FI74819B - Analytiskt flerskiktselement och dess anvaendning i analytiskt foerfarande. - Google Patents

Description

! 74819

Monikerroksinen analyyttinen väline ja sen käyttö analyysimenetelmässä

Keksintö kohdistuu monikerroksisiin analyyttisiin 5 välineisiin ligandin tai ligandin sidoskyvyn ilmaisemiseksi nestemäisestä näytteestä, kuten kehon nesteestä, ja menetelmiin, joita voidaan käyttää käsikäyttöisissä ja automatisoiduissa diagnostisissa järjestelmissä kehon nesteiden sisältämien lääkkeiden kvalitatiivisessa ja kvantitatiivi-10 sessa analyysissä.

Testivälineet testiliuskoina ja vastaavat kiinteässä tilassa olevat analyyttiset välineet ovat nykyisin yleisessä käytössä analysoitaessa eri näytetyyppejä, erikoisesti biologisia nesteitä. Testiliuskat, jotka on suunniteltu 15 ilmaisemaan kliinisesti merkittäviä aineita biologisissa nesteissä, kuten seerumissa ja virtsassa, ovat edullisia tautien diagnostiikassa.

Tunnetaan eri tyyppisiä testiliuskoja ja niitä on käytetty useita vuosia laajalti aina tunnetuimmasta pH-ar-20 von testipapereista in vitro diagnostisiin välineisiin asti virtsan ja veren eri aineosien, kuten glukoosin, proteiinin, kliinisesti vaikeasti havaittavan veren jne. määrittämisen (kuten on esitetty US-patenteissa 3 165 534; 3 485 587 ja 3 012 976) . Näissä testiliuskoissa käytettyjen 25 reagenssikoostumusten herkkyys on usein rajoitettu, ne vaikuttavat määritettäviin aineosiin (tai aineosaan) suoran kemiallisen reaktion avulla ja niitä käytetään ilmaisemaan aineita, joiden pitoisuudet nestenäytteissä on millimoolin alueella tai suurempia.

30 Monikerroksiset analyyttiset välineet

Monikerroksinen, yhtenäinen, analyyttinen perusväline on esitetty US-patentissa 3 092 465. Näissä monikerroksisissa välineissä käytetään imukykyistä, kuitumaista kantajaa, joka on kyllästetty yhdellä tai useammalla rea-35 genssilla, joihin tyypillisesti kuuluu värinmuodostaja, joka on päällystetty puoliläpäisevällä membraanilla. Kosketuksessa tutkittavan liuoksen kanssa analyyttiä siirtyy 2 74819 membraanin lävitse kuitumaiseen kantajaan aiheuttaen vär-jäytymisen, jonka määrä vastaa analyytin väkevyyttä. Membraa-ni estää määrättyjen, häiritsevien aineosien, kuten punaisten verisolujen läpikulun ja absorboitumisen, mikä voisi 5 haitata muodostuneen värin tarkkaa havaitsemista testin tuloksena .

Muita monikerroksisia, yhtenäisiä, analyyttisiä välineitä on esitetty US-patentissa 3 992 158. Nämä välineet voivat vastaanottaa nestemäisen näytteen ja siirtää näyt-10 teen välineen levityskerrokseen, jolloin välineeseen saadaan analyytin, muun sopivan näytteen aineosan tai analyyt-tituotteen näennäisesti tasainen väkevyys ja ne muodostavat analyytin läsnäollessa analyyttisen tuloksen, joka voidaan mitata kvantitatiivisesti automaattisten laitteiden avulla 15 käyttäen menetelmiä, kuten spektrofotometriaa, fluoromet-riaa jne. Näihin välineisiin voi kuulua levityskerroksia ja reagenssikerroksia, jotka sisältävät reaktiivista tai muuten vaikuttavaa materiaalia, joka aktiivisuutensa vuoksi aiheuttaa välineessä radiometrisesti havaittavan muutoksen, 20 kuten värin muutoksen.

US-patentti nro 4 042 335 kohdistuu välineeseen, jossa on (1) reagenssikerros, joka reagoi analyytin kanssa muodostaen diffundoituvan, ilmaistavan ainelajin; (2) ei-kuitumainen säteilyn torjuva kerros, joka läpäisee ilmais-25 tavan ainelajin ja joka sisältää läpikuultamattomaksi tekevää ainetta; ja (3) ei-kuitumainen, säteilyä läpäisevä il-maisukerros, jossa ilmaistava ainelaji havaitaan. Välinettä tarkastellaan siten alapuolelta.

US-patentti 4 066 403 (Re 30 267) kohdistuu väli-30 neeseen, joka sisältää (1) reagenssia, joka reagoi analyytin kanssa muodostaen hajaantumistuotteen; ja (2) reagenssia, joka reagoi hajaantumistuotteen tai välituotteen kanssa ilmaistavan muutoksen muodostamiseksi ja väline käsittää parannuksena erotuskoostumusta, joka erottaa reagenssin (1) 35 reagenssista (2) ja joka läpäisee oleellisesti tasaisesti hajaantumistuotetta ja on oleellisesti läpäisemätön häi- 3 7481 9 ritsevien aineiden suhteen. Täten itse asiassa on lisätty "suodatin"-kerros "reagenssikerroksen" ja "rekisteröinti-kerroksen väliin.

US-patentti 4 144 306 kohdistuu välineeseen, jossa 5 reagenssikerros sisältää diffundoitumatonta materiaalia sisältäen etukäteen muodostetun, ilmaistavan osan, joka vapautuu ja muuttuu diffundoituvaksi analyytin läsnäollessa. Rekisteröintikerros vastaanottaa diffundoituvan ainelajin. Kerrokset välineessä on muodostettu siten, että reagenssi-10 kerroksen vapauttama, etukäteen muodostettu, ilmaistava osa voidaan havaita selektiivisesti välineessä.

US-patentti 4 166 093 kohdistuu välineeseen, jossa on (1) säteilyä läpäisevä reagenssikerros, joka reagoi analyytin kanssa muodostaen ilmaistavan ainelajin ja (2) huo-15 koinen, säteilyä estävä kerros, joka läpäisee analyyttiä. Parannuksena kuuluu siihen myös (3) säteilyä läpäisevä, ilmaistavan aineosan migraation estävä kerros reagenssikerroksen ja huokoisen, säteilyä estävän kerroksen välillä. Migraation estävä kerros läpäisee analyyttiä ja estää il-20 maistavan ainelajin siirtymisen säteilyn estävään kerrokseen.

Spesifinen sidosanalyysiväline

Kiinteäfaasisia testivälineitä on käytetty heterogeenisissa, spesifisissä sidosanalyyseissä pyrittäessä välttämään ne hankaluudet ja epäkohdat, joita liittyy tar-25 vittavaan erotusvaiheeseen. Yleisesti käytetty tämäntyyppinen kiinteäfaasinen väline käsittää huokosettoman pinnan, kuten koeputken tai muun astian sisäpinnan, johon vasta-aine kiinnittyy tai jonka se peittää adsorption tai kova-lenttisen sidoksen avulla. US-patentit 3 826 619; 4 001583; 30 4 017 597 ja 4 105 410 kohdistuvat vasta-aineella päällys tettyjen koeputkien käyttöön radioimmunoanalyysissä. Kiinteäfaasisia koevälineitä on käytetty myös heterogeenisissä entsyymi-immunoanalyyseissä (US-patentit 4 016 043 ja 4 147 752) ja heterogeenisissä fluoresenssi-immunoanalyy-35 seissä (US-patenfit 4 025 310 ja 4 056 724 sekä GB-patentti-julkaisu 1 552 374) .

4 74819 Näiden heterogeenisten, spesifisten sidosanalyysi-koevälineiden käyttöä on esitelty US-patentin 4 135 884 raukaisen menetelmän avulla, joka kohdistuu ns. "gammatik-kuun". Koevälineeseen lisätään vasta-ainereagenssia ja se 5 saatetaan kosketukseen nestemäisen näytteen sekä reaktio-järjestelmän muiden reagenssien, pääasiassa merkkikonjugaa-tin kanssa. Inkubointijakson jälkeen poistetaan kiinteä-faasinen väline fysikaalisesti reaktioliuoksesta ja merk-kiosa mitataan joko liuoksessa tai koevälineellä.

10 Vastaavia välineitä, joissa vasta-ainereagenssia on kiinnitetty matriisiin, kuten geeliin tai paperikudon-naisiin, on esitetty US-patenteissa 3 925 017; 3 970 429; 4 138 474; 3 966 897; 3 981 981 ja 3 888 629 sekä DE-hake-mus julkaisussa 2 241 646. Tunnetaan myös välineitä, joita käy-15 tetään heterogeenisissä, spesifisissä sidosanalyyseissä ja jolloin vasta-ainereagenssi on kiinnitetty läpivirtauspyl-väässä olevaan matriisiin (US-patentit 4 036 947; 4 039 652; 4 059 684; 4 153 675 ja 4 166 102). Koevälineeseen ei tavallisesti ole yhdistetty kaikkia tarvittavia 20 reagensseja analyysin suorittamiseksi ja se on pelkästään väline tarvittavan erotusvaiheen saamiseksi sopivammaksi.

Myös heterogeenisiä, spesifisiä sidosanalyyskoe-välineitä on esitetty, jolloin suurin osa tai kaikki tarvittavista reagensseista on yhdistetty samaan kantajaosaan 25 ja jolloin reagenssi/näytekosketukset ja vapaan sekä sidotun faasin erotus saadaan aikaan kapillaarisen siirtymisen avulla pitkin kantajaosaa (US-patentit 3 641 235; 4 094 647 ja 4 168 146) . Näissä patenteissa esitettyjen välineiden valmitusta pidetään yleisesti vaikeana ja ne ovat alttiita 30 eroavaisuuksille useiden kemiallisten ja fysikaalisten monimutkaisten vuorovaikutusten vuoksi, joita tapahtuu pitkin kantajaosaa analyysiä suoritettaessa. Vielä eräs lähestymistapa heterogeeniselle immunoanalyysivälineelle on esitetty eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 13 156.

35 Homogeenisten, spesifisten sidosanalyysireagenssi- järjestelmien soveltaminen kiinteän tilan testivälineisiin antaisi suuria etuja näiden analyysijärjestelmien rutiini- 5 7481 9 käyttöön. Nestemäisissä näytteissä erittäin pieninä pitoisuuksina esiintyvien ligandien määritys voitaisiin yksinkertaistaa välineen saattamiseen kosketukseen näytteen kanssa ja muodostuneen signaalin mittaamiseen joko visuaalises-5 ti havaitsemalla tai mittalaitteita käyttäen. Reagensseja voitaisiin käyttää kiinteässä muodossa, jolloin ei vaadita nestemäisten reagenssien varastointia, levittämistä eikä sekoittamista, kuten alan aikaisempia koepakkauksia käytettäessä. Kiinteässä tilassa olevat välineet olisivat huomat-10 tavasti paremmin sovellettavissa automaatioon kuin alan aikaisemmat nestemäiset järjestelmät.

