NO161703B - Proeveinnretning til bestemmelse av en ligand i en flytende proeve ved en homogen immunoanalyse. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrøer prøveinnretning for bruk ved bestemmelse av en ligand i eller ligandbindingskapasiteten av en væskeprøve basert på et spesifikt bindingsanalyseprinsipp, f.eks. immunoanalyse. Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen bæreelementer i fast form hvor det er inkorporert reagenser for homogene, spesifike bindingsanalyser.

Prøveinnretninger i form av teststrimler og lignende analytiske elementer i fast form er blitt vanlig ved analyse av forskjellige typer prøver, spesielt væskeprøver i form av biologiske væsker, industrielle væsker osv., på grunn av bekvemmeligheten og hurtigheten som oppnås ved bruken av dem. Prøvesstrimler utformet for å påvise forskjellige klinisk signifikante forbindelser i biologiske væsker, slik som en serum og urin, har spesielt vist seg å være meget fordelaktige for å bidra til diagnosen og behandlingen av syk-domstilstander hos mennesker og dyr.

Konvensjonelle prøveinnretninger av prøvestrimmeltypen omfatter vanligvis en bærerdel slik som en absorbant eller en porøs matrise, f.eks. papir, hvori det er inkorporert reagenser som reagerer med bestanddelen eller bestanddelene i en væskeprøve som analyseres for å frembringe en påvisbar respons, vanligvis et elektromagnetisk strålingssignal slik som en fargeendring. Prøven som undersøkes bringes i kontakt med den reagensinkoporerte bærerdelen, slik som ved et øyeblikk å dyppe innretningen i prøven eller ved å tilføre en porsjon av prøven til bærerdelen, og responsen observeres eller måles etter en fastsatt reaksjonstid. Den store fordelen ved slike prøveinnretninger er den lettvinte rutinebruken av dem, idet de ikke krever tid eller erfaring for reagenstilsetninger til prøven av en tekniker og idet de gir et lett observerbart eller med instrument lesbart signal. Videre frembringes et lett observerbart eller med instrument lesbart signal hurtig.

Prøvestrimler av forskjellige typer har vært kjent og brukt i mange år på mange forskjellige områder, fra den enkleste pH-prøvepapirinnretning til in vitro-diagnostlske innretninger for påvisningen av forskjellige urin- og blodbestanddeler slik som glukose og protein, små mengder blod osv. (f.eks. som beskrevet i US-PS 3 164 534, 3 485 587 og 3 812 976). Reagensbestanddeler som man finner i slike konvensjonelle prøvestrimler, reagenser med bestanddelen eller bestanddelene som skal bestemmes ved direkte kjemisk reaksjon og har av denne og av andre grunner begrenset følsomhet når de anvendes for på påvise forbindelser som er tilstede i væskeprøver i konsentrasjoner i millimolarområdet eller over.

Utviklingen av spesifike teknikker for bindingsanalyse har derimot frembragt svært nyttige analysemetoder for å bestemme forskjellige organiske forbindelser av diagnostisk, medi-sinsk, miljømessig og industriell viktighet som opptrer i væskemedier ved svært lave konsentrasjoner. Spesifike bindingsanalyser er basert på den spesifike reaksjon mellom liganden, dvs. stoffet som er istand til å bindes og som skal bestemmes, og en bindingsparther for det. Når enten liganden eller dens bindingspartner er et antistoff og den andre er et korresponderende hapten eller antigen, er analysen kjent som immunoanalyse.

Ved konvensjonelle teknikker for spesifik bindingsanalyse kombineres en prøve av væskemediet som skal undersøkes med reagensmidler av forskjellige sammensetninger. Slike sammensetninger inkluderer et merket konjugat som omfatter en bindingskomponent hvori det er inkorporert en markør. Bindingsbestanddelen i det merkede koknjugatet deltar sammen med andre bestanddeler, dersom det finnes slike, fra reagensmidlene og liganden i mediet som undersøkes, til å danne et bindingsreaksjonssystem som gir to arter eller former av det merkede konjugat; en bundet art og en fri art. I de bundne artene er bindingsbstanddelen, f.eks. et antigen, i det merkede konjugatet bundet av en korresponderende bindingspartner, f.eks. et antistoff, mens bindingsbestanddelen i de frie artene ikke er bundet slik. Den relative mengde eller del av det merkede konjugatet som gir de bundne artene, i forhold til de frie artene, er en funksjon av nærværet (eller mengden) av liganden som skal undersøkes i prøven.

Når det merkede konjugatet i den bunden art i det vesentlige ikke er påvisbar i nærværet av det merkede konjugatet i den frie art med de midlene som brukes for å registrere markøren, må den bundne art og den frie art skilles fysisk for å fullføre analysen. Denne analysetype refereres til i teknikken som "heterogen". Når de bundne artene og de frie artene av det merkede konjugatet kan skjelnes fra hverandre i hverandres nærvær, unngås separeringstrinnet og analysen kalles "homogen".

Den først oppdagede type av høysensitiv, spesifik bindingsanalyse var radioimmunoanalysen hvor det anvendes en radioaktiv isotop som markør. En slik analyse må nødvendig-vis følge den heterogene formen ettersom den registrererbare egenskapen hos markøren er kvalitativt sett uforandret i den frie og den bundne arten. På grunn av besværligheten og vanskeligheten med å håndtere radioaktive materialer og nødvendigheten av et separeringstrinn, er det blitt oppfunnet homogene analysesystemer hvor det brukes andre materialer enn radioisotoper som markørbestanddel, inkludert enzymer, bakteriofager, metaller og organometalliske komplekser, koenzymer, enzymsubstrater, enzymaktivatorer og -inhibitorer, cykliseringsreagenser, organiske og uorganiske katalysatorer, prostetiske grupper, luminiscensreagenser og fluorescensmole-kyler. Slike homogene, spesifikke bindingsanalysesystemer gir en påvisbar respons, f.eks. et elektromagnetisk strålingssignal, slik som luminescens, fluorescensstråling eller fargeskifte, i forhold til nærværet av eller mengden av ligand som væskeprøven skal undersøkes for.

Kommersielt tilgjengelige testmidler for å utføres spesifike bindingsanalyser foreligger vanligivs i form av prøvesett som omfatter en pakket kombinasjon av beholdere med oppløsninger eller rehydratiserbare sammensetninger av de nødvendige reagenser for å utføre analysen. For å utføre den aktuelle analysefremgangsmåte, må porsjoner av slike oppløsninger utdeles manuelt eller instrumentelt i et raksjonskar med prøven. Dersom utporsjoneringen skjer manuelt, krever analysen alltid en fagmanns tid og erfaring, og dersom utporsjoneringen skjer instrumentelt, krever analysen alltid utgiften ved og vedlikeholdet av utporsjoneringsapparater.

Prøveinnretninger i fast form er blitt anvendt ved heterogene, spesifike bindingsanalyser i et forsøk på å overvinne ubekvemmelighetene og ulempene i det nødvendige separeringstrinnet. En vanlig brukt fast form innretning av denne type omfatter en uporøs overflate, slik som innerflaten i et prøverør eller en annen beholder hvortil antistoff er bundet eller spredd utover ved adsorbsjon eller kovalent binding. US-PS 3 826 619, 4.001.583, 4.017.597 og 4.105.410 vedrører bruken av antistoffdekkede prøverør for radioimmunoanalyser. Prøveinnretninger for fast form er også blitt brukt ved heterogene enzymimmunoanalyser (US-PS 4.016.043, 4.147.752) og ved heterogene flourescensimmunoanalyser (US-PS 4.025.310 og 4.056.724, og GB-PS 1.552.374).

Bruken av slike prøveinnretninger for heterogen, spesifik bindingsanalyse er eksemplifisert ved fremgangsmåten ifølge US-PS 4.135.884 som vedrører et såkalt "gamma-merke". Prøveinnretningen inkorporeres med antistoffreagenset og bringes i kontakt med væskeprøven og med de gjenværende reagenser i reaksjonssystemet, først og fremst det merkede konjugat. Etter en inkubasjonsperiode, fjernes fast form innretningen fysisk fra reaksjonsoppløsningen og markøren måles i oppløsningen eller på prøveinnretningen.

Lignende innretninger hvor antistoffreagenset er innesluttet i en matarise slik som en gel eller et porøst papir er beskrevet i US-PS 3.925.017, 3.970.429, 4.138.474, 3.966.897, 3.981,981 og 3.888.629 og i DE off.-skrift 2.241.646. Videre er det kjent innretninger for bruk ved heterogene, spesifike bindingsanalyser hvor antistoffreagenset er bundet til en matrise i en gjennomstrømningskolonne (US-PS 4.036.947, 4.039.652, 4.059.684, 4.153.675 og 4.166.102). Som ved alle innretninger for heterogen, spesifik bindingsanalyse, er prøveinnretningen vanligvis inkorporert med mindre enn alle de nødvendige reagenser for å utføre analysen, og er snarere et middel for å gjøre det nødvendige separeringstrinnet enklere.

Endelig er prøveinnretninger for heterogen, spesifik bindingsanalyse blitt beskrevet hvor det meste av eller alle de nødvendige reagenser er inkorporert i ett og samme bæreelement, og hvor reagens/prøve-kontakt og separering av den frie og den bundne form utføres ved kapillær spredning langs bæreelementet (US-PS 3.641.235, 4.094.647 og

4.168.146). Innretningene beskrevet i disse patentene er vanligvis ansett som vanskelige å fremstille og gir lett ikke-reproduserbare resultater på grunn av den komplekse naturen til de mange kjemiske og fysisk gjensidige påvirknin-ger som finner sted langs bæreelementet under utføringen av en analyse og de lave konsentrasjonene av ligand eller analyt som slike innretninger er ment å skulle bestemme.

Anvendelsen av reagenssystemer for homogen, spesifik bindingsanalyse i prøveinnretninger i fast form vil gi store fordeler for rutinebrukeren av slike analysesystemer. Bestemmelsen av ligander som opptrer i svært små konsentrasjoner i væskerøver, ville forenkles til trinnene med å bringe innretningen i kontakt med prøven og måle, enten ved visuell observasjon eller ved hjelp av instrumenter, det resulterende signal. Reagenser ville bli anvendt i fast form, uten behov for å lagre, utporsjonere eller blande reagenser i væskeform slik som ved bruk av prøvesettene i den kjente teknikk. Fast form-innretninger vile også egne seg bedre for automatisering enn væskesystemene i den kjente teknikk.

Den kjente teknikk mangler en detaljert beskrivelse av hvordan man kan anvende homogene reagenssystemer for spesifik bindingsanalyse i fast form-prøveinnretninger. GB patent-skrivet nr. 1.552.607, som generelt anviser dette, beskriver homogene, spesifike bindingsanalysesystemer hvor det anvendes forskjellige nye markører inkludert kjemiluminiscensmarkører, enzymsubstrat-markører og koenzymmarkører. På side 23, fra linje 12 i dette patent foreslås det å inkoporere analysereagensene i forskjellige bærere inkludert beholdere med væske eller uoppløselige, porøse og fortrinnsvis absorberende, matriser, slik som porøst papir, polymer-filmer, membraner, skinn eller blokker, geler o.l.

DE-off-skrift 2.537.275 beskriver et homogent reagenssystem for spesifik bindingsanalyse og antyder muligheten av å bruke skiver eller strimler inkorporert med antistoff ved utførel-sen av analysen. Ifølge dette forslaget skulle det merkede konkugatet først blandes med prøven og deretter skulle prøve-innretningen inkoporert med antistoff bringes i kontakt med reaksjonsblandingen. Det foreslås at prøveinnretningen, etter en passe inkubasjonstid, skulle fylles med buffer, tørkes og deretter skulle signalet (fluorescens) måles. Dette DE-off.-skrift angir følgelig en prøveinnretning og analysefremgangsmåte som ligner mye på de allerede kjente heterogene teknikkerfor spesifik bindingsanalyse hvor prøveinnretningen dyppes ned i den flytende reaksjonsblandingen, inkuberes, trekkes opp, vaskes og avleses til slutt. Dertil kommer at den foreslåtte prøveinnretning ikke inkopo-rerer alle bindingsanalysereagensene i bærerelementet. Nærmere bestemt så foreslås det at bare antistoffet skal til-føres separat til prøven som skal undersøkes før den bringes i kontakt med den foreslåtte prøveinnretning.

i

Oppfinnelsen vedrører en prøveinnretning til bestemmelse av en ligand i en flytende prøve ved en homogen immunoanalyse, idet prøveinnretningen omfatter (1) et fast bærerelement som virker absorberende med hensyn til den flytende prøve, og (2) en reagenssammensetning som er inkorporert i det nevnte bærerelement og som omfatter (i) et antistofff eller et annet naturlig forekommende bindingsprotein for ligandene, og (ii) et konjugat av liganden eller en analog herav, som likeledes bindes av antistoffet eller annet bindingsprotein, idet disse er bundet kovalent til en markør og markøren kan påvises ved hjelp av et elektromagnetisk signal som er forskjellig når det markerte konjugat er bundet av antistoffet, eller annet bindingsprotein sammenlignet med når det ikke er bundet på denne måten, og det nevnte signal er en funksjon av mengden av ligandene i prøven, idet innretningen er karakterisert ved at det faste bæreelement er inkorporert med antistoffet eller en annet bindingsprotein, og et merket konjugat omfattende liganden eller en ligand-analog og en markør vesentlig ubundet til hverandre.

I en utførelsesform er bærerdelen i det vesentlige enhetlig inkorporert med analysereagensene. Bærerdelen er foretrukket en matrise som i forhold til væskeprøven er en absorbent, slik som en vevet matrise bestående i det vesentlige av naturlige eller syntetiske polymerfibre, f.eks. papir, en polymerfilm eller gel. I en annen utførelsesform omfatter bærerdelen flere soner, f.eks. fysisk adskilte lag, hvor hver av sonene er inkorporert med et forskjellig reagens eller kombinasjoner av analysereagensene.

