ES2134185T5 - Ensayos utilizando esteres, tioesteres y amidas quimioluminiscentes mejorados. - Google Patents
Ensayos utilizando esteres, tioesteres y amidas quimioluminiscentes mejorados.Info
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Abstract
DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCION SE DESCRIBEN ENSAYOS DE ENLACE ESPECIFICOS, QUE UTLIZAN UN COMPUESTO QUIMILUMINISCENTE, QUE TIENE ESTABILIDAD MEJORADA EN DISOLUCION ACUOSA. LA PARTE QUIMILUMINISCENTE ES UN ESTER, TIOESTER O AMIDA, EN LA QUE LA UNION ESTER, TIOESTER O AMIDA ESTA ENTRE (1) UN ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS HETEROCICLICOS, QUE TIENE UN ATOMO DE CARBONO AL QUE ESTA LIGADO EL ENLACE, DONDE EL HETEROATOMO EN EL ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS HETEROCICLICOS SE HALLA EN UN ESTADO DE OXIDACION QUE HACE TAL ATOMO DE CARBONO SUSCEPTIBLE DE ATAQUE POR PEROXIDO U OXIGENO MOLECULAR, PARA FORMAR UN INTERMEDIO QUE SE DESCOMPONE PARA PRODUCIR QUIMILUMINISCENCIA, Y (2) UN ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS ARILICO. ESTE CONTIENE POR LO MENOS UN ANILLO DE 6 MIEMBROS SUSTITUIDO. ESTE TIENE DOS O MAS GRUPOS SUSTITUYENTES, DONDE POR LO MENOS DOS DE DICHOS GRUPOS IMPIDEN ESTERICAMENTE LA HIDROLISIS DE DICHO ENLACE. UNO O MAS DE LOS GRUPOS SUSTITUYENTES QUE IMPIDEN ESTERICAMENTE LA HIDROLISIS DEL ENLACEPUEDE SER UN GRUPO APETENTE DE ELECTRONES. EL ANILLO DE 6 MIEMBROS SUSTITUIDO PUEDE TENER UNO O MAS GRUPOS SUSTITUYENTES ADICIONALES, ADEMAS DE LOS GRUPOS SUSTITUYENTES QUE IMPIDEN ESTERICAMENTE LA HIDROLISIS DEL ENLACE. LOS ATOMOS DE CARBONO EN EL ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS HETEROCICLICOS, A LOS QUE ESTA UNIDO EL ENLACE, TAMBIEN PUEDEN TENER UN SUSTITUYENTE SECUNDARIO DE FORMULA RNX-, DONDE X SE ELIGE DEL GRUPO QUE CONSTA DE O, N, S Y C; R ES CUALQUIER GRUPO, Y N ES UN NUMERO TAL QUE X TIENE LA VALENCIA ADECUADA. SE DESCRIBEN OTRAS PARTES QUIMILUMINISCENTES QUE SE CARACTERIZAN POR UN ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS HETEROCICLICOS Y UN SUSTITUYENTE SECUNDARIO DE FORMULA RNX-, ESTANDO LA UNION ESTER, TIOESTER O AMIDA ENTRE EL ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS HETEROCICLICOS Y UN GRUPO SALIENTE. LAS PARTES QUIMILUMINISCENTES DESCRITAS TAMBIEN PUEDEN CONTENER SUSTITUYENTES EN POSICIONES PERI DENTRO DEL ANILLO O SISTEMA DE ANILLOS HETEROCICLICOS. TAMBIEN DE ACUERDO CON LA PRESENTE INVENCION, SE DESCRIBEN COMPOSICIONES QUE CONTIENEN TALES PARTES QUIMILUMINISCENTES Y CONJUNTOS DE ENSAYO QUE LAS INCORPORAN.
Description
Ensayos utilizando ésteres, tioésteres y amidas
quimioluminiscentes mejorados.
Esta invención se refiere a ensayos e
inmunoensayos que utilizan conjugados quimioluminiscentes como
marcadores.
Ciertos compuestos producen luz o
quimioluminiscencia por tratamiento con peróxido u oxígeno molecular
a un pH alto. La luz se produce por el descenso de un intermediario
químico que se forma por el ataque del peróxido u oxígeno molecular
a un centro de carbono hibridado sp2 o sp3. El centro de carbono que
es atacado puede ser parte de una cadena, de un anillo o de un
sistema cíclico.
Las características y el comportamiento de
algunos de estos compuestos quimioluminiscentes están completamente
descritas en McCapra, "Chemiluminiscence of Organic Compounds",
in Progress in Organic Chemistry, vol. 8, Carruthers and
Sutherland ed. (Wiley & Sons 1973) que se incorpora a este
documento como referencia.
Los compuestos quimioluminiscentes se han
utilizado como marcadores en ensayos prototipo incluyendo los
inmunoensayos durante muchos años. Ejemplos de dicho uso pueden
encontrarse en los documentos patentes de EE.UU. números 4.383.031,
4.380.580, 4.226.993 y muchos otros. En general, sin embargo, estos
compuestos no han sido utilizados en ensayos comerciales, debido a
su falta de estabilidad en soluciones acuosas. Esta falta de
estabilidad es especialmente importante para la subclase de
compuestos quimioluminiscentes que comprende ciertos ésteres,
tioésteres y amidas. Estos compuestos reaccionan según la reacción
general ilustrada debajo para los ésteres:
en la que A es un anillo arilo o sistema cíclico
arilo y B es un anillo heterocíclico o un sistema cíclico
heterocíclico. Los compuestos de esta subclase tienden a "perder
su quimioluminiscencia" debido a la hidrólisis prematura del
enlace éster, el tioéster o amida. Una vez que se hidroliza el
enlace el compuesto ya no produce quimioluminiscencia
eficientemente. Si el compuesto se utiliza como marcador en un
ensayo, la marca perderá gradualmente su capacidad de
quimioluminiscencia, produciendo así resultados de ensayo no
fiables.
Por lo tanto es deseable proporcionar compuestos
éster, tioéster y amida quimioluminiscentes para su uso en ensayos
que no sean susceptibles de hidrolizarse y que muestren por lo tanto
un incremento de la estabilidad en solución acuosa.
Un artículo de Weeks et al [Clin. Chem.,
29/8, 1474-1479, (1983)] discute la síntesis de un
derivado de éster de acridinio quimioluminiscente del que se dice
que es capaz de asociación covalente, bajo condiciones suaves, con
anticuerpos para rendir derivados inmunoreactivos estables de alta
actividad quimioluminiscente específica.
El documento
EP-A-0263657 describe varios ésteres
de aril-acridinio polisustituídos. Se dice que estos
compuestos proporcionan marcas altamente estables para su uso en un
ensayo quimioluminiscente.
El documento
EP-A-0309230 describe métodos de
ensayo diagnóstico y marcas para detectar un medio cuando el
anabolito es un miembro de un par de unión específica. En un sistema
quimioluminiscente particular se usan sondas de éster de acridinio
marcadas en un ensayo de hibridación para detectar secuencias de
polinucleótidos diana.
El documento
EP-A-0257541 describe ciertos
derivados de acridinio quimioluminiscentes y su uso en ensayos de
inmunoenzimas luminiscentes.
El documento
EP-A-0273115 describe varias
sulfonamidas de acridinio e isómeros de las mismas. También se
describen métodos de síntesis. El
N-sulfonil-9-acridinio
carboxamida y su isómero parecen ser útiles en ensayos
quimioluminiscentes, cuando se conjugan a antígenos, haptenos,
anticuerpos o ácidos nucleicos.
Según la presente invención, se han descrito
ensayos de unión específicos que utilizan un compuesto
quimioluminiscente, es decir, resto, que tiene una estabilidad
aumentada en solución acuosa. El resto quimioluminiscente es un
éster, tioéster o amida en el que el enlace éster, tioéster o amida
se produce entre (1) un anillo heterocíclico o sistema cíclico que
contiene un átomo de carbono al que se une el enlace, en el que el
heteroátomo dentro del anillo heterocíclico o sistema cíclico
heterocíclico está en un estado de oxidación que vuelve a tal átomo
susceptible de ser atacado por un peróxido ú oxígeno molecular para
formar un intermediario que reduce la producción de
quimioluminiscencia, y (2) un anillo arilo o sistema cíclico arilo.
El anillo arilo o sistema cíclico arilo contiene al menos un anillo
de seis miembros sustituido. El anillo de seis miembros sustituido,
tiene dos o más grupos sustituyentes, en los que al menos dos de
dichos dos o más grupos sustituyentes impiden estéricamente la
hidrólisis de dicho enlace. Uno o más de los grupos sustituyentes
que impiden estéricamente la hidrólisis de dicho enlace puede ser un
grupo receptor de electrones. El anillo de seis miembros sustituido
puede tener uno o más grupos sustituyentes adicionales además de los
grupos sustituyentes que impiden estéricamente la hidrólisis de los
enlaces. Tales grupos sustituyentes pueden también ser grupos
receptores de electrones.
El átomo de carbono en el anillo heterocíclico o
sistema cíclico heterocíclico al que está unido el enlace, puede
también tener un sustituyente secundario de la fórmula R_{n}X-,
en la que X se selecciona entre el grupo que consta de O, N, S y C,
en la que R es cualquier grupo, y en la que n es un número tal que X
tiene una valencia propia. Se describen otros restos
quimioluminiscentes que se caracterizan por un anillo heterocíclico
o sistema cíclico heterocíclico y un sustituyente secundario de la
fórmula R_{n}X-, con el enlace éster, tioéster o amida estando
entre el anillo heterocíclico o sistema cíclico heterocíclico y un
grupo residual. Los restos quimioluminiscentes descritos pueden
también incluir sustituyentes en posiciones pero dentro del anillo
heterocíclico o sistema cíclico heterocíclico.
Los compuestos quimioluminiscentes proporcionados
por la presente invención se describen en las reivindicaciones 1 a
38. Pueden unirse a compuestos de unión específicos para
proporcionar conjugados como se manifiesta en las reivindicaciones
39 y 40.
También según la presente invención existen
composiciones y estuches de ensayo que comprenden los
compuestos/conjugados referidos anteriormente, como se manifiesta en
las reivindicaciones 41 y 42. También se incluyen ensayos de unión
específicos. Estos se manifiestan en las reivindicaciones 43 a
69.
Los restos quimioluminiscentes de la presente
invención tienen una de las dos fórmulas esquemáticas
siguientes:
Dentro de las fórmulas esquemáticas, la caja
separada marcada con "L" contiene el "enlace" éster,
tioéster o amida que está entre dos anillos sustituidos o sistemas
cíclicos sustituidos representados por el círculo marcado con
"Q" y la caja sólida marcada "R3". Si el enlace L es un
éster, tioéster o amida es determinado por R4 siendo -O-, -S- o
-N(SO_{2}CF_{3})- respectivamente. Preferiblemente, el
enlace es un enlace éster.
Q es un anillo heterocíclico o sistema cíclico
heterocíclico al que está unido el enlace éster, tioéster o amida en
un átomo de carbono dentro del anillo heterocíclico o sistema
cíclico heterocíclico el cual (1) es o hibridado sp^{2} o
sp^{3}, y (2) es susceptible de ser atacado por peróxido u oxígeno
molecular para formar un intermediario que disminuye la producción
de quimioluminiscencia. Si el átomo de carbono se ha vuelto
susceptible de tal ataque se determina por el estado de oxidación
del heteroátomo dentro del anillo heterocíclico o sistema cíclico
heterocíclico. Si el carbono al que está unido el enlace es
hibridado sp^{2}, el heteroátomo debe estar en un estado de
oxidación positivo (es decir, tiene una carga positiva; por ejemplo,
como obtenido por N-alquilación o
N-oxidación). Si el carbono al que está unido el
enlace es hibridado sp^{3}, el heteroátomo debe estar en un estado
de oxidación neutral (es decir descargado). Cuando el heteroátomo es
nitrógeno, los estados de oxidación apropiados pueden ser
conseguidos sólo si el nitrógeno es sustituido con un grupo alquilo
(incluyendo un grupo funcionalizado), un grupo arilo (incluyendo un
grupo funcionalizado), -O^{-} (si el nitrógeno está en un estado
de oxidación positivo) o -OH (si el nitrógeno está en un estado de
oxidación neutral). Cuando el heteroátomo está en estos estados
"apropiados" de oxidación, el átomo de carbono será susceptible
de ser atacado por peróxido u oxígeno molecular para producir el
intermediario quimioluminiscente.
Los anillos heterocíclicos o sistemas cíclicos
heterocíclicos en los que el heteroátomo está en un estado de
oxidación positivo incluyen, pero no se limitan a, acridinio,
benz[a]acridinio, benz[b]acridinio,
benz[c]acridinio, un catión
1,2,4-triazol, un catión isooxazol, un catión
isotiazol, un catión 1,2-azol, un catión imidazol,
un catión bencimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, un
quinolinio sustituido cíclico, piridinio, pirimidinio, piridazinio,
pirazinio, fenantridinio y quinoxalinio. Anillos o sistemas cíclicos
en los que el heteroátomo está en un estado de oxidación neutral
incluyen las formas reducidas de los anteriores. Estos anillos o
sistemas cíclicos derivan de los siguientes anillos o sistemas
cíclicos:
El anillo heterocíclico o sistema cíclico
heterocíclico puede estar libre de sustituciones opcionales no
mostradas en las fórmulas esquemáticas. De forma alternativa, el
anillo heterocíclico o sistema cíclico heterocíclico puede estar
sustituido opcionalmente en cualquier posición, incluyendo el
heteroátomo, con grupos no mostrados en la fórmula esquemática.