GB-patentissa 1 552 607, johon tässä yleisesti viitataan, esitetään homogeenisia, spesifisiä sidosanalyysi-järjestelmiä, joissa käytetään erilaisia uusia merkkiainei-15 ta mukaan luettuina kemiluminoivat merkkiaineet, entsyymi-alustamerkkiaineet ja koentsyymimerkkiaineet. Tämän patentin sivulla 23, rivit 12 jne. on esitys analyysireagenssien yhdistämiseksi eri kantajien kanssa mukaan luettuina nestettä sisältävät astiat tai liukenemattomat, huokoiset ja 20 edullisesti absorboivat matriisit, nukat tai höytyvät; geelit ja vastaavat. Siitä puuttuu yksityiskohtainen esitys, kuinka homogeenisia, spesifisiä sidosanalyysireagenssijärjestelmiä sovelletaan kiinteässä tilassa oleviin testivä-lineisiin.

25 DE-A 2 537 275 esittää homogeenisen, spesifisen si dosanalyysireagenssi järjestelmän ja esittää mahdollisuuden vasta-aineen kanssa yhdistettyjen lastojen tai liuskojen käyttämiseksi analyysin suorittamiseksi. Tässä ehdotuksessa merkkiainekonjugaatti sekoitetaan ensin näytteen kanssa ja 30 sitten vasta-aineen sisältämä testiväline saatetaan kosketukseen reaktioseoksen kanssa. Sopivan inkubointiajän jälkeen esitetään testivälineen huuhtelu puskurin kanssa, sen kuivaus ja sitten siqnaalin (fluoresenssi) mittaus. Täten tässä julkaisussa ehdotetaan testivälineen ja analyysimene-35 telmän käyttämistä, jotka ovat hyvin samanlaiset kuin ne, jotka jo ennestään ovat tunnettuja heterogeenisissä, spesifisissä sidosanalyysimenetelmissä, joissa testiväline upotetaan 6 74819 nestemäiseen reaktioseokseen, sitä inkuboidaan, poistetaan sitten, pestään ja lopuksi luetaan. Lisäksi ehdotettu tes-tiväline ei käsitä kaikkia sidosanalyysireagensseja kanta-jaosassaan. Erikoisesti vain vasta-aine esitetään lisättä-5 väksi kantajaosaan ja merkkikonjugaatti lisätään erikseen analysoitavaan näytteeseen ennen sen saattamista kosketukseen ehdotetun testivälineen kanssa.

Alan aikaisemmissa välineissä esiintyvät vaikeudet on havaittu ja niiltä vältytään tai ne voitetaan tämän kek-10 sinnön mukaisen monikerroksisen analyyttisen välineen avulla. Alan aikaisemmissa välineissä käytettyjen estokerrosten täytyi läpäistä ligandi, reagenssikerroksen reagenssit tai niiden välisten reaktioiden tuotteet, koska välineen vaste luetaan reagenssikerroksesta erossa olevalta välineen pin-15 naita, so. tukikerroksen pinnalta.

Vaikeutena on, että sähkömagneettiseen säteilyyn, kuten heijastavista ja fluoresoivista järjestelmistä emittoituvaan säteilyyn, vaikuttavat haitallisesti tukikerrok-set, kuten polystyreeni- tai polyesterikerrokset, joiden 20 lävitse sen täytyy kulkea näissä alan aikaisemmissa välineissä . Osa sähkömagneettisesta säteilystä, kuten valosta, joka kulkee tukikerroksen lävitse, pysähtyy tähän kerrokseen. Täten se itse asiassa vaikuttaa kuituoptiikan tavoin. Tällöin sähkömagneettisen säteilyn, kuten valon, se määrä, 25 joka ilmaistaan, ei tarkoin osoita sitä määrää, joka muodostuu välineessä tapahtuvassa reaktiossa. Annosvastetu-lokset ja vastaavat parametrit eivät siten täysin vastaa sähkömagneettisen säteilyn määrää ligandin vasteena reagens-sikerroksessa. Tapauksessa, jossa välineet luetaan käyttäen 30 fluoresenssijärjestelmiä, vakiomäärä emittoitua valoa pysähtyy ja siten tämän ilmiön vaikutus on voimakkaampi tulosten luotettavuuteen pienillä ligandipitoisuuksilla. Tapauksissa, jolloin välineet luetaan heijastavia järjestelmiä käyttäen, haitta on suurempi suurilla ligandipitoisuuk-35 silla.

Nämä vaikeudet vältetään tai ne voitetaan tämän 7 74819 keksinnön mukaisissa monikerroksisissa analyyttisissä välineissä. Näiden vaikeuksien voittamiseksi keksinnön mukainen väline emittoi parantuneen sähkömagneettisen vasteen tai signaalin alan aikaisempiin välineisiin ver-5 rattuna. Tarkemmin sanottuna, emittoituneen signaalin säteilyn (S) suhde taustasäteilyyn (B) on parantunut, jolloin vältytään haittaavasta taustasäteilystä vähintään suuruusluokkaa lOx olevan tekijän verran, kuten esimerkeissä seuraavassa esitetään.

10 Keksinnön mukaiselle monikerroksiselle, analyytti selle välineelle ligandin tai ligandin sidoskyvyn ilmaisemiseksi nestemäisessä näytteessä, mikä väline käsittää reagenssikerroksen, joka sisältää reagensseja, jotka vaikuttavat ligandiin ja näytteen ligandinsitomiskykyyn muo- 15 dostaen ilmaistavan vasteen, säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen sekä tukikerroksen, on tunnusomaista, että reagenssikerros on ei-diffundoiva kalvo ja säteilyä dif-fundoiva ja estävä kerros (a) on sijoitettu ei-diffundoi-van reagenssikerroksen ja tukikerroksen väliin; (b) ei 20 läpäise ligandia, ei-diffundoivassa reagenssikerroksessa olevia reagensseja eikä niiden vuorovaikutustuotteitä; ja (c) on inertti ligandin, ei-diffundoivassa reagenssikerroksessa olevien reagenssien ja niiden vuorovaikutus-tuotteiden suhteen.

25 Oheisissa piirroksissa kuviot 1-2 ovat graafisia esityksiä esimerkissä 1 esitetyissä kokeissa saaduista arvoista.

Kuvio 3 esittää menettelyä, jota käytettiin esimerkissä 2 käytetyn konjugaatin valmistamiseksi.

30 Kuvio 4 on poikkileikkauskuva teofylliinin ana lyyttisestä välineestä, joka on valmistettu esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.

Kuviot 5-6 ovat graafisia esityksiä esimerkissä 2 esitetyissä kokeissa saaduista arvoista.

35 8 7481 9 1. Ligandi

Termiä ligandi käytetään viittaamaan kehon nesteiden aineosiin ja lääkkeisiin tai muihin aineisiin, joita on näissä kehon nesteissä. Seuraavassa on esitetty eräitä 5 näitä mahdollisia ligandeja.

Reagenssikoostumuksia tunnetaan veri-, plasma- tai seerumiligandeille, kuten askorbiinihappo, sappihapot, bi-lirubiini, kolesteroli, kreatiini, glukoosi, maitohappo, fosfolipidit, triglyseridit, ureatyppi (BUN) ja virtsahap-10 po. Tärkeää on myös verikemian entsyymiligandien määritys, kuten amylaasin, koliiniesteraasin, kreatiinifosfokinaasin (CKP), dehydrogenaasien (hydroksivoi-, isositruuna-, maitoja omenahappo), lipaasin, fenyylialaniinin, transaminaasien (glutaamioksoetikkahappo ja glutaamipalorypälehappo), hap-15 pamien ja alkalisten fosfataasien, gamma-glutamyylitranspep-tidaasin, leusiiniaminopeptidaasin ja erytrosyyttientsyy-mien (glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, 6-fosfoglukonaat-tidehydrogenaasi, glutationireduktaasi ja pyrubaattikinaa-si). Testaus on myös mahdollista veriproteiiniligandien, 20 kuten albumiinin, kryoglobiinin, koagulaatio- ja fibrino-lyyttijärjestelmien aineosien, komplementtitekijoiden ja solu- ja seerumi-immuuni-efektorien, kuten interferonin ja immunoglobiinien suhteen, kuten myöhemmin tarkemmin esitetään homogeenisiin, spesifisiin sidosanalyyseihin viitaten. 25 Samoin tunnetaan koostumuksia uriinikemiallisia mää rityksiä varten. Uriinikemian alalla näihin ligandeihin kuuluvat yleensä askorbiinihappo, albumiini, kreatiini, glukoosi, sappihapot, bilirubiini, proteiinit, ketonit, kliinisesti havaitsematon veri, nitriitti, amylaasi ja fe-30 nyylipalorypälehappo.

Keksinnön analyysivälinettä voidaan käyttää myös ilmaisemaan jokainen ligandi, jota varten on spesifinen sidososa ja vastaavasti ilmaisemaan nestemäisen väliaineen sidoskyky ligandin suhteen (tavallisesti ligandin sidos-35 kumppanin läsnäolosta väliaineessa aiheutuen). Ligandi on tavallisesti peptidi, polypeptidi, proteiini, hiilihydraatti, glykoproteiini, steroidi tai muu orgaaninen molekyyli, 9 74819 jota varten on olemassa määrätty sidoskumppani biologisissa järjestelmissä tai joka voidaan syntetisoida. Toiminnallisesti ligandi valitaan tavallisesti ryhmästä, johon kuuluvat antigeenit ja niiden vasta-aineet; hapteenit ja niiden 5 vasta-aineet; ja hormonit, vitamiinit, metaboliitit ja farmakologiset aineet ja niiden vastaanottajat ja sitovat aineet. Tavallisesti ligandi on immunologisesti aktiivinen polypeptidi tai proteiini, jonka molekyylipaino on välillä 1 000 - 10 000 000, kuten vasta-aine tai antigeeninen poly-10 peptidi tai proteiini tai hapteeni, joiden molekyylipaino on välillä 100 - 1 500.

Edustavia esimerkkejä polypeptidi-ligandeista ovat angiotensiini I ja II, C-peptidi, oksitosiini, vasopressii-ni, neurofysiini, gestriini, sekretiini, bradykinniini ja 15 glukagoni.