Under bruk bringes prøveinnretningen i kontakt med væs-keprøven, f.eks. en biologisk væske slik som serum eller urin, slik som ved hurtig å dyppe denne reagensinkoporerte bærerdel i prøven eller ved å fordele en porsjon av prøven på en overflate hos bærerdelen. Den påvisbare responsen måles deretter, vanligvis etter en på forhånd bestemt inkubasjons-eller reaksjonsperiode, enten ved observasjon av fagmannen som utfører analysen eller ved hjelp av Instrumenter. Den påvisbare responsen er vanligvis et elektromagnetisk strålingssignal, f.eks. fluorescens, kjemiluminescens, farge-endrInger og spektrofotometriske responser.

Foretrukkede homogene systemer for spesifik bindingsanalyse er de kjente som omfatter en markør som deltar i en enzymatisk reaksjon. Et slikt foretrukket analysesystem er det hvor markøren er en prostetisk gruppe i enzym og hvor et apoenzyms evne til å binde seg til en slik prostetisk gruppemarkør til å gi et aktivt holoenzym, er avhengig av nærværet av liganden eller bindingskapasiteten for den. Holo-enzymet kan måles ved sin enzymatiske aktivtet ved hjelp av en rekke systemer, inkludert kolorimetriske systemer. Et annet foretrukket analysesystem er det hvor markøren er et enzymsubstrat og hvor et enzymsevne til å virke på en slik substratmarkør for å gi et registrerbart produkt, er avhengig av nærværet av liganden eller bindingskapasiteten for den. I et slikt homogent system for spesifik bindingsanalyse er det påvisbare produktet foretrukket flourescens slik at den registrerbare responsen fra prøveinnretningen er målbar med et fluorometer. Det systemet hvor markøren er et enzym og hvor aktiviteten av en slik enzymmarkør er avhengig av nærværet av liganden eller bindingskapasiteten for den, er også et brukbart homogent system for spesifik bindingsanalyse. Også i dette tilfelle! kan enzymaktiviteten måles på mange forskjellige måter.

Fig. 1 - 15 er grafiske fremstillinger av data oppnådd i eksperimentene beskrevet i eksemplene nedenunder.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en prøveinnretning for bruk ved utførelse av homogene, spesifike bindingsanalyser uten bruk av radioisotoper, f.eks. immunoanalyser, som har alle de fordelaktige trekkene ved vanlige analytiske teststrimler og andre lignende testelementer. Som i tilfellet med slike konvensjonelle Innretninger, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fast bærer, vanligvis en matrise av en aller annen sort, hvor alle nødvendige reagenser for utførelse av en bestemt analyse er inkorporert slik at brukeren bare har til oppgave å bringe prøveinnret-ningen i kontakt med prøven som skal testes og måle den resulterende respons. Når hele fremgangsmåten er automati-sert, kan et instrument for utførelse av de samme behandlin-gene ha en mye enklere utforming enn et instrument beregnet på konvensjonelle, flytende, kjemiske systemer som nå brukes for å utføre homogene, spesifike bindingsanalyser.

Reagenser for et hvilket som helst homogent system for spesifike bindingsanalyser kan inkorporeres i nærværende prøveinnretning. Homogene teknikker for spesifik bindingsanalyse er vanllgivs basert på den spesielle reaksjonen mellom (1) et konjugat av en bindingskomponent og en markør og (2) en bindingspartner til bindingskomponenten i konjugatet, idet en egenskap hos markøren er forskjellig når det merkede konjugatet er bundet til bindingspartneren sammenlignet når et slikt konjugat ikke er bundet på denne måten. Den berørte egenskapen hos markøren kan være av en hvilken som helst målbar type, f.eks. en kjemisk eller fysisk egenskap hos markøren. I enkelte tilfeller er den berørte egenskapen en kjemisk reaktivitet i en på forhånd bestemt reaskjon som omfatter dannelsen eller brytningen av kjemiske bindinger, kovalente eller ikke-kovalente. I andre tilfeller er den berørte egenskapen en fysisk egenskap hos markøren som kan måles uten kjemiske reaksjoner.

I de fleste tilfeller vil foreliggende prøveinnretning omfatte reagenser for homogen, spesifik bindingsanalyse som virker sammen med liganden eller dens bindingskapasitet I prøven på en immunokjemisk måte. Med andre ord vil det være et antigen-anatistoff eller hapten-antistoff-forhold mellom reagenser og/eller liganden eller dens bindingskapasitet i prøven. Slike analyser kalles derfor immunoanalyser og det spesielle samvirket mellom det merkede konjugat og dets bindingspartner er en immunokjemisk binding. I slike tilfeller er derfor bindingskomponenten i det merkede konjugat et antigen, hapten eller antistoff (eller et fragment av slike) og bindingspartneren er dets korresponderende immunokjemiske bindingspartner. Det er imidlertid vel kjent i faget at andre gjensidige bindingspåvirkninger mellom det merkede konjugat og bindingspartneren tjener som grunnlag for homogene, spesifike bindingsanalyser, inkuldert de gjensidige bindingspåvirkninger mellom hormoner, vitaminer, metabolitter og farmakologiske midler, og deres respektive reseptorer og bindingsstoffer.

Når prøven analyseres for å bestemme nærværet eller mengden av en bestemt ligand, omfatter reagensene for den homogene, spesifike bindingsanalyseteknikken vanligvis (1) et merket konjugat bestående av liganden, eller en bindingsanalog til den, kjemisk bundet til markøren, (2) en bindingspartner for liganden, f.eks. et antistoff eller et fragment av et antistoff, et naturlig reseptorprotein og lignende, og (3) hvilke som helst sekundære reagenser nødvendige for å måle markørstoffet i det merkede konjugat. En begrensende mengde bindingsstoff innføres slik at en hvilken som helst ligand i prøven vil konkurrere med det merkede konjugat om binding til bindingspartneren. Fordelingen av markøren mellom den bundne arten og den frie arten vil derfor bestemme størrelsen av den registrerbare responsen fra markøren, som igjen vil være en funksjon av nærværet av liganden. En annen måte for å bestemme en ligand foreslås hvor det merkede konjugatet består av en merket bindingspartner til liganden og etter binding til liganden påvirkes markøren med hensyn til dens registrerbare respons. Når 1igandbindinskapasitet i prøven analyseres, vil det merkede konjugat bestå av liganden, eller en bindingsanalog til den, kjemisk bundet til markøren hvorved prøvens kapasitet til å binde det merkede konjugat, slik som på grunn av nærværet av en bindingspartner for liganden i prøven, bestemme effekten på det registrerbare signalet fra markøren.

Flere forskjellige homogene systemer for spesifike bindingsanalyser er kjent fra tidligere. De følgende systemene er stilt opp i henhold til naturen av den anvendte markøren. 1. Markører som utgjøres av prostetisk gruppe i enzym. I dette systemet er markøren en prostetisk gruppe hos et enzym, og et katalytisk inaktivt apoenzyms evne til å kombineres med den prostetiske gruppe for å gi et aktivt enzym (holoenzym) påvirkes ved binding av det merkede konjugatet til dets bindingspartner. Aktiviteten til det resulterende holoenzym er målbart ved vanlig kjente påvisningssystemer hvorved det oppnås et endelig registrerbart signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i US-patentsøknad nr. 45.423, inngitt 4. juni 19-79 (svarende til GB patentskrift nr. 2.023.607). I en særlig foretrukket, prostetisk gruppe-merket analysefremgangsmåte benyttes flavinadenindinukleotid (FAD) som markør og apoglukoseoksidase som apoenzym. Den resulterende aktivitet av glukoseoksydase er målbar ved et kolorimetrisk påvisningssystem omfattende glukose, peroksydase og et indikatorsystem som gir en fargeendring som respons på hydrogenperoksyd.

I et slikt foretrukket analysesystem har det FAD-merkede konjugat fortrinnsvis den følgende formel:

2. Enzyrosubstrat- markører.

I dette systemet er markøren valgt slik at det merkede konjugatet er et substrat for et enzym og enzymets evne til å virke på det substratmerkede konjgat berøres, enten på en positiv eller negativ måte, ved binding av det merkede konjugat til dets bindingspartner. Innvirkning av enzymet på det substrat-merkede konjugatet gir et produkt som kan sjeldnes på visse egenskaper, vanligvis en kjemisk eller fysisk egenskap, slik som en kjemisk reaktivitet i en indikatprreaksjon eller slik som en fotomemtrisk egenskap, f.eks. fluorescens eller lysabsorbsjon (farge). Analysesystemer . av denne type er beskrevet i US patentsøknader nr 894.836, inngitt 10. april 1978 (svarende til DE Off.-skrift 2.618.511) og 87.819, inngitt 23. oktober 1979, og Anal. Chem. 48:1933 (1976), Anal. Biochem. 77:55 (1977) og Clin. Chem. 23:1402 (1977). Et særlig foretrukket substratmerket analysesystem nytter et merket konjugat med den følgende struktur:

hvor R er en sammenbindingsgruppe og L er bindingskomponenten, f.eks. liganden eller en analog av den, idet evnen til enzymet p<->galaktosidase til å splitte konjugatet som gir et produkt som kan sjelnes ved sin fluorescens, inhiberes av konjugatets binding til dets bindingspartner.

3. Koenzym- markører.

Det merkede konjugat i dette systemet består i sin markørdel av en koenzym-aktiv kunksjon, og en slik koenzym-markørs evne til å delta i en enzymatisk reaksjon påvirkes ved binding av det merkede konjugatet til dets bindingspartner. Hastigheten av denne resulterende enzymatiske reaksjon er målbar ved vanlig kjente påvisningssystemer som gir et endelig registrerbart signal. Analysesystemer av denne typen er beskrevet i US patentsøknad nr. 894.836, inngitt 10. april 1978 (svarende til DE Off-skrift 2.618.511), i Anal. Biochem.

72:271 (1976), Anal. Biochem. 72:283 (1976) og Anal. Biochem. 76:95 (1976).

4. Enzvmmodulator- markører.

Det merkede konjugat i dette system består, i sin markørdel, av en enzym-modulerende funksjon slik som en enzyminhibitor eller -stimulator, og en slik modulator-markørs evne til å modulere aktiviteten til et enzym påvirkes ved binding av det merkede konjugatet til dets bindingspartner. Hastigheten til den resulterende enzymatiske reaksjon er målbar ved vanlig kjente påvisningssystemer som gir et endelig registrerbart signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i US patentskrift nr 4.134.792.

5. Ensymmarkører.

I dette systemet er markøren et enzym og aktiviteten til enzymmarkøren påvirkes ved binding av det merkede konjugatet til dets bindingspartner. Den resulterende enzymaktivitet er målbar ved alminnelig kjente påvisningssystemer som gir et endelig registrerbart signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i US. patentskrift nr. 3.817.837 og 4.043.872.

6. Fluorescens- markører.

Det merkede konjugat i dette system består, i sin markørdel av en fluorescensgiver hvis fluorescens slokkes i en målbar grad når det merkede konjugat bindes til sin bindingspartner, vanligvis et protein slik som et antistoff. Den fluorescerende markør måles direkte idet dens fluorescens utgjør det registrerbare signal. Analysesystemer av denne type er beskrevet i US. patentskrift nr. 4.160.016 og i J.Clin.Path. 30:526 (1977).

7. Fluorescenspolarlserings- markører.

Markøren i dette systemet er også et fluorescerende stoff, den berørte egenskap er imidlertid polarisering av fluorescens på grunn av binding av det merkede konjugatet til dets bindingspartner, vanligvis et protein slik som et antistoff. Analysesystemer av denne type er beskrevet i J.Exp.Med. 122:1029 (1965).

8. Klemisk fremkalte, fluorescerende markører.

I dette systemet er markøren igjen et flourescerende stoff, det fluorescerende stoffets evne til å bli kjemisk eksitert til et energinivå hvor det fluorescerer, blir imidlertid påvirket ved binding av det merkede konjugatet til dets bindingspartner. Kjemisk fremkalling av markøren utføres vanligvis ved eksponering av det fluorescernede stoffet mot en høyenergiforbindelse dannet in situ. Analysesystemer av denne type er beskrevet i US patentsøknad nr. 4.580, inngitt 18. januar 1979.

9. Markørsystemer med to antistoffer og sterisk hindring.

Et annet analysesystem er immunoanalysesystemet med to antistoffer beskrevet i US patentskrifter nr. 3.935.074 og 3.998.943. Det merkede konjugatet omfatter to epitoper, hvorav det ene deltar i den immunologiske reaksjonen mellom liganden og anti-ligandantistoffet, med den begrensning at de to antistoffene hindres fra å bindes til det merkede konjugatet samtidig. Den annen epitop kan være et fluorescerende stoff hvis fluorescens utslukkes ved den annen antistoffbinding, eller kan delta i en underordnet konkurrerende bindingsraeksjon med en merket form av den annen epitop for binding til det annet antistoff. Forskjellige påvisningssystemer er mulige i et silke system som beskrevet i de ovenfor nevnte patenter. Beslektede analysesystemer er beskrevet i US patentskrifter nr. 4.130.462 og 4.161.515 og i GB patentskrift nr 1.560.852.

10. Energioverførlngs- markører.

I dette systemet er markøren 1 den ene av et energi overfør-ingsdonor-akseptorpar og bindingspartneren konjugeres med en andre i paret. Når det merkede konjugat bindes til bindingspartneren, påvirkes således energiavgivelsen fra donorbestanddelen i paret av overdragning til akseptorbe-standdelen. Donoren er vanligvis et fluorescerende stoff og akseptoren er en "slokker" for det, Idet også "slokkeren" kan være et fluorescerende stoff. I en slik utførelse er det registrerbare signalet fluorescens, men også andre påvisningssystemer er mulige. Slike analysesystemer er beskrevet i US patentskrift nr. 3.996.345, 4.174.384 og 4.199.559 og i britisk patentskrift nr. 2.018.424.