Tales anillos o sistemas cíclicos, tanto si están opcionalmente
sustituidos o libres de tales sustituciones opcionales, se
consideran aquí estar dentro del significado de "anillo
heterocíclico o sistema cíclico heterocíclico".
Sustituciones opcionales posibles pueden ser
funcionales o no funcionales. Sustituciones opcionales funcionales
incluyen aquellas para el propósito de producir
peri-interacciones alrededor del enlace L,
incrementando la solubilidad del resto, incrementando la eficacia
quimioluminiscente del resto y, preferiblemente, uniendo el resto a
proteína y otro material. Grupos útiles para unir el resto a
proteína y otro material incluyen, pero no se limitan a, cadenas
(lineales o ramificadas) alquilo, alquenilo, alquinilo, alquilamino,
oxoalquilo, tioalquilo o alquiloxocarbonilo opcionalmente
funcionalizadas o grupos arilo opcionalmente funcionalizados. Los
grupos arilo pueden estar unidos al anillo heterocíclico o sistema
cíclico heterocíclico por una cadena alquilo, alquenilo, alquinilo,
alquilamino, oxoalquilo, tioalquilo o alquiloxocarbonilo. Se conocen
en la técnica otras cadenas, además de las listadas. Funcionalidades
opcionales incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de las
siguientes:
-CO_{2}R, en la que R= un hidrógeno, alquilo o
arilo
---
\delm{C}{\delm{\para}{OR}}=\uelm{N}{ \oplus }H_{2}
en la que R= un residuo de un alcohol
funcional
- SO_{2}Cl
- NCS
-N(CH_{3})(CH_{2})_{m}Cl, en
la que m es mayor o igual a 1
-N_{3} y otras funcionalidades
fotomarcadoras
-NH_{2}
o iones, azúcares, poliaminas y
polioxi-compuestos (por ej., polioxietileno,
polioxibutileno, etc.). Otras cadenas, grupos y funcionalidades
útiles para unir compuestos de la presente invención a proteínas se
muestran en Ji, "Bifunctional Reagents", Meth. Enzymology
91:580 (1983), el cual se incorpora aquí como referencia. Se conocen
en la técnica métodos de unión de tales grupos a proteínas y otros
materiales utilizando tanto enlaces covalentes como fuerzas químicas
débiles.
Los peri sustituyentes, que pueden provocar
peri-interacciones, incluyen cualquier grupo que
pueda provocar impedimento estérico con respecto al carbono al que
está unido el enlace éster, tioéster o amida y/o con respecto al
carbono dentro del enlace éster, tioéster o amida. Los peri
sustituyentes preferidos incluyen grupos alquilo cortos (por ej.
metilo, etilo) y grupos arilo (por ej. fenilo). Los peri
sustituyentes, si están presentes, se localizan en los átomos de
carbono dentro del anillo heterocíclico o sistema cíclico que son
"adyacentes al" carbono al que está unido el enlace éster,
tioéster o amida. Los restos pueden incluir más de un peri
sustituyente. Por ejemplo, los peri sustituyentes pueden colocarse
en las siguientes posiciones:
(a) en acridinio y acridos: en C1 y C8;
(b) en fenantridinios y fenentridinios reducidos:
en C7; y
(c) en quinolinios y quinolinios reducidos: en
C3.
- El anillo arilo o sistema cíclico arilo, representado por R3, incluye al menos un anillo sustituido de seis miembros. El enlace éster amida o tioéster está unido directamente a tal anillo de seis miembros. R3 puede incluir, pero no se limita a, fenilo, naftaleno y antraceno, que tienen las siguientes estructuras:
R3 puede ser sustituido en cualquier posición
incluyendo, pero no limitándose a, las sustituciones para R1, R2 y
R2' descritas más adelante. Una sustitución que incluye R1, R2 y
R2', puede también ser utilizada para enlazar el resto a proteína u
otro material. Se muestran más adelante grupos apropiados para tal
propósito.
R2 y R2' son grupos voluminosos que se localizan
en R3 de forma que estéricamente esconden la hidrólisis de la unión
L entre R3 y el anillo heterocíclico o sistema cíclico Q.
Preferiblemente, cuando R3 es un anillo fenilo con el enlace éster
unido en la posición 1, R2 y R2' se localizan en las posiciones 2 y
6 (orto). R2 y R2' pueden ser idénticos o distintos entre si y
pueden incluir:
Un alquilo o un grupo alquilo opcionalmente
funcionalizado
Un arilo o un grupo arilo opcionalmente
funcionalizado
-OR, en el que R = alquilo o arilo
-NR_{2}, en el que R = alquilo o arilo
-NR_{3}^{+}, en el que R = alquilo o
arilo
-COO^{-}
-COOH
-COOR, en el que R = alquilo o arilo
-COR, en el que R = alquilo o arilo
-(CF_{2})_{n}CF_{3}, en el que n = 0
a 10
-CN
-NH_{3}^{+}
-NO_{2}
-N(CH_{3})_{3}^{+}
-SR, en el que R = alquilo o arilo
-SR_{2}^{+}, en el que R = alquilo o
arilo
-SO_{2}R, en el que R = alquilo o arilo
un halógeno.
El impedimento estérico requerido puede también
ser suministrado por otros anillos dentro de un
multi-anillo R_{3} que son "adyacentes" al
anillo de seis miembros al que está unido el enlace éster. Por
ejemplo, si R_{3}= naftaleno y un enlace éster está unido en la
posición 1, R_{2} podría ser un grupo metilo en la posición 2 y
R_{2}' es el anillo "adyacente" que contiene carbonos
7-10. En tales casos, el anillo adyacente se
considera aquí como una sustitución (sobre el anillo de seis
miembros dentro de R_{3}) que impide estéricamente la hidrólisis
del enlace.
R_{1} puede ser cualquier grupo receptor de
electrones sobre R_{3}, pero es preferiblemente seleccionado entre
-NO_{2}, -SO_{2}Cl, -Br, -N(CH_{3})_{3}^{+}
y -H. Según se utiliza en esta especificación, y las
reivindicaciones anexas, un "grupo receptor de electrones"
significará cualquier grupo que tiene un valor sigma_{p} mayor o
igual a 0,0. Se pueden encontrar tablas de sigma_{p} para varios
grupos en Hansch et al J. Med. Chem.
16(11):1209-1213 (1977) y en Hansch and Leo,
"Substituent Constants for Correlation Analysis in Chemistry and
Biology", Ch. 6, pp. 49-52 (John Wiley &
Sons, New York 1979), que son ambos incorporados aquí como
referencia.
En algunos restos, R_{1} y uno o ambos de
R_{2} y R_{2}' son grupos receptores de electrones (que pueden
ser idénticos o diferentes uno de otro). Si más de un grupo entre
R_{1}, R_{2} y R_{2}' son grupos receptores de electrones, se
prefiere que el valor aditivo de sigma_{p} sólo para los grupos
que son grupos receptores de electrones (es decir excluyendo
aquellos grupos con sigma_{p} < 0,0 ) sea menor o igual a
alrededor de 1,0. Algunos restos que tienen un valor aditivo de
sigma_{p} mayor que 1,0 son inestables.
Los restos de la presente invención pueden
también estar unidos a proteína y otro material mediante
sustituciones en R_{3}. Se pueden utilizar algunos grupos
receptores de electrones como un medio de unión. De los grupos
receptores de electrones preferidos, puede utilizarse -SO_{2}Cl
para unir un resto a proteína u otro material. De forma alternativa,
cualquiera de los grupos listados anteriormente para unión del
anillo heterocíclico o sistema cíclico heterocíclico Q puede también
ser utilizado si aquellos pueden ser unidos como sustituciones a
R_{3}. Se conocen en la técnica procedimientos de juntar tales
grupos de unión a proteína y otro material que utilizan tanto enlace
covalente como fuerzas químicas débiles.
En la fórmula esquemática II anterior, Z es un
grupo sustituyente secundario unido al átomo de carbono al que el
enlace éster, tioéster o amida está unido cuando dicho átomo de
carbono es hibridado sp^{3}. Z puede incluir, pero no se limita
a:
- H
un halógeno
- CN
- OR
- NR_{2}
- NR_{3}^{+}
- SR
- SR_{2}^{+}
- S_{2}R
- NRCO_{2}R
- NHNR_{2}
- NRNR_{2}
- NHOR
- ONR_{2}
- CR(CN)_{2}
- CR(COR)_{2}
- CR_{2}NO_{2}
- C\equivCOR
Generalmente, además de un hidrógeno y un
halógeno, Z puede ser cualquier grupo nucleofílico de la fórmula
general R_{n}X, en la que X es O, N, S, o C (con cambios
apropiados en n para acomodar cambios de valencia en X) y en la que
R = cualquier sustituyente (preferiblemente alquilo, arilo, un
aminoácido o un azúcar opcionalmente sustituido) y en la que grupos
R múltiples pueden formar opcionalmente estructuras cíclicas, por
ej. en los grupos Z:
R_{n} y R_{n}X también pueden ser (o pueden
derivar de) un medicamento o molécula esteroide.
En compuestos en los que Z es R_{n}X, Z sirve
como resto "bloqueante" que evita o deteriora la hidrólisis del
enlace éster, tioéster o amida, disminuyendo así la probabilidad de
que tales compuestos sean inestables. El efecto bloqueante está
causado por (1) el volumen estérico del grupo R_{n}X que bloquea
físicamente el ataque por especies químicas que inducirían o
incrementarían la hidrólisis del enlace éster, tioéster o amida (por
ej. especies que formarían una pseudo base en el carbono 9 de un
compuesto acridinio), y (2) efectos electrónicos producidos por el
cambio del átomo de carbono desde hibridación sp^{2} a sp^{3}
(que provoca que los enlaces éster, tioéster o amida se comporten
más como un éster, tioéster o amida alifáticos). Cuando los
compuestos que incluyen un grupo R_{n}X son provocados para
producir quimioluminiscencia deben ser tratados primero con ácido
que rompe el grupo R_{n}X, permitiendo de esta manera la inducción
de la reacción quimioluminiscente por la adición de peróxido, base u
otro agente desencadenante (el tratamiento ácido no se requiere para
compuestos en los que Z es -H o un halógeno). El carácter y
estructura del grupo R_{n}X está limitado sólo por dos factores:
(1) el tamaño del grupo R_{n}X debe ser tal que el grupo pueda ser
añadido a los compuestos de la presente invención durante la
síntesis según se describe más adelante o por otros procedimientos
sintéticos (es decir las especies R_{n}XH, de las cuales deriva el
grupo R_{n}X durante la síntesis, no pueden ser tan grandes que
los efectos estéricos hagan imposible sintetizar un compuesto de la
presente invención que tenga tal grupo R_{n}X) y (2) el grupo
R_{n}X debe tener un carácter químico y estérico tal que pueda ser
separado de la molécula con ácido antes de activar la reacción de
quimioluminiscencia.
Los restos quimioluminiscentes mejorados
descritos anteriormente son útiles en un amplio rango de ensayos de
unión específicos para la presencia de analito en una muestra.
"Presencia" significará en este documento la detección
cualitativa y/o cuantitativa de un analito. Tales ensayos pueden ser
dirigidos a cualquier analito que pueda ser detectado utilizando el
resto quimioluminiscente mejorado en conjunción con reacciones de
unión específicas. Estos ensayos incluyen, pero no se limitan a,
inmunoensayos, ensayos de unión de proteína y ensayos de hibridación
de ácido nucleico.
En un inmunoensayo típico, el analito es
inmunorreactivo y puede determinarse su presencia en una muestra en
virtud de su inmunorreacción con un reactivo de ensayo. En un ensayo
típico de unión de proteína, la presencia de analito en una muestra
se determina por la reactividad de unión específica del analito con
un reactivo de ensayo en el que la reactividad es distinta de la
inmunorreactividad. Ejemplos de esto incluyen reconocimiento de
substrato de enzima y la afinidad de unión de avidina para biotina.
En el ensayo típico de hibridación de ácido nucleico, la presencia
de analito en una muestra se determina por una reacción de
hibridación del analito con un reactivo de ensayo. El ácido nucleico
analito (presente usualmente como ADN de doble cadena o ARN) se
convierte primero normalmente a una forma de cadena simple y se
inmoviliza sobre un portador (por ej. papel de nitrocelulosa). El
ácido nucleico del analito puede ser tratado alternativamente por
electroforesis en una matriz de gel. El analito inmovilizado puede
después ser hibridado (es decir, unido específicamente) por una
secuencia complementaria de ácido nucleico.
Los ensayos de unión específicos mencionados
anteriormente pueden ser llevados a cabo en una gran variedad de
formatos de ensayo. Estos formados de ensayo estarán dentro de dos
grandes categorías. En la primera categoría, el ensayo utiliza un
conjugado quimioluminiscente que comprende el resto
quimioluminiscente mejorado unido a un material de unión específico.
"Material de unión específico" significa en este documento
cualquier material que unirá específicamente por una
inmunorreacción, reacción de unión de proteína, reacción de
hibridación de ácido nucleico, y cualquier otra reacción en la que
el material reacciona específicamente con una clase restringida de
especie biológica, bioquímica o química. En esta categoría de
ensayos, el conjugado quimioluminiscente participa en una reacción
de unión específica y la presencia de analito en la muestra es
proporcional a la formación de uno o más productos de reacción
específica de unión que contienen el conjugado quimioluminiscente.
El ensayo se lleva a cabo permitiendo que las reacciones específicas
de unión requeridas ocurran bajo las condiciones de reacción
adecuadas. La formación de productos de reacción específica de unión
que contienen el conjugado quimioluminiscente se determina midiendo
la quimioluminiscencia de tales productos que contienen el conjugado
quimioluminiscente o midiendo la quimioluminiscencia del conjugado
quimioluminiscente sin reaccionar o que ha reaccionado parcialmente
no contenido en tales productos.