Edustaviin proteiiniligandeihin kuuluvat protamii-nien, mukoproteiinien, glykoproteiinien, globuliinien, albumiinien, skleroproteiinien, fosfoproteiinien, histo-nien, lipoproteiinien, kromoproteiinien ja nukleoproteii-20 nien luokat. Esimerkkejä määrätyistä proteiineista ovat prealbumiini, C^-lipoproteiini, ihmisen seerumialbumiini, d(^-glykoproteiini, transkortiini, tyroksiinia sitova glo-buliini, haptaglobiini, hemoglobiini, myoglobiini, serulo-plasmiini, O^-lipoproteiini, tf2-makro9lokuli:i-n:i- · /^-lipo-25 proteiini, erytroproteiini, transferriini, homopeksiini, fibrinogeeni, immunoglobuliinit, kuten IgG, IgM, IgA, IgD ja IgE ja niiden osat, esimerkiksi Fc 9a Fab' komplement-titekijät, prolaktiini, verta koaguloivat tekijät, kuten fibrinogeeni, trombiini ja niin edelleen, insuliini, mela-30 notropiini, somatropiini, tyrotropiini, munarakkulahormoo-ni, leutinoiva hormooni, gonatropiini, kilpirauhasta stimuloiva hormooni, plasentaalilaktogeeni, B^2-Vitainiinite_ kijä, transkobalamiini, seerumientsyymit, kuten alkaliset fosfataasit, koliiniesteraasi, glutamiinioksaloetikkahappo-35 transaminaasi, glutaamipalorypälehappotransaminaasi ja uropepsiini, endorfiinit, enkefaliinit, protamiini, kudos- 10 7481 9 antigeenit, bakteeriantigeenit ja viraaliset antigeenit, kuten hepatiitikseen liittyvät antigeenit (esim. HB Ag, HB Ag ja HB Ag). c ©

Edustaviin hapteeniligandeihin kuuluvat lääkkeiden, 5 metaboliittien, hormonien, vitamiinien ja vastaavien orgaanisten yhdisteiden yleiset luokat. Hapteenihormoneihin kuuluvat tyroksiini ja tri-jodotyroniini. Vitamiineihin kuuluvat vitamiinit A, B, esim. B12, C, D, E ja K, folihappo ja tiamiini. Lääkkeisiin kuuluvat antibiootit, kuten amino-10 glykosidit, esimerkiksi gentamisiini, tobramysiini, ami- kasiini, sisomisiini, kanamysiini ja netilmisiini, penisilliini, tetrasykliini, terramysiini, kloromysetiini ja akti-nomysetiini; nukleosidit ja nukleotidit, kuten adenosiini-difosfaatti (ADP), adenosiinitrifosfaatti (ATP), flaviini-15 mononukleotidi (FMN), nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD) ja sen fosfaattijohdannainen (NADP), tymidiini, gua-nosiini ja adenosiini; prostaglandiinit; steroidit, kuten estrogeenit, esimerkiksi estrioli ja estradioli, sterogee-nit, andogeenit, digoksiini, digitoksiini ja adrenokorti-20 kaaliset steroidit; sekä muita yhdisteitä, kuten fenobar-bitaali, fenytoiini, primidoni, etosyksimidi, karbamatse-piini, valproaatti, teofylliini, kafeiini, propranololi, prokaiiniamidi, kinidiini, amitryptiliini, kortisoli, desipramiini, disopyramidi, doksepiini, doksirubisiini, 25 nortryptiliini, metotreksaatti, imipramiini, lidokaiini, prokaiiniamidi, N-asetyyliprokaiiniamidi, amfetamiinit, ka-tekoliamiinit ja antihistamiinit.

Analysoitava nestemäinen väliaine voi olla luonnollisesti esiintyvä tai keinotekoisesti muodostettu neste, 30 jonka oletetaan sisältävän ligandia ja tavallisesti se on biologinen neste tai sen laimennus. Biologisiin nesteisiin, joita voidaan analysoida, kuuluvat seerumi, plasma, virtsa, sylkineste ja amnioottiset ja serebrospinaaliset nesteet.

Säteilyä diffundolva ja estävä kerros 35 Säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen sijainti reagenssikerroksen (-kerrosten) ja tukikerroksen suhteen on kriittinen tässä keksinnössä. Säteilyä diffundoivan ja 11 74 81 9 estävän kerroksen ominaisuudet aiheutuvat niistä aineosista, joista se valmistetaan ja nämä ominaisuudet ovat myös kriittisiä keksinnössä.

Keksinnön mukainen säteilyä estävä kerros on sätei-5 lyä diffundoiva ja estävä kerros, joka on sijoitettu rea-genssikerroksen (-kerrosten) ja tukikerroksen väliin. Se voi koskettaa suoraan reagenssikerroksen (-kerrosten) yhtä pintaa; reagenssikerroksen emittoiva signaali luetaan silloin reagenssikerroksen (-kerrosten) toiselta pinnalta. Täl-10 löin säteilysignaalin ei tarvitse kulkea ilmaisua varten minkään muun kerroksen tai materiaalin lävitse kuin sen reagenssikerroksen, josta se emittoituu. Jos reagenssiker-ros ei liity hyvin diffundoivaan ja estävään kerrokseen, on joskus mahdollista käsitellä tai aktivoida säteilyä diffun-15 doivan ja estävän kerroksen pinta sopivan käsittelyn avulla, esimerkiksi käsittelemällä natriumhydroksidilla, reagenssikerroksen ja säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen välisen liitoksen parantamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan sijoittaa välikerros säteilyä diffundoivan ja estävän 20 kerroksen ja reagenssikerroksen (-kerrosten) väliin liittymisen tai kiinnittymisen parantamiseksi reagenssikerrokseen.

Säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen tarvittavina ominaisuuksina ovat, että se on läpinäkymätön, verrattain ohut eikä se läpäise ligandia, reagenssikerroksen 25 reagensseja eikä niiden välisten reaktioiden tuotteita. Säteilyä diffundoiva ja estävä kerros sisältää valkoista tai vaaleaa väripigmenttiä, edullisesti tasaisesti jakautuneena kauttaaltaan kerrokseen tai ainakin kerroksen sille pinnalle, joka on reagenssikerroksen tai välikerroksen vie-30 ressä. Tarkemmin sanottuna säteilyä diffundoiva ja estävä kerros voi sisältää jotain säteilyä läpäisemätöntä pigmenttiä lisättynä johonkin sopivaan hartsi- tai muovimateriaaliin, joka on yhteensopiva alustan tai tukimateriaalin kanssa toisaalta ja reagenssikerroksen tai välikerroksen kans-35 sa toisaalta. Jos säteilyä diffundoiva ja estävä kerros on luonteeltaan polymeerinen, voi se olla homopolymeeri tai kopolymeeri. Säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen 12 74 81 9 paksuus voi olla mikä tahansa sopiva, mutta se on tavallisesti välillä noin 0,0005 - 0,05 cm.

Esimerkkeihin käyttökelpoisista säteilyä läpäisemättömistä pigmenteistä kuuluvat titaanidioksidi, bariumsulfaat-5 ti, sinkkioksidi, magnesiumoksidi, sirkoniumdioksidi ja vastaavat aineet. Tavallisesti käytetyn pigmentin määrän yläraja on pienempi kuin 40 % kiinteistä aineista ja sen alaraja on noin 2 % kiinteistä aineista.

Esimerkkeihin sopivista hartseista, joita voidaan 10 käyttää säteilyä diffundoivaa ja estävää kerrosta varten, kuuluvat anhydridihartsit, kuten metyylivinyylieetteri/ma-leiinihappoanhydridi-kopolymeeri; etyleeni/maleiinihappoan-hydridi-kopolymeeri; oktadesengl-l/maleiinihappoanhydridi-kopolymeeri; oktadesyylivinyylieetteri/maleiinihappoanhyd-15 ridi-kopolymeeri; styreeni/maleiinihappoanhydridi-kopolymee-ri ja vastaavat aineet.

Esimerkkejä muista polymeerimateriaaleista, joita voidaan käyttää säteilyä diffundoivaa ja estävää kerrosta varten, ovat polyvinyyliasetaatti, polyvinyylimetakrylaat-20 ti, polybutadieeni, polykloropreeni, polyvinyylipyrrolido-ni ja vastaavat aineet.

Homogeeninen, spesifinen sidosanalyysi

Reagensseja jokaista homogeenista, spesifistä sidos-analyysiä varten voidaan lisätä esiteltävään testivälinee-25 seen. Yleisesti homogeeniset, spesifiset sidosanalyysimene-telmät perustuvat määrättyyn vuorovaikutukseen (1) sidoskom-ponentin konjugaatin ja merkkiaineen ja (2) sidoskomponen-tin sidosvastaosan välillä konjugaatissa, jolloin merkkiaineen ominaisuudet ovat erilaiset, kun merkkiainekonjugaat-30 ti sitoutuu sidosvastaosaan, verrattuna tapaukseen, jossa tämä konjugaatti ei ole sitoutunut. Se merkkiaineen ominaisuus, johon vaikutetaan, voi olla jokin mitattava ominaisuus, esimerkiksi merkkiaineen kemiallinen tai fysikaalinen ominaisuus. Eräissä tapauksissa ominaisuus, johon vaikutc-35 taan, on kemiallinen reaktiivisuus etukäteen määrätyssä reaktiossa, joka käsittää kemiallisten sidosten, kovalent-tisten tai ei-kovalenttisten, muodostumisen tai irtautumisen.

7481 9 13

Toisissa tapauksissa ominaisuus, johon vaikutetaan, on merkkiaineen fysikaalinen ominaisuus, joka voidaan mitata ilman kemiallista reaktiota.

Useimmissa tapauksissa esillä olevaan testivälinee-5 seen sisältyy homogeenisen, spesifisen sidosanalyysin rea-gensseja, jotka reagoivat ligandin kanssa näytteessä tai vaikuttavat sen sidoskykyyn immunokemiallisella tavalla. Tällöin on kyse antigeeni/vasta-aine- tai hapteeni/vasta-aine-vuorovaikutuksesta reagenssien ja/tai ligandin tai sen 10 sidosmuodostuskyvyn välillä näytteessä. Näitä analyysejä kutsutaan täten immunoanalyyseiksi ja määrätty vuorovaikutus merkkikonjugaatin ja sidoskumppanin välillä on immuno-kemiallinen sitoutuminen. Tällöin, näissä tapauksissa, merkkikon jugaatin sidoskomponentti on antigeeni, hapteeni tai 15 vasta-aine (tai sen osa) ja sidoskumppani on vastaava im-munokemiallinen sidoskumppani. Alalla tunnetaan kuitenkin hyvin, että muitakin sidosvuorovaikutuksia merkkikonjugaatin ja sidoskomppanin välillä voidaan käyttää perustana homogeenista, spesifistä sidosanalyysiä varten, mukaan luet-20 tuna sidosvuorovaikutukset hormonien, vitamiinien, metabo-liittien sekä farmakologisten aineiden ja niiden vastaavien reseptorien ja sidosaineiden välillä.

Jos näyte analysoidaan siinä olevan määrätyn ligandin läsnäolon tai määrän määrittämiseksi, reagenssit homo-25 geenistä, spesifistä sidosanalyysimenettelyä varten käsittävät tavanomaisessa tapauksessa (1) merkkikonjugaatin, joka muodostuu ligandista tai sen sidosanalogista kemiallisesti kytkettynä merkkiaineeseen. (2) sidoskumppanin ligan-dia varten, esimerkiksi vasta-aineen tai sen osan, luon-30 nollisen vastaanottavan proteiinin tai vastaavan ja (3) li-säreagensseja, jotka tarvitaan merkkiaineen mittaamiseksi merkkikonjugaatissa. Sidosainetta lisätään rajallinen määrä, niin että jokainen ligandi näytteessä kilpailee merkkikon-jugaatin kanssa sitoutuakseen sidoskumppanin kanssa. Merk-35 kiaineen jakauma sitoutuneiden ainelajien ja vapaiden aine-lajien välillä määrää siten ilmaistavan vasteen voimakkuuden merkkiaineesta, mikä vuorostaan on funktio ligandin 14 7481 9 läsnäolosta. Toinen kaavio ligandin määrittämiseksi on se, jolloin merkkikonjugaatti muodostuu merkitystä ligandin si-doskumppanista ja sitoutuessaan ligandiin vaikutetaan merkkiaineeseen sen ilmaistavan vasteen suhteen. Jos analysoi-5 daan näytteen ligandin sitomiskyky, merkkikonjugaatti muodostuu ligandista tai sen sidosanalogista, joka on kemiallisesti kytketty merkkiaineeseen, jolloin näytteen kyky sitoa merkkikonjugaattia, kuten ligandin sidoskumppanin läsnäolosta johtuen näytteessä, määrää sen vaikutuksen 10 merkkiaineen ilmaistavaan signaaliin.