11. Andre markører.

Andre homogene systemer for spesifik bindingsanalyse beskrevet tidligere og som kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse omfatter bruken av slike markører som: (a) ikke-enzymatiskekatalysatorer, slik som elektronover-overføringsmidler (se US-patentskrift nr. 4.160.645). (b) ikke-enzymatiske luminiscerende stoffer (se den ovenfor

nevnte US patentsøknad nr. 894.836),

(c) "kanaliserende" markører (se GB patentskrift nr.

2.018.986),

(d) "partikkel"-markører (se GB patentskrift nr.

2.019.562), og (e) merkede liposompartiklker (se US patentskrift nr.

4.13.983).

Foreliggende analysemetoder kan anvendes for påvisning av enhver ligand som det finnes en spesifik bindingspartner til, og omvendt, for bestemmelse av et væskemediums kapasitet til å binde en ligand (vanligvis som følge av nærværet av en bindingspartner for liganden i mediet). Liganden er vanligvis et peptid, polypeptid, protein, karbohydrat, glykoprotein, steroid eller annet organisk molekyl som det eksisterer en spesifik bindingspartner for i biologiske systemer, eller som kan syntetiseres. Liganden velges vanligvis fra gruppen som omfatter antigener og antistoffer til disse, haptener og antistoffer til disse, hormoner, vitaminer, metabolitter og farmakologiske midler, samt deres reseptorer og bindingsstoffer. Vanligvis er liganden et immunologisk aktivt polypeptid eller protein med molekylvekt mellom 1.000 og 10 millioner, slik som et antistoff eller antigenisk polypeptid eller protein, eller et hapten med molekylvekt mellom 100 og 1500.

Væskemediet som skal analyseres kan være et naturlig forekommende eller en kunstig fremstilt væske antatt å inneholde liganden, og er vanligvis en biologisk væske eller en fortynning av denne. Biologiske væsker som kan analyseres omfatter serum, plasma, urin, saliva og amniotiske og cerebrospinale væsker.

Bærerdelen i foreliggende oppfinnelse kan fremstå i en rekke former. Den kan være en en- eller flerfaset, omfatte ett eller flere egnede materialer eller medier med like eller forskjellige absorbsjons- eller andre fysiske egenskaper. Den kan være hydrofob eller hydrofil, porøs eller ikke-porøs. I sin mest effektive utførelse skreddersys bærerdelen omhyggelig for å tilpasses egenskapene hos det bestemte homogene systemet for spesifik bindingsanalyse som skal anvendes.

Uttrykket "bærerdel" omfatter, slik det er brukt her, følgelig ethvert stoff,, matrise eller overflate som er istand til å bli Inkorporert med reagenser for spesifik bindingsanalyse. Den kan utføres av mange kjente former slik som har vært benyttet ved kjemiske og enzymatiske reagensstrimler ved oppløsningsmiddelanalyse. F.eks. beskriver US patentskrift nr. 3.846.247 bruken av formede, porøse keramiske strimler og vevede eller pressede glassfibre. Som erstatninger for papir, beskriver US patentskrift nr. 3.552.928 bruken av trepinner, tøy, svampmateriale og leirestoffer. Bruken av syntetiske harpiksskinn og glassfiberfilt istedet for papir foreslås i GB patentskrift nr. 1.369.139. Et annet GB patent, nr. 1.340.623, foreslår bruken av et lett permeabelt nettverk av tynne filamenter som overtrekk for en underliggende bærerdel av papir. Denne referansen foreslår også å impregnere papiret med en del av et reagenssystem og impregnere nettverket med de andre, potensielt ikke-konkurrerende, kjemiske eller enzymatiske reagenser. FR patent nr. 2.170.397 beskriver bruken av bærerdeler bestående av mer enn 50$ polyamidfibre. En annen form for bærerdeler er åpenbaret i US patent nr. 4.046.513 hvor prinsippet med å feste reagenser på en egnet bærer benyttes. US patent nr. 4.046.514 åpenbarer sammenveving eller binding av filamenter som bærer reagenser i et reaksjonssystem. Alle slike bærerdelprinsipper kan utnyttes i foreliggende oppfinnelse, likesåvel som andre. Foretrukket omfatter bærerdelen et porøst materiale, slik som filterpapir, idet en oppløsning eller suspensjon av reagensene i systemet for spesifik bindingsanalyse brukes for å impregnere bærerdelen. Den kan også omfatte et system som fysisk inneslutter disse bestanddelene, slik som i polymere mikrokapsler, som brytes opp etter å ha kommet i kontakt med prøven. Den kan omfatte et system hvor bestanddelen er homogent kombinert med bærerdelen i en væske- eller semivæskeform som senere stivner og derved inneslutter bestanddelene.

Uansett hvilket materiale som velges som bærerdel, enten det er porøst for å gi adgang til inkorporering av bestanddeler slik som ved metting med en oppløsning som inneholder den, eller den er ikke-porøs slik som for bruk med påtrykte reagenser eller for å understøtte et kontinuerlig belegg, enten den er vevet eller bundet, uansett hvilken sammensetning eller konfigurasjon den har, vil utvelgelsen av den i alle tilfeller være diktert av forutsatt bruk og av reagenssystemet. Den kan f.eks. være ønskelig å benytte reagenser i flere tirnn. I slike tilfeller fremstilles to eller flere oppløsninger eller suspensjoner av reagenser og bærerdelen dyppes i tur og orden i hver med tørketrinn imellom. I et slikt tilfelle kan et porøst materiale slik som papir, være mest fordelaktig. Alternativt kan det være ønskelig å benytte en flerfaset bærerdel hvor to eller flere lag av porøst materiale er festet oppå hverandre. Nok en annen form for inkorporering i bærerdelen er å belegge en sammenhengende polymer i tur og orden med belegg som inneholder forskjellige reagenser i immunoanalysesystmet. Filterlag kan være tilstede i bærerdelen for å hindre potensielt samvirkende midler fra å nå analysesystemet, men som tillater adgang for enhver analyt som er tilstede i prøven.

Det vil følgelig forstås at passende utvelgelse av en bærerdel er avhengig av kun to faktorer: den forutsatte bruk og naturen av systeme for spesifik bindingsanalyse som skal anvendes. På bakgrunn av det som således er kjent, blir det å velge ut den egnede bærerdel et spørsmål om rutineeksperi-mentering.

En fremgangsmåte for fremstilling av prøveinnretningen i henhold til foreliggende oppfinnelse som omfatter å inkorporere en bærerdel med bestanddelene i prøvesystemet, er også tilveiebragt. Når denne inkorporering er ved impregnering med en eller flere oppløsninger av analysereagensen ifølge oppfinnelsen, blir den Impregnerte bæreren deretter tørket. Innretningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan, i tillegg til impregnering, lages ved andre egnede teknikker slik som å feste eller spre sammensetningen på et lag av bærermaterlale eller å inkorporere oppløsningene i filmdannende væsker og la den således fremstilte kombinasjonen stivne eller festne.

Når bærerdelen omfatter flere lag, f.eks. papir eller andre fibermaterialer, kan slike lag opprettholdes i laminert forhold ved hjelp av klebestoffer som tillater væske å passere mellom lagene. Ved fremstilling av integrerte

i

analytiske elementer ved hjelp av filmdannere kan laget eller lagene fremstilles separat på forhånd og settes sammen til

det fullstendige element. Materialet i filmlaget eller-lagene kan være en sammensetning som omfatter et plas-tiseringsmiddel og en polymer egnet til å gi dimensjonen stabilitet. Lag som fremstilles på denne måten er vanligvis spredd utover fra oppløsningen eller dispersjonen på en overflate fra hvilken det tørkede laget kan trekkes av fysisk. En vanlig fremgangsmåte som kan unngå problemer med flere avtrekkings- og sammensetningstrinn, er imidlertid å legge et første lag på en avtrekkingsoverflate eller en bærer, etter ønske, og deretter suksessivt å legge lag direkte på de foran lagte. Slik belegging kan utføres for hånd ved hjelp av en beleggingsinnretning med blad, eller maskinelt ved å brukt teknikker slik som dyppe- eller badovertrekking. Dersom det benyttes maskinelle overtrekkingsteknikker, er det ofte mulig å legge tilgrensende lag samtidig ved å bruke overtrekkingsteknikker med fødeapparater som er vel kjent fra fremstillingen av lysfølsomme, fotogra-fiske filmer og papirer.

Polymerlag som stivner hurtig kan brukes som filmlag-materialet. Filmen dannes på et substrat ved å oppløse en polymer i en blanding av to væsker, hvorav den ene har et lavere kokepunkt og er et godt oppløsningsmiddel for polymeren og den andre har et høyere kokepunkt og er ikke-oppløsningsmiddel eller i det minste et dårligere oppløs-ningsmiddel for polymeren. En slik polymeroppløsning legges deretter på substratet og tørkes under kontrollerte forhold. Oppløsningsmidlet med lavere kokepunkt fordamper hurtigere og innholdet av væsken som er dårlig oppløsningsmiddel eller ikke-oppløsningsmiddel i belegget økes. Polymeren dannes som et porøst lag etter hvert som fordampningen skrider fram under egnede forhold. Mange forskjellige polymerer kan brukes, alene eller i kombinasjon, for å fremstille porøse lag av polymerer som stivner hurtig ved bruk i denne oppfinnelsen. Typiske eksempler omfatter polykarbonater, polyamider, polyuretaner og celluloseestere slik som celluloseacetat. For slike lag som inneholder et merket konjugat eller andre reagenser, kan det fremstilles en overtrekkingsoppløsning eller -dispersjon som Inneholder matrisen og inkorporerte aktive materialer, legges som beskrevet ovenfor og tørkes til å gi et dimensjonelt stabilt lag.

Tykkelsen av ethvert lag og dets grad av permeabilitet kan varieres i stor grad og avhenger av den aktuelle bruken. Tykkelsen i tørr form fra 5 mikron til 100 mikron har vært vanlig, selv om større variasjoner i tykkelse kan være å foretrekke i visse tilfeller. Dersom f.eks. forholdsvis store mengder samvirkende materiale, f.eks. polymere materialer slik som enzymer, kreves, kan det være ønskelig å fremstille noe tykkere lag.

Det kan også være ønskelig å Inkludere i bærerdelen ett eller flere reflekterende lag, som evt. absorberer den målte stråling, slik som for å lette signalmålingen ved reflek-sjonsradiometri, f.eks. refleksjonsfotometrl eller en lignende teknikk. En slik reflektor kan utgjøres av ett av de ovenfor beskrevne lagene eller den kan utgjøres av et ytterligere lag som ikke behøver å ha noen annen funksjon i elementet. Reflekterende pigmenter, slik som tltandioksyd og bariumsulfat, kan med fordel benyttes i et reflekterende lag. Polymerer som stivner hurtig kan også utgjøre et egnet reflekterende materiale. I en foretrukket utførelsesform inneholder polymerlagene også et pigment for å fremme reflektlviteten eller andre funksjoner. Mengden av pigment som kan være inkludert i et lag sammen med en polymer som stivner hurtig, er svært variabel og mengder fra 1 til 10 vekt-deler pigment pr. vektdel polymer er foretrukket, idet fra 3 til 6 deler pigment pr. del polymer er mest foretrukket .

Det kan være fordelaktig å inkorporere ett eller flere overflateaktive midler, slik som anloniske eller ikke-ioniske overflateaktive midler, I lagene til bærerdelen. De kan f.eks. fremme lag-preparaters evne til å legge seg og fremme utstrekningen og graden av fukting i lag som ikke så lett fuktes av væskeprøver i fraværet av et hjelpemiddel slik som et overflateaktivt middel. Det kan også være ønskelig i lag hos bæreren å inkludere materialer som i den valgte analyse ved kjemisk reaksjon eller på annen måte kan gjøre potensielt skadelige materialer ved enslik analyse Ikke-aktive.

De integrerte analytiske elementene kan være selvbærende eller belagt på et hjelpestoff. Hjelpestoffet kan være opakt eller gjennomskinnelig for lys eller annen energi. Hjelpestoffet som velges for en bestemt bærerdel må være forenlig med den påtenkte måte for signalregistrering. Foretrukne hjelpestoffer omfatter gjennomskinnelige materialer som er istand til å slippe igjennom elektromagnetisk stråling med en bølgelengde innen området mellom 200 og 900 nm. Hjelpestoffet behøver selvfølgelig ikke å slippe gjennom over hele 200 - 900 nm-området, selv om det for fluorometrisk måling av analytiske resultater gjennom hjelpestoffet er ønskelig at hjeplestoffet slipper gjennom stråler over et videre spektrum, eller at det alternativt slipper gjenom stråler ved absorbsjons- og emisjonsspektrene for de fluorescerende materialene brukt ved målingen. Det kan også være ønskelig å ha et hjelpestoff som slipper gjennom stråler ved ett eller flere trange bølgelengdebånd og er opakt for nærliggende bølgelengdebånd. Dette kan utføres ved f.eks. å impregnere eller belegge hjelpestoffet med ett eller flere fargestoffer med egnede absorbsjonsegenskaper.

I det følgende beskrives noen foretrukne metoder for fremstilling av foreliggende prøveinnretning:

Metode med flere impregneringer.

Et lag med bærermateriale impregneres med en første oppløs-ning eller suspensjon av reagenser i et første oppløsnigns-middel og tørkes. Deretter impregneres bærermaterialet med en annen oppløsning eller supsensjon av de gjenværende reagenser i et annet oppløsningsmiddel som forhindrer gjen sidig påvirkning med reagensene impregnert med det første oppløsningsmidlet og tørkes. På denne måten er reagensene i de respektive oppløsningsmidlene ute av stand til vesentlig gjensidig påvirkning under fremstillingen av prøveinnretnin-gen og reagerer følgelig ikke for tidlig. Ved en foretrukket utførelsesform imkorporeres visse første reagenser i et lag bærermateriale ved dypping i et vandig medium. Et egnet organisk oppløsningsmiddel brukes for de gjenværende reagensene, slik som toluen, aceton, kloroform, metylenklo-rid, n-propanol og etylendiklorld. Dette laget festes ved å la det organiske oppløsningsmidlet fordampe. Ytterligere detaljer finnes i eksemplene.