La primera categoría de formatos de ensayo se
ilustra por ensayos de sándwich, ensayos competitivos, ensayos de
antígeno de superficie, ensayos de saturación secuencial, ensayos de
desplazamiento competitivo y ensayos de amortiguación.
En un formato sándwich, el material de unión
específica, al que se une el resto quimioluminiscente es capaz de
unirse específicamente con el analito. El ensayo utiliza
adicionalmente un reactivo que es capaz de unirse específicamente
con el analito para formar un complejo
reactivo-analito-conjugado
quimioluminiscente. El reactivo puede unirse a una fase sólida,
incluyendo, pero no limitándose a, varillas de aforar, cápsulas,
tubos, papel o láminas de polímero. En tales casos, la presencia de
analito en una muestra será proporcional a la quimioluminiscencia de
la fase sólida después de que se hayan completado las reacciones
específicas de unión. Tales formatos de ensayo se discuten más
ampliamente en los documentos patentes EE.UU. nros. 4.652.533,
4.383.031, 4.380.580 y 4.226.993.
En un formato competitivo, el ensayo utiliza un
reactivo que es capaz de unirse específicamente con el analito para
formar un complejo analito-reactivo y con el
material de unión específico, al que se une el resto
quimioluminiscente, para formar un complejo
reactivo-conjugado quimioluminiscente. El reactivo
puede unirse a una fase sólida o, de forma alternativa se pueden
precipitar los productos de reacción que contienen el reactivo
utilizando un segundo anticuerpo o por otros métodos conocidos. En
este formato competitivo, la presencia de analito es
"proporcional", es decir, inversamente proporcional a la
quimioluminiscencia de la fase sólida o precipitado. Se puede
encontrar una discusión más amplia de este formato de ensayo en los
documentos patentes de EE.UU. mencionados anteriormente.
En otro formato de ensayo, el analito puede estar
sobre o estar unido a unas especies biológicas, bioquímicas o
químicas mayores. Este tipo de formato se ilustra por un ensayo de
antígeno de superficie. En este formato el material de unión
específico es capaz de unirse específicamente con el analito y la
presencia de analito es proporcional al complejo
analito-conjugado quimioluminiscente formado como un
producto de reacción. Esto se ilustra uniendo el resto
quimioluminiscente a un anticuerpo que es específico a un antígeno
de superficie sobre una célula. La presencia del antígeno de
superficie celular será indicada por la quimioluminiscencia de las
células después de completar la reacción. Las mismas células pueden
ser utilizadas en conjunción con un sistema de filtrado para separar
el complejo analito-conjugado quimioluminiscente que
se forma sobre la superficie de la célula a partir del conjugado
quimioluminiscente sin reaccionar. Esto se discute más ampliamente
en el documento patente de EE.UU. 4.652.533.
El resto quimioluminiscente mejorado puede
utilizarse en formatos de ensayo adicionales conocidos en la
técnica, incluyendo, pero no limitándose a, saturación secuencial y
desplazamiento competitivo, ambos de los cuales utilizan un
conjugado quimioluminiscente en el que tanto (1) el material de
unión específico al que se fija el resto, como (2) el analito, se
unen específicamente al reactivo. En el caso de saturación
secuencial, el analito reacciona con el reactivo primero, seguido
por una reacción del conjugado quimioluminiscente con el reactivo
restante sin reaccionar. En el caso de desplazamiento competitivo,
el conjugado quimioluminiscente desplaza competitivamente el analito
que se ha unido ya al reactivo.
En un formato de amortiguación, el ensayo utiliza
un reactivo que es capaz de unirse específicamente al analito para
formar un complejo analito-reactivo y con el
material de unión específico, al que está unido el resto
quimioluminiscente, para formar un complejo
reactivo-conjugado quimioluminiscente El resto de
amortiguación se une al reactivo. Cuando se lleva a la proximidad
del resto quimioluminiscente, el resto de amortiguación reduce o
amortigua la quimioluminiscencia del resto quimioluminiscente. En
este formato de amortiguación, la presencia de analito es
proporcional a la quimioluminiscencia del resto quimioluminiscente.
Se puede encontrar una discusión más amplia de este formato en los
documentos patentes de EE.UU. 4.220.450 y 4.277.437.
Respecto a los formatos de ensayo discutidos
anteriormente y en los formatos discutidos más adelante, el orden en
el que se añaden los reactivos de ensayo puede variar ampliamente
como se conoce en la técnica. Por ejemplo en un ensayo de sándwich,
el reactivo unido a una fase sólida puede reaccionar con un analito
contenido en una muestra y después de esta reacción puede separarse
la fase sólida que contiene el complejo de analito de la muestra
resultante. Después de esta etapa de separación, el conjugado
quimioluminiscente puede reaccionar con el complejo sobre la fase
sólida. De forma alternativa, la fase sólida, muestra y conjugado
quimioluminiscente pueden añadirse juntos al tiempo y reaccionar
antes de la separación. Como una alternativa adicional, pero menos
preferida, el analito en la muestra y el conjugado
quimioluminiscente pueden reaccionar antes de la adición del
reactivo sobre la fase sólida. Son posibles variaciones similares en
las etapas de mezcla y reacción para formatos de ensayo competitivo
así como otros formatos conocidos en la técnica. "Permitiendo bajo
condiciones adecuadas formación sustancial" de productos de
reacción de unión específicos incluirá en este documento las
múltiples variaciones del orden de adición y reacción de reactivos
de ensayo.
En la segunda categoría de formatos de ensayo, el
ensayo utiliza un resto quimioluminiscente mejorado no conjugado. La
presencia de analito en la muestra es proporcional a la formación de
uno o más productos de reacción de unión específicos que no
contienen ellos mismos el resto quimioluminiscente. En vez de esto,
el resto quimioluminiscente produce quimioluminiscencia en
proporción a la formación de tales productos de reacción.
En un ejemplo de esta segunda categoría de
ensayos, el ensayo utiliza un reactivo capaz de unirse con el
analito para formar un complejo analito-reactivo que
provoca la quimioluminiscencia del resto quimioluminiscente. Eso se
ilustra por un simple ensayo de substrato-enzima en
el que el analito es la glucosa del substrato y el reactivo es la
enzima glucosa oxidasa. La formación de complejo
enzima-substrato activa el resto quimioluminiscente.
Tal ensayo de enzima-substrato para glucosa se
describe en lo documentos patentes de EE.UU. Nros. 3.964.870 y
4.427.770. Este ensayo enzima-substrato es un ensayo
de unión específica en el sentido de que el substrato se une
específicamente al lugar activo de la enzima casi de la misma forma
que un antígeno se une a un anticuerpo. En este ensayo, la enzima se
une específicamente con el substrato que resulta en la producción de
peróxido que, a su vez, provoca la luminiscencia del resto
quimioluminiscente.
También incluidos en la segunda categoría de
ensayos, se encuentran aquellos ensayos en los que la formación de
productos de reacción provoca o inhibe la quimioluminiscencia del
resto quimioluminiscente de una forma menos directa. En este ensayo,
un primer reactivo, que es reactivo cruzado con el analito, se une a
una enzima tal como glucosa oxidasa cerca de su posición activa. Un
segundo reactivo que es específico para ambos, tanto el analito como
el material inmunorreactivo se añade a la muestra y la enzima
alterada en la presencia del substrato, (es decir glucosa). Cuando
el segundo reactivo se une al primer reactivo localizado cerca del
sitio activo en la enzima, el segundo reactivo bloquea el sitio
activo en una forma que el substrato no puede unirse a la enzima en
el sitio activo o la unión del substrato en el sitio activo
disminuye de forma significativa. De esta manera el segundo
reactivo bloqueante de la enzima inhibe la producción de peróxido de
la enzima que, a su vez, habría activado el resto
quimioluminiscente. Sin embargo, el analito en la muestra,
inmovilizará al segundo reactivo, evitando así que el segundo
reactivo inhiba la producción de peróxido. La presencia de analito
será proporcional a la quimioluminiscencia del resto.
Los ensayos contenidos en las dos categorías
anteriores de formatos de ensayo pueden ser heterogéneos u
homogéneos. En ensayos heterogéneos, los productos de reacción, cuya
formación es proporcional a la presencia de analito en la muestra,
se separan de otros productos de la reacción. La separación puede
conseguirse por cualquier medio, incluyendo, pero no limitándose a,
separación de una fase líquida de una fase sólida por filtración,
microfiltración, precipitación de anticuerpo doble, centrifugado,
cromatografía de exclusión por tamaño, extracción de una fase sólida
(por ej. una varilla de aforar) de una solución muestra o
electroforesis. Por ejemplo, en un ensayo de sándwich, el complejo
reactivo-analito-conjugado
quimioluminiscente se separa del conjugado quimioluminiscente sin
reaccionar. En un ensayo de antígeno de superficie, el complejo
reactivo-analito-conjugado
quimioluminiscente se separa del conjugado quimioluminiscente sin
reaccionar. En un ensayo competitivo, el complejo
reactivo-analito-conjugado
quimioluminiscente se separa del conjugado quimioluminiscente sin
reaccionar. En un ensayo de saturación secuencial y en un ensayo de
desplazamiento competitivo, el complejo
reactivo-analito-conjugado
quimioluminiscente se separa del conjugado quimioluminiscente sin
reaccionar. De forma alternativa, en ensayos homogéneos los
productos de reacción no se separan. Después de dejar reaccionar a
los reactivos de ensayo, se puede medir la quimioluminiscencia de la
mezcla completa de ensayo si tal mezcla se encuentra en solución, en
una fase sólida o distribuida entre varias capas de membrana de una
varilla de aforar u otro soporte sólido. El ensayo de glucosa
utilizando glucosa oxidasa y un resto quimioluminiscente ilustra un
ensayo homogéneo simple en el que es innecesaria la separación. El
ensayo de amortiguación ilustra un ensayo homogéneo más complejo en
el que es innecesaria la separación. Se contempla que cualquier
categoría de formatos de ensayo pueda dar lugar a formatos
homogéneos o heterogéneos.
Finalmente, "la medida de la
quimioluminiscencia" incluirá, cuando sea relevante, la acción de
separar aquellos productos de reacción de unión específica, cuya
formación es proporcional a la presencia de analito en la muestra,
de otros productos de reacción. Esto también incluirá, cuando sea
relevante, las acciones de (i) tratar el resto quimioluminiscente
con ácido para romper un grupo Z (es decir, R_{n}X) del resto, y/o
(ii) activar la luminiscencia del resto quimioluminiscente en el
caso de aquellos formatos de ensayo en los que la formación de los
productos de reacción no activa por sí misma al resto
quimioluminiscente.
Los siguientes ejemplos muestran la síntesis de
varios restos quimioluminiscentes de la presente invención
Un resto quimioluminiscente preferido de la
presente invención es fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)-propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
(u otro contra ion tal como cloruro, trifluoroacetato, sulfato,
etc.) que tiene la siguiente fórmula:
El fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)-propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
se sintetiza según el siguiente esquema:
\newpage
(Continuación)
La condensación de isatina (1) con resorcinol (2)
proporciona el ácido
3-hidroxi-acridino-9-carboxílico
(3). La reacción con butirato de
bencil-4-bromo da el éster (4) con
el grupo 3-hidroxi eterificado. La hidrólisis
utilizando base elimina ambos grupos bencilo como resultantes del
ácido dicarboxílico (5). La rebencilación selectiva de la función
carboxílica del grupo propiloxi da ácido
9-carboxílico (6). La esterificación con
2,6-dimetil-4-nitrofenol
y la metilación de la acridina nitrógeno da (8). La desprotección
del grupo carboxílico con HBr y la condensación con
N-hidroxisuccinimida utilizando DCC proporciona
fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-)3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-meti-acridinio-9-carboxilato.
Estas reacciones se describen con mayor detalle a continuación.
Se puso cloruro de
4-bromobutirilo (13,8 g, 75 mmoles) en un matraz de
fondo redondo de 100 ml. Se enfrió el matraz a -20ºC utilizando un
baño de hielo seco/tetracloruro de carbono. Se añadió cuidadosamente
acetato de etilo (50 ml) que contenía
N-metilmorfolina (7,58 g, 75 mmoles, 8,2 ml). Se
añadió gota a gota alcohol bencilo (6,97 g, 6,67 ml, 6,64 mmoles)
mediante un embudo de adición. Después de la adición el baño se
retiró y la mezcla se agitó durante 2 horas. El producto se
transfirió a un embudo separatorio utilizando acetato de etilo (50
ml), se lavó una vez con bicarbonato de sodio (10%), después dos
veces con agua y se secó con sulfato de sodio anhidro. La
evaporación de los disolventes dio
bencil-4-bromo-butirato
como un aceite (rendimiento = 91%).
Se añadió lentamente isatina (1) (1,88 g) a una
solución de hidróxido de potasio (5,07 g, 0,09 moles) disuelta en
agua (3,5 ml). El matraz de reacción se calentó a alrededor de 50ºC
en un baño de aceite. Se añadieron lentamente alrededor de 10 ml de
agua adicional gota a gota. Se añadió resorcinal (2) (10 g, 0,089
moles) y la temperatura se elevó a 100ºC según se continuó la
agitación, dando como resultado la formación de una mezcla líquida.