Alalla tunnetaan useita erilaisia homogeenisia, spesifisiä sidosanalyysijärjestelmiä ja seuraavassa esitetään esimerkkejä, rajoittamatta esillä olevan keksinnön aluetta, eräistä näistä järjestelmistä, jotka soveltuvat käytettä-15 viksi tämän keksinnön mukaisen testivälineen kanssa. Seuraa-vat järjestelmät on lueteltu käytetyn merkkiaineen luonteen mukaan.

(a) Entsyymin prosteettisen ryhmän merkkiaineet Tässä järjestelmässä merkkiaine on entsyymin pros-20 teettinen ryhmä ja katalyyttisesti epäaktiivin apoentsyy-min kykyyn liittyä prosteettisen ryhmän muodostamaan merkkiaineeseen muodostaen aktiivisen entsyymin (holoentsyymin) vaikutetaan sitomalla merkkikonjugaatti sen sidoskumppanin kanssa. Muodostuneen holoentsyymin aktiivisuus voidaan mi-25 tata tavanomaisen ilmaisulaitteen avulla ilmaistavan perus-signaalin saamiseksi. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty GB-patentissa 2 023 607.

Erikoisen edullisesti prosteettisella ryhmällä merkityssä analyysikaaviossa käytetään flaviiniadeniinidinuk-30 leotidia (FAD) merkkiaineena ja apoglukoosioksidaasia apo-entsyyminä. Muodostunut glukoosioksidaasiaktiivisuus voidaan mitata kolorimetrisen ilmaisujärjestelmän avulla, joka muodostuu glukoosista, peroksidaasista ja ilmaisusys-teemistä, joka muodostaa värinmuutoksen vasteena vetyper-35 oksidille.

Tässä suositellussa analyysikaaviossa FAD-merkityn konjugaatin kaava on edullisesti seuraava: is 7481 9

NH—R-L

<byS

'N.—^ N '

5 I

Ribof laviini-ffos)^-Riboosi jolloin riboflaviini—ffos)^—riboosi esittää riboflaviini-pyrofosfaatti-riboositähdettä FAD:ssä, R on sitova ryhmä ja 10 L on sidoskomponentti, esimerkiksi ligandi tai sen analogi. Esimerkki tällaisesta konjugaatista on FAD-teofylliini-kon-jugaatti, joka on esitetty eurooppalaisessa patenttihakemuksessa nro 81108681.

(b) Entsyymisubstraattimerkkiaineet 15 Tässä järjestelmässä valitaan merkkiaine siten, että merkkikonjugaatti on substraatti entsyymille ja entsyymin kykyyn vaikuttaa substraattimerkkikonjugaattiin vaikutetaan joko positiivisessa tai negatiivisessa mielessä sitomalla merkkikonjugaatti sen sidoskumppaninsa kanssa. Entsyymin 20 vaikuttaessa substraatti-merkkikonjugaattiin, muodostuu tuote, joka on erotettavissa eräiden ominaisuuksiensa, tavallisesti kemiallisten tai fysikaalisten ominaisuuksiensa perusteella, kuten kemiallisen reaktiivisuutensa avulla in-dikaattorireaktiossa tai fotometrisen luonteensa, esimer-25 kiksi fluoresenssin tai valonabsorption (värin) avulla. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty esimerkiksi julkaisuissa DE-A 2 618 511, Anal. Chem. 48:1933 (1976) , Anal. Biochem. 77:55 (1977) ja Clin. Chem. 23:1402 (1977) .

30 Erikoisen edullisessa substraattimerkityssä analyy- sikaaviossa käytetään kaavan 16 7481 9

CH,OH

Ηθ|_

r ‘SN

\0H ) 0,

Ti W°Y° s 0H ΙΟΙ J

R-L

mukaista merkkikonjugaattia, jossa R on sidosryhmä ja L on sidoskomponentti, esimerkiksi ligandi tai sen analogi, jolloin entsyymi-/3-galaktosidaasin kyky lohkaista konju-10 gaatti tuotteen saamiseksi, joka voidaan erottaa fluoresenssinsa avulla, estetään sitomalla konjugaatti sidoskump-paniinsa.

(c) Koentsyymimerkkiaineet

Merkkikonjugaatti tässä järjestelmässä perustuu, 15 merkkiosassaan, koentsyymiaktiiviseen toimintaan ja tämän koentsyymimerkkiaineen kykyyn osallistua entsymaattiseen reaktioon vaikutetaan sitomalla merkkikonjugaatti sidos-kumppaninsa kanssa. Muodostuneen entsymaattisen reaktion nopeus voidaan mitata tavanomaisten ilmaisujärjestelmien 20 avulla ilmaistavan perussignaalin saamiseksi. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty julkaisuissa DE-A 2 618 511; sekä Anal. Biochem. 27:271 (1976), Anal. Biochem. 72:283(1976), Anal. Biochem. 76:95(1976), Anal. Biochem. 72:283 (1976) ja Anal. Biochem.

25 (d) Entsyymimodulaattorimerkkiaineet

Merkkikonjugaatti tässä järjestelmässä perustuu, merkkiaineosassaan, entsyymin modulointitoimintaan, kuten entsyymin inhibiittoriin tai stimulaattoriin ja tällaisen modulaattimerkkiaineen kykyyn moduloida entsyymin aktivi-30 teettia vaikutetaan sitomalla merkkikonjugaatti sidoskump-paninsa kanssa. Muodostuneen entsymaattisen reaktion nopeus voidaan mitata tavanomaisten ilmaisujärjestelmien avulla ilmaistavan perussignaalin saamiseksi. Tämäntyyppisiä analyysi järjestelmiä on esitetty yleisessä US-patentissa 35 4 134 792.

17 7 4 81 9 (e) Entsyymimerkklaineet Tässä järjestelmässä merkkiaine on entsyymi ja entsyy-mimerkkiaineen aktiviteettiin vaikutetaan sitomalla merkkikon jugaatti sidoskumppaninsa kanssa. Muodostunut entsyymin 5 aktiviteetti voidaan mitata tavanomaisten ilmaisujärjes-telmien avulla ilmaistavan perussignaalin saamiseksi. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty US-patenteis-sa 3 817 837 ja 4 043 872.

(f) Sammutettavat fluoresenssimerkkiaineet 10 Merkkikonjugaatti tässä järjestelmässä muodostuu, merkkiosassaan, fluoresenssin fluorista, mitä fluoresenssia voidaan sammuttaa jokin mitattava määrä sitomalla merkkikon-jugaatti sidoskumppaninsa kanssa, joka on tavallisesti proteiini, kuten vasta-aine. Fluoresoiva merkkiaine mitataan 15 suoraan, sen fluoresenssin ollessa ilmaistava signaali. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty US-paten-teissa 4-160-016 ja julkaisussa J. Clin. Path. 30:526 (1977).

(g) Fluoresenssipolarisaatiomerkkiaineet

Merkkiaine tässä järjestelmässä on myös fluori, omi- 20 naisuus, johon vaikutetaan, on fluoresenssipolarisaatio, mikä aiheutuu merkkikonjugaatin sitoutuessa sidoskumppa-niinsa, joka on tavallisesti proteiini, kuten vasta-aine. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty julkaisussa J. Exp. Med. 122:1029 (1965).

25 (h) Kemiallisesti herkistetyt fluoresenssimerkki aineet Tässä järjestelmässä merkkiaine on jälleen fluori, kuitenkin fluorimerkkiaineen kykyyn virittyä kemiallisesti energiatilaan, jossa se fluoresoi, vaikutetaan sitomalla 30 merkkikonjugaatti sidoskumppaniinsa. Merkkiaineen kemiallinen viritys suoritetaan tavallisesti antamalla in situ muodostetun suurienergiaisen yhdisteen vaikuttaa fluorimerk-kiaineeseen. Tämäntyyppisiä analyysijärjestelmiä on esitetty julkaisussa DE-Λ 29 52 498.

35 (i) Kaksoisvaste-aine-steeriset estomerkkiaineet

Seuraava analyysijärjestelmä on kaksoisvasta-aine-immunoanalyysijärjestelmä, joka on esitetty US-patenteissa ie 7 4 81 9 3 935 074 ja 3 998 943. Merkkikonjugaatti muodostuu kahdesta epitoopista, joista toinen osallistuu immunologiseen reaktioon ligandin sekä antiligandi-vasta-aineen kanssa ja toinen, joka voi sitoutua toiseen vasta-aineeseen sillä ra- 5 joituksella, että kaksi vasta-ainetta ovat estyneet sitoutumasta merkkikonjugaattiin samanaikaisesti. Toinen epi-tooppi voi olla fluori, jonka fluoresenssi sammuu toisen vasta-aineen sitoutuessa tai joka voi osallistua toiseen kilpailevaan sidosreaktioon toisen epitoopin merkityn muo-10 don kanssa sitoutumista varten toisen vasta-aineen kanssa. Tässä järjestelmässä ovat eri ilmaisujärjestelmät mahdollisia, kuten edellä mainituissa patenteissa on esitetty. Vastaavia analyysijärjestelmiä on esitetty US-patenteissa 4 130 462 ja 4 161 515 sekä GB-patenttiesitteessä 1 560 852.

15 (j) Energiasiirtomerkkiaineet Tässä järjestelmässä merkkiaine on toinen jäsen luovuttaja/vastaanottaja-energiansiirtoparista ja sidos-kumppani on konjugoitu tämän parin toisen jäsenen kanssa. Täten, kun merkkikonjugaatti sitoutuu sidoskumppanin vai-20 kutuksesta, luovuttajajäsenen energiamäärä tässä parissa muuttuu siirtymisen vuoksi vastaanottajakomponenttiin. Tavallisesti luovuttaja on fluori ja vastaanottaja on sen sammuttaja, mikä sammuttaja voi myös olla fluori tai joku muu. Tässä toteutuksessa ilmaistava signaali on fluoresens-25 si, mutta muut ilmaisujärjestelmät ovat myös mahdollisia. Näitä analyysijärjestelmiä on esitetty US-patenteissa 3 996 345; 4 174 384 ja 4 199 559 ja GB-patentissä 2 018 424. (k) Muut merkkiaineet

Muihin alalla esitettyihin homogeenisiin, spesifi-30 siin sidosanalyysijärjestelmiin, joita voidaan käyttää tämän keksinnön yhteydessä, kuuluvat seuraavia merkkiaineita käyttävät: (i) ei-entsyymiset katalyytit, kuten elektronisiir-toaineet (ks. US-patentti 4 160 645);

35 (ii) ei-entsyymiset kemiluminoivat aineet (ks. DE-A

2 618 511, viitattu edellä); is 7481 9 (iii) "kanavoituvat" merkkiaineet (ks. GB-patentti-esite 2 018 986); (iv) "osas"-merkintäaineet (ks. GB-patenttiesite 2 019 562); ja 5 (v) merkityt liposomiosaset (ks. US-patentti 4 193 983).