Enhet med flere lag.

En enhet med flere lag fremstilles ved å inkorporere et første eller overliggende lag med noen, men ikke alle, reagensene i det anvendte system for spesifik bindingsanalyse, inkorporere de gjenværende reagensene i et annet eller underliggende lag, la de individuelle lagene stivne, f.eks. ved tørking, og feste dem i et laminert forhold til hverandre. Når det brukes bærermaterialer som er absorbsjonsmid-ler, fremstilles disse enhetene ved å impregnere individuelle lag og tørke de impregnerte lagene.

Det første laget og det andre laget har hver et par av motsatt beliggende overflater. En overflate i det første laget er i et laminært forhold til en overflate i det andre laget, idet prøven tilføres til den andre overflaten i hvert av de nevnte lagene. Henvisning til et laminert forhold betyr dessuten muligheten for en væske, enten flytende eller i gassform, til å passere mellom på hverandre liggende overflater i slike lag. Slike lag kan være sammenhengende eller adskilte ved mellomliggende lag. Det mellomliggende lag bør ikke forhindre overføring mellom alle lag.

Metode med frystetørklng.

Denne metoden består av en fremgangsmåte for å inkorporere og forhindre reaksjon mellom uforenelige reagenser i en analytisk enhet med et enkelt lag. Når man f.eks. bruker bærermaterlale som er absorbsjonsmiddel, inkorporeres en første gruppe reagenser i lag-materialet ved forhøyet temperatur (eller alternativt ved frysetørking) og det behandlede lag tillates å stivne. Den andre gruppen av reagenser som inneholder et eller annet som vil reagere under omgivelsesforhold med den første gruppen, tilføres og enheten fryses hurtig. Nedfrysing forhindrer for tidlig reaksjon og den derpå følgende fjerning av vann ved frysetørking forhindrer for tidlig reaksjon når laget bringes tilbake til romtemperatur.

Ved den foretrukne utførelsesform kan en gruppe reagenser tilføres i vandig oppløsning til et lag og tørkes. Tilførse-len av en annen gruppe reagenser i vandig oppløsning følges av hurtig nedfrysing og deretter frysetørking for å fjerne vann. Denne fremgangsmåte tillater inkorporeringen av og forhindrer den gjensidige reaksjonen mellom visse reagenser som kun er vannoppløselige. Dertil unngås bruken av organiske oppløsningsmidler, hvorav noen kan reagere skadelig med enkelte reagenser (f.eks. enzymer).

Fremgangsmåten tillater sammensetning av enheter hvor det benyttes reagenser for homogen, spesifik bindingsanalyse og hvor alle reagensene er innlemmet i en enhet som består av et enkelt lag.

Metode med reversibel kompleksdannelse.

Konkurransen mellom prøveligand og merket ligand ved binding til en bindingspartner (hver eksemplifisert ved et antistoff "Ab") kan sammenfattes i den følgende ligning:

I systemet som er illustrert ovenfor, holdes antistoffet og den merkede liganden adskilt inntil tilførselen av prøven. Denne utførelsesformen av den beskrevne oppfinnelse gjør bruk av den motsatte reaksjon og gjenvinning av likevekten med liganden som vist 1 den følgende ligning:

hvor mengden av fortrengt merket ligand står i forhold til ligandkonsentrasjonen i prøven. Fordelen er at alle reagens-bestanddelene kan kombineres i et inkorporeringsmedium og derved gi et system som bare krever tilførselen av prøven som skal undersøkes.

Analytiske enheter fremstilles ved å inkubere et gitt konjugat med dets respektive antisere i en kort periode, slik som 15 minutter. Deretter tilsettes evt. ytterligere reagenser og systemet inkuberes i en ytterligere periode. Den erholdte oppløsning impregneres i eller inkorporeres på annen måte i et lag med bærermaterlale som man dereter lar stivne.

Mange av de nylig anviste homogene, spesifike bindingsanalysesystemer gir, eller kan lett bringes til å gi, som tidligere anført, en registrerbar respons slik som er fargeendring, kjemiluminescens eller fluorescens knyttet til nærværet eller mengden av liganden som skal analyseres i væskeprøven.

Uttrykket "registrerbar art" og lignende uttrykk som er brukt her refererer til atomer, kjemiske grupper (f.eks. en del av et molekyl) eller kjemiske forbindelser som i seg selv er direkte eller indirekte registrerbare, og uttrykket "registrerbar respons" og, lignende uttrykk refererer, slik de her er brukt til det registrerbare utslaget av nærværet av slike arter. Eksempler er elektromagnetiske strållngssignaler, slik som fluorescens, fosforscens, kjemiluminescens, en endring 1 lysabsorbsjon eller refleksjon 1 det synlige spektrum som gir en synlig fargeendrlng, en endring i lysabsorbsjon eller -refleksjon utenfor den synlige området slik som i det ultrafiolette eller infrarøde området. Som det vil være åpenbart for en fagmann 1 immunoanalyser, er uttrykket "registrerbar respons" slik det her er brukt, ment å skulle forstås i sin videste betydning. I tillegg til elektromagnetiske strållngssignaler er uttrykket "registrerbar respons" også ment å skulle omfatte enhver observerbar endring av en parameter i et system, slik som en endring i eller frekomst av en reaktant, observerbar utfelling av en hvilken som helst bestanddel i enalyseprøven eller en endring i en hvilken som helst annen parameter, enten det er i immunoanalysesystemet eller i analyseprøven. Slike andre registrerbare responser omfatter elektrokjemiske responser og kalorimetriske responser. Videre er den registrerbare responsen en som kan observeres direkte ved hjelp av sansene eller ved å bruke registreringshjepemldler for disse, slik som et spektrofootmeter, utstyr som reagerer på ultrafiolett lys, fluorometer, spektrofluormeter, pH-meter og andre hjelpemidler for påvisning. Det er å ønske at slik regi-strerbarhet kan utnyttes fullt ut på registrerbare arter uten å påvirke mengden flyktige produkter som resulterer fra den gjensidige påvirkningen mellom analyttene, som er grunnlaget for den tilsiktede analyse.

Etter at analyseresultatet er oppnådd som en registrerbar endring, måles det vanligvis ved å føre prøveenheten gjennom en sone hvor egnet apparatur for refleksjons-, transmisjons-eller fluorescensfotometri er anordnet. Slik apparatur virker ved å lede en energistsråle, slik som lys, gjennom hjelpstoffet 1 en utførelsesform. Lysetreflekteres så fra enheten tilbake til et registreringsmlddel eller passerer gjennom enheten til en detektor i tilfellet med transmi-sjonsmåling. Ved en foretrukket måte måles resultatet av analysen 1 et område i enheten som i sin helhet ligger innenfor området hvor resultatet fremkommer. I enkelte tilfeller kan bruk av refleksjonsspektrofotometri være fordelaktig ettersom det effektivt unngår optisk interferens fra fra hvilke som helst utfellinger, slik som blodceller eller urinsedimenter, som er blitt tilbake på eller I lagene i enheten, eller fra atypiske urinfarger. Om ønsket kan også vanlig kjente teknikker med flourescensspektrofotometri anvendes. Videre kan transmisjonsteknikker brukes til å påvise og måle de utslagsgivende reaksjonsproduktene ved omsetning med en strøm av stråleenergi, f.eks. ultrafiolett, synlig eller infrarød stråling på en overflate I enheten og måle utsendelsen av energi fra den motsatte overflaten i enheten. Generelt er elektromagnetisk stråling i området fra 200 - 900 nm funnet å være anvendbart ved slike målinger, selv om det kan brukes enhver stråling som enheten er permeabel for og som er istand til å kvantifisere det fremstilte produkt i enheten. Forskjellige kalibreringstek-nikker kan brukes for å gi en kontroll på liganden som analyseres tilsettes ved siden av området prøvedråpen er plassert for å gi anledning til bruken av differensial-målinger i analysen.

De følgende eksempler beskriver eksperimenter som ble utført under utviklingen av foreliggende oppfinnelse.

A. Prøveinnretninger for immunoanalyse med prostetisk gruppe

som markør.

Eksempel 1 - Et standardsystem.

For å undersøke forskjellige parametre ved inkorporering av det homogene reagenssystemet for immunoanalyse hvor markøren er en prostetisk gruppe beskrevet i GB patent nr. 2.023.607 i en prøveinnretning i tørr form, ble et standardsystem utviklet eksperimentelt. Liganden som standardsystem ga respons på, var N-(2,4-dinitrofenyl)-c-mainokaprylsyre (heretter kalt "DNP"). Reagenser som utgjør de immunokjemiske bestanddelene i systemet, omfattet antistoff til DNP, et konjugat av DNP og flavinadenindinukleotid (heretterkalt "DNP-FAD") og apoglukoseoksydase.

Systemet ble utformet til å reagerer på DNP ved å vise farge på grunn av aktiveringen av apoglukoseoksidase med DNP-FAD-konjugatet. DNP-FAD som ikke bindes av antistoff, er direkte proporsjonal med DNP-konsentrasjonen. Det er registrerbart ved sin evne til å kombinere med apoglukoseoksydase og gi aktivt glukoseoksydase. Hesponssytemet omfattet følgelig i tillegg til apoenzym, antistoff og konjugat, et påvisningssystem for glukoseoksydase omfattende glukose, 3,3'-3,5'-tetrametylbenzidin (TMB) og peroksydase fra pepperrot. Etter aktivering av apoenzymet til glukoseoksydase, ble det dannet en blå farge på grunn av oksydasjonen av glukose til hydrogenperoksyd og derpå følgende omdannelse av TMB til dets blå oksyderte form i nærvær av peroksydase.

1. Fremstilling av apoenzym.

Apoenzym ble fremstilt fra en prøve av høyrenset glukoseoksydase. 10,5 ml av denne enzymoppløsnig (1.000 enheter/ml) ble blandet i et glassberger med 4,5 ml glycerol og blandingen ble nedkjølt til en temperatur på 0 - 4°C. Blandingens pH ble senket ved hjelp av 10% vandig oppløsning av svovel-syre til 1,4. Denne fremgangsmåte ble utført under konstant omrøring med begeret nedsenket i et isbad, og omrøringen ble fortsatt i 2 timer. Deretter ble oppløsningen helt over i en 1,5 x 43 cm kolonne med "Sephadex G-50" (medium) kryssbundet gelfiltreringsmedium. "Sephadex"'en var blitt bragt til likevekt før innføringen av enzymoppløsningen ved hjelp av en 30 volum-% vandig glyceroloppløsning med enpH på 1,4. Etter innføringen av enzymoppløsningen i "Sephadex"-kolonnen ble mer av den 30% glyceroloppløsningen brukt til å eluere apoenzym. Eluatet ble separert i fraksjoner og undersøkt ved hjelp av UV-absorbering ved 280 nm. De fraksjonene som oppviste absorbsjon ved denne bølgelengde, ble helt sammen med en bufferoppløsning inneholdende 50 mg aktivt kull og 25 mg dekstran. Bufferen omfattet en vandig oppløsning som var 1-molar tris-(hydroksymetyl)-aminometan til hvilken glutaminsyre ble tilsatt inntil en pH på 7,0 var oppnådd. pH-en 1 det resulterende eluatet ble deretter på nytt justert til 7 ved hjelp av en mettet oppløsning av tris-(hydroksyme-tyl)aminometan. Denne siste oppløsning ble omrørt i et isbad i 1 time. Apoenzymoppløsningen ble deretter sentrifugert og supernatanten ble filtrert gjennom 0,5 pm og 0,2 pm filtre.

2. Fremstilling av DNP- FAD- kon. 1ugat.

Konjugatet ble fremstilt som følger. N<6> (triflouracetamldo-heksyl)ademosin-5'-monofosfat ble syntetisert ved fremgangsmåten til Trayer et al., Biochem. J., 139, 609-623

(1974). 56 mg N<6->(trifluoracetamldoheksyl)adenosin-5'-monofosfat (0,1 mmol) be oppløst i ca. 10 ml vann og 25 pl tri-n-butylamin (0,1 mmol) ble tilsatt. Vannet ble fjernet under vakuum og residuet ble oppløst i 10 ml tørr dimetylfor-mamid som deretter ble fjernet under vakuum. Residuet ble adskilt fra tørr dimetylformamld ved fordamping tre ganger til. Det siste residuet ble oppløst i 10 ml tørr dimetylfor-mamid. 80 mg N,N'-karbonyldiimidazol (0,5 mmol) ble tilført og omsatt i 1,5 timer. Deretter ble 15 pl vann tilsatt og oppløsningsmidlet fjernet under vakuum. Residuet av N^-(tr i f luoracetamldoheksyl )adenosin-5 ' -monofosfat-imidazol id ble oppløst 1 10 ml dimetylformamld.