Se añadió más isatina (1) (1,88 g). El matraz de reacción (de fondo
redondo de tres bocas) se unió a una entrada de nitrógeno y los
vapores de agua se soplaron hacia fuera mediante una corriente de
nitrógeno. La mezcla se agitó durante 4 horas a 125ºC. Se añadió
agua (70 ml) y los contenidos se disolvieron por agitación
continuada. Después de transferir la mezcla a un matraz Erlenmeyer
el volumen se llevó hasta 200 ml con agua. Se ajustó el pH a 2.0 con
ácido hidroclórico concentrado. El filtrado y el lavado de los
sólidos con agua dio el ácido acridina crudo. Después se disolvió en
NaOH 2N (100 ml) y la solución se filtró a través de celita. El
lecho de celita se lavó con 200 ml de NaOH 1N.
El filtrado se acidificó con HCl concentrado a pH
2,0. El ácido
2-hidroxi-acridino-9-carboxílico
(3) precipitado se filtró, se lavó con agua y se secó en vacío sobre
P_{2}O_{5} (rendimiento = 42%).
Se disolvieron en DMSO (125 ml) en un matraz de
fondo redondo de 250 ml ácido
3-hidroxi-9-acridino
carboxílico (3) (4 g, 0,017 moles),
bencil-4-bromobutirato (14,6 g,
0,057 moles) y carbonato de cesio (22,16 g, 0,068 moles). El matraz
se calentó a alrededor de 50ºC en un baño de aceite. Después de
agitar la mezcla a esa temperatura durante 1 hora, la mezcla se
vertió en agua (1 litro). El producto precipitado se extractó con
cloroformo después de hacer básica a la suspensión acuosa con
bicarbonato de sodio. El secado y la evaporación del cloroformo dio
3-(3-benciloxicarbonil)-propiloxi-9-(3-benciloxi-carbonil-propil)
acridino carboxilato (4) que se cromatografió sobre columna de gel
de sílice utilizando cloroformo como solvente. Se recogieron las
fracciones con valor R_{f} de 0,36 sobre TLC con CHCl_{3}/EtOAc,
9/1. Se evaporaron los solventes (rendimiento = 55%).
Se añadió
3-(3-benciloxicarbonil)-propiloxi-9-(3-benciloxicarbonil-propil)
acridino carboxilato (4) (4,93 g, 8,3 mmoles) a una mezcla de NaOH
2N (300 ml) y metanol (300 ml). La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 48 horas. Se eliminó el metanol sobre un evaporador
rotatorio y se acidificó la solución con ácido hidroclórico
concentrado a pH 6.0. Los sólidos precipitados se filtraron, se
lavaron con agua y se disolvieron con acetato de etilo. La solución
se secó y después se evaporaron los solventes para dar ácido
3-(3-carboxi)
propiloxi-acridino-9-carboxílico
(5) (rendimiento = 92,8%).
Se disolvió el ácido
3-(3-carboxi)
propiloxi-acridino-9-carboxílico
(5) (1,5 g, 4,6 mmoles) en DMAP (80 ml,
1,3-dimetil-3,4,5,6-tetrahidro-2(1H)
pirimidona) con calentamiento. Se añadieron a la reacción que se
había enfriado previamente en un baño de hielo seco/CCl_{4},
alcohol bencilo (0,5 ml, 0,52 g, 4,8 mmoles),
1,3-diciclohexilcarbodiimida (1,04 g, 5,0 mmoles) y
N,N-dimetil aminopiridina (0,2 g, 1,6 mmoles). Se
agitó la mezcla durante 15 horas con una entrada de nitrógeno a
temperatura ambiente. La mezcla se añadió a cloruro de sodio
saturado (320 ml). Se filtró el ácido
3-(3-benciloxicarboxil)
propiloxi-acridino-9-carboxílico
(6) y se lavó con una pequeña cantidad de agua. El producto se
cromatografió sobre una columna de gel de sílice utilizando
CHCl_{3}/MeOH 95/5 como solvente (rendimiento = 26%).
Se disolvieron en piridina (20 ml) ácido
3-(3-carboxi)
propiloxi-acridino-9-carboxílico
(6) (0,5 g, 1,2 mmoles) y cloruro de p-tolueno
sulfonilo (0,46 g, 2,4 mmoles). La solución se enfrió en un baño de
hielo seco/CCl_{4} durante 15 minutos. Se añadió
2,6-dimetil-4-nitrofenol
(0,2 g, 1,2 mmoles) y se retiró el baño de enfriamiento y la mezcla
se agitó durante 15 horas a temperatura ambiente. Se añadió a agua
(450 ml) y se ajustó el pH a 2,0 con ácido hidroclórico concentrado.
El producto se filtró, se lavó con agua y se secó en vacío. El
producto crudo se cromatografió sobre una columna de gel de sílice
utilizando cloroformo como solvente. Se recogieron las fracciones
con un valor R_{f} de 0,8 sobre TLC con CHCl_{3}/EtOAc 1:1. La
evaporación de los solventes dio
(2,6-dimetil-4-nitro)
fenil-3-(3-benciloxicarbonil)-propiloxi-acridino-9-carboxilato
(7) (rendimiento = 47%).
El acridino (7) (0,32 g, 0,56 mmoles) se disolvió
en cloruro de metileno anhidro (4 ml) y se añadió fluorosulfonato
de metilo (0,27 ml, 3,36 mmoles, equivalente 6 molar). Se agitó la
mezcla durante 15 horas a temperatura ambiente. Se añadió éter
anhidro (20 ml). Se filtró el fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)
fenil-3-(3-benciloxicarbonil)-propiloxi-acridinio-9-carboxilato,
se lavó con éter (50 ml). El rendimiento fue cuantitativo.
El éster de acridinio
bencil-protegido (8) (250 ng) se trató con HBr/ácido
acético al 30% (3 ml) durante 2 horas a 55ºC. Se añadió éter anhidro
(20 ml) para precipitar el producto. El filtrado y el lavado de los
sólidos con éter dio fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-carboxil)-propiloxi-acridinio-9-carboxilato
(9). La cristalización a partir de acetonitrilo produjo el compuesto
puro (rendimiento = 80%).
El acridinio desprotegido (9) (67 mg, 0,13
mmoles) en un matraz de fondo redondo de dos bocas de 50 ml se
disolvió en acetonitrilo anhidro (10 ml). Se añadió
diciclohexilcarbodiimida (DCC, 33 mg, 0,16 mmoles) y se agitó la
mezcla durante 45 minutos a temperatura ambiente. Se añadió
N-hidrosuccinimida (17 mg, 0,15 mmoles) y la
reacción continuó durante 2,5 horas. Se añadió más DCC (14 mg) y
N-hidroxisuccinimida (8 mg) y otra vez las mismas
cantidades después de 1,5 horas. Después de 1,5 horas después de la
última adición, se añadió ácido acético glacial (1,7 l) para
amortiguar el exceso de DCC. Se eliminó el disolvente in
vacuo.
El producto crudo se purificó sobre una columna
HPLC semi-preparativa
C_{18}-Dynamax (disponible comercialmente de
Rainin Instrument Co., Inc, Woburn, Massachusetts) utilizando
CH_{3}CN/H_{2}O (ácido trifluoroacético al 0,1%) 60/40 como la
fase móvil a una velocidad de flujo de 1,8 ml/min, utilizando 360 nm
para detección. Se recogió la fracción en el momento de retención
9,4 minutos y se eliminaron los solventes in vacuo. Se secó
bajo vacío el fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)-fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)-propiloxi-acridinio-9-carboxilato
(10) en un desecador que contenía pentóxido de fósforo (rendimiento
= 33%). MS: FAB, matriz de tioglicerol, 586 (M^{+}). HPLC Rainin
C_{18} Dynamax (10 mm x 25 mm), CH_{3}CN/H_{2}O (ácido
trifluoroacético al 0,1%), 60:40 velocidad de flujo 1,8 ml/min
momento de retención 9,4 min, detectado a 360 nm.
Otro resto preferido de la presente invención es
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
el fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
se sintetiza de acuerdo con el siguiente
esquema:
La esterificación del ácido
acridino-9-carboxílico (11) con
2,6-dimetoxifenol (12) por medio del ácido
clorhídrico proporciona el éster (13). La metilación del acridino
nitrógeno con metilfluorosulfato y la subsiguiente clorosulfonación
con ácido clorosulfónico produce la marca (15). Estas reacciones se
describen con más detalle a continuación.
Se mezcló el ácido
acridino-9-carboxílico (11) (6,10 g,
0,027 moles) en un matraz de fondo redondo de 250 ml con cloruro de
tionilo (130 ml) y la mezcla se puso a reflujo durante 2 horas con
agitación. Se retiró el exceso de cloruro de tionilo en un
evaporador rotatorio. El residuo se trató con benceno (875 ml) y el
disolvente se eliminó in vacuo para eliminar trazas de
cloruro de tionilo. Se mezcló el residuo de cloruro de
acridino-9-carbonilo (11) con
piridina (130 ml) y se añadió 2,6-dimetoxifenol (12)
(4,16 g, 0,027 moles). La mezcla se calentó utilizando un baño de
agua (alrededor de 60ºC) para disolver todos los sólidos. Después de
15 horas de agitación a temperatura ambiente la mezcla se vertió en
1 litro de agua. La suspensión se acidificó con ácido hidroclórico
concentrado a pH 2.0. El producto sólido se filtró, se lavó con agua
y se disolvió en cloroformo. El secado (sulfato de sodio anhidro) y
la evaporación de cloroformo dieron
(2,6-dimetoxi)fenil-acridino-9-carboxilato
(13). Este se cromatografió sobre una columna de gel de sílice
utilizando CHCl_{3}/EtOAc, 98:2 como disolvente. Se recogieron las
fracciones con un valor 0,19 de Rf sobre TLC sobre el mismo
disolvente y la evaporación de los disolventes dio el éster puro
(13) (rendimiento = 30%).
Se disolvió
(2,6-dimetoxi)fenil-acridino-9-carboxilate
(13) (2,01 g, 5,6 mmoles) en diclorometano (110 ml, anhidro) en un
matraz de fondo redondo de 250 ml. Se añadió fluorosulfonato de
metilo (4,60 ml, 6,48 g, 56 mmoles) y la mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 15 horas. Se añadió éter anhidro (100
ml) y los sólidos amarillo brillante precipitados se filtraron
después de agitar la suspensión durante 0,5 horas. El sólido se lavó
bien con éter (alrededor de 100 ml) y después con pentano (50 ml).
Se recristalizó el acridinio a partir de acetonitrilo para
proporcionar fluorosulfonato de
2,6-dimetoxi-fenil-acridinium-9-carboxilato
(14) (rendimiento = 81%).
Se colocó en un matraz seco de fondo redondo de
25 ml de dos bocas, el fluoro-sulfonato de
(2,6-dimetoxi)fenil-10-metil
acridinio-9-carboxilato (14) (101,7
mg, 0,215 mmoles), una barra de agitación magnética y
CH_{2}Cl_{2} (5 ml) anhidro. La suspensión se agitó y se enfrió
a -201 en un baño de CCl_{4}/hielo seco. Se añadió el ácido
clorosulfónico (72 l, 0,125 g, 1,07 mmoles) y se agitó
continuadamente a -20ºC durante 30 minutos. Después se permitió que
la mezcla de reacción se calentara lentamente a temperatura ambiente
y se agitó durante unas 2 horas adicionales. Se añadió éter anhidro
(5 ml) al matraz de reacción produciendo la formación de un
precipitado amarillo claro. Se filtró y se lavó completamente con
éter. El secado en vacío dio el fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-acridinio-9-carboxilato
(15) (rendimiento = 93,4%). MS: FAB, matriz de
ditiotreitol/ditioeritrol, 472 (M+).
Otro resto preferido de la presente invención es
fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
El fluorosulfonato de
9-(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
se sintetizó por el mismo procedimiento de esterificación que el
fluororsulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato,
con la sustitución de
2,6-dimetil-4-bromo-fenol
para el fenol sustituido empleado en la síntesis de fluorosulfonato
de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
Otro resto preferido de la presente invención es
fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
El fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
se sintetizó por el mismo método que el fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
con la sustitución de 2,6-dimetilfenol por
2,6-dimetoxifenol en la etapa de esterificación.
Otro resto de la presente invención es el
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidiloxicarbonil)propiloxi-9,10-dihidro-N-metil-acridan-9-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
El
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidiloxicarbonil)propiloxi-9,10-dihidro-N-metil-acridan-9-carboxilato
se sintetizó a partir del ácido acridinio (9). La reducción del
ácido (9) con cianoborohidruro de sodio produce el acridano el cual
se convierte después al éster NHS por el método anhídrido mezclado.
Estas reacciones se describen con más detalle a continuación.
El ácido acridinio (9) (210 mg, 0,37 mmoles) se
disolvió en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y tampón fosfato 0,1M, pH
5,2 (60 ml). Se añadió gota a gota una solución de cianoborohidruro
de sodio (190 mg) en acetonitrilo (5 ml) a la solución de acridinio.
Esto produjo el blanqueamiento del color amarillo de la solución. Se
continuó agitando durante 15 minutos. Se añadió acetonitrilo (100
ml) y se retiraron los disolventes en un evaporador rotatorio. Se
extractó el residuo como una suspensión en agua con etilacetato. Se
lavaron las capas orgánicas con agua y se secaron. La eliminación de
los disolventes dio
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-carboxil)propiloxi-9,10-dihidro-acridan-9-carboxilato
(rendimiento 90%).