Reagenssikerros (-kerrokset)

Keksintö kohdistuu myös menetelmään reagenssikerrok-sen (-kerrosten) valmistamiseksi säteilyä diffundoivalle 10 ja estävälle kerrokselle tai välikerrokselle, jos sellaista käytetään. Tämän keksinnön mukaiset välineet voidaan valmistaa jonkin sopivan menettelyn avulla, kuten painamalla tai ruiskuttamalla reagenssikoostumusta kerrokselle tai käyttäen jollekin säteilyä diffundoivalle ja estävälle kerrokselle 15 tai välikerrokselle tunnettuja kalvonmuodostusmenettelyjä.

Jos reagenssikerros itse asiassa muodostuu useista kerroksista, voidaan nämä kerrokset pitää päällekkäisinä liiman avulla, joka sallii nesteen kulun kerrosten välissä. Tavallisesti ei kuitenkaan ole välttämätöntä käyttää lii-20 maa yhden reagenssikerroksen kiinnittämiseksi toiselle. Valmistettaessa yhtenäisiä analyyttisiä välineitä kalvon-muodostajia käyttäen voidaan kerrokset muodostaa etukäteen erikseen ja laminoida yhteen koko välineen valmistamiseksi. Kalvokerroksen (-kerrosten) materiaali voi olla koostumusta, 25 joka muodostuu pehmentimestä ja polymeeristä, joka sopii mittastabiilisuuden saamiseen. Tällä tavalla valmistetut kerrokset muodostetaan tavallisesti levittämällä liuosta tai dispersiota alustalle, josta kuivattu kerros voidaan fysikaalisesti irrottaa. Kuitenkin sopiva menetelmä, jossa 30 vältytään useiden irrotus- ja laminointivaiheiden aiheuttamilta vaikeuksilta, on päällystää ensimmäinen kerros irro-tuspinnalle tai haluttaessa tukialustalle ja sitten levittää seuraavat kerrokset suoraan aikaisemmin päällystetyille. Nämä levitykset voidaan suorittaa käsin käyttäen terä-35 levityslaitetta tai koneellisesti käyttäen menettelyjä, kuten kastoa tai kuplapäällystystä. Jos käytetään kone-päällystysmenettelyjä, on usein mahdollista levittää 20 7481 9 vierekkäiset kerrokset samanaikaisesti käyttäen suppilo-päällystysmenetelmiä, jotka ovat hyvin tunnettuja valmistettaessa valonherkkiä valokuvausfilmejä ja papereita.

Sameita polymeerikerroksia voidaan käyttää kalvoker-5 rosmateriaalina. Kalvo muodostetaan alustalle liuottamalla polymeeri kahden nesteen seokseen, joista toisen kiehumispiste on alempi ja se on hyvä liuotin polymeeriä varten ja joista toisen kiehumispiste on korkeampi ja liuottaa se huonosti tai ei lainkaan polymeeriä. Tätä polymeeriliuos-10 ta levitetään sitten alustalle ja kuivataan valvotuissa olosuhteissa. Alemman kiehumispisteen omaava liuotin haihtuu helpommin ja päällysteeseen rikastuu nestettä, joka on huono liuotin tai joka ei liuota lainkaan polymeeriä. Haihtumisen jatkuessa asianmukaisissa olosuhteissa, muodostaa 15 polymeeri huokoisen kerroksen. Useita eri polymeerejä voidaan käyttää, yksinään tai yhdistettyinä, valmistettaessa huokoisia, sameita polymeerikerroksia tässä keksinnössä käytettäviksi. Tyypillisiin esimerkkeihin kuuluvat poly-karbonaatit, polyamidit, polyuretaanit ja selluloosaesterit, 20 kuten selluloosa-asetaatti. Kerroksia varten, jotka sisältävät merkkikonjugaattia tai muuta reagenssia, voidaan valmistaa päällystysliuos tai -dispersio mukaan luettuna matriisi ja lisätty aktiivinen materiaali, suorittaa päällystys, kuten edellä on esitetty sekä kuivata mittastabiilin 25 kerroksen muodostamiseksi.

Kunkin kerroksen paksuus ja sen läpäisyaste voivat vaihdella laajasti ja ne riippuvat todellisesta käytöstä. Noin 5-100 mikrometriä olevat kuivapaksuudet ovat sopivia, vaikkakin laajemmin vaihtelevat paksuudet voivat olla suo-30 siteltavia määrättyihin tarkoituksiin. Esimerkiksi, jos tarvitaan verrattain suuret määrät vaikuttavaa materiaalia, esimerkiksi polymeerimateriaaleja ja entsyymejä, voi olla edullista valmistaa hieman paksumpia kerroksia.

Voi olin edullista lisätä yhtä tai useampaa pinta-35 aktiivista ainetta, kuten anionista tai ei-ionista pinta-aktiivista ainetta reagenssikerrokseen (-kerroksiin). Ne voivat esimerkiksi parantaa kerrosvalmisteiden päällystys- 2i 7481 9 kykyä ja parantaa kerrosten kostumisen voimakkuutta alueille, jotka eivät helposti kostu nestemäisten näytteiden vaikutuksesta ilman apuainetta, kuten pinta-aktiivista ainetta. Voi olla myös edullista lisätä materiaaleja, jotka voi-5 vat valitussa analyysissä kemiallisen reaktion avulla tai muulla tavalla muuttaa epäaktiivisiksi materiaalit, jotka saattavat haitata tällaista analyysiä.

Seuraavassa esitetään eräitä suositeltavia tapoja reagenssikerroksen (-kerrosten) valmistamiseksi.

10 (a) Monikerroksinen valmistustapa Tämä tapa kohdistuu menetelmään homogeenisen, spesifisen sidosanalyysivälineen reagenssikerroksen valmistamiseksi ligandin tai ligandin sitomiskyvyn määrittämiseksi nestemäisessä näytteessä lisäämällä koostumusta, johon si-15 sältyy merkkikonjugaattia, joka muodostuu merkkikomponen-tista kytkettynä ligandiosaan tai sen määrättyyn sitovaan analogiin ja reagenssia, joka reagoi merkkikonjugaatin kanssa. Reagenssi voi muodostua esimerkiksi määrätystä sidos-kumppanista ligandia varten tai määrätystä sidoskumppanista 20 ligandia ja komponenttia varten, joka pystyy reagoimaan merkkikonjugaatin kanssa merkkikomponentin lohkaisemiseksi ligandiosasta tai sen määrätystä sidosanalogista.

Reagenssit voidaan levittää sopivissa liuoksissa, jotka eivät pysty reagoimaan oleellisesti keskenään testi-25 välinettä valmistettaessa eivätkä siten reagoi ennenaikaisesti. Suositellussa toteutuksessa määrätyt ensimmäiset reagenssit lisätään kerrokseen vesikastoa käyttäen. Muita rea-gensseja varten käytetään sopivaa orgaanista liuotinta, kuten tolueenia, asetonia, kloroformia, metyleenikloridia, 30 n-propanolia tai etyleenidikloridia. Tämä kerros kiinnitetään antamalla orgaanisen liuottimen haihtua pois.

Esimerkki tästä suositellusta toteutuksesta on menetelmä homogeenisen, spesifisen sidosanalyysivälineen valmistamiseksi ligandin tai ligandin sidoskyvyn määrittämi-35 seksi nestemäisessä näytteessä levittämällä koostumusta, joka sisältää /3-galaktosyyli-umbelliferoni-ligandia tai analogista ligandikonjugaattia, /?-galaktosidaasia ja 22 7481 9 antiseerumia ligandia varten, mikä menetelmä käsittää (a) /3-galaktosidaasin ja ligandin antiseerumin levittämisen vesipitoisena nesteenä ja (b) /J-galaktosyyli-umbelliferoni-ligandin tai analogisen ligandikonjugaatin levittämisen 5 sitten asetonissa.

(b) Monialueinen reagenssikerros

Monialueinen reagenssikerros valmistetaan (a) lisäämällä ensimmäiseen tai peittävään alueeseen hieman, mutta ei kaikkea spesifisessä sidosanalyysijärjestelmässä käyte-10 tyistä reagensseista, (b) lisäämällä toiseen tai alusker-rokseen jäljellä olevat reagenssit, (c) kovettamalla, esimerkiksi kuivaamalla, yksittäiset alueet ja (d) kiinnittämällä ne laminaarisesti toisiinsa.

Ensimmäisellä ja toisella kerroksella kummallakin on 15 kaksi vastakkaista pintaa. Ensimmäisen kerroksen toinen pinta on laminaarisesti kosketuksessa toisen kerroksen toisen pinnan kanssa ja näyte levitetään jommankumman mainittujen kerrosten toiselle pinnalle. Maininta "laminaarinen" tarkoittaa, että näyte, nestemäinen tai kaasumainen, pystyy 20 kulkemaan näiden kerrosten päällekkäin olevien pintojen välitse. Nämä kerrokset voivat liittyä toisiinsa tai niiden välissä voi olla välikerroksia. Välikerrokset eivät saa estää kulkua kaikkien kerrosten välitse.

(c) Jäädytyskuivausmenettely 25 Tämä menettelytapa käsittää yhteensopimattomien rea- genssien lisäämisen yksikerroksiseen analyyttiseen välisen reaktion estämisen. Esimerkiksi ensimmäinen ryhmä rea-gensseja levitetään jäädytyskuivauksen avulla tai kohotetussa lämpötilassa ja käsitelty kerros kovetetaan. Toinen 30 ryhmä reagensseja sisältäen niitä, jotka reagoivat ympäris-tölämpotilassa ensimmäisen ryhmän kanssa, levitetään ja väline jäädytetään nopeasti. Jäädytys estää ennenaikaisen reaktion ja seuraava vedenpoisto jäädytyskuivaamalla estää ennenaikaisen reaktion, kun kerros tuodaan takaisin huoneen 35 lämpötilaan.

Suositellussa toteutuksessa yksi reagenssiryhmä voidaan Lisälä vesiliuoksessa kerrokselle ja kuivata.

23 74 8 1 9

Sitten lisätään toinen reagenssiryhmä vesiliuoksessa ja jäädytetään nopeasti ja jäädytyskuivataan sitten veden poistamiseksi. Tämä menettely sallii reagenssien lisäämisen, jotka liukenevat vain veteen ja estää niiden välisen reak-5 tion. Lisäksi tällöin vältytään orgaanisten liuottimien käytöltä, joista jotkut voivat vaikuttaa haitallisesti joihinkin reagensseihin (esimerkiksi entsyymeihin).

Tämä menettely sallii välineiden valmistamisen käyttäen homogeenisen, spesifisen sidosanalyysin reagensseja, 10 jolloin kaikki reagenssit sisältyvät yhteen ainoaan kerros-elementtiin .

(d) Esimuodostetun kompleksin käyttö Näyteligandin ja merkityn ligandin välinen kilpailu sitoutumisessa sidospartneriin (jota tässä esittää vasta-15 aine "Ab") voidaan esittää yhtälön avulla:

Ligandi + Ab:ligandi z_

Merkkiaine - ligandi -^ + 20 + Ab:merkkiaine - ligandi

Ab

Edellä esitetyssä järjestelmässä vasta-aine ja merkkikon-jugaatti pidetään erillisinä näytteen lisäämiseen asti.

