技術はこのような
捕捉反応のの発生を同定するために誘導されてきた。一
般に、このような方法は捕捉反応により形成された生成
物へ標識を直接にあるいは間接に取付けることに頼る。

種々の適用可能な標識は、検出技術の種々の族を生み出
し、このような技術は、例えば、拡張された表面上の捕
捉された蛍光標識の検出、光散乱体における分裂を含む
変更された光学的パラメーターの測定、透過量、反射量
、および検出可能な生成物の転化容量に対する酵素の基
質のレベルによる酵素標識の検出を包含する（例えば、
シュラ）（Ｓｈｕｔｔ）らの係属中の米国特許出願第８
７９．２３６号：カメントスキー（Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ
）の米国特許第４．４８７．８３９号；クロニック（Ｋ
　ｒ　ｏ　ｎ　ｉ　ｃ　ｋ）らの米国特許出願第３．９
３９．３５０号；ニリンゲス（ＥｌｉｎｇＳ）らの米国
特許出卯第４，５５７，８６１号参照）、このような種
々の技術に関する知識の一般的レベルは、ここで詳細に
述べことが不必要であるように進歩した状態にある。し
かしながら、当業者は容易に理解するように、すべての
このような技術が活性成分をそれに関連して有する拡張
された表面に頼る程度に、本発明の方法はこれらの技術
に適用することができる。

本発明は反応速度論すなわち速度イムノアッセイのため
に最も有用である。このようなイムノアッセイでは、理
想的には、配位子または配位子結合相手についてのアッ
セイの前に、決定すべき既知のレベルの配位子または配
位子結合相手からなる検量試薬を使用する実質的に同一
のイムノアッセイ手順を実施し、前記配位子または配位
子結合相手は直接に、あるいは追加のアッセイ試薬で標
識する。再び、理想的にはほんの少量の検量物質を使用
し、こうして拡張された表面の活性が試料のアッセイの
実施前にこのような反応によって有意に減少しないよう
にする。

典型的には、そして実施例としてｈＣＧアッセイを利用
して、汀通の速度イムノアッセイは、検出すべきｈＣＧ
を含有することが疑われる試料を標識試薬と一緒に拡張
された表面、例えば、マイクロウェルに、伝統的サンド
イッチアッセイに適する条件下に添加することによって
実施されるであろう。試薬の添加および混合のための気
泡および他の全体の不均質性を排除が排除される短い待
機期間（一般に約５分より短い）後、連続的にあるいは
複数の連続のΔｉｌｌ定によって表面上の標識の蓄積を
測定する。時間の進行とともに、１系列のデータ点を蓄
積して、例えば、標へりの曲線適合技術による曲線の計
算、およびそれぞれの傾斜の決定を可能とする。典型的
には、曲線の傾斜および／または終点の内挿を別々にあ
るいは組み合わせて利用して、試料中のｈＣＧを定量的
にあるいは定性的に決定することができる。とくに配位
子または配位子結合相手が非常に低い濃度で存在すると
き、配位子または配位子結合相手を使用して発生するこ
とがある、汀通の終点イムノアッセイの実施が時間を消
費し過ぎるとき、このような速度イムノアッセイはこと
に好ましい。

理解されるように、マイクロウェルまたは他の拡張され
た表面への試料または試薬の添加の体積に小さい差、マ
イクロウェルの表面上の固定化された生物学的に活性な
分子の活性レベルの小ざい差、イムノアッセイの含まれ
る混合、インキュベーションまたは他の機械的工程にお
いて観Ｊｌｌ！できない差によって誘発される変動、な
らびにマイクロウェルの材料自体の物理的不均質性は１
個々にあるいは集合的に、試料のイムノアッセイの決定
に関して誤差の源を形成することがある。