Se disolvió ácido acridano (125 mg, 0,255 mmoles)
y N-metilmorfolina (28 l) en acetonitrilo anhidro
(15 ml). La mezcla se enfrió en un baño de CCl_{4}/hielo seco bajo
nitrógeno. Se añadió isobutilcloroformato (35 l), la mezcla se agitó
durante 3 minutos y se añadió N-hidroxisuccinimida
(35 mg) disuelto en acetonitrilo (2 ml). Después de agitar a -20ºC
durante 15 minutos se retiró el baño de CCl_{4}/hielo seco y se
permitió que la reacción se calentara hasta temperatura ambiente.
Después de 2 horas se evaporaron los disolventes y se extractó el
residuo en acetato de etilo. Se retiró por filtración la sal
hidrocloruro de N-metilmorfolina insoluble. Se
concentró el filtrado y se añadió hexano (20 ml). El enfriamiento
produce la cristalización de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidiloxi-carbonil)propiloxi-9,10-dihidro-N-metil-acridan-9-carboxilato.
Los cristales finalmente se filtraron y se lavaron con hexano
(rendimiento = 70%). MS: FAB, matriz de ditiotreitol/ditioeritrol,
588 (M+ 1). HPLC: Waters C_{18} Novapak (3,9 mm x 15 mm)
disponible comercialmente de Millipore Corporation, Waters
Chromatography Division, Milford, Massachusetts),
CH_{3}CN/H_{2}O (ácido trifluoroacético al 0,1%) 60:40,
velocidad de flujo 1,0 ml/min, tiempo de retención 6,34 minutos,
detectado a 280 nm.
Otro resto representativo de la invención es
cloruro de
(2,6-dimetil-4-nitro-fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato-3-oxo-butirimidato,
el hidrocloruro del cual tiene la fórmula:
cloruro de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato-3-oxo-butirimidato,
el hidrocloruro se sintetiza según el siguiente
esquema:
La reacción del ácido
3-hidroxi-9-acridino
carboxílico (16) con 4-bromobutironitrilo da un
éster (7). La hidrólisis del éster y la reesterificación con
2,6-dimetil-4-nitrofenol
proporciona (19). La metilación con fluorosulfato de metilo y la
conversión del grupo ciano al éster imidato utilizando gas cloruro
de hidrógeno y metanol proporciona hidrocloruro del cloruro de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato-3-oxo-butirimidato
(21). Esta reacción se describe en más detalle a continuación.
El ácido
3-hidroxi-9-acridino
carboxílico (16) (2 g, 8,4 mmoles),
4-bromobutironitrilo (5,87 ml, 8,74 g, 34 mmoles) y
carbonato de cesio (11,08 g, 34 mmoles) se disolvió en DMSO anhidro
(50 ml) en un matraz de fondo redondo de 100 ml. La mezcla se
calentó hasta 50ºC en un baño de agua con agitación. Después de 3
horas la mezcla se vertió en agua (600 ml). Los sólidos se filtraron
y se disolvieron en cloroformo. El secado y la evaporación del
disolvente dio (3-ciano)propil éster del
ácido
(3-(3-ciano)propoxil-acridino-9-carboxílico
(17). Se disolvió después en tolueno (50 ml) y se añadió ciclohexano
(150 ml). Se separó el producto crudo (17), y después se filtró y se
secó. El producto seco se purificó por cromatografía en capa fina
con acetato de etilo como la fase móvil (Rf = 0,58) (rendimiento =
78,6%).
Se disolvió el éster cianopropilo (17) (3,73 g,
10 mmoles) en una mezcla de NaOH 0,5 N (90 ml) y metanol (90 ml) y
se agitó en un baño de agua a 60ºC utilizando un condensador réflex
durante 2,5 horas. Se eliminó el metanol en un evaporador rotatorio
y el producto se extractó con acetato de etilo después de acidificar
la fase acuosa con ácido hidroclórico concentrado. El secado y la
evaporación del disolvente proporcionó ácido
3-(3-ciano)
propoxil-acridino-9-carboxílico
(18) (rendimiento = 80%).
El ácido carboxílico (18) (4,62 g, 15 mmoles) se
disolvió en piridina (130 ml) y la solución se enfrió en un baño
seco de CCl_{4}. Se añadió cloruro de
p-toluenosulfonilo (5,8 g, 30 mmoles) y se eliminó
el baño. Después de 15 minutos de agitación a temperatura ambiente,
se añadió
2,6-dimetil-4-nitrofenol
(2,8 g, 16,8 mmoles). Después de 18 horas a temperatura ambiente, se
añadió agua (10 ml) y se retiraron los solventes in vacuo. Se
disolvió el residuo en cloroformo (200 ml) y se lavó la capa
orgánica con bicarbonato de sodio saturado (2 x 100 ml), agua (2 x
100 ml), NaCl 1N (1 x 100 ml) y finalmente con agua (2 x 100 ml). El
secado y la evaporación del disolvente dio
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-ciano)
propoxil-acridino-9-carboxilato
(19) el cual se cromatografió en una columna de gel de sílice
utilizando acetato de etilo/hexano (7:3) como disolvente
(rendimiento = 74,5%).
Se disolvió el éster (19) (1,6 g, 3,52 mmoles) en
cloruro de metileno seco (50 ml) y se añadió fluorosulfato de metilo
(1,6 ml, 17,6 mmoles) bajo nitrógeno. Se agitó la solución a
temperatura ambiente durante 20 horas. Se añadió éter anhidro (100
ml) y se filtró el fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-ciano)
propoxil-acridinio-9-carboxilato
(20), se lavó con éter y se secó in vacuo (rendimiento =
84,7%).
Se disolvió el éster acridinio (20) (4 mg, 7,4 x
10^{-3} mmoles) en metanol (0,5 ml) en un matraz de 5 ml de 2
bocas. Se burbujeó cuidadosamente gas de cloruro de hidrógeno
anhidro durante 10 minutos. Se añadió éter anhidro (3 ml). El
hidrocloruro del cloruro de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato-3-oxo-butirimidato
(21) se recogió y se lavó con éter. El sólido se secó in
vacuo y se almacenó en un desecador que contenía pentóxido de
fósforo.
Otro resto de la presente invención es
fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-fenantridinio-6-carboxilato
que tiene la siguiente fórmula:
El fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-fenantridinio-6-carboxilato
se sintetiza según el siguiente esquema:
Se disolvió 2-aminofenil (16,9 g,
0,1 moles) en piridina anhidra (30 ml) y se añadió anhídrido acético
(10,5 ml, 0,11 moles). La solución se agitó brevemente y se enfrió a
temperatura ambiente y se dejó reposar durante 15 horas. Después de
la adición de agua (50 ml) se retiró por filtración el
N-acetil-2-aminobifenil
(22) y se recristalizó a partir de etanol acuoso para dar 19,6 g de
agujas blancas (rendimiento = 93%).
Se puso a reflujo ligeramente el
N-acetil-2-aminobifenil
(22) (19 g, 0,09 moles) con cloruro de fosforilo destilado
recientemente (45 ml, 0,49 moles) durante 80 minutos. Después se
enfrió la solución en hielo y se retiró por filtración el
(hidrocloruro de 6-metilfenantridina) precipitado,
se disolvió en agua y se hizo alcalino con amonio acuoso. Después
se extractó la solución con éter (4 x 75 ml). El extracto se secó
sobre sulfato de sodio y se eliminó el éter in vacuo. El
aceite amarillo resultante se disolvió en ciclohexano en ebullición
(400 ml) y al enfriarlo se formaron agujas blancas de
6-metilfenantridina (23) (rendimiento = 63%).
Se preparó
6-(2-hidroxi-1-hidroximetiletil)-fenantridina
(24) por tratamiento de 6-metilfenantridina (23)
con formaldehído según el método de Morgan y Walls, J. Chem. Soc.
34:2447 (1931), el cual se incorpora a este documento como
referencia. Se formó
6-(2-hidroxi-1-hidroximetiletil)-fenantridina
(24) como agujas blancas (rendimiento = 57%).
Se puso a reflujo en acetato de etilo (125 ml)
durante 10 horas una mezcla de
6-(2-hidroxi-1-hidroximetiletil)-fenantridina
(24) (6 g, 31 mmoles) y dióxido de selenio en polvo fino (3,8 g, 34
mmoles). Después se filtró la solución de color rojo intenso
mientras se calentaba a través de celita, antes de evaporar hasta
sequedad. El sólido resultante se digirió en ácido hidroclórico
templado 1M (125 ml), se filtró y se neutralizó parcialmente con
bicarbonato de sodio. El precipitado rojo inicial se retiró por
filtración antes de neutralizar completamente la solución. El sólido
amarillo claro resultante se eliminó por filtración y se
recristalizó a partir de acetona/éter pet. para dar 2,7 g de
6-formilfenantridina (rendimiento = 42%).
Se preparó 6-carboxifenantridina
(25) por oxidación de 6-formilfenantridina con ácido
crómico según el método de Morgan y Walls, J. Chem. Soc. 34:2447
(1931), el cual se incorpora a este documento como referencia. Se
formó el producto (25) como un polvo blanco (rendimiento = 60%).
Se disolvió 6-carboxifenantridina
(25) (662 mg, 3 mmoles) en piridina anhidra (14 ml) y se enfrió a
0ºC. Se añadió cloruro de
p-tolueno-sulfonilo (1,15 g, 6
mmoles) seguido por
2,6-dimetil-4-nitro-fenol
(501 mg, 3 mmoles) y se permitió que la mezcla reposara a lo largo
de la noche a 4ºC. Se agitó la solución marrón resultante en agua
helada. Se eliminó por filtración el precipitado y se cromatografió
sobre gel de sílice usando cloroformo/hexano (1:1) para obtener
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-fenantridina-6-carboxilato
(26) (rendimiento = 60%).
Se suspendió el éster (26) (369 mg, 1 mmol) en un
matraz de 25 ml de fondo redondo con dos bocas en cloruro de
metileno anhidro (5 ml). Se enfrió la suspensión en un baño de
CCl_{4}/hielo seco bajo nitrógeno. Se añadió ácido clorosulfónico
(342 l, 6 mmoles) y se continuó agitando a -20ºC durante 3 minutos.
Después se permitió que la mezcla se calentara lentamente hasta
temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas adicionales. Se
añadió éter anhidro (20 ml) y los sólidos precipitados se filtraron
y se lavaron con éter. El secado dio fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-fenantridinio-6-carboxilato
(27) (rendimiento = 90%).
Otro resto de la presente invención es el
fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-5,6-dihidro-N-metil-fenantridinio-6-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
el fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-5,6-dihidro-N-metil-fenantridinio-6-carboxilato
se sintetiza a partir del análogo fenantridinio no reducido (27). El
fenantridinio (27) (398 mg, 0,8 mmoles) se disolvió en una mezcla
1:1 de acetonitrilo y tampón fosfato 0,1 M, pH 5,2 (80 ml). Se
añadió gota a gota una solución de cianoborohidruro de sodio (410
mg) en acetonitrilo (10 ml) a la solución de fenantridinio. Esto
produjo el blanqueamiento del color amarillo de la solución. Se
continuó agitando durante 15 minutos. Se añadió acetonitrilo (100
ml) y se retiraron los disolventes en un evaporador rotatorio. El
residuo se suspendió en agua y se extractó con acetato de etilo. Se
lavó la capa orgánica con agua y se secó. La eliminación de los
disolventes dio fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-5,6-dihidro-N-metil-fenantridinio-6-carboxilato
(rendimiento =
90%).
Otro resto de la presente invención es
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil-fenil)-2-fenil-N-metil-quinolinio-4-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
El fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil-fenil)-2-fenil-N-metil-quinolinio-4-carboxilato
se sintetiza según el siguiente esquema:
Se pusieron a reflujo acetofenona (29) (120 g, 1
mol) e isatin (30) (147 g, 1 mol) durante 10 horas en agua y etanol,
con hidróxido de potasio (17 g). Se recuperó ácido
2-fenil-quinolino-4-carboxílico
(31) a partir de etanol como agujas blancas (rendimiento 84%).
Se disolvió ácido
2-fenil-quinolino carboxílico (31)
(735 mg, 3 mmoles) en piridina anhidra (14 ml) y se enfrió en un
baño de agua helada. Se añadió cloruro de
p-toluenosulfonilo (1,15 g, 6 mmoles) y la mezcla se
agitó durante 15 minutos. Se añadió 2,6-dimetoxi
fenol (462 mg, 3 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente
durante 15 horas. Se vertió la solución en agua helada (300 ml) y se
filtró el
(2,6-dimetoxi)fenil-2-fenil-quinolino-4-carboxilato
(32). Se secaron los sólidos y se purificaron sobre una columna de
gel de sílice utilizando cloroformo/hexano (1:1) (rendimiento =
50%).
Se disolvió el éster (32) (381 g, 1 mmol) en
cloruro de metileno anhidro (3 ml) y se añadió fluorosulfato de
metilo (492 l, 0,69 g, 6 mmoles). Después de agitación durante 15
horas a temperatura ambiente bajo nitrógeno se añadió éter anhidro
(20 ml). El fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi)-fenil-2-fenil-N-metil-quinolino-4-carboxilato-N-metilo
(33) se filtró y se lavó con éter y se secó (rendimiento = 95%).
En un matraz seco de fondo redondo de 25 ml con
dos bocas se suspendió el éster (33) (200 mg, 0,4 mmoles) en cloruro
de metileno anhidro (5 ml). La suspensión se enfrió en un baño de
hielo seco/CCl_{4} bajo nitrógeno. Se añadió ácido clorosulfónico
(144 l, 2 mmoles) y se continuó agitando a -20ºC durante 0,5 horas.
Después se permitió que la mezcla se calentara lentamente hasta
temperatura ambiente y se agitó durante 2 horas adicionales. Se
añadió éter anhidro (20 ml) y se filtró el fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-2-fenil-N-metil-quinolinio-4-carboxilato
(34) y se lavó con éter y se secó (rendimiento = 90%).