25 Esiteltävän keksinnön tässä toteutuksessa käytetään hyödyksi käänteisreaktiota ja uudelleen tasapainottumista ligandin kanssa, kuten seuraava reaktioyhtälö osoittaa:

Ligandi Ab:ligandi 30 + ----—+

Ab:merkkiaine - ligandi Merkkiaine - ligandi jolloin korvautuneen merkkikonjugaatin määrä on verrannollinen näytteen ligandipitoisuuteen. Etuna on tällöin se, 35 että kaikki reagenssikomponentit voidaan yhdistää yhdeksi lisättäväksi väliaineeksi järjestelmän muodostamiseksi, jossa vaaditaan vain tutkittavan näytteen lisäys.

24 7 4 8 1 9 Tämä käyttötapa antaa tällöin menetelmän homogeenisen, spesifisen sidosanalyysivälineen reagenssikerroksen valmistamiseksi ligandin määrittämiseksi nestemäisessä näytteessä, mikä menetelmä käsittää (a) kompleksin muodosta-5 misen merkkikonjugaatin, mikä konjugaatti muodostuu merk-kikomponentista kytkettynä ligandiin tai sen määrättyyn sidosanalogiin ja spesifisen sidoskumppanin välillä ligan-dia varten; ja (b) kompleksin levittämisen. Tässä menetelmässä kompleksin muodostaminen käsittää merkkikonjugaatin 10 ja sen spesifisen sidoskumppanin saattamisen yhteen ja antaen konjugaatin, sidoskumppanin ja kompleksin saavuttaa tasapainotila.

Tarkemmin sanottuna, kerrokset valmistetaan inkuboi-malla annettua konjugaattia sen vastaavan antiseerumin kans-15 sa lyhyen aikaa, kuten 15 minuuttia. Sitten lisätään mahdolliset lisäaineet ja järjestelmää inkuboidaan edelleen. Täten muodostuneen liuoksen annetaan sitten kovettua.

Tukikerros

Kuten edellä on mainittu, yhtenäiseen analyyttiseen 20 välineeseen kuuluu tukialusta. Tukialusta voi olla läpinäkymätön, läpikuultava tai läpinäkyvä valon tai muun energian suhteen. Tukialustan valinta kutakin määrättyä välinettä varten voidaan tehdä riippumatta tarkoitetusta signaalin ilmaisutavasta. Suositeltaviin tukialustamateriaa-25 leihin kuuluvat polystyreeni ja samantapaiset muovit.

Monikerroksisen välineen valmistus

Keksinnön mukainen monikerroksinen, analyyttinen väline ligandin tai ligandin sidoskyvyn ilmaisemiseksi nestemäisestä näytteestä, missä välineessä on reagenssi-30 kerros sisältäen reagensseja, jotka reagoivat näytteen ligandin kanssa ja sen ligandin sitaniskykvyn muodostaen ilmaistavan vasteen, säteilyä diffundoiva ja estävä kerros ja tukikerros, jolloin jokaisella tällaisella kerroksella on vastakkaiset pinnat, voidaan valmistaa menetelmällä, joka käsittää 35 vaiheet: (1) tukikerroksen pinnan kiinnittämisen säteilyä diffundoivaan ja estävään kerrokseen, joka 25 7481 9 (a) ei läpäise ligandia, reagenssikerroksen reagens-seja eikä niiden välisten reaktioiden tuotteita ja (b) on inertti ligandin, reagenssikerroksen reagens-sien ja niiden välisten reaktioiden tuotteiden suhteen; ja 5 (2) reagenssikerroksen pinnan kiinnittämisen sätei lyä diffundoivan ja estävän kerroksen vastakkaiseen pintaan.

Eräässä toteutuksessa tukikerroksen pinnan kiinnittäminen säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen pintaan suoritetaan muodostamalla säteilyä diffundoiva ja estävä 10 kerros tukikerroksen pinnalle. Toisessa toteutuksessa tukikerroksen pinnan kiinnittäminen säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen pintaan suoritetaan muodostamalla säteilyä diffundoiva ja estävä kerros ja kiinnittämällä sitten täten muodostetun säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen 15 pinta tukikerroksen pintaan.

Ilmaisuvaste

Kuten edellä on mainittu, useat nykyisin käytetyt homogeeniset, spesifiset sidosanalyysijärjestelmät muodostavat tai ne voidaan helposti saada muodostamaan ilmaista-20 va vaste, kuten värinmuutos, kemiluminenssi tai fluoresenssi, jotka ovat riippuvia analysoitavan ligandin läsnäolosta tai määrästä nestemäisessä näytteessä.

Termi "ilmaistava ainelaji" ja vastaavat tässä käytetyt termit tarkoittavat atomeja, kemiallisia ryhmiä (esi-25 merkiksi molekyylin osaa) tai kemiallisia yhdisteitä, jotka itsessään ovat ilmaistavissa suoraan tai epäsuoraan ja termillä "ilmaisuvaste" ja vastaavilla tässä käytetyillä termeillä tarkoitetaan näiden ainelajien läsnäolon ilmaistua todentamista. Esimerkkejä ovat sähkömagneettiset sätei-30 lysignaalit, kuten fluoresenssi, fosforenssi, kemiluminenssi, muutos valon absorptiossa tai heijastus näkyvässä spektrialueessa, jolloin esiintyy näkyvä värinmuutos, muutos valon absorptiossa tai heijastuksessa näkyvän valo-alueen ulkopuolella, kuten ultraviolettialueessa tai infra-35 puna-alueessa. Kuten alan asiantuntijat ymmärtävät, mainintaa "ilmaistava vaste" käytetään sen laajimmassa merkityksessä. Sähkömagneettisten säteilysignaalien lisäksi termiin 26 7 4 8 1 9 "ilmaistava vaste" tarkoitetaan kuuluvan myös kaikki havaittavat muutokset järjestelmän parametreissä, kuten muutos reagenssissa tai sen ulkonäössä, jonkin aineosan havaittava saostuminen näytteessä tai muutos jossakin muussa 5 parametrissä, joko reagenssijärjestelmässä tai tutkittavassa näytteessä. Näihin muihin ilmaistaviin vasteisiin kuuluvat sähkökemialliset vasteet ja kalorimetriset vasteet. Ilmaistava vaste on lisäksi sellainen, joka voidaan havaita aistien avulla joko suoraan tai lisäilmaisuvälineitä, 10 kuten spektrofotometria, ultraviolettia valoa ilmaisevaa laitetta, fluorometriä, spektrofotometria, ultraviolettia valoa ilmaisevaa laitetta, fluorometriä, spektrofluoromet-riä ja muita vastaavia mittausvälineitä käyttäen. Edullisesti tämä ilmaistavuus sopivasti kohdistuu ilmaistavan ai-15 nelajin koko määrään ilman, että vaikutetaan haitallisesti diffundoituvan tuotteen määrään, mikä aiheutuu analyytin vuorovaikutuksista, jotka muodostavat tarkoitetun analyysin perustan.

Kun analyyttinen tulos on saatu ilmaistavana muutok-20 sena, se mitataan, tavallisesti siirtämällä testiväline alueen lävitse, jossa voidaan käyttää sopivaa laitetta heijastus-, läpäisy- tai fluoresenssifotometriaa varten. Nämä laitteet kohdistavat välineeseen energiasuihkun, kuten valo-suihkun. Valo heijastuu sitten välineestä takaisin ilmaisi-25 meen. Analyyttinen tulos ilmaistaan välineen alueelta, joka on kokonaan sillä alueella, jossa tällainen tulos muodostuu. Heijastusspektrometrian käyttö voi olla edullista eräissä tapauksissa, koska tällöin vältytään tehokkaasti mahdollisten jäännösten optisilta häiriöiltä, kuten verisolujen tai 30 virtsasaostumien aiheuttamilta häiriöiltä, joita on jäänyt välineen kerroksille tai kerroksiin tai epätyypillisistä virtsan väreistä johtuen. Fluoresenssispektrofotometrian tavanomaisia menettelyjä voidaan myös käyttää. Yleensä sähkömagneettinen säteily, jonka aallonpituus on alueella 35 noin 200-900 nm, on havaittu käyttökelpoiseksi näissä mittauksissa, vaikka jokaista säteilyä, jotka läpäisevät rea- 27 7481 9 genssikerroksen (-kerrokset) ja jotka pystyvät määrittämään välineessä muodostuneen tuotteen määrän, voidaan käyttää. Erilaisia kalibrointimenettelyä voidaan käyttää analyysin valvontaa varten. Eräänä esimerkkinä näyte ana-5 lysoitavan ligandin standardiliuosta voidaan levittää sen alueen viereen, jolle näytepisara on sijoitettu differen-tiaalimittausten suorittamiseksi analyysissä.

Esimerkit

Seuraavissa esimerkeissä esitellään kokeita, joita 10 suoritettiin esillä olevaa keksintöä kehitettäessä. Ne esittelevät keksinnön suositeltavia toteutusmuotoja.

Esimerkki 1

Mallijärjestelmien vertailu 15 Keksinnön mukaisen estokerroksen vaikutuksen tutki miseksi valmistettiin välineitä sekä käyttäen esitettyä säteilyä diffundoivaa ja estävää kerrosta reagenssikerroksen ja tukikerroksen välissä sekä ilman sitä. Tämän mallijärjestelmän reagenssikerrokseen sisältyy reagenssiliuosta, 20 joka itse emittoi ilmaistavan vasteen, fluoresenssin. Täten tämä esimerkki muodostaa vertailun, joka ei rajoitu johonkin määrättyyn ligandiin.

Välineen valmistus

Molempia tyyppejä olevia välineitä valmistettiin 25 käyttäen tukikerroksia, joista eräät olivat polyesteriä ja muut geelisidottua kalvoa, joiden kaikkien mitat olivat 0,5 x 1,0 cm. Välineissä A ja B oli tukikerros säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen sekä reagenssikerrosten välissä; välineessä B oli monialueinen reagenssikerros.

30 Välineessä C reagenssikerros oli tukikerroksen ja säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen välissä. Välineessä D säteilyä diffundoiva ja estävä kerros oli reagenssikerroksen ja tukikerroksen välissä ja se on tämän keksinnön mukainen väline.

35 Väline A valmistettiin valamalla reagenssikerros- kalvo agaroosikoostumuksesta tukikerroksen toiselle pinnalle ja TiC^-pigmenttiä sisältävää koostumusta oleva kerros 7481 9 28 toiselle pinnalle säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen muodostamiseksi. Agaroosikoostumus valmistettiin seuraavasti :

Aineosa Määrä 5 Agaroosia 1,5 g

Triton X-100 (10-%:ista, paino/tilav.) 500,0 ^ul 1 M (molaarista) Bicine'ä (pH-arvo 8,3) 10,0 1 H20 40,0 ml

Triton on synteettisten, orgaanisten pinta-aktiivisten ai-10 neiden kauppanimi, joita myy Rohm & Haas, Philadelphia, PA. Bicine on Ν,Ν-bis(2-hydroksietyyli)glysiini.