したがって、このような問題を克服するおよび／または
克服できない拡張された表面の欠陥のとんでもない場合
を少なくとも同定するために、ここでは理想的な速度の
均質イムノアッセイは、まず、同一拡張された表面上の
試料のアッセイの実施前に、検量試薬を利用する検量ア
ッセイを実施することによって、本発明の検量法を用い
るであろう、このような検量試薬は、ｈＣＧ試料の場合
において、既知量の標識ｈＣＧ、既知量のｈＣＧおよび
既知量の標識試薬を含むことができるであろう。このよ
うな検量物質は、拡張された表面、例えば、ウェルに、
試料のアッセイそれ自体を引続いて実施するとき用いる
条件と実質的に同一の条件下に添加する。しかしながら
、前に示したように、検量試薬は、理想的には、試料の
アッセイのあっせいに実施されるが、検量反応を試料の
アッセイ後にあるいは、好ましさに劣るが、試料のアッ
セイと同時に実施することができ、ただし検量および試
料のアッセイが個々に監視できるように、検出可能な異
なる標識を使用する０次いで、捕捉された標識の測７を
ある期間の間実施し、こうして速度を汀通の曲線適合技
術によって計算できるようにする。検量試薬の添加量は
既知であるので、次いで計算された傾斜または他の速度
の指示は既知の活性によって補正し、これによって特定
の拡張された表面の活性を標準化することができる。

その後、試料を同一の拡張された表面またはマイクロウ
ェルに添加し、そして標準の標識捕捉曲線の測定を再び
実施する。最終の配位子または配位子結合相手の決定は
、好ましくは、検量アッセイの間に決定された補正因子
を含むであろう。そうでなければ非直線性を導入するで
あろう拡張された表面を消耗させないという条件下に、
線形補正因子を適用するよく知られた数学的方法は、検
量アッセイの結果に基づいて試料のアッセイの適用され
るであろう０例えば、検量アッセイが標準から観測され
た速度から１０％だけ低い速度を生成した場合、同一表
面からの試料のアッセイの結果は１０％によって処理さ
れるべきである。検量は、もちろん、各ウェルについて
特異的であり、これによってすべてのウェルからのすべ
ての結果は、ウェル間の特異性、活性、または物理的差
にかかわらず、比較可能とすることができる。

検量試薬の添加量は、既知の量または活性レベルに対し
て最適に調節され、ここで一般に拡張された表面表面か
ら一般に期待される最大の活性レベル、試料中に記載す
べき配位子または配位子結合相手のレベルの範囲、およ
び円滑に検出すべき表面上に固定化しなくてはならない
標識した検量試薬の量を考慮する。当然、検量試薬と配
位子または配位子結合相手との間の固定化結合部位につ
いての競合の影響を回避できない場合、好ましくはそれ
を減少し、これによって、とくに試料および検量のアッ
セイを同時に実施する場合、それに応じて検量活性を調
節することが要求されるであろう。あるいは、適当−構
成した標準に基づいて、試料のイムノアッセイの結果の
補正にこのような競合を含めることができるであろう。

この方法は、有利には、とてつもない物理的、特異性ま
たは活性の不均質性の同定を可能とし、そしてこのよう
な不均質性によって４発される跨叉が検量アッセイの間
に可能なレベルを越えるとき、このような不均質性の排
除を可能とするであろう。適当なアラームを含めて、手
動により、あるいは自動化した場合、装δにより、その
特定のウェルの排除を指示することができる。