Otro resto de la presente invención es
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-1,4-dihidro-N-metil-quinolino-4-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
El
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-1,4-dihidro-N-metil-quinolino-4-carboxilato
se sintetizó a partir del
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-N-metil-quinolinio-4-carboxilato
por reducción con cianoborohidruro de sodio. Se obtuvo el quinolinio
no reducido por el mismo procedimiento que el resto
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil
acridinio descrito anteriormente, con la sustitución de quinolino
por acridino.
El éster quinolinio (500 mg, 0,9 mmoles) se
disolvió en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y tampón fosfato 0,1 M a
pH 5,2 (80 ml). Se añadió una solución de cianoborohidruro de sodio
(56 mg, 0,9 mmoles) en una mezcla de acetonitrilo/tampón (10 ml).
Después de agitar durante 2 minutos, la mezcla se acidificó a pH 2,0
y se añadió acetonitrilo (100 ml). Se eliminaron los disolventes en
un evaporador rotatorio. Se suspendió el residuo en agua y se
extractó con acetato de etilo. El secado y la evaporación del
acetato de etilo dio
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-1,4-dihidro-N-metil-quinolino-4-carboxilato
(rendimiento = 70%).
Otro resto de la presente invención es
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-1,2,3,4-tetrahidro-N-metil-quinolino-4-carboxilato
el cual tiene la siguiente fórmula:
El
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-1,2,3,4-tetrahidro-N-metil-quinolino-4-carboxilato
se sintetizó a partir de
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-N-metil-quinolinio-4-carboxilato
por reducción con cianoborohidruro de sodio. El quinolino no
reducido fue obtenido por el mismo procedimiento que el compuesto
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil
acridinio descrito anteriormente, con la sustitución de quinolino
por acridino.
El éster quinolinio (500 mg, 0,9 mmoles) se
disolvió en una mezcla 1:1 de acetonitrilo y tampón fosfato 0,1 M a
pH 5,2 (80 ml). Se añadió una solución de cianoborohidruro de sodio
(560 mg, 9,0 mmoles) en una mezcla de acetonitrilo/tampón (20 ml).
Después de agitar durante 30 minutos, la mezcla se acidificó hasta
pH 2,0 con ácido hidroclórico 0,1 N y se agitó durante 5 minutos
adicionales. Se añadió acetonitrilo (100 ml) y se eliminaron los
disolventes en un evaporador rotatorio. El residuo se suspendió en
agua y se extractó con acetato de etilo. El secado y la evaporación
de acetato de etilo dio
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-2-fenil-1,2,3,4-tetrahidro-N-metil-quinolino-4-carboxilato
(rendimiento = 80%).
Otro resto preferido de la presente invención es
difluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-trimetilamonio)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el cual tienen la siguiente fórmula:
El difluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-trimetilamonio)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
se sintetizó según el siguiente esquema:
Se obtuvo
(2,6-dimetil-4-trimetilamonio)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
(35) por esterificación de ácido
acridino-9-carboxílico con
2,6-dimetil-4-nitrofenol
(36). El producto (37) se redujo al
(2,6-dimetil-4-amino)fenil-acridino-9-carboxilato
(38) con zinc. Se introdujeron dos grupos metilo en el grupo amino
por tratamiento con yoduro de metilo. Después se llevó a cabo la
cuaternización y la formación de acridinio utilizando fluorosulfato
de metilo. Estas reacciones se describen con mas detalle a
continuación.
Se mezcló el ácido
acridino-9-carboxílico (35) (3,05 g,
0,014 moles) en un matraz de fondo redondo de 250 ml con cloruro de
tionilo (65 ml) y la mezcla se puso a reflujo durante 2 horas con
agitación. Se eliminó el exceso de cloruro de tionilo en un
evaporador rotatorio. El residuo se trató con benceno (75 ml) y el
disolvente se eliminó in vacuo para eliminar las trazas de
cloruro de tionilo. El residuo de cloruro de
acridino-9-carbonilo se mezcló con
piridina (65 ml) y se añadió
2,6,dimetil-4-nitrofenol (36) (2,25
g, 0,014 moles). La mezcla se calentó utilizando un baño de agua
(alrededor de 60ºC) para disolver todos los sólidos. Después de 15
horas de agitación a temperatura ambiente se vertió la mezcla en 1
litro de agua. Se acidificó la suspensión con ácido hidroclórico
concentrado hasta pH 2,0. El producto sólido se filtró, se lavó con
agua y se disolvió en cloroformo. El secado (sulfato de sodio
anhidro) y la evaporación de cloroformo dio el éster crudo.
El éster crudo se cromatografió sobre una columna
de gel de sílice utilizando CHCl_{3}/EtOAc 98:2 como disolvente.
Se recogieron las fracciones con valor de Rf de 0,6 sobre TLC con el
mismo disolvente y la evaporación de los solventes dio el
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-acridino-9-carboxilato
(37) (rendimiento = 30%).
Se disolvió el éster
(2,6-dimetil-4-nitro)fenilo
(37) (1,16 g, 3,1 mmoles) en ácido acético (50 ml) por calentamiento
en un baño de aceite a alrededor de 65ºC. Se disolvió cloruro de
estaño (1,5 g) en ácido hidroclórico concentrado (10 ml) y se añadió
a la solución del éster. Se agitó la mezcla durante 45 minutos y
después se vertió en agua (750 ml). La extracción con cloroformo (3
x 200 ml) eliminó el éster
(2,6-dimetil-4-nitro)fenilo
no reaccionado. La capa acuosa se volvió básica con bicarbonato de
sodio y se extractó con cloroformo (4 x 200 ml). El secado y la
evaporación del cloroformo dio
(2,6-dimetil-4-amino)fenil-acridino-9-carboxilato
(38) (rendimiento = 25%).
Se disolvió el amino éster (38) (64 mg, 0,18
mmoles) en nitrometano (5 ml). Se añadieron yoduro de metilo (1 ml)
y piridina (0,1 ml). Se agitó la mezcla a temperatura ambiente
durante 15 horas. Se añadió metanol (2 ml) y después la mezcla se
agitó durante unas 2 horas adicionales. Se evaporaron los
disolventes y el residuo se trató con agua (10 ml) y después se
extractó con cloroformo (4 x 20 ml) después de que la solución se
hiciera básica. El secado y la evaporación del cloroformo dio
(2,6-dimetil-4-dimetilamino)fenil-acridino-9-carboxilato
(39) (rendimiento
= 50%).
= 50%).
El éster dimetilamino (39) (154 mg, 0,41 mmoles)
se disolvió en cloruro de metileno (2 ml). Se añadió fluorosulfato
de metilo (265 l, 3,28 mmoles) y se agitó la mezcla a temperatura
ambiente durante 15 horas. Se añadió éter anhidro (15 ml) y los
sólidos precipitados se filtraron y se lavaron con éter. El secado
dio
(2,6-dimetil-4-trimetilamonio)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
(40) (rendimiento = 50%). MS: FAB, matriz de triglicerol, m/e 400
(M^{+}).
Un conjugado de la presente invención comprende
progesterona unida a un aducto
\exists-D-tioglucosa de
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato.
El conjugado progesterona del aducto
\exists-D-tioglucosa de
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
tiene la siguiente fórmula:
El conjugado progesterona se sintetiza según el
siguiente esquema:
Se disolvió
3,5-dimetoxi-4-hidroxi
benzamida (35) (3,0 g, 15,2 mmoles) en piridina anhidra (15 ml) y se
enfrió la solución en un baño de hielo seco/CCl_{4}. Se añadió
cloruro de acetilo (1,4 ml, 1,54 g, 19,7 mmoles) y la mezcla se
mantuvo agitando a temperatura ambiente durante 2 horas. Se
añadieron metanol (1 ml) y agua (5 ml) y se retiraron los
disolventes bajo presión reducida. El residuo se trató con agua (50
ml), se acidificó con ácido hidroclórico diluido y se extractó con
acetato de etilo. El lavado con agua, secado y evaporación del
acetato de etilo dio acetato de
2,6-dimetoxi-4-carbozamido-fenilo
(36) (2,2 g) el cual se recristalizó a partir de acetato de etilo
(rendimiento = 60%).
Se disolvió el fenil acetato (36) (1,27 g, 5,33
mmoles) en tetrahidrofurano anhidro (125 ml). Se añadió una solución
diborano en THF (1,0 M, 10,9 ml, 10,9 mmoles) y la mezcla se puso a
reflujo durante 4 horas. Después de enfriar a temperatura ambiente
se añadió agua (2 ml) y ácido hidroclórico (1,0 N, 5 ml). Después de
agitar durante 30 minutos se retiraron los disolvente in
vacuo. El residuo se extractó con cloroformo. Después el
cloroformo se secó y se retiró in vacuo. El
2,6-dimetoxi-4-aminometil
fenol (37) se utilizó en la siguiente etapa sin ulterior
purificación.
A una solución de la amina cruda (37) en piridina
anhidra (10 ml) se le añadió bencilcloroformato (1,050 ml, 1,25 g,
7,3 mmoles) y la mezcla se agitó durante 3 horas a temperatura
ambiente. Se añadió agua (5 ml) y los disolventes se retiraron in
vacuo. Se añadió agua al residuo (30 ml) y la mezcla se
acidificó con HCl diluido. La extracción con acetato de etilo, el
lavado con agua, el secado y la evaporación del disolvente dio
2,6-dimetoxi-4-(benciloxicarbonil
amino)metil fenol (38) como un aceite (rendimiento = 70% en
total).
Se disolvió ácido
acridino-9-carboxílico (754 mg, 3,38
mmoles) en piridina anhidra (14 ml). Se añadió cloruro de
p-tolueno sulfonilo (1,28 g, 6,76 mmoles) y la
mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se añadió
2,6-dimetoxi-4-(benciloxi carbonil
amino)metil fenol (38) (1,18 g, 3,76 mmoles) y la mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 15 horas. Se añadió agua (10
ml) y los disolventes se retiraron in vacuo. Se disolvió el
residuo en cloroformo y la capa de cloroformo se lavó sucesivamente
con agua, HCl 0,1 N y solución de bicarbonato de sodio. El secado y
la evaporación del cloroformo dio el éster crudo el cual se
cromatografió sobre una columna de gel de sílice utilizando
CHCl_{3}/acetato de etilo, 1:1 como disolvente. La evaporación de
los disolventes de las fracciones colectadas dio
[2,6-dimetoxi-4-(benciloxicarbonil
amino)metil]fenil-acridino-9-carboxilato
(39) (rendimiento = 22%).
El acridino (39) (296 mg, 0,57 mmoles) se
disolvió en cloruro de metileno anhidro (5 ml). Se añadió
fluorosulfato de metilo (277 l, 3,4 mmoles) y la mezcla se agitó a
temperatura ambiente durante 5 horas. Se añadió éter anhidro (25 ml)
y el fluorosulfonato de
[2,6-dimetoxi-4-(benciloxicarbonil
amino)metil]fenil-acridinio-9-carboxilato
precipitado (40) se filtró y se lavó con éter y se secó (rendimiento
= 99%).
Se suspendió el acridinio (40) (107 mg, 0,169
mmoles) en cloruro de metileno anhidro (2 ml). Se añadió ácido
clorosulfónico (53 l, 92 mg, 0,797 mmoles) después de enfriar el
matraz en un baño de hielo seco/CCl_{4}. Se agitó durante 30
minutos y se retiró el baño. Después de agitar adicionalmente a
temperatura ambiente durante 1,5 horas se añadió éter anhidro (20
ml). Se filtró el producto precipitado y se secó in vacuo. El
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-4-aminometil-3-clorosulfonil)fenil-acridinio-9-carboxilato
(41) se utilizó directamente en la siguiente reacción.
Se agitó el cloruro de sulfonilo (41) (129 mg) a
temperatura ambiente en una mezcla de metanol (12,5 ml) y agua (12,5
ml) durante 3 horas. Se añadió acetonitrilo (35 ml) y se evaporaron
los disolventes. Se secó el residuo en vacío sobre pentóxido de
fósforo. El fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-4-aminometil-3-oxosulfonil)fenil-acridinio-9-carboxilato
(42) se utilizó directamente en la siguiente reacción.
Se disolvieron hemisuccinato de progesterona (90
mg, 0,209 mmoles) y N-metilmorfolina (22 l, 209
mmoles) en DMF anhidro (2 ml). La solución se enfrió en un baño de
hielo seco/CCl_{4} y se añadió isobutilcloroformato (30 l, 0,229
mmoles). Después de 2 minutos se añadió una solución del acridinio
(42) (101 mg, 0,143 mmoles) en dimetilsulfóxido (2 ml) que contenía
N-metilmorfolina (3,14 l, 0,28 mmoles). Se continuó
agitando a -20ºC durante 10 minutos y se retiró el baño de
enfriamiento. Después de agitar a temperatura ambiente durante 7
horas, se añadieron 3 gotas de agua. Se retiraron los disolventes
in vacuo y se añadió acetato de etilo al residuo. Se lavó el
precipitado oleoso repetidamente con acetato de etilo. Después de
valoración con acetonitrilo (2 ml) se separó el aceite como sólidos.
El producto se purificó sobre HPLC utilizando una columna semi
preparada Dynamax C_{18} (10 mm x 250 mm) (disponible
comercialmente de Rainin Instrument Co., Inc., Woburn,
Massachusetts) utilizando CH_{3}CN/H_{2}O (ácido
trifluoroacético al 0,1%), 55/45 como fase móvil a una velocidad de
flujo de 2,75 ml/min. Se recogió el pico que aparece en el tiempo de
retención de 6,00 minutos. La evaporación de los disolventes dio el
conjugado (43) (rendimiento = 30%). MS:FAB, matriz de tioglicerol,
895 (M^{+}, sin ningún contraión).