Ti02-pigmenttiä sisältävä koostumus valmistettiin seuraavasti:

Aineosa Määrä 15 TiC>2 2,5 g PVP 2,5 g

Kloroformi 44,5 g

Dioktyyliftalaatti 0,5 g Välineen B valmistus oli samanlainen kuin edellä 20 esitetyn välineen A, paitsi että polyvinyylipyrrolidoni-koostumusta (PVP) valettiin kalvoksi agaroosikalvon pinnalle, joka oli vastapäätä tukikerrokseen koskettavaa pintaa. PVP-koostumus muodosti kalvon, joka yhdistyi agaroosi-kalvoon muodostaen monialueisen reagenssikerroksen ja se 25 valmistettiin seuraavasti:

Aineosa Määrä PVP 5,0 g

Kloroformi 45,0 g Väline C valmistettiin valamalla reagenssikerros-30 kalvo agaroosikoostumuksesta tukikerroksen toiselle pinnalle. Agaroosikerroksen koostumus oli sama kuin välineissä A ja B käytetty. Samaa Ti02~koostumusta, jota käytettiin välineisiin A ja B, käytettiin sitten kalvon valamiseksi agaroosikalvon pinnalle, joka oli vastapäätä tukikerroksen 35 kanssa kosketuksessa olevaa pintaa.

VäJ inc 1) valmistettiin valamalla Ti02-pigmcntt ikoos-tumusta, joka oli samaa kuin muissa välineissä käytetty, 29 7481 9 tukialustalle säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen muodostamiseksi ja sitten valamalla agaroosikoostumusta, joka oli samaa kuin muissa välineissä käytetty, sille aga-roosikerroksen pinnalle, joka oli vastapäätä tukikerrosta 5 koskettavaa pintaa.

Lisäksi laminoitiin yhteen kooltaan 0,5 x 1,0 cm olevia palasia Whatman 31 ET suodatinpaperia (Whatman, Inc., Dlifton, N.J. 07014) ja heijastavaa Mylar-polyesteriä (3M Company, St. Paul, MN 55144) välineen E muodostamiseksi.

10 Mitään reagenssia ei sisältynyt valmistettuihin välineisiin .

Analyyttinen menettely

Edellä esitetyllä tavalla valmistetut välineet sijoitettiin kukin mekaaniseen pitimeen, joka soveltuu sijoitet-15 tavaksi vaakatasoon fluorometriin. Jokaiseen välineeseen pantiin 30 ^ul suuruinen pisara 7-hydroksikumariini-3-karb-oksanilidiä (HCC) vesiliuoksissa välittömästi ennen välineen sijoittamista fluorometriin. Jokainen HCC-liuos, jota käytettiin, oli väkevyydeltään 0,2 - 2,0 mikromolaarinen 20 (yUM).

Fluorometri oli säädetty muodostamaan viritysvalolähde, jonka aallonpituus oli 405 nanometriä (nm) ja joka kohdistui välineen pintaan 90° kulmassa pinnan tasoon nähden ja ilmaisemaan 450 nm aallonpituudella heijastunut va-25 io. Fluoresenssin etupintamittaus tehtiin 90° kulmassa välineen pinnan tasosta. Jokaisen näytteen fluoresenssi mitattiin .

Tulokset Määritettiin vastaavasti jokaisen HCC-näytteen alue 30 (R) ja signaalin suhde taustaan (S/B) käyttäen lausekkei ta 1 ja 2: (1) R ' Fm - Fb <2) S'B - VFb jolloin F^ ja F^ ovat fluoresenssisignaalit sokeassa kokeessa ja HCC-liuokselle vastaavasti.

35 Välineitä A ja B käyttäen saadut arvot on esitetty sekä kuvioissa 1 että 2 katkoviivoilla piirrettyjen käyrien avulla. Välineitä C ja D käyttäen saadut arvot on esitetty 30 7 4 8 1 9 sekä kuviossa 1 että 2 jatkuvana viivana piirrettyjen käyrien avulla. Välinettä E käyttäen saadut arvot on esitetty sekä kuviossa 1 että 2 ohuena viivana esitettyjen käyrien avulla.

5 Kuvio 1 esittää graafisesti aluetta funktiona HCC- pitoisuudesta jokaiselle järjestelmälle. Lukuun ottamatta Whatman 31 ET välinettä (väline E) havaitaan kaksi selvästi erottuvaa vastetta Ti02~järjestelmille. Valmisteet, joissa TiC^-kerros on tukialustan alapuolella (välineet A ja B) 10 sekä geelisidokselle että polyesterille, osoittavat matalamman alueen kuin ne, joissa Ti02~kerros on tukialustan päällä (välineet C ja D) sekä geelisidokselle että polyesterille, kosketuksessa HCC-liuosten kanssa. Whatman 31 ET väline (väline E) osoittaa paremman alueen kuin Ti02~jär-15 jestelmät.

Sama ilmiö välineiden A ja B toisaalta ja välineiden C ja D välillä toisaalta voidaan havaita, jos signaali/ taustasuhde (S/B) piirretään HCC-pitoisuuksien suhteen, kuten kuviossa 2 on esitetty. Valmisteet, joissa Ti02“kerros 20 on tukialustan päällä, mikä suojaa HCC-liuoksia vastaanottavaa kerrosta, osoittavat suuria S/B-suhteita. Ne, joissa Ti02-kerros on tukialustan alapuolella, osoittavat pieniä suhteita ja Whatman 31 ET väline (väline E) on näiden välillä.

25 Esimerkki 2

Substraattimerkitty fluoresoiva immunoanalyysiväli-ne teofylliiniä varten

Teofylliini /1,3-dimetyyliksantiini, ks. The Merck Index, 9. painos, sivu 1196 (1976)./ on käyttökelpoinen lää-30 ke astman hoidossa. Useimmille potilaille seerumipitoisuuden terapeuttinen alue on välillä 10-20 ^ug mililitraa kohti, kun taas myrkyllisyys lähes aina esiintyy suuremmilla kuin 35 ^.ug/ml olevilla veripitoisuuksilla.

Konjugaatin valmistus 35 /A-galaktosyyli-umbelliferoni-merkitty teofylliini- konjugaatteja (,^-GUT) valmistettiin kuviossa 3 esitetyn reaktiokaavion mukaan. Tätä synteettistä menettelyä esittää 31 7481 9 seuraava menetelmä 8-/3-(7-/3-galaktosyylikumariini-3-karbok-siamido)propyyli/teofylliinin (4), n = 3, valmistamiseksi.

8-(3-aminopropyyli)teofylliini_(2/

Seosta, joka sisälsi 2,66 g (0,01 mol) 8-(3-karbok-5 sipropyyli)teofylliiniä (1) /Cook et ai., Res. Commun, Chem, Path. Pharmacol. 13(3):497-505 (1976)^, 20 ml kloroformia ja 3 ml väkevöityä rikkihappoa, sekoitettiin 50°C lämpötilassa argon-atmosfäärissä. Tähän lisättiin 1,3 g kiinteää natriumatsidia annoksittain 90 minuutin aikana /vrt. Organic 10 Reactions 47:28 (1976)/. Reaktioseos jäähdytettiin ja liuotin poistettiin alennetussa paineessa. Jäännökseen lisättiin riittävästi natriumbikarbonaattiliuosta pH:n saamiseksi arvoon 7,5. Lisättiin 10 g Celite'ä (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, Pennsylvania) ja vesi poistettiin haihdut-15 tamalla. Celite on määrättyjen piimaatuotteiden kauppanimi. Kyllästetty Celite sijoitettiin pylvään huippuun, joka sisälsi 200 g piigeeliä (E. Merck Co., Darmstadt, Länsi-Saksa) muodostettuna seokseen, joka sisälsi suhteessa 9:1 (tilav./ tilav.) etanolia ja 1-molaarista trietyyliammoniumbikarbo-20 naatin vesiliuosta. Pylvästä eluoitiin tällä liuottimena ja 15 ml jakeet koottiin. Jakeet 171-225 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 500 mg valkoista jauhetta. Tälle aineelle suoritettiin uudestaan kromatografinen käsittely CM-Sephadex-pylväässä, ammoniummuoto 25 (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey, USA), eluoimalla 0,5-molaarisella ammoniumbikarbonaattiliuoksel-la. Panostilavuus oli 3 x 50 cm ja 10 ml jakeet koottiin. Jakeet 65-110 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 250 mg valkoista kiinteää ainetta. Se pantiin lai-30 meaan suolahappoon ja haihdutettiin uudestaan kuiviin.

Jäännös kiteytettiin uudestaan metanolista, jolloin saatiin 90 mg (saanto 3 %) yhdisteen (2) suolahapposuolaa vaaleanruskeina neulasina, jotka eivät sulaneet 300°C alapuolella .

35 Analyysi kaavalle C-^qH^Nj-CIC^ : laskettu: C 43,88 H 5,89 N 25,59 saatu: C 43,77 H 5,88 N 25,46.

32 7481 9

Infrapunaspektri (KC1): 1695 cm ^ ja 1655 cm 1 (amidikarbonyylit).

8-/2- (7-/3-galaktosyylikumariini-3-karboksamidi) pro-pyyli/teofylliini (4) 5 Valmistettiin reaktioseos, joka sisälsi 24 g kalium- hydroksidia, 80 ml vettä, 240 ml metanolia ja 20 g (0,035 mmol) etyyli-7-/3-galaktosyylikumariini-3-karboksylaattia /Burd et ai., Clin. Chem. 23:1402 (1977)/. Reaktioseosta sekoitettiin 50°C lämpötilassa 15 tuntia. Jäähdyttämisen 10 jälkeen poistettiin metanoli alennetussa paineessa. Väke-vöity vesiliuos tehtiin happameksi pH-arvoon 2,0 väkevöi-dyllä suolahapolla. Valkoinen sakka otettiin talteen, pestiin kylmällä vedellä ja kiteytettiin uudestaan kuumasta vedestä. Kiteet otettiin talteen, pestiin asetonilla ja 15 kuivattiin 80°C lämpötilassa tunnin aikana. Tällöin saatiin 12 g 7--Vgalaktosyylikumariini-3-karboksyylihappoa valkoisina kiteinä; sp. 250-255°C.