47 mg riboflavin-5'-monofosfat (0,1 mmol), renset etter framgangsmåten til Johnson et al., Anal. Biochem. 86, 526-530

(1978) ble oppløst i ca. 10 ml vann og tilført dråpevis til 20 ml aceton inneholdende 43 pl tri-n-oktylamin (0,1 mmol). Et bunnfall ble dannet før tilsetningen var fullført. Oppløsningsmidlet ble fjernet med en roterende fordamper Inntil riboflavin-5'-monofosfoatet oppløstes. Deretter ble 5 ml aceton og 5-10 ml dimetylformamld tilsatt og blandingen bragt til tørrhet. Residuet ble oppløst i 15 - 20 ml tørr dimetylformamld og bragt til tørrhet. Denne fremgangsmåten ble gjentatt tre ganger. Residuet ble oppløst i 5ml dimetylformamld og bragt sammen med den ovenfor nevnte 10 ml oppløsning av lmidazolid i dimetylformamld. Reaksjonsblandingen ble hensatt ved romtemperatur over natten og deretter ble oppløsningsmidlet fjernet. Residuet ble tatt opp i 50 ml vann og overført til en 2,5 x 25 cm kolonne me DEAE-cellulose ("Whatman DE 23") i bikarbonatformen. Kromatogrammet ble fremkalt med en linær gradient frembragt ved hjep av 2 liter vann og 2 liter 0,3M ammoniumbikarbonat (23 ml fraksjoner ble samlet opp. Tynnsjiktskromatografi på silikagel "60 F254" ved hjelpe av etanol/lM trietylammoniumbikarbonat pH 7,8 (volumforhold 7:3) viste at fraksjoner nr. 68-73 inneholdt større (Rp 0,75) og mindre (Rp 0,36) gule forbindelser. Disse fraksjoner ble samlet og det optiske adsorbsjonsspektrum hadde maksima ved 267 nm, 373 nm og 450 nm.

Oppløsningsmidlet ble fjernet fra det samlede materiale og residuet ble oppløst i ca. 5 ml vann. Denne oppløsningen ble justert i ca. 5 ml vann. Denne oppløsnignen ble justert til pH 11,0 med 5M NaOH og hensatt ved romtemperatur i 9 timer. Tynnsjiktskromatografi viste at bestanddelen med Rp 0,75 forsvant mens et nytt gult materiale med Rp 0,37 kom til syne. Reaksjonsblandingen ble justert til pH 8,0 med saltsyre og overført til en kolonne (2,5 x 20 cm) med DEAE-cellulose i bikarbonatformen. Kromatogrammet ble fremkalt med en lineær gradient av 1 liter vann og 1 liter 0,2M ammoniumbikarbonat. Det gule eluatet fra kolonnen ble samlet og oppløsningsmidlet fjernet. Residuet ble adsorbert på 2 g silikagel som var plassert på toppen av kolonnen med 50 g silikagel bragt til likevekt med etanol/lM trietylammoniumbikarbonat, pH 7,8 (volumforhold 8;2). Kromatogrammet ble fremkalt med et samme oppløsningsmidlet, den gule bestanddelen med Rp 0,37 ble samlet opp og oppløsningsmidlet fjernet. Utbyttet av flavin-N^-6-N-aminoheksyladenin-dinukleotid (heretter kalt N<6> (aminoheksyl)FAD)) basert på adsorbsjon ved 450 nm var ca. 10$.

Til 10 ml 0.21M vandig natriumbikarbonat inneholdende 0,06 mmol N<6> (aminoheksyl)FAD ble det tilsatt dråpevis 17 pl 2,4-dinitrofluorbenzen (0,13 mmol) i 1 ml absolutt etanol under omrøring. Reaksjonsblandingen ble omrørt i mørket i 4-6 timer og deretter ble det tilsatt 10 pl 2,4-dinitrofluorenzen (0,08 mmol) oppløst I 0,5 ml etanol. Reaksjonsblandingen ble omrørt over natten. Tynnsjiktskromataografi på silikagel (silikagel 60, "F-254" ved hjelp av etanol/trietylammoniumbikarbonat, pH 7,5, (7:3)-oppløsningsmiddel, viste at all N^

(aminoheksyl)FAD var omsatt.

Reaksjonsblandingen ble filtrert gjenom "Whatman nr. 1"-papir og filtratet tilført en 2,5 x 56 cm kolonne med "Sephadex LH-20" som var bragt til likevekt med 0,3M ammoniumkarbonat. Kromatogrammet ble fremkalt med dette oppløsningsmidlet og flere gule stoffer ble eluert som separate topper. Toppen mellom 470 og 590 ml av 0,3M ammoniumbikarbonat var den eneste som aktiverte apoglukoseoksydase. Tynnsjiktskromato-graf i som beskrevet ovenfor skilte materialet i to gule, fluorescerende punkter med Rf «= 0,84 og 0,89. Det optiske absorbsjonsspektrum hadde maksima ved 265, 370 og 455 nm.

En prøve av produktet ble omsatt med et fosfodiesteraseprepa-rat fra slangegift (Croteus adamatoces ). Tynnsjiktskromato-graf i viste at raksjonsproduktene var riboflavin-5'-monofos-fat og N^-(2,4-dinitrofenylamlnoheksyl)adenosin-5'-monofos-fat. Det var åpenbart ut fra Intensitetene på flekkene at den med Rf = 0,84 var stoffet som ble brutt ned av enzymet. Nedbrytingen var ikke fullstendig etter 3 dager.

3. Fremstilling av prøveinnretningen.

Innretningen ble fremstilt ved inkorporereing av bestanddelene i en bærermatrise av papir ved en fremgangsmåte med to bad. Det første impregneringsbad var en acetonoppløsning laget av 2 mM TMB. Biter av ''Eaton & Dikeman 205" filterpapir som målte 4 cm i kvadrat ble dyppet 1 TMB-oppløsningen (det første bad), fjernet og tørket i en gjennomluftingsovn ved 90"C i 1-2 minutter.

En oppløsning for det annet bad ble fremstilt ved å kombinere de følgende bestanddeler i den angitte rekkefølge:

<*> Bufferen omfatter en vandig oppløsning av 10,8 g tris-(hydroksymetyl)aminometan, 9,7 g glutaminsyre og 1,6 g sltronsyre pr. 100 ml oppløsning. <*«> Delvis rnset antistoff ble fremstilt fra et DNP-antis-serum. Immunoglobulinfraksjonen ble isolert ved utfelling med ammoniumsulfat som beskrevet av Livingston i "Methods in Enzymology", bind XXXIV), W.B.Jakoby og M.Wilchek, 3ds.), side 725, Academlc Press, New York, 1974). Det endelige bunnfall fra denne fremgangsmåten ble oppløst 1 50 mM kaliumfosfat (pH 6,8) for å bringe det totale volumet til det opprinnelige volumet anvendt serum. Denne oppløsningen ble dialysert over natten ved 4°C mot 500 volumdeler av den samme buffer (50 mM kaliumfosfat).

Apoenzymoppløsningen fremstilt som beskrevet ovenfor, ble før anvendelsen i det foreliggende eksperiment, dialysert mot 20 mM trisf lutamatbuf f er ved en pH på 7,0 og som inneholdt 10 vekt-5É mannitol.

Denne oppløsningen for det andre badet ble deretter brukt til å impregnere papirene som tidligere var blitt impregnert med

TMB. De TMB-inneholdende papirene ble dyppet i oppløsningen for det andre badet, fjernet og tørket i en gjennomluftningsovn ved 90°C i 6 minutter.

Det ble fremstilt prøveinnretninger med 0,5 cm i kvadrat av det tørkede papiret montert på den ene enden av biaksialt orienterte polystyrenstrlmler som målte ca. 0,5 x 8,3 cm. Monteringen ble utført ved å brukte en dobbeltsidig klebrig tape, "Double-Stick".

Reagenssystemet ble ferdiglaget ved å bringe reagensinnret-ningen fremstilt ovenfor 1 kontakt med vandige oppløsninger som ble fremstilt med 1 pM DNP-FAD-konjugat. Alle oppløsnin-gene som ble benyttet ved utprøvingen av innretningene, inneholdt den mengden konjugat og enten ingen eller varierende mengder av liganden, DNP. Følgelig ble det fremstilt fire prøveoppløsninger som følger:

4. Vurdering av utførelsen.

Ved undersøkelse av utførelsen av prøveinnretningene ble hver fuktet med 15 pl av en av de ovenfor nevnte prøveoppløsnin-ger. Etter å ha vært i kontakt med prøveoppløsningen, ble hver innretning inkubert i 6 minutter i en overdekekt petriskål med et fuktet stykke filterpapir i bunnen. Dette tjente som et fuktighetskammer.

Utførelsen av reagensinnretningene fremstilt og inkubert som beskrevet ovenfor ble analysert Instrumentelt ved hjelp av en Innretning kjent som "Rapid Scanner". Denne innretningen er et søkende refleksjons-spektrofotogmeter tilkoplet en "PDP-12" datamaskin. Instrumentet brukes til hurtig måling av refleksjonsspektra i det synlige område. Datamaskinen gir anledning til lagring av spektraldata og beregninger. Målinger av reagensstrimlenes utførelse i hurtigscanneren har følgende fordeler fremfor visuelle observasjoner av de samme Innretningene: 1. Lyskilden og forholdene rundt prøven holdes konstante. Ved visuelle avlesninger kan lyskilden variere, ikke bare med hensyn til de enkelte bølgelengder, men også i forhold til beliggenheten av strimlene som observeres. 2. Egenskapene til detektoren forblir konstante i hurtigscanneren. Ved visuell observasjon varierer detektoren (dvs. øynene til den som observerer) fra person til person, og med den sammen person, fra dag til dag. 3. Hurtigscanneren gir mere presise kvantifiseringer av data enn det som er tilfelle ved menneskelig observasjon, og gir derved anledning til å gjøre sammenligninger mellom resultatene på en mere objektiv måte enn ved visuell observasjon.

Prøveinnretninger som var blitt inokulert med de fire oppløsningene ble analysert med hurtigscanneren. Spektra erholdt fra disse analysene er gjengitt i fig. 1. De fire kurvene i fig. 1 viser prosent refleksjon i forhold til bølgelengde. Av spesiell interesse er strimlenes opptreden ved 660 nm, bølgelengden for maksimal absorbsjon i blå-fargeområdet til okdysert TMB. Refleksjonsprosenten avtar med økende ligandkonsentrasjon og indikerer derved innretnin-gens evne til kvantitativt å analysere oppløsninger med varaierende konsentrasjon av DNP-kaproat. Videre ved fargeforskjellene mellom hver enkelt av ligandoppløsningene store nok til å muliggjøre visuell korrelasjon mellom fargen på prøveinnretningen og ligandkonsentrasjonen.

Dette eksperimentet viser at antistoff og apoenzym kan konkurrere samtidig om det respektive konjugat, i dette tilfelle DNP-FAD, uten en fastlåst rekkefølge i reagenstil-setningen. Videre viser det hvor praktisk det er å blande og lagre reagensene for et immunokjemisk analysesystem lenge før analysen skal utføres.

Eksempel II - En enhetlig prøveinnretning for Immunoanalyse.

Det ble utført et eksperiment hvor det ble gjort et forsøk på å forbedre standardsystemet fra eksempel I ved å inkorporere konjugatet direkte i bærerenheten før utførelsen av analysen og derved fremstilte en enhetlig, homogen prøveinnretning for immunoanalyse.

Et stykke "Buckeye S-22"-papir som målte 3,75 x 6,25 cm, ble senket ned 1 et første oppløsningsbad med 5 mM TMB i aceton inneholdende 0,1 g/100 ml av en emulgator ("GAF ON-870"). Denne siste bestanddelen i det første badet er en polyetylen-oksydpolymer hvor endene er beskyttet med en lang fett-alkoholkjede. Molforholdet mellom etylenoksyd og fettalkohol som omslutter polymeren er 30:1. Papiret ble deretter tørket ved 50"C i 1 minutt.

Etter tørking ble papiret senket ned i et annet oppløsnings-bad som var fremstilt ved å kombinere de følgende bestanddeler :

Etter tørking ved 50°C i 12 minutter ble papiret senket ned i et tredje oppløsningsbad fremstilt ved blanding av 250 pl 80 pM DNP-FAD-konjugat i vann med 9,75 ml n-propanol til å gi et oppløsningsbad med 2pM DNP-FAD. Etter den tredje impreg-neringen ble papiret tørket ved 50°C i 4 minutter.

Det ble fremstilt prøveinnretninger med kvadrater på 0,5 cm. av det tre ganger impregnerte papiret montert på den ene enden av biaksialt orienterte polystyrenstrimler som målte ca. 0,5 x 8,3 cm. Monteringen ble utført ved å bruke en dobbeltsidig tape.

Disse innretningene ble undersøkt med hensyn til deres evne til å gi respons på forskjellige konsentrasjoner av DNP ved dypping i de respektive oppløsninger, inkubering av de dyppede strimlene i 3 minuter og ved å analysere strimlene i hurtigscanneren (se eksempel I) for å bestemme lysrefleksjo-nen. Dataene opnådd ved 660 nm er gjengitt grafisk i fig. 2 hvor K/S er plottet mot DNP-konsentrasjonen. K/S er definert som følger:

hvor K er en konstant, S er spredningskoeffisienten til det bestemte relfkejsonsmedium og R er ref leksjonsfraksjonen fra prøvestrimmelen. Dette forholdet er en forenklet utgave av den velkjente Eubelka-Munk-1 igningen (Gustav Korttim, "Reflectance Spectroscpy", sidene 106-111, Springer-Verlag, New York (1969 )).

Resultatene fra hurtigscanneren ble også brukt til å fastlegge utførelsen ved å beregne fargedifferanseenheter (AE) som er gjengitt i tabell A. aE er en verdi som er proporsjonal med fargeutviklingen som følge av nærværet av apoenzym og DNP-FAD-konjugatet sammen med indikatoren, peroksydase og glukose tilstede i prøveinnretningen. Tre ganger AE i henhold til overenskomsnte beskrevet 1 "Supple-ment No. 2 to Commission Internationale de 1'Eclairage (Paris), Publication No. 15, Colorimetry, (E,-1,3,1), 1971".

Dataene viser brukbarheten av en homogen immunoanalyse i fast form som er gjort fullstendig enhetlig.

Eksempel III - Forbedret stabilitet av apoenzym i en bærer

matriks.