本発明の拡張された表面を使用しかつ検量法を利用する
速度均質イムノアッセイの実施するための好ましい手順
を、下に要約する。固定化された生物学的に活性な分子
を有する拡張された表面を準備する。生物学的に活性な
分子は、その結合相手、試料中に存在する配位子または
配位子結合相手と特異的に反応性であり、そしてこのよ
うな物質は検量試薬中に既知量の範囲内で存在する。既
知量の配位子または配位子結合相手またはそれらのそれ
ぞれの類似体からなる検量試薬は、イムノアッセイを適
当に促進する条件下に拡張された表面と接触させる。検
量試薬は、さらに、前記配位子または配位子結合相手と
直接関連する標識を含むか、あるいは標識を追加の配位
ｆ・または配位ｆ結合相手の反応を経て取付けるときに
起こるような間接的に関連する場合、このような追加の
標識した検量試薬を添加する。はぼ５分の待機時間を経
過させて、気泡および他の混合の不均質性を消失させる
。理解されるように、捕捉された標識の検出に関連した
シグナルをノイズのバックグラウンドと区別することが
できるときを決定することが可能であるとき、待機時間
を調節することができる。シグナル対ノイズの比を改良
するためのこのようなシグナルのサンプリングおよびシ
グナルのコンディショニングの面は、当業者にとって明
らかな事項である。待機時間後、シグナルは連続的に、
あるいはそれらの間の内捜を可能とするために十分なサ
ンプリング速度で監視して、普通の曲線適合または同様
な手順を設定し、そしてそれから傾斜または速度を決定
することができる。その速度は検量試薬中の配位子また
は配位子結合相手のレベルに依存し、そしてまた、試験
する拡張された表面の活性、特異的および物理的完全さ
を反映するであろう、試料および標識試薬は拡張された
表面と実質的の同一のイムノアッセイ条件下に接触させ
る。（あるいは、標識試薬は試料より前に表面に添加す
ることができるか、あるいは試料と前もって混合し、そ
してこの混合物を表面に添加することができる。）他の
待機時間後、捕捉された標識を、再び連続的にあるいは
完結的基準で十分な時間の量検出して、曲線適合技術お
よび試料速度の決定をできるようにする。利用可能な種
々の数学的操作によって、既知のレベルの配位子に関連
する検量速度を使用して試料のアッセイにおいて決定し
た速度を補正し、こうして試料中の配位子または配位子
結合相手の精確なアッセイを誘導することができる。

本発明の方法をｈＣＧの試料によって説明したが、容易
に理解されるように１本発明の方法はそのようにまった
く限定されない０本発明の方法は拡張された表面を利用
する任意の配位子または配位子結合相手の検出のための
事実上任意の均質速度アッセイとともに使用することが
でき、そしてそれについて類似の分子、例えば、実質的
に同様な結合特性を有する分子を得、そして、直接また
は間接に標識して検量試薬として使用できる。同様に、
特定の標識を述べてきたが、本発明はすべての型の標識
を用いる利用に容易に拡張することができ、唯一の限定
はそれらの標識が検出可能であるということである。こ
れらの置換および他の置換、例えば、試料のイムノアッ
セイに関係する検量アッセイの実施の順序、検量アッセ
イを含む使用すべき試薬、および利用する実際の数学的
補正処理の選択は当業者にとって明らかであろう。

すべてのこのような変更は同等であり、そして本発明の
原理および特許請求の範囲内に包含されるものと認めら
れるべきである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、標識した成分を利用しかつ拡張された表面を用いる
   イムノアッセイにおいて使用するための方法であって、
   前記拡張された表面は配位子または配位子結合相手の検
   出のために、その上に配置された、固定化された生物学
   的に活性な分子を有し、前記配位子または配位子結合相
   手は前記分子と特異的に反応性であり、前記配位子また
   は配位子結合相手は前もって、あるいは引続いて検出可
   能な標識で標識され、前記方法は、同一の拡張された表
   面上で検量アッセイを実施する工程を含んでなり、前記
   拡張された表面上で前記イムノアッセイは実施され、前
   記検量アッセイは既知の活性レベルの検量試薬を使用し
   、これによって拡張された表面上の活性レベルおよび／
   またはその分布をアッセイすることができることを特徴
   とする方法。 ２、拡張された表面の活性レベルを使用してイムノアッ
   セイの結果を補正する特許請求の範囲第１項記載の方法
   。 ３、イムノアッセイは速度イムノアッセイであり、そし
   て検量アッセイは前記速度イムノアッセイの前に実施さ
   れる特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、試料のイムノアッセイにおいて固定化された生物学
   的に活性な分子を有する拡張された表面を定性する方法
   であって、前記方法は前記拡張された表面上の前記試料
   のイムノアッセイ前に検量アッセイを実施する工程を含
   んでなり、前記検量アッセイは検量試薬を含み、前記検
   量試薬は既知の活性レベルを有しかつ前記固定化された
   生物学的に活性な分子が活性である場合それと結合する
   ことができると同時に、なお、同一の拡張された表面を
   使用する試料のイムノアッセイの実施を可能とすること
   を特徴とする方法。 ５、前記検量アッセイおよび前記試料のアッセイは速度
   イムノアッセイである特許請求の範囲第４項記載の方法
   。