Seos, joka sisälsi 1,45 g (0,004 mol) 7-/3-galakto-syylikumariini-3-karboksyylihappoa, 404 mg (0,004 mol) 20 trietyyliamiinia ja 40 ml kuivaa dimetyyliformamidia (DMF), jäähdytettiin -10°C lämpötilaan sekoittaen argonin alla. Tähän lisättiin 546 mg (0,004 mol) isobutyylikloroformaat-tia (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) seka-an-hydridin (3) muodostamiseksi. 10 minuutin kuluttua lisät-25 tiin pulloon vielä 404 mg trietyyliamiinia ja 949 mg (0,004 mol) 8-(3-aminopropyyli)teofylliiniä (2). Sekoittamisen jälkeen 30 minuutin ajan -10°C lämpötilassa reaktio-seoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan. Se yhdistettiin 10 g kanssa piigeeliä ja DMF poistettiin suuressa tyh-30 jiössä. Kyllästetty piigeeli pantiin pylvään huippuun, joka sisälsi 170 g piigeeliä ja pylvästä eluoitiin vedettömällä etanolilla ja 15 ml jakeet koottiin. Jakeet 41-475 yhdistettiin ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 545 mg keltaista kiinteää ainetta. Se liuotettiin veteen, 35 suodatettiin ja väkevöitiin 20 ml tilavuuteen. Muodostui pieni määrä sakkaa, joka hävitettiin. Suodokselle suoritettiin kromatografinen käsittely 2,5 x 57 cm Sephadex LH-20 33 7481 9 geelipylväässä (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New jersey), eluoitiin edellä ja 15 ml jakeet otettiin talteen. Sephadex on hydrofiilinen, liukenematon molekyyliseula-kromatografinen välinaine, valmistettu ristiliittämällä 5 dekstraania. Jakeet 18-23 yhdistettiin, haihdutettiin kuiviin ja jäännös kiteytettiin uudestaan vedestä, jolloin saatiin 55 mg (saanto 2 %) merkkikonjugaattia (4) vaaleankeltaisena kiinteänä aineena; sp. 190-192°C.

Analyysi kaavalle C26H29N5°11: 10 laskettu: C 53,15 H 4,98 N 11,92 saatu: C 52,65 H 5,01 N 11,80

Edellä esitetty synteesi ,3-galaktosyylikumariini-teofylliini-konjugaattia (4), n = 3, varten voidaan modifioida merkkikonjugaatin saamiseksi, jossa n = 2, vaiheen 15 6 kautta korvaamalla lähtömateriaali 8-(3-karboksipropyy- li) teofylliini (1), n = 3, asianmukaisella 8-(<o-karboksi-alkyyli)teofylliinillä seuraavasti: n Alkyleeni 2 etyleeni 20 4 butyleeni 5 pentyleeni 6 heksyleeni Antiseerumin valmistus

Antiseerumi kerättiin kaniineista, jotka immunisoi-25 tu teofylliini-immunogeeni-konjugaatilla valmistettuna tavalla, jonka ovat esittäneet Cook et ai, Res. Comm. Chem. Path. Parhamacol. 13:497-505 (1976).

Välineen valmistus Näissä kokeissa käytetyn välineen rakenne on esitet-30 ty kuviossa 4. Tukikerros 2 on polystyreeniä. Läpäisemätt-män säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen 4 koostumus sisältää seuraavat aineosat:

Styreeni/maleiinihappoanhydridi-kopolymeeriä (50/50, molekyylipaino 50 000) 10 g 35 Polyctylecniglykolia (molekyylipaino 1 000) 4 g

Titaanidioksidia 10 g

Asetonia 34 g 34 7481 9 Tätä koostumusta valettiin polystyreenialustalle 2 märkäpaksuuteen 5 mm ja sen annettiin kuivua huoneen lämpötilassa .

Gelatiinivälikerros 6 kiinnittyy läpäisemättömän, 5 säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen 4 pintaan ja muodostaa yhden alueen monialueiseen reagenssikerrokseen 12. Välikerroksen koostumus on seuraava: gelatiinia 5 g 0,1 M bicine-puskuria (pH-arvo 11,1) 45 g 10 Tätä koostumusta valettiin kerrokselle 4 0,127 mm paksuu delta ja kuivattiin 37°C lämpötilassa.

Kerrokseen 8 sisältyvä vasta-aine ja entsyymi valmistettiin seuraavan koostumuksen omaavasta valmisteesta: 4-%:ista (paino/tilav.) agaroosia LGT 0,8 M 15 bicine-puskurissa (pH-arvo 8,5) 1,5 ml 10-%:ista Triton X-100 (paino/tilav.) 30 ^ul 1 M bicine'ä, 0,1 M MgC^, pH-arvo 8,5 300 ^ul teofylliinin antiseerumia 464 ^ul /3-galaktosidaasia (177 U/ml) 430 ^ul 20 kahdesti tislattua vettä 276 ^ul

Agaroosi LGT on agaroosimateriaalia, jonka paahto-lämpötila on alempi kuin 40°C ja sitä myy the Research Products of Miles Laboratories, Inc., P.O. 2000, Elkhart, Indiana 46515. Tätä koostumusta valettiin kerrokselle 6 25 0,5 mm märkäpaksuudelta ja kuivattiin 37°C lämpötilassa.

Tämä on monialueisen reagenssikerroksen 12 välialue.

Konjugaattia sisältävä kerros 10 valmistettiin seuraavan koostumuksen omaavasta valmisteesta /3-GUT-konjugaattia 69,2 ^ul 30 6-%:ista (paino/paino) PVP:tä (molekyylipaino 360 000) CHCl^rssa (1,93 ml) 2,90 g

Triton X-100 5 ^ul Tätä koostumusta valettiin kerrokselle 8 märkäpaksuuteen 0,127 mm ja kuivattiin huoneen lämpötilassa. Tämä 35 on monikerroksisen reagenssikerroksen 12 päällimmäisin alue. Kerroksen 10 paljaana oleva yläpinta on pinta, johon näyte sijoitetaan ja josta lukemat luetaan.

35 74 8 1 9

Analyyttinen menettely 35 ^,ul:n otos lääkeliuoksesta pipetoitiin edellä esitetyllä tavalla luistetun analyyttisen välineen paljaal-le pinnalle.

5 Huoneen lämpötilassa muodostunut fluoresenssi mitat tiin viiden minuutin aikana fluorometrissä, joka oli varustettu mekaanisella pitimellä, joka soveltuu analyyttisen välineen sijoittamiseen vaakatasoon. Fluorometri oli säädetty antamaan viritysvalolähde, jonka aallonpituus oli 10 405 nm ja joka osui pintaan 90° kulmassa sekä ilmaisemaan aallonpituudella 450 nm emittoitunut valo. Fluoresenssin etupintamittaus suoritettiin 90° kulmassa alustan suhteen.

Analysoidut väkevyysalueet olivat seuraavat:

Alue Teolifylliini 15 Terapeuttinen alue 10-20 ^ul/ml

Annosvaste, tarkistettu alue 0-41 ^ul/ml

Annosvasteen tarkistettu alue peittää terapeuttisen alueen.

Tulokset

Edellä esitetyssä menettelyssä saadut arvot on esi-20 tetty graafisesti kuviossa 5. Fluoresenssi (ordinaatta) on esitetty millivoltteina (mV). Millivoltti on voltin tuhannesosa. Annosvastekäyrä 6 laadittiin kuvion 5 mukaisten arvojen perusteella kolmen (3) minuutin kohdalta. (Oordi-naatta esittää suhteellista fluoresenssia.) 25 Johtopäätökset

Saadut arvot osoittavat, että keksinnön mukaisesti valmistetut analyyttiset välineet antavat kvantitatiivisesti ilmaistavia signaaleja, jotka vastaavat läsnäolevan teo-fylliinin pitoisuusalueita. Teofylliinin pitoisuuden suu-30 rentaminen aiheuttaa lääkkeestä riippuvan kasvun vastaavan analyyttisen välineen fluoresenssiin.

Claims (9)

36 7481 9

1. Monikerroksinen analyyttinen väline ligandin tai ligandin sidoskyvyn ilmaisemiseksi nestemäisestä näyttees- 5 tä, mikä väline käsittää reagenssikerroksen, joka sisältää reagensseja, jotka vaikuttavat näytteen ligandiin tai näytteen ligandinsitomiskykyyn muodostaen ilmaistavan vasteen, säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen ja tukikerroksen, tunnettu siitä, että reagenssikerros on ei-diffun-10 doiva kalvo ja säteilyä diffundoiva ja estävä kerros (a) on sijoitettu ei-diffundoivan reagenssikerroksen ja tukikerroksen väliin; (b) ei läpäise ligandia, ei-diffundoivassa reagenssikerroksessa olevia reagensseja eikä niiden vuoro-vaikutustuotteita; ja (c) on inertti ligandin, ei-diffun-15 doivassa reagenssikerroksessa olevien reagenssien ja niiden vuorovaikutustuotteiden suhteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monikerroksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että säteilyä diffundoiva ja estävä kerros on läpinäkymätön ja sisältää 20 valkoista tai väriltään vaaleaa pigmenttiä.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen monikerroksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että säteilyä diffundoiva ja estävä kerros muodostuu anhydridi-hartsista.

4. Jonkin patenttivaatimuksista 1-3 mukainen moniker roksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen paksuus on 0,0005 - 0,05 cm.

5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen moniker-30 roksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että reagenssikerros sisältää reagensseja homogeenista, spesifistä sidosanalyysijärjestelmää varten, joka muodostaa ilmaistavan vasteen, joka on funktio ligandin läsnäolon tai ligandin sidoskyvyn suhteen näytteessä.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen monikerroksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että homogee- 7481 9 37 niseen, spesifiseen sidosanalyysijärjestelmään kuuluu merkkiaine, joka osallistuu entsymaattiseen reaktioon.

7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen monikerroksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että 5 reagenssikerros muodostuu reagenssikoostumuksesta, joka sisältää (i) vasta-ainetta, joka sitoo ligandin (ii) ligandin konjugaattia tai sen sidosanalogia ja merkkiainetta sekä 10 (iii) ilmaisujärjestelmän, joka reagoi merkkiaineen kanssa ilmaistavan vasteen muodostamiseksi, joka on erilainen, kun merkkikonjugaatti on sitoutunut vasta-aineeseen verrattuna siihen vasteeseen, joka muodostuu, kun se ei ole sitoutunut, 15 jolloin ilmaistava vaste on funktio ligandin läsnäolosta nestemäisessä näytteessä.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 5-7 mukainen monikerroksinen analyyttinen väline, tunnettu siitä, että (1) reagenssikerros muodostuu 20 (a) reagensseista homogeenisista, spesifistä sidos- analyysi järjestelmää varten, joka muodostaa ilmaistavan vasteen, joka on funktio ligandin läsnäolosta tai ligandin sidoskyvystä näytteessä; ja (b) kiinteästä kantajasta, johon reagenssit on lisät- 25 ty; ja (2) säteilyä diffundoiva ja estävä kerros sisältää pigmenttiä, joka on lisätty anhydridihartsiin, mikä kerros (a) on sijoitettu reagenssikerroksen ja tukikerrok-sen väliin; 30 (b) ei läpäise ligandia, reagenssikerroksen reagens- seja eikä niiden välisten reaktioiden tuotteita; ja (c) on inertti ligandin, reagenssikerroksen reagens-sien ja niiden välisten reaktioiden tuotteiden suhteen.

9. Menetelmä ligandin tai ligandin sidoskyvyn ilmai- 35 semiseksi nestemäisestä näytteestä, jolloin näyte saatetaan kosketukseen monikerroksisen analyyttisen välineen kanssa, 38 7481 9 mikä on tyyppiä, joka käsittää reagenssikerroksen, joka sisältää reagensseja, jotka reagoivat näytteen ligandiin tai näytteen ligandin sidoskyvyn ilmaistavan vasteen muodostamiseksi; säteilyä diffundoivan ja estävän kerroksen 5 sekä tukikerroksen, tunnettu siitä, että käytetään monikerroksista analyyttistä välinettä, joka on jonkin patenttivaatimuksista 1-8 mukainen. 39 74 81 9