El conjugado de progesterona (43) (1,1 mg) en una
mezcla de CH_{3}CN (1 ml) y H_{2}O (200 l) se trató con
\exists-D-tioglucosa (0,29 mg)
como una solución en agua (72 l). Después de 10 minutos se retiraron
los disolventes completamente bajo vacío para proporcionar el aducto
\exists-D-tioglucosa descrito
anteriormente.
El siguiente procedimiento para unir una proteína
se aplica generalmente a los restos de la presente invención.
Se disolvió el IgG de ratón (Sigma, 1 mg) en
tampón fosfato 0,9 ml (100 mM, pH 8,0, 150 mM). Después la solución
se dividió en tres partes iguales de 0,33 mg/0,3 ml (0,0022 moles).
Alrededor de 0,3 mg de un resto de la presente invención se disolvió
en alrededor de 0,4 ml de DMF para obtener 0,022 moles del resto en
15 l de DMF.
Se mezclaron 0,022 moles del compuesto de la
presente invención con 0,0022 moles de IgG en un tubo
microcentrífugo de plástico. Después de 15 minutos, se añadieron
0,022 moles adicionales de compuesto al tubo microcentrífugo (la
proporción molar del compuesto a proteína era de 20 a 1). Después de
otros 15 minutos adicionales, la cantidad en exceso del compuesto
de la siguiente invención se amortiguó con una solución de lisina
HCl (10 l en tampón pi 100 mM, pH 8,0) durante 15 minutos.
Alternativamente, se utilizaron alícuotas de
0,0055 moles del compuesto de la presente invención en lugar de
0,022 moles (proporción molar del compuesto a proteína era 5:1).
Se guardaron columnas de vidrio Biorad (1 cm x 50
cm) (disponibles comercialmente de Biorad, Chemical Division,
Richmond, California) con Sephadex r
G-50-80 previamente sellados y
preparados al vacío en tampón fosfato (100 mM, pH 6,3, NaCl 150 mM,
TMS 0,001%) hasta un volumen de base de 45 ml. La solución de
reacción se pasó a través de las columnas a una velocidad de flujo
de 0,3-0,4 ml/min. Se recogieron fracciones de 0,5
ml. Se detectaron fracciones de proteína marcadas diluyendo, sacando
20 l de cada fracción a partir de 1 ml y determinando la
quimioluminiscencia producida con 30 l de la solución diluída.
Después se recogieron las fracciones marcadas.
Se dializaron las fracciones de conjugado
recogidas para mejorar la pureza del conjugado inmunoreactivo. Se
dializaron las fracciones recogidas contra 500 ml de tampón fosfato
a pH 6,3 (100 mM, pH 6,3, NaCl 150 mM, TMS 0,001%) en un periodo de
alrededor de 24 horas con tres cambios de tampón.
Restos que contienen un anillo heterocíclico no
reducido o un sistema cíclico heterocíclico pueden convertirse a sus
formas reducidas equivalentes mientras que tales restos no reducidos
se unen a proteína o a otro material. Esto puede llevarse a cabo
utilizando un agente reductor tal como cianoborohidruro de sodio. El
procedimiento para la reducción de un conjugado acridinio/IgG se
describe a continuación. El mismo procedimiento se aplica a la
reducción de otros conjugados.
Se trató la IgG marcada con acridinio
representativo (100 g) en tampón fosfato (400 l) (pH 6,0, 100 mM,
150 mM, NaCl, Timerosal 0,001%) con una solución preparada
recientemente (10 l) que contiene cianoborohidruro de sodio
(10^{-7} moles). Después de 2 horas de incubación a temperatura
ambiente la conversión de la marca de acridinio sobre el anticuerpo
al acridano se completa como se ve en el espectro
UV-Vis que indica la aparición de una banda a 280 nm
y la desaparición de la banda a 360 nm. Estas formas reducidas
retenían todas sus propiedades inmunológicas.
A) Anticuerpo marcado (conjugado):
anti-prolactina de ratón purificada por afinidad
conjugada con fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato.
Tampón de almacenamiento: Tampón fosfato 10mM, NaCl 100 mM a pH
6,00, timerosal al 0,001%, BSA al 0,4%.
B) Anticuerpo de captura:
anti-prolactina de conejo (6 g/ml) como una fase
sólida sobre tubos Nunc (comercialmente disponibles de Midland
Scientific, Roseville, Minnesota).
C) Tubos cubiertos de fase sólida: se prepararon
tubos Nunc secos de la siguiente forma: Tubos Nunc.
- 1)
- Se pipetearon en tubos Nunc 0,3 ml del anticuerpo de captura por tubo a 6 g/ml en tampón PBS (tampón fosfato salino, pH 7,2-7,4, fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, NaN_{3} 10 mM).
- 2)
- Se incubaron los tubos durante 18-24 horas.
- 3)
- Se lavaron los tubos dos veces con el tampón PBS.
- 4)
- Se bloquearon los tubos con BSA al 2% en tampón PBS.
Incubación durante <4 horas a temperatura
ambiente.
- 5)
- Se lavaron los tubos 3 veces con tampón PBS.
- 6)
- Se secaron los tubos a temperatura ambiente,
- 7)
- Se almacenaron los tubos en bolsas de plástico de congelar a 4ºC.
D) Estándares: Preparado en suero de caballo 0,
5, 30, 100, 200 ng/ml/ml.
- 1)
- Se pipetearon 25 ml de la muestra o estándar en los tubos cubiertos de anticuerpo.
- 2)
- Se añadieron 100 l de anticuerpo marcado.
- 3)
- Se movieron suavemente en un vórtex.
- 4)
- Se incubaron los tubos durante 1 hora a temperatura ambiente sobre un aparato rotador.
- 5)
- Se lavaron los tubos 3 veces con agua desionizada.
- 6)
- Se midió la quimioluminiscencia cada dos segundos bombeo 1: HNO_{3} 0,1 N + H_{2}O_{2} al 25%; bombeo 2: NaOH 0,25 N + CTAC 0,125%] en un analizador Lumatag^{MR} (comercialmente disponible de London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota).
A) Conjugado de progesterona del aducto
\exists-D-tioglucosa del
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato:
20 pg/ml de conjugado de progesterona en tampón fosfato (pH 6,0,
fosfato 100 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero humano al 0,1%,
Timerosal al 0,001%).
B) Anticuerpo primario: antiprogesterona de
conejo (Cambridge Medical Diagnostics) en tampón fosfato (pH 6,0,
fosfato 200 mM, NaCl 150 mM, albúmina de suero humano al 0,1%, CHAPS
al 0,01%, 5 g de Danazol).
C) Tubos cubiertos con fase sólida: tubos Nunc
secos cubiertos con 2,5 g de Fc de cabra anti-conejo
con BSA al 0,5%. Se prepararon los tubos como sigue:
- 1)
- Se incubaron los tubos durante 1 hora con 2,5 g /ml de Fc de cabra anti-conejo (500 ml) a temperatura ambiente.
- 2)
- Se lavaron los tubos 3 veces con agua destilada.
- 3)
- Se incubaron los tubos inmediatamente durante 3 horas con BSA al 0,5% (500 ml ) a temperatura ambiente.
- 4)
- Se lavaron los tubos 3 veces con agua destilada.
- 5)
- Se secaron los tubos 3 veces a lo largo de la noche al 40% de humedad relativa a temperatura ambiente.
- 6)
- Se almacenaron los tubos en bolsas de plástico de congelar a 4ºC.
D) Matriz de suero: suero de buey
E) Estándares: 0, 0,13, 0,38, 1,31, 7,31, 16,6 y
37,0 ng/ml.
- 1)
- Se pipetearon 50 ml de la muestra o estándar en los tubos cubiertos de anticuerpo.
- 2)
- Se añadieron 100 l del tampón conjugado.
- 3)
- Se añadieron 100 ml del tampón de anticuerpo primario.
- 4)
- Se movieron suavemente en un vórtex.
- 5)
- Se incubaron los tubos durante 2 horas a 37ºC.
- 6)
- Se decantaron los tubos y se lavaron con NaCl 150 mM en Tween al 0,1% (1 ml) y después se lavaron 3 veces con agua destilada.
- 7)
- Se invirtieron los tubos y se les permitió drenar.
- 8)
- Se midió la quimioluminiscencia cada dos segundos bombeo 1: HNO_{3} 0,1 N + H_{2}O_{2} al 25%; bombeo 2: NaOH 0,25 N + CTAC al 0,125%] en un analizador Lumatag ^{MR}(comercialmente disponible de London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota).
A) Ac marcado: Anti-TSH de cabra
purificado por afinidad conjugado con fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilado.
B) Tampón de almacenamiento: fosfato 100 mM, NaCl
0,145 M, timerosal 0,001%, BSA 0,4%, globulinas de ratón 0,1 mg/ml,
y globulinas de cabra 0,1 mg/ml, pH 6,0.
C) Anticuerpo de captura:
Anti-TSH-monoclonal (2 g/ml) como
una fase sólida sobre tubos Nunc. Procedimiento para la preparación
de tubos Nunc de fase sólida:
- 1)
- Se añadió a cada tubo 0,4 ml de anticuerpo de captura a 2 g/ml en tampón PBS (solución salina de tampón fosfato, pH 7,2-7,4, fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, NaN_{3} 10 mM).
- 2)
- Los tubos se incubaron durante 18 a 24 horas.
- 3)
- Los tubos se lavaron 3 veces con tampón PBS.
- 4)
- Los tubos se bloquearon con BSA al 2,0% en tampón PBS y se incubaron durante \leq4 horas a temperatura ambiente.
- 5)
- Se lavaron los tubos 3 veces con tampón PBS.
- 6)
- Los tubos se secaron a temperatura ambiente.
- 7)
- Los tubos se almacenaron a 4ºC en bolsas de plástico para congelar.
D) Estándar: Preparado en suero de caballo. 0,
0,5, 2,5, 10, 25 y 100 UI/ml.
- 1)
- Se pipetearon 200 l de muestra en los tubos recubiertos.
- 2)
- Se añadieron 100 l de anticuerpo marcado.
- 3)
- Los tubos se movieron en Vortex suavemente.
- 4)
- Los tubos se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente sobre un agitador.
- 5)
- Los tubos se lavaron utilizando un aparato de lavado Biotomic (disponible comercialmente de Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, California).
- 6)
- Se midió la quimioluminiscencia durante 2 segundos [bomba 1: NaOH 0,1 N + H_{2}O_{2} al 25%; bomba 2: NaOH 0,25 N + CTAC al 0,125%] en un analizador LumaTag^{MR} (Disponible comercialmente de London Diagnostic, Eden Prairie, Minnesota).
A) Ac marcado: Anti-prolactina de
conejo purificado por afinidad conjugado con fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato.
Tampón de almacenamiento: tampón fosfato 10 mM, NaCl 100 mM pH 6,0,
timerosal 0,001%, BSA 0,4%.
B) Anticuerpo de captura:
Anti-prolactina de conejo (6 g/ml) como una fase
sólida sobre tubos Nunc.
C) Tubos recubiertos de fase sólida: Se
prepararon tubos Nunc secos como sigue:
- 1)
- Se pipetearon en tubos Nunc 0,3 ml de anticuerpo de captura por tubo a 6 g/ml en tampón PBS (tampón fosfato salino, pH 7,2-7,4, fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, NaN_{3} 10 mM).
- 2)
- Los tubos se incubaron durante 18 a 24 horas.
- 3)
- Los tubos se lavaron 2 veces con tampón PBS.
- 4)
- Los tubos se bloquearon con BSA al 2,0% en tampón PBS y se incubaron durante =4 horas a temperatura ambiente.
- 5)
- Se lavaron los tubos 3 veces con tampón PBS.
- 6)
- Los tubos se secaron a temperatura ambiente.
- 7)
- Los tubos se almacenaron a 4ºC en bolsas de plástico para congelar.
D) Estándar: Preparado en suero de caballo. 0, 5,
30, 100 y 200 ng/ml/ml.
- 1)
- Se pipetearon 25 l de muestra o estándar en los tubos recubiertos de anticuerpo
- 2)
- Se añadieron 100 l de anticuerpo marcado.
- 3)
- Los tubos se movieron en Vortex suavemente.
- 4)
- Los tubos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente sobre un aparato rotatorio.
- 5)
- Los tubos se lavaron 3 veces con agua desionizada.
- 6)
- Se midió la quimioluminiscencia durante 2 segundos [bomba 1: NaOH 0,1 N + H_{2}O_{2} al 0,25%; bomba 2: NaOH 0,25 N + CTAC al 0,125%] en un analizador LumaTag^{MR} (Disponible comercialmente de London Diagnostic, Eden Prairie, Minnesota).
Según los siguientes estudios de estabilidad, los
restos y conjugados de la presente invención preferiblemente se
almacenan y utilizan en ensayos a pH entre alrededor de 6,5 y
alrededor de 7,5. Los restos y conjugados muestran estabilidad
incrementada a otros pHs bajo ciertas condiciones; sin embargo, el
incremento no es condicionante dentro del intervalo de pH
preferido.