Eksperimentelle forsøk ble gjort for å finne en måte å stabilisere apoglukoseoksydase i en bærermatrise slik som papir, for derved å sikre større reaktivitet, sensitivitet og levetid for prøveinretningen. Reagensstrimler ble fremstilt på samme måte som i eksempel I, med unntak av at antistoffet ikke ble tatt med. Et system med to bad ble benyttet idet stykker av "Eaton & Dikeman 205"-papir som målte 4 cm i kvadrat, ble impregnert i et første bad omfattende TMB og aceton, tørket og impregnert på nytt i et annet oppløsningsbad inneholdende de øvrige bestanddelene i et reagenssystem som er følsomt for konjugatet. Innretninger fremstilt på denne måten ble varmebehandlet og Inokulert med konjugat for å undersøke effekten av serumalbumin fra okse (BSA) og polyvinylalkohol (PVA) på apoenzymets stabilitet. 2 ml av en 2 mM oppøsning av 3,3',5,5'-tetra-metylbenzidin (TMB) i aceton ble brukt for å impregnere et 4 cm stort stykke "Eaton & Dikeman 205"-filterpapir. Papiret ble tørket ved 90°C i 1-2 minutter i en gjennomluftet ovn.

Det ble fremstilt et annet oppløsningsbad som inneholdt tris-glutamatcitratbuffer (pH 6,4) i en konsentrasjon på 0,33 M (se eksempel I), 0,1M glukose, 19 enheter/ml peroksydase fra pepperrot, glukoseoksydaseapoenzym (.1,3 nmol FAD-bindingsseter pr. ml), serumalbumin fra okse (BSA) i en konsentrasjon på 0,5 mg/ml og polyvinylalkohol (PVA) i en konsentrasjon på 10 mg/ml. Deretter ble de TMB-impregnerte papirene hurtig senket ned i det andre oppløsningsbadet, tatt opp igjen og tørket i en gjennomluftnlngsovn ved 90°C i ca. 7 minutter.

Det ble fremstilt prøveinnretninger med 0,5 cm store kvadratiske stykker av det impregnerte, tørkede papir montert på endene av biaksialt orienterte polystyrenstrimler som målte ca. 0,5 x 8,3 cm. Monteringen ble utført ved bruken av dobbeltsidig tape, "Double-Stick". De på denne måten fremstilte strimler ble lagret med silikagel som tørkemiddel i ravflasker ved 4°C før de ble utsatt for varmebehandlings-eksperimenter.

Strimlene som inneholdt BSA og PVA likesåvel som de som ikke inneholdt disse materialene, ble utsatt for varmebehandling ved lagring i de lukkede, tørkemiddel-innholdende flaskene i 3 dager ved 50°C. Beskaffenheten til de behandlede reagens-strimlene ble undersøkt ved å pipettere porsjoner på 15 pl av en av 4jjM DNP-FAD-oppløsning over på underlaget og inkubere i 6 minutter i en lukket petriskål med et fuktet stykke filterpapir i bunnen. De ubehandlede strimlene ble inokulert som ovenfor og inkubert i 2 minutter. Etter inkuberingen ble strimlene analysert ved hjelp av hurtigscan-nerinnretningen som beskrevet i eksempel I ovenfor. Informa-sjonen fra hurtigscanneren fremkom som fargedifferanseenheter (AE) med ureagerte strimler som referanse, dvs. disse var fuktet bare med destillert vann istedetfor DNP-FAD-konjugatet. Resultatene av hurtigscanneranalysene av de behandlede, stabiliserte prøveinnretningene fremkommer nedenfor i tabell B.

Dataene i tabell B viser at uten nærværet av BSA og PVA blir strimlenes evne til å gi respons markert forminsket, mens det fremkommer en økning i fargedifferanseenheter på 6,5 - 9 ganger når BSA og PVA er tilstede. Videre stabiliserer nærværet av BSA og PVA i sammensetningen strimlene markert mot varmepåvirkning. Dataene i dette eksperimentet viser følgelig oppsiktsvekkende fordeler ved bruken av disse stabiliserende midlene ved frembringelse av apoenzym-basert immunoanalyse i fast form.

Eksempel IV - Anvendelse av standardsystemet i en teofvllln-analyse.

Et eksperiment ble utført i et forsøk på å redusere standardsystemet beskrevet i eksemplene I - III til en praktisk anvendelse med kliniske betydning, dvs. en teofyllinprøve. Teofyllin [1,3-dimetylxantin, kfr. The Merck Index, 9. utg. , side 1196 (1976)] er et legemidel som er nyttig ved be-handling med astma. Hos de fleste pasienter ligger det terapeutiske området for konsentrasjon i serum mellom 10 og 20 pg/ml mens toksitet nesten uten unntak opptrer ved blodnivåer på over 35 pg/ml. Det ble fremstilt en prøve-innretning på samme måte som 1 de foregående eksemplene, med unntak av at konjugatet som ble brukt omfattet FAD bundet kovalent til teofyllin, og at antistoffet som ble benyttet var delvis renset antistoff mot teofyllin.

1. Konjugatsystese.

Konjugatmolekylet som FAD bindes kovalent til teofyllin ved hjelp av, ble fremstilt som følger: 1,3-dimetyl-l,6,7,8-tetrahydropyrldo[l ,2e]-pyrln^-2 ,4-9-[3H]-trlon (0,9 mg/3,62 nmmol), ble fremstilt 1 henhold til metoden til Cook et al.,<* >ble tilsatt til 0,2 ml dimetylsulfoksyd inneholdende 2,4 prool N<6->(aminoheksyl)-FAD. Etter 4 timer ble ytterligere 1,8 mg (7,3 pmol) av trionet tilsatt. Oppløsningen ble omrørt over natten, oppløsningsmidlet fordampet under vakuum (0,1 mm Hg) og residuet ble kromatografert på en kolonne (2,5 x 90 cm) med "Sephadex LH 20" ekvilibrert som 0,3 M trietylammoniumbikarbonat, pH 7,8. Råproduktet som eluerte mellom 216 og 246 ml elueringsmiddel ble samlet opp, overført til en 20 x 20 cm x 100 m si 1ikagelplate og kromatografert ved hjelp av etanol/lM trietylammoniumbikarbonat, pH 7,8 (volumforhold 8:2). Båndet som inneholdt det ønskede produkt Rp 0,77) ble skrapet av platen, ekstrahert med IM trietylammoniumbikar-bonatbuffer, filtrert og konsentret. Avsluttende rensing ved kromatografering på "Sephadex LH-20" ekvilibrert med 0.3M buffer ga 1,26 pmol teofyllin-FAD bestemt ved adsorbsjonen ved 450 nm, som tilsvarte et utbytte på 53$. ••Cook, C.E., Twine, M.E. , Meyers, M. , Amerson, E. , Kepler, J.A. & Taylor,G.F., Res. Commun. Chem. Path. Pharmacol. 13, 497-505, (1976). Det således fremstilte konjugat har strukturen angitt ovenfor under overskriften "Markører som utgjøres av protetisk gruppe i enzym" hvor -R-L har strukturen

2. Fremstilling av prøveinnretningen.

Ved å bruke dette teofyllln-FAD-konjugatet ble det fremstilt reagensstrimler for analysen av teofyllin. Stykker av "Buckeye S-22"-papir som målte 4 cm i kvadrat ble impregnert med et første oppløsningsbad omfattende 5 mM TMB i aceton innehldende 0,1 g/100 ml av en emulgator kjent som "ON-870". Etter dypping i det første oppløsningsbadet ble det impregnerte papiret tørket ved 50° C i 1 minutt i en gjennomluftningsovn. Etter tørking ble papirene impregnert med et annet oppløsningsbad. Det annet bad var en vandig oppløsning som var 0,33 M med hensyn til bufferen beskrevet i eksempel I som ga en pH på 6,4, 0,1 M med hensyn til glukose, 19 enheter/ml peroksydase fra pepperrot, glukoseoksydaseapoenzym (l.Onmol FAD-bindingsseter pr. ml), delvis renset antistoff mot teofyllin (0,14 mol) antistoff pr. ml oppløs-ningsbad), 0,5 mg/ml serumalbumin fra okse og 0,5 g polyvinylalkohol pr. 100 ml. Antiserumet mot teofyllin ble tatt fra kaniner immunisert med et teofyllin-immunogenkonjugat som beskrevet av Cook et al., Res. Comm. Chem. Path. Pharmacol. 13:497:505 (1976). Serumet ble delvis renset som i eksempel 1. Etter kort neddyping av de tørkede papirene i det andre oppløsningsbdet, ble en annen tørking utført ved 50° C i 12 minutter i en gjennomluftningsovn.

Det ble fremstilt prøveinnretninger med 0,5 cm^ av de tre ganger impregnerte papirene montert på strimler av polystyren som målte 0,5 x 8,3 cm ved hjelp av dobbeltsidig tape.

Det ble fremstilt oppløsninger av teofyllin i vann med teofyllinkonsentras joner i området 0 - 8 jjM, for å teste utførelsen av prøveinnretningene fremstilt ovenfor. Innretningene ble dyppet i disse oppløsningene og, etter en inkubasjonsperiode på 2 minutter, ble de analysert i hurtigscanneren beskrevet i eksempel I. Mengderesponskurven er vist i fig. 3 hvor K/S er plottet mot teofyl1inkonsentra-sjonen.

De plottede data viser at det er en observerbar endring i fargeintensitet med varierende mengder teofyllin i oppløs-ning, og at endringen gir en indikasjon på den enkelte teofyllinkonsentrasjon.

Eksempel V - Anvendelse av standardsystemet på en fenvtoin-analyse.

Som 1 eksempel IV, ble det stilt opp et eksperiment for å tilpasse standardsystemet i eksemplene I - III til en analyse av en analyt med klinisk betydning: fenytoin. Eksperimentet viste en homogen immunoanalyse med en prostetisk gruppe som markør, sin tilpasningsevne til en tørr reagensstrimmelform for fenyltoinbestemmelse. Som i de foregående eksemplene, tillot bærermatriseformen samtidig konkurranse mellom fenytoin merket med en prostetisk gruppe og analyten (fenytoin) med hensyn til binding til et antistoff for fenytoin.

1. Syntese av f enytoin- FAD- kon, 1ugat.

Til 14,7 mg (40,0 jjM) 5-(2'-karboksybutyloksyfenyl-5-fenylhydantoln i 1,8 ml molekylsiltørket didmetylformamld (DMF) under argon ble tilsatt 0,10 ml (40,0 umol) av en 400 jjM oppløsning av isobutylkloroformat i DMF. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1 time ved romtemperatur. Til reaksjonsblandingen ble det tilsatt en oppløsning av 10,0 pmol N<6 >(aminoheksyl)-FAD i 2,0 ml molekylsiltørket dimetylsulfoksyd (DMSO), fulgt av 0,05 ml av en 400 pM oppløsning av trietyl-amin i DMF. Blandingen ble omrørt i 19 timer ved romtemperatur, deretter fortynnet til 450 ml med vann og overført til en 1,5 x 30 cm kolonne med "Whatman DE-52" cellulose-anionbytterharpiks (bikarbonatform) ved hjelp av en peristal-tisk pumpe. Kolonnen ble deretter eluert med en gradient av 1,5 liter vann mot 1,5 liter 0,3M trietylammoniumbikarbonat-vandig oppløsning. Fraksjoner på omtrent 16 ml ble samlet idet fraksjonene 70-88 ble funnet å inneholde produktet på grunnlag av reaksjon med apoglukoseoksydase. Disse fraksjonene ble slått sammen og oppløsningen justert til pH 7. Utbyttet ble bestemt til 4,78 pmol (47,8$ utbytte) på grunnlag av oppløsningens absorbsjon ved 450 nm ved hjelp av millimolarekstinksjonskoefffesienten til FAD (E450= 11,3).

2. Fremstiling av prøveinnretninger.

Prøveinnretnlngene ble fremstilt ved etter hverandre følgende nedsenkninger av et papirsstykke i 3 oppløsninger, hvorav hver enkelt inneholder forskjellige bestanddeler i et immunoanalysesystem med muligheter til å reagere på nærværet av fenytoin, med tørking mellom hver neddypping. Et stykke papir som målte 4 cm^ ("S-22"), ble således i en 5 mM oppløsning av TMB i aceton Inneholdende 0, 1% (vekt/volum) av en emulgator kjent eom "ON-870". Etter tørking ved 50°C i 1 minutt ble papiret dyppet i en annen, vandig oppløsning som var 0,2M med hensyn til tris-glutamatbuffer, pH 6,4, 0,1M med hensyn til glukose, peroksydase fra pepperrot (19 enheter/- ml), apoglukoseoksydase (1,0 nmol FAD-bindingsenheter/ml), 0,5 mg/ml serumalbumin fra okse, 0,5 g/100 ml polyvinylalkohol (se eksempel III), og antifenytoinserum (0,14 ml antlserum pr. ml). Antiserumet ble frembragt mot o-kaproyldifenylhydan-toin på samme måte som i eksempel IV.

Etter tørking ved 50°C i 12 minutter i en gjennomluftnlngsovn ble papiret impregnert ved neddypping i en tredje oppløsning inneholdende FAD-fenytoinkonjugatet (0,5 pM) i n-propanol med 0,1 g/100 ml "Gafquta 734", en polymer med kvaternære amlngrupper.

Etter tørking ved 50° C i 3-4 minutter ble det impregnerte papiret brukt til å lage prøvestrimler med 0,5 cm^ av det reagensladede papir montert på hver ende av en strimmel av biaksialt orientert pollystyrenfilm som målte 0,5 x 8,3 cm. Monteringen ble utført ved hjelp av den dobbeltsidige tap "Double-Stick".

For å fastlegge nytten av disse prøveinnretnlngene med hensyn til repons på nærværet av fenytoin, ble de inokulert med prøveoppløsninger inneholdende analyt i konsentrasjoner som varierte fra 0 - 8 pM og analysert 1 hurtigscanneren 2 minutter etter inokulering. Fig. 4 viser endringen K/S med fenytoinkonsentrasjoner på 9, 0,5, 1, 2,4 og 8 jjM i vann. Dataene gjengitt i fig- 4 viser at prøveinnretningen gir god respons på nærværet av fenytoin og muliggjør en elttvint bestemmelse av forskjellige konsentrasjoner av analyten.

Eksempel VI - Anvendelse av det enhetlige standardsystem på

en prøveinnretning for immunoanalyse ved hjelp

av fluorescens.

Det ble stilt opp et eksperiment for å undersøke anvendbar-heten av det enhetlige standardsystemet 1 eksempel II på fluorescenslmmunoanalyse. En prøveinnretning ble således fremstilt som i eksempel II, idet TMB ble erstattet med p-hydroksyfenyleddlksyre. Oksydasjon av p-hydroksyfenyleddik-syre med peroksyd i nærvær av peroksydase gir et fluorometrisk registrerbart produkt.

Innretningen ble fremstilt på følgende måte: Et stykke "Buckeye S-22"-papir ble impregnert med en oppløsning omfattende:

Etter impregnering ble papiret tørket i en ovn med luftsirku-lasjon ved 50°C i 22 minutter.

Det tørkede papiret ble impregnert med en 2 pM oppløsning av DNP-FAD-konjugat i n-propanol og tørket ved 50°C 1 5 minutter.

Metallisk "Mylar"-tape ble festet på den ene siden av det tørkede reagenspapiret. Papiret ble montert på biaksialt orientert polysytrenflim ved hjelp av "Double-Stick"-tape festet på "Mylar"-laget. Den oppnådde prøveinnretning omfattet et 0,2 x 0,4" stykke "Mylar"-dekket reagenspapir montert på en polystyrenstrimmel som målte 0,2 x 3,5".

Som en kontorllinnretning for sammenligning med prøveinnret-ningen, ble uimpregnert papir festet på samme måten med "Mylar" og "Double-Stick" til polystyrenstrimler.

De fluorescerende strimlene ble undersøkt med hensyn til deres funksjon ved hjep av et instrument som måler lysenergi. En kvartsfiberoptikk ble plassert i en 45° vinkel med planet til innretningen som skulle undersøkes. Denne fiberoptikken ble utstyrt med en kviksølvlampe og et filter som slipper gjennom eksitasjonsbåndet ved 314 nm. Fluorescensen fra en bestemt innretning ble oppnådd direkte fra en annen fiberop-tikk plassert i 45° i forhold til prøveinnretningsplanet og oppfanget i en interferensfilter (420 nm). Styrken ble avlest i millivolt ved hjelp av lysmåleren.

For å undersøke kapaisteten til de fluorescernede prøve-innretnlngene ble 30 pl porsjoner med DNP-inneholdende prøveoppløsninger pipettert over på reagenspapirdelene og inkubert i 11 minutter ved romtemperatur i et fuktighetskammer. DNP-prøveoppløsningené varierte i konsentrasjon fra 0-8 pM DNP. Fluorescensstyrken ble målt for 0, 1, 2, 4 og 8 pM oppløsninger ved hjelp av lysmåleren. Målingen ble gjort om igjen med kontroll innretningene. Fig. 5 viser mengdere-sponsforholdet for prøveinnretnlngene. Data fra kontroll-innretningene bekreftet av dataene i fig. 5 ikke var påvirket av noen vesentlig fluorescens fra DNP-analyten.

Dette eksperimentet viser følgelig den vellykkede anvendelse av en homogenteknikk for immunoanalyse med fluorescens som den registrerbare respons i en fast innretning.

B. Enzvmsubstratmerkede prøveinnretninger for immunoanalyse. Eksempel VII - Enhet med flere papirlag.

I eksperimentet beskrevet i dette eksempel ble det fremstilt en intergrert, flerlags analytisk enhet, og denne ble undersøkt for sin evne til kvantitativt å bestemme, avlest ved forsideflourometri, nærværet av teofyllin i en væs-keprøve .

Fremstilling av antlserum.

Antlserum til teofyllin ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i US patentsøknad nr 87.819, inngitt 23. oktober 1979 og overdradd til nærværende rettighetshaver, med dette tatt med som henvisning.

Fremstilling av konjugat.

Galaktosyl-umbelliferon-teofyllin (konjugat) ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i den tidligere nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av enhet.

Oppløsningen brukt ved fremstilling av ett lag i enheten spesifik for teofyllin inneholdt følgende bestanddeler:

Et 3 x 1,2 cm lag "Whatman 21 ET"-papir ble montert ved hjelp av dobbeltsidig tape på en 8,2 x 1,2 cm polystyrenbærer hvoretter den ovenfor fremstilte oppløsning ble pipettert over på laget av "Whatman el ET"-paplr. Papiret ble tørket i en konveksjonsovn ved 50°C i 10 minutter.

En annen oppløsning ble deretter fremstilt ved å oppløse konjugatet i 50 pl vann til en endelig konsentrasjon på 14,4 pM i denne oppløsning. Den således fremstilte oppløsning ble deretter pipettert over på et 1,0 x 3,0 cm lag av "Whatman 54"-papir. Dette impregnerte laget ble så tørket len konveksjonsovn ved 50°C i 10 minutter.

Deretter ble det annet lag festet langs en kant til det første lag ved hjelp av en strimmel dobbeltsidig tape.

Prøveoppløsning.

Teofyllin ble tilsatt til porsjoner med 0,05 M Bicine-buffer, pH 8,5, hvorved man fikk endelig teofyllinkonsentrasjoner med henholdsvis 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 og 40 pg/ml. Analysefremgangsmåter.

De analytiske enhetene som var blitt fremstilt og festet til bærerne som beskrevet ovenfor, ble hver innført i en mekanisk holder egnet for å plassere Innretningen vertikalt i et flourometer. Like før innføring av enheten og holderen i fluormetret, ble en 250 pl porsjon av en av teofyllin-oppløsningene, fremstilt som beskrevet ovenfor, pipettert over på den avdekkede overflaten av det konjugat-inneholdende lag.

Fluorometret var blitt justert til å gi en eksitasjonslyskilde med bølgelengde 405 nm, som traff overflaten til enheten i en vinkel på 60°C fra normalen på overflaten, og til å måle emittert lys med en bølgelengde på 450 nm. En forsidemållng av fluorescens ble gjort i en vinkel på 30°C fra normalen på underlaget.

Fluorescensresponsen hos hver prøve ble først målt over tid (0 - 200 sekunder) og deretter ble det gjort avlesninger for hver ved 200 sekunder.

Resultater.

Avlesningene oppnådd ved denne analytiske fremgangsmåten var i form av relativ fluorescens. Den observante, relative fluorescens ble sammenlignet med mengden teofyllin tilstede i den tilførte prøven. Fluorescensresponsen som funksjon av tiden er vist i fig. 6. Fluorescensen ved 200 sekunder ble plottet som en funksjon av teofyllinkonsentrasjonen og ga standardkurven for teofylin i fig. 7.

Konklusjon.

De oppnådde data viser at den integrerte analytiske enhet gir kvantitativt registrerbar respons på teofyllinkonsentrasjonen hos hver av de undersøkte porsjoner. Inhibering av reaksjonen ble forårsaket av nærværet av antistoff til teofyllin. Økende konsentrasjon av teofyllin overvant inhiberingen som resulterte i en teofyllin-avhengig økning i frembringelsen av fluorescerende produkt.

Eksempel VIII - Frysetørket enhet.

I eksperimentet redegjort for i dette eksempel ble det oppnådd en enhet for teofyllinbestemmelse bestående av et enkelt lag ved hjelp av temperaturkontrollteknikker for å forhindre ugunstig gjensidig påvirkning av reagenser.

Antiserumfremstilling.

Antlserum for teofyllin ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i den ovenfor nevnte US patentsøknad nr. 87.819. Antlserumet ble utfelt med vandig ammoniumsulfat, 33 mg/dl, bunnfallet ble oppløst og dialysert mot 0,05 M Bicine-buffer (pH 8,5) og det ble oppnådd et konsentrat av teofyllln-antlstoff. Konsentratet inneholdt ca 200 pmol teofyllin-bindingsseter pr. ml.

Fremstilling av konjugat.

Galaktosyl-umbelliferon-teofyllin (konjugat) ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i den ovenfor nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av enhet.

Den første oppløsning brukt ved fremstilling av den spesifike enheten for teofyllin bestående av ett lag, inneholdt de følgende bestanddeler:

Et 0,5 x 1,0 cm stort lag av "Whatman 31 ET"-papir ble montert ved hjelp av dobbeltsidig tape på en 8,2 x 0,5 cm stor polystyrenbærer og deretter ble 20 ul av den ovenfor fremstilte oppløsning pipettert over på laget av "Whatman 31 ET"-papir. Papiret ble tørket 1 en konveksjonsovn ved 50°C i 10 minutter og deretter avkjølt på tørris 1 5 minutter i et rom med lav fuktighet.

En 6,13 mM oppløsning av teofyl1in-umbel1iferon-galaktose i dimetylsulfoksyd (DMSO) ble fortynnet til en 0,077 mM opp-løsning i vann og 20 pl ble overført til hvert av papirlagene som var blitt behandlet som beskrevet ovenfor. Enhetene ble frysetørket over natten.

Prøveoppløsning.

Teofyllin ble tilsatt til porsjoner med 0,05 M Bicine-buffer hvorved man får sluttkonsentrasjoner av teofyllin på hhv. 0,0, 4,0, 16,0 og 40 pg/ml.

Analysefremgangsmåte.

Analyseenhetene som var blitt fremstilt og festet til bærere som beskrevet ovenfor, ble hver innført i en mekanisk holder egnet for å horisontalstille innretningen i en refleksjonslysmåler. Like før innføring av enheten og holderen I refleksjonslysmåleren, hie en porsjon på 50 pl av en av teofyllinoppløsningene, fremstilt som beskrevet ovenfor, ble pipettert over på den eksponerte overflaten. Lysmåleren var blitt Justert til å registrere endringer i refleksjonen ved 400 nanometer.

Refleksjonen 1 hver oppløsning ble først målt over tid (0-200 sekunder) og deretter ble avlesninger av hver gjort ved 200 sekunder.

Resultater.

Dataene oppnådd ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er fremstilt grafisk i fig. 8. Ordinatenhetene (K/S) er definert som i eksempel II.

Konklusjon.

De oppnådde data viser at den integrerteanalytiske enhet gir en kvantitativ, kromogen repons på teofyllinkonsentrasjonen I hver av de analyserte prøvene.

Under disse forhold inhiberes reaksjonen av nærværet av antisera, og denne inhiberingen overvinnes litt etter litt ved å øke teofylllnkonsentrasjonene.

Eksempel IX - Impregnerte multippelenheter.

I eksperimentet beskrevet i dette eksempel ble det fremstilt en enhet med et lag som ble undersøkt for sin evne til kvantitativt å bestemme, avlest ved forsidefluorometri, teofyllin i en væskeprøve.

Fremstilling av antlserum.

Antlserum for teofyllin ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i den ovenfor nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av konjugat.

Galaktosyl-umbelliferon-teofylliii (konjugat) ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet 1 den ovenfor nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av enhet.

Oppløsningene brukt ved fremstiling av den teofyllinspesifike enhet inneholdt de følgende bestanddeler:

Et 1 x 1 cm stort lag av "Whatman 31 ET"-papir ble laminert på sølv-"mylar"- og montert ved hjelp av dobbeltsidig tape på en 8,3 x 1 cm stor polystyrenbærer, hvoretter den ovenfor fremstilte, vandige oppløsning ble pipettert på laget med "Whatman 31ET"-papir. Andre, underliggende reflekterende lag, slik som de som er forsølvet eller opake, egner seg også. Papiret ble tørket 1 en konveksjonsovn ved 40°C i 15 minutter. Den organiske oppløsningen ble deretter pipettert på papiret som inneholdt det tørkede residu fra den vandige oppløsningen, og tørket i en konveksjonsovn ved 50°C 1 15 minutter.

Prøveoppløsning.

Teofyllin ble tilsatt til porsjoner av vann hvoretter det ble oppnådd en endelig konsentrasjon av teofyllin på hhv. 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 10,0, 20,0 og 40,0 pg/ml. Analysefremgangsmåte.

Analyseenhetene som var blitt fremstilt og festet til bærere som beskrevet ovenfor, ble innført i en mekanisk holder egnet for horisontalstilling av innretningen i en fluorescensmåler. Like før innføringen av enheten og holderen i fluorescensmåleren ble en porsjon av 70 pl av en av teofyllin-oppløsningene, fremstilt som beskrevet ovenfor, pipettert på den eksponerte overflaten i enheten.

Fluorescensmåleren var blitt justert til å bestemme en eksitasjonslyskilde ved 405 nm, som traff overflaten av enheten i en vinkel på 90° , og til å registrere lys med en bølgelengde på 450 nm. En forsidemål ing av fluorescens ble gjort i en vinkel på 90°C i forhold til underlaget.

Fluorescensresponsen hos hver ble først målt over tid (0-6 minutter) og deretter ble det gjort avlesninger for hver ved 6 minutter.

Resultater.

Dataene oppnådd ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er fremstilt grafisk i fig. 9. Ordinatenheten er millivolt.

Konkulsjon.

De oppnådde data viser at analyseenheten gir en kvantitativ registrerbar respons på teofyllinkonsentrasjonen i hver av de undersøkte prøver. Under disse forhold inhiberes reaksjonen av nærværet av antlserum og denne inhibering kan overvinnes litt etter litt hvis man øker konsentrasjonen av teofyllin.

Eksempel X - Enhet med reversibel kompleksdannelse.

I eksperimentene beskrevet i dette eksemplet ble det fremstilt enheter bestående av et enkelt lag som ble undersøkt med hensyn til sin evne til kvantitativt å bestemme, avlest ved forsidefluorescnsmåling, teofyllin, karbamazepin, tobramycin og gentamycin. Det terapeutiske området for serumkonsentrasjonen og de minimale toksiske nivåene for hvert legemiddel er oppsummert i den følgende tabell:

Fremstilling av antisera.