La estabilidad comparativa se determinó
comparando el número de días (t1/2) en el que un resto pierde el 50%
de su quimioluminiscencia. La estabilidad de ciertos restos no
unidos a proteínas u otro material se monitorizó a temperatura
ambiente y a 4ºC. Los restos se almacenaron en tampón (pH 6,0, 50
mM, p_{j}, 0,1% BSA). El fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
no mostró pérdida apreciable en la medida de quimioluminiscencia
después de 98 días ni a temperatura ambiente ni a 4ºC. El
fluorosulfonato de
(2,6-isopropil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
no mostró pérdida apreciable en la medida de quimioluminiscencia
después de 312 días ni a temperatura ambiente ni a 4ºC. Para el
difluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-trimetilamonio)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el t1/2 fue de 105 días a temperatura ambiente y el t1/2 no se
alcanzó después de 105 días a 4ºC. Para el fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el t1/2 fue de 50 días a temperatura ambiente. El t1/2 a 4ºC no se
alcanzó después de 130 días. Para el fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil-4-propanoico)
fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el t1/2 fue de 24 días a temperatura ambiente y de > 95 días a
4ºC. Para el fluorosulfonato de
(2,6-dimetil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
el t1/2 a temperatura ambiente fue de 50 días. En comparación, los
restos que no tenían las sustituciones de restos de la presente
invención, tenían un t1/2 medio menor de 8 días a temperatura
ambiente y aproximadamente 32 días a 4ºC.
La estabilidad comparativa de los ésteres de
fenil-, (2,6-dimetil)fenil- y
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-,
(2,6-dimetil-3-clorosulfonil)fenil-,
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-,
(2,6-dimetil-4-trimetilamonio)fenil-,
y
(2,6-dimetil-4-bromo)fenil-
N-metil acridinio se observó en tampón fosfato (100
mM p_{j}, NaCl 150 mM, Timerosal 0,001%, albúmina de suero humano
0,005%) a pH 6,3 y pH 8,0 mientras se incubaba a 35ºC y 45ºC.
Todos los compuestos fenil sustituidos con la
excepción del compuesto (2,6-dimetil)fenilo-
mostraron estabilidad incrementada en comparación con el compuesto
fenilo desnudo. El compuesto
(2,6-dimetil)fenilo- era menos estable que el
compuesto fenilo desnudo a pH 6,3 a 35ºC pero mostró estabilidad
incrementada a pH 8,0 a 35ºC y a ambos pH a 45ºC.
La estabilidad de conjugados de IgG de ratón de
flourosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y de flourosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
a diversas temperaturas y pHs se estudió y comparó con la
estabilidad de conjugados IgG de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato. El
fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato tiene la
siguiente fórmula:
El fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato es diferente
de los compuestos de la presente invención en que no tiene un grupo
receptor de electrones o 2,6-sustituciones en el
anillo fenilo. El fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato se ha
descrito en la literatura y se emplea ampliamente en aplicaciones de
quimioluminiscencia.
Como se muestra más adelante, la pérdida de
medida de quimioluminiscencia en algún conjugado se debe a la
hidrólisis del enlace éster en la etiqueta quimioluminiscente.
Debido a eso, como la estabilidad del compuesto marcado decrece, la
velocidad de pérdida de medida en el conjugado decrece.
Se almacenaron a 4ºC conjugados de IgG de ratón
de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato,
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato. Los
conjugados se almacenaron en tres soluciones tampón diferentes a pH
6,3, 7,3 y 8,0.
El primer tampón contenía p_{j} 100mM, NaCl 150
mM, Timerosal al 0,001%, albúmina de suero humano al 0,1%, 20 mg/l
de IgG de oveja ("Tampón de Fosfato Estándar").
El segundo tampón era Tampón de Fosfato Estándar
sin IgG de oveja.
El tercer tampón era Tampón de Fosfato Estándar
sin IgG de oveja y con albúmina de suero bovino al 0,1% en lugar de
albúmina de suero humano.
En cada tampón a cada uno de los pH los
conjugados de IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mostraron estabilidad incrementada con respecto al conjugado IgG de
fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato.
Los conjugados de IgG de ratón de fluorosulfonato
de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato,
fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato se
almacenaron a temperatura ambiente (alrededor de 23ºC) ("RT") y
37ºC. Los conjugados se almacenaron en Tampón de Fosfato Estándar a
pH 6,3, 7,3 y 8,0.
A cada pH y a temperatura ambiente y a 37ºC los
conjugados IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y de fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mostraron estabilidad incrementada comparados con el conjugado IgG
de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato.
Los conjugados IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato,
de fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato se
almacenaron a 37ºC en tampón azida (50 mM pj, NaCl 100 mM, albúmina
de suero bovino al 0,1%, azida de sodio 10 mM) a pH 6,9, 7,0, 7,3 y
8,0.
A los pH mencionados tanto el conjugado de IgG de
fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)
fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
como el de fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mostraron estabilidad incrementada comparados con el conjugado IgG
de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato. A pH 6,9 y
7,0 sólo el conjugado de IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mostró estabilidad incrementada. A pH 6,9 y 7,0 el conjugado de IgG
de fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
no fue significativamente más estable que el conjugado IgG de
fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato.
Los conjugados IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato,
de fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato se
almacenaron a 37ºC en tampón azida a pH 6,3.
Los conjugados IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
y de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato se
almacenaron a temperatura ambiente y a 4ºC en tampón azida a pH
5,9.
A pH menores de 6,3 a 37ºC tanto el conjugado de
IgG de fluorosulfonato de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
como el de fluorosulfonato de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mostraron menor estabilidad que el conjugado IgG de fluorosulfonato
de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato. A pH 5,9 a
temperatura ambiente y a 4ºC el conjugado de IgG de fluorosulfonato
de
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-3-(3-succinimidil-oxicarbonil)
propiloxi-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mostró menor estabilidad que el conjugado IgG de fluorosulfonato de
4-(2-succinimidilcarboxietil)-fenil-N-metil
acridinio-9-carboxilato.
Se midió la estabilidad comparativa de los
ésteres de N-metil-acridano de
fenil-, (2,6-dimetil)fenil- y
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-
en tampón fosfato (100 mM pj, NaCl 150 mM, Timerosal al 0,001%,
albúmina de suero humana al 0,005%) a pH 6,3 y pH 8,0 mientras se
incubaban a 35ºC y 45ºC.
Los compuestos
(2,6-dimetil)fenil- y
(2,6-dimetil-4-nitro)fenil-
mostraron estabilidad incrementada en comparación con el compuesto
fenilo desnudo.
Un resto quimioluminiscente preferido de la
presente invención que tiene un grupo RnX en el carbono al que está
unido el enlace éster es
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-etoxi-9-carboxilato
que tiene la siguiente fórmula:
El
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-etoxi-9-carboxilato
se sintetiza a partir de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
mediante dos procedimientos alternativos descritos a
continuación.
Una columna C18 (Rainin, Dynamax 60 \ring{A},
250 mm x 10 mm) se equilibró con una mezcla de etanol y acetonitrilo
(hasta el 10%) conteniendo alrededor del 0,05% de una amina
terciaria (por ej. trietilamina), se disolvió
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
en la fase móvil y se inyectó sobre la columna. La fracción mayor,
que eluía con una absorbancia máxima a 280 nm, se recogió a una
velocidad de 2,0 a 2,5 ml/min. Se extrajo completamente el
disolvente de forma inmediata bajo vacío. Después el residuo se
trató con una pequeña cantidad de benceno para eliminar trazas de
alcohol y para eliminar mezclas del producto final,
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-etoxi-9-carboxilato.
Este método de HPLC es el método de síntesis preferido, ya que
produce un producto mucho más puro. Sin embargo, el procedimiento
HPLC puede no ser apropiado para algunos nucleófilos. Cuando el
procedimiento de HPLC no funciona, se puede utilizar el
procedimiento de anión nucleofílico descrito a continuación.
Se disolvió
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
(0,013 mmol, 7,5 mg) en etanol absoluto (3 ml) bajo nitrógeno. Se
añadió gota a gota una solución de
potasio-t-butóxido en etanol
absoluto (2 mg/ml) (utilizando una jeringuilla hermética de gas ) a
la solución de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
agitada vigorosamente hasta que se desvaneció completamente el color
amarillo de la solución. Entonces se eliminó completamente el etanol
bajo vacío. El residuo se trato con éter anhidro (2 ml) y
aproximadamente 1 g de sulfato de sodio anhidro. La separación de la
solución de éter y la evaporación del disolvente rindió
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-etoxi-9-carboxilato
como un sólido blanco (2,5 mg).
El
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-metoxi-9-carboxilato
se ha producido tanto por los procedimientos de HPLC como por el
procedimiento sintético de anión nucleofílico a partir del
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato.
El
(2,6-dimetil-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-metoxi-9-carboxilato
se ha producido utilizando el procedimiento sintético de anión
nucleofílico a partir del
(2,6-dimetil-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato.
Ambos procedimientos de síntesis descritos
anteriormente pueden ser utilizados para producir cualquiera de los
productos de la presente invención que tenga un grupo R_{n}X. Si
un nucleófilo distinto del etanol va a proporcionar el grupo
R_{n}X, el nucleófilo deseado se sustituye por etanol en los
procedimientos de síntesis. Si se desea un acridinio diferente,
fenantridinio, etc., el compuesto al que se va a añadir el grupo
R_{n}X puede ser sustituido por
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
en los procedimientos de síntesis descritos anteriormente. En muchos
casos, un cambio en el nucleófilo requerirá también un cambio en el
disolvente (por ej. si el nucleófilo deseado es metanol, no puede
utilizarse etanol como disolvente debido a la competición por la
adición). En tales casos, el nuevo nucleófilo puede ser utilizado
como un disolvente de reemplazamiento, si es apropiado, o puede ser
sustituido por un disolvente no-nucleofílico,
no-prótico (por ej., THF).
Otros procedimientos de síntesis, incluyen, pero
no se limitándose a tratamiento con un disolvente nucleofílico,
pueden también utilizarse para producir restos que tienen un grupo
R_{n}X.
La operabilidad de los procedimientos de síntesis
descritos en el Ejemplo 24 se confirmó por análisis de los productos
por espectroscopia UV-Vis, espectroscopia de masa
por bombardeo rápido de átomos y NMR de protón a 300 MHz.
El
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-etoxi-9-carboxilato
se utilizó como un marcador en un ensayo de TSH como sigue:
A) Ac marcado: Anti-TSH de cabra
purificada por afinidad se conjugó con
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-etoxi-9-carboxilato
como sigue: se trató una solución del anticuerpo
anti-TSH (aproximadamente 100 ug) en tampón de
bicarbonato (0,1 M, pH 9,6) con 25 moles de exceso de
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-etoxi-9-carboxilato
como una solución en DMF. La mezcla de reacción se purificó sobre
una columna (Pharmacia) Sephadex® G25 (superfine) de flujo rápido
utilizando un sistema de HPLC. Se recogió el pico de proteína a una
velocidad de flujo de aproximadamente 0,75 ml/min con una fase móvil
de tampón fosfato (pH 6,0) que contenía aproximadamente un 20% de
etanol. Después del intercambio de tampón, se diluyó la preparación
de anticuerpo marcado con tampón de almacenamiento para proporcionar
aproximadamente 100.000 cuentas/100 ul en un Analizador LumaTag®
(disponible comercialmente en London Diagnostics, Eden Prairie,
Minnesota) después de diluir 1:10.
B) Tampón de almacenamiento: fosfato 100 mM, NaCl
0,145 M, Timerosal al 0,001%, BSA al 0,4%, 0,1 mg/ml de globulina de
ratón, 0,1 mg/ml de anticuerpo de cabra pH 6,0.
C) Anticuerpo de captura:
Anti-TSH-monoclonal (2 ug/ml) como
una fase sólida sobre tubos Nunc. Procedimiento para la preparación
de tubos Nunc de fase sólida:
- 1)
- Se añadió a cada tubo 0,4 ml de anticuerpo de captura a 2 ug/ml en tampón PBS (tampón de fosfato salino, pH 7,2-7,4, fosfato 10 mM, NaCl 100 mM, NaN_{3} 10 mM).
- 2)
- Se incubaron los tubos durante 18 a 24 horas.
- 3)
- Se lavaron los tubos 3 veces con tampón PBS.
- 4)
- Se bloquearon los tubos con BSA al 2,0% en tampón PBS y se incubaron durante < 4 horas a temperatura ambiente.
- 5)
- Se lavaron los tubos 3 veces con tampón PBS.
- 6)
- Los tubos se secaron a temperatura ambiente.
- 7)
- Los tubos se almacenaron en bolsas plásticas para congelar a 4ºC.
D) Estándares: Preparados en suero de caballo 0,
0,05, 0,1, 0,5, 2,5, 10, 25 y 50 uIU/ml.
E) Solución de lavado: tampón de solución salina
que contenía BSA.
- 1)
- Se pipetearon 200 ul de muestra en los tubos recubiertos.
- 2)
- Se añadieron 100 ul de anticuerpo marcado.
- 3)
- Se sometieron los tubos a un centrifugado ligero en vortex
- 4)
- Se incubaron los tubos durante 2 horas a temperatura ambiente sobre un agitador.
- 5)
- Se añadió a cada tubo 1 ml de Solución de Lavado.
- 6)
- Los tubos se lavaron utilizando un lavador biotónico (Disponible comercialmente de Ocean Scientific, Inc., Garden Grove, California).
- 7)
- Se midió la quinioluminiscencia durante 2 segundos [bomba 1: HNO_{3} 0,1N + 0,25% H_{2}O_{2} ; bomba 2: NaOH 0,25N + CTAC 0,125%] en un analizador Lumatag® (Disponible comercialmente de London Diagnostics, Eden Prairie, Minnesota).
La adición de HNO_