Antisera mot teofyllin, karbamazepin, tobramycin og gentamycin ble fremstilt ved fremgangsmåtene beskrevet i den tidligere nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av konjugat.

Galaktosyl-umbelliferon-teofyllin, galaktosyl-umbelliferon-karbamazepin, galaktosyl-umbelliferon-tobramycin og galaktosyl-umbelliferon-sisomicin (en analog til gentamycin) ble fremstilt ved fremgangsmåtene beskrevet 1 den tidligere nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av enhet.

Oppløsninger brukt ved fremstiling av et lag av de teofyllin-, karbamazepin-, tobramycin- og gentamycinspesifike enhetene inneholdt bestanddelene gjengitt i tabell C. 1 x 1 cm lag av "Whatman 31 ET"-papir ble laminert på sølv-"Mylar" og montert ved hjelp av dobbeltsidig tape på 8,3 x 1 cm store polystyrenbærere, hvoretter de ovenfor fremstilte oppløsninger ble pipettert over på lagene med "Whatman 31 ET"-papir. Papirene ble tørket i en konveksjonsovn ved 50°C i 15 minutter.

Prøveoppløsninger.

Teofyllin, karbamazepin, tobramycin og gentamycin ble tilsatt til porsjoner med vann hvorved det ble oppnådd prøver innenfor de endelige konsentrasjonsområder oppsummert nedenfor.

Analysef remgangsmåte.

Analyseenhetene som var blitt fremstilt og festet til bærere som beskrevet ovenfor, ble plassert i et kammer egnet for å opprettholde en konstant fuktighet. Før kammeret ble lukket, ble 70 ul porsjoner med legemiddeloppløsninger fremstilt som beskrevet ovenfor, pipettert over på den eksponerte overflate til de respektive analyseenhetene. Fluorescensen frembragt ved romtemperatur etter 15 minutter ble målt i en fluorescensmåler utstyrt med en mekanisk holder egnet for horisontalstilling av analyseenheten. Fluorescensmåleren var blitt justert til å frembringe en eksitasjonslyskilde med 405 nm som traff overflaten ved 90°C, og til å registrere utsendt lys ved en bølgelengde på 450 nm. Et forsidemåling av fluorescens ble gjort ved en vinkel på 90°C i forhold til underlaget.

Resultater.

Dataene oppnådd ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er fremstilt grafisk i fig. 10, 11, 12og 13 for henholdsvis teofyllin, karbamazepin, tobramycin og gentamycin. Ordinatenhetene er uttrykt i form av elektrisk produksjon.

Konklus. 1 on.

De oppnådde data viser at de integrerte analyseenhetene gir kvantitativt registrerbare reponser på konsentrasjonsområdene til de respektive legemidlene. Økende konsentrasjoner av teofyllin, karbamazepin, tobramycin og gentamycin gir en legemiddelavhengig økning i fluorescens i de respektive analyseelementene. Teknikkene som er brukt i de beskrevne eksperimentene, har gjort det mulig å inkorpoere alle bestanddelene 1 en enkelt enhet.

Eksempel XI - Enhet med flere fllmlag.

I eksperimentet beskrevet i dette eksemplet ble det fremstilt en lntergrert tolags-analyseenhet ved hjelp av to filmer som Inneholdt analysebestanddeler for den substratmerkede fluorescens-immunoanalyse. Enhetene ble undersøkt med hensyn til sin- evne til å kvantifisere teofyllin ved hjelp av forsidefluorescensmåling.

Fremstilling av antisera og konjugat.

Fremstillingen av antisera og konjugat ble utført som beskrevet i eksempel VII.

Fremstilling av enhet.

De følgende basisoppløsninger ble brukt: 2$ agarose i 0,05 M Bicine-buffer, pH 8, prøven ble oppløst ved 100°C og deretter holdt ved 60°C,

10$ "Trlton X100",

B-galaktosidase, 86 enheter/ml i 0,5 M Bicine-buffer, pH 8,5,

6,67$ polyvinylpyrrolidon,

(gjennomsnittlig molekylvekt 360.000) i kloroform,

Galaktosyl-umbelliferon-teofyllin

(konjugat),

6,16 mM i dimetylsulfoksyd.

Antisera for teofyllin og p<->galaktosidase ble innkorporert i agaroseoppløsningen ved 60° C hvorved man fikk den følgende sammensetning:

Antiseraene ble oppvarmet til 60°C før blanding. En 2,5 cm bred film ble lagt utover et polyesterark ved hjelp av en vanlig brukt bladform for en filmtykkelse på 0,5 cm. Etter at den hadde stivnet, ble filmen tørket ved 47°C i 10 min.

En annen film ble lagt utover den første ved hjelp av en bladform for 0,005 cm. Filmen inneholdt konjugat i en oppløsning av polyvinylpyrrolidon (PVP) i kloroform som hadde den følgende sammensetning:

Filmen ble tørket ved romtempratur. Polyesterarket ble montert på sølvbelagt "Mylar" ved hjelp av dobbeltsidig tape. Segmenter på 0,5 x 1 cm av dette materialet ble montert på en polystyrenbærer, idet det igjen ble brukt dobbeltsidig tape.

Prøveoppløsning.

Teofyllin ble tilsatt til porsjoner av 0,05 M Bicine-buffer, pH 8,5, hvorved man fikk sluttkonsentrasjoner av teofyllin på 1, 2, 4, 8 og 40 pg/ml.

Analysefremgangsmåte.

Et volum på 30 1 av en av prøveoppløsningene ble tilført analyseenhetene beskrevet ovenfor og fluorescensresponsen ble målt etter 5 minutter. Fluorescens ble målt som beskrevet i eksempel X.

Resultater.

De oppnådde data i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er fremstilt grafisk i fig. 14. Fluorescens i vilkårlige enheter er plottet mot teofyllinkonsentrasjonen.

Konklusjon.

Resultatene viser at uforenlige reagenser i en immunoanalyse kan samles på forhånd i en analyseenhet ved å bruke flere filmlag som ikke gir uønskede reaksjoner mellom analysebestanddeler og som tillater kvantitativ bestemmelse av analyter etter tilsetning av prøven. C. Prøveinnretninger for immunoanalyse med fluoresecns-slokking.

Eksempel XII.

I eksperimentet beskrevet I dette eksempel ble en enhet bestående av et enkelt lag fremstilt og undersøkt med hensyn til sin evne til å utføre en immunoanalyse med direkte fluorescensmåling, av teofyllin i en væskeprøve.

Fremstilling av antlserum.

Antlserum for teofylliri ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i den tidligere nevnte US patentsøknat nr. 87.819.

Fremstilling av konlugat.

Umbelliferon-teofyllin (konjugat) ble fremstilt .ved hydrolyse av galaktosyl-umbelliferon-teofyllin (GUT) med e-galaktosidase. GUT ble fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet i den ovenfor nevnte US patentsøknad nr. 87.819.

Fremstilling av enhet.

Oppløsningene brukt ved fremstilling av den teofyllinspesifike enhet inneholdt de følgende bestanddeler:

Et 1 x 1 cm stort lag med "Whatman 31 ET"-papIr ble laminert på sølv-"Mylar" og montert ved hjelp av dobbeltsidig tape på en 8,3 x 1 cm stor polystyrenbærer, hvoretter 20 ul av den ovenfor fremstilte vandige oppløsning ble pipettert over på laget med "Whatman 31 ET"-papir. Andre underliggende, reflekterende lag, slik som de som er sølvbelagte eller opake, er likeledes egnet. Papiret ble tørket i en konveksjonsovn ved 40 °C i 20 minutter. Den organiske oppløsning (20 ul) ble deretter pipettert over på papiret som inneholdt det tørkede residuet av den vandige oppløsningen, og tørket i en konveksjonsovn ved 50°C i 15 minutter.

Prøveoppløsning.

Teofyllin ble tilsatt til porsjoner med vann hvorved man fikk sluttkonsentrasjoner av teofyllin på hhv. 0,125, 0,25, 0,50, 1,00, 10,0, 20,0 og 40,0 ug/ml.

Analvsefremgangsmåte.

Anslyseelementene som var blitt fremstilt og festet til bærere som beskrevet ovenfor, ble innført i en mekanisk holder egnet for å horisontalstille innretningen i en fluorescensmåler. Like før innføringen av enheten og holderen i f luorescensmåleren, ble en porsjon på 70 pl av en av teofyllinoppløsningene, fremstilt som beskreet ovenfor, pipettert over på den eksponerte overflaten hos enheten.

Fluorescensmåleren var blitt justert til å gi en eksitasjonslyskilde ved 405 nm som traff overflaten av enheten i en vinkel på 90° C, og til å registrere emittert lys ved en bølgelengde på 450 nm. En forsidemåling av fluorescens ble gjort ved en vinkel på 90°C i forhold til underlaget.

Fluorescensresponsen hos hver ble målt etter 2 minutter.

Resultater.

Dataene oppnådd i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er gjengitt grafisk i fig. 15. Ordlnatenhetene er uttrykt som prosent slokking.

Konklusjon.

De erholdte data viser at analyseenheten gir en kvantitativt registrerbar respons på teofyllinkonsentrasjonen hos hver av de undersøkte prøvene.

Under disse forhold slokkes fluorescensen i nærværet av antlserum og denne slokking kan overvinnes litt etter litt ved å øke konsentrasjonen av teofyllin. C. Prøveinnretninger for enzvm- merket immunoanalyse.

Eksempel XIII.

I eksperimentet referert 1 dette eksemplet ble det fremstilt en flerlags enhet som Inneholdt alle nødvendige bestanddeler for å utføre en enzym-merket, homogen immunoanalyse for teofyllin.

Antlserum.

Antlserum for teofyllin ble erholdt ved hjelp av et "EMIT"-aad-teofyllinprøvesett.

Fremstilling av konjugat.

G6PDH-teofyllln (konjugat) ble på samme måte erholdt fra et "EMIT"-aad-teofyllinprøvesett.

Fremstilling av enhet.

Oppløsningene som ble brukt ved fremstilling av den spesifike enheten for teofyllin bestående av et lag, var den som refereres til som reagens A (inneholdende antiserum for teofyllin og enzymsubstrat) i "EMIT"-aad-teofyllinprøveset-tet.

Et 0,5 x 1,0 cm stort lag av "Whatman 54"-papir ble montert ved hjelp av dobbeltsidig tape på en 8,2 x 0,5 cm stor polystyrenbærer, hvoretter 10 pl av den ovenfor nevnte oppløsning ble pipettert over på laget med "Whatman 31 ET"-paplr. Papiret ble tørket i en konveksjonsovn ved 50°C i 10 minutter.

En annen oppløsning ble deretter fremstilt ved å blande like volumer av en fiolett oppløsning av diaforase/-p-jodnitrotet-razol (INT) (1,5 mg diaforase og 1 mg INT i 2,5 ml 0,055 M tris-(hydroksymetyl)aminometanbuffer, pH 7,9) og oppløsningen referert til som teofyllinkonjugatet). 20 pl ble pipettert over på et 0,6 x 1,0 cm stort lag med "Whatman 54"-papir. Dette impregnerte laget ble deretter tørket i en konveksjonsovn ved 50°C i 10 minutter.

Det andre laget ble så festet langs den ene kanten til det første lagetmed en strimmel dobbeltsidig tape.

Prøveoppløsning.

Teofyllin ble tilsatt til vannporsjoner hvorved man fikk sluttkonsentrasjoner av teofyllin på henholdsvis 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 og 40 ug/ml.

Analvsef remgangssmåte.

Analyseelementene som var blitt fremstilt og festet til polystyrenbærere som beskrevet ovenfor, ble hver innført i en mekanisk holder egnet for å horlsontalstille innretningen I en refleksjonslysmåler. Like før innføringen av enheten og holderen i lysmåleren, ble en 50 ul porsjon av en av teofyllinoppløsningene, fremstilt som beskrevet ovenfor, pipetert over på den eksponerte overflaten. Lysmåleren var blitt justert til å følge endringer i refleksjonen av 500 nm.

Refleksjonen hos hver ble først måle over tid (0 - 200 sekunder) og deretter ble det gjort avlesninger av hver ved 200 sekunder (K/S = (1-R)<2>/2R, hvor R er refleksjonen).

Resultater.

Dataene oppnådd ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte er gjengitt 1 fig. 16.

Konklusjon.

De erholdte data viser at den integrerte analyseenhet gir en semi-kvantitativ registrerbar respons på teofyl1in-konsentrasjonen hos hver av de undersøkte prøvene.

Claims (4)

1. Prøveinnretning til bestemmelse av en ligand i en flytende prøve ved en homogen Immunoanalyse, idet prøveinnretningen omfatter (1) et fast bærerelement som virker .absorberende med hensyn til den flytende prøve, og (2) en reagenssammensetning som er inkorporert i det nevnte bærerelement og som omfatter (i) et antistoff eller et annet naturlig forekommende bindingsprotein for ligandene, og (ii) et konjugat av liganden eller en analog herav, som likeledes bindes av antistoffet eller annet bindingsprotein, idet disse er bundet kovalent til en markør og markøren kan påvises ved hjelp av et elektromagnetisk signal som er forskjellig når det markerte konjugat er bundet av antistoffet, eller annet bindingsprotein sammenlignet med når det ikke er bundet på denne måten, og den nevnte ligand er en funksjon av mengden av ligandene i prøven, karakterisert ved at det faste bærerelement er inkorporert med antistoffet eller et annet bindingsprotein og et merket konjugat omfattende liganden eller en ligand-analog, og en markør vesentlig ubundet til hverandre.

2. Innretning Ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte bærerelement i det vesentlige er inkorporert jevnt med de nevnte reagenser.

3. Innretning ifølge et eller flere av kravene 1-2, karakterisert ved at det nevnte bærerelement danner en vevnadsmatriks som er sammensatt av naturlige eller syntetiske polymerfibre.

4. Innretning ifølge et eller flere av kravene 1-2, karakterisert ved at det nevnte bærerelement er en polymerfilm eller -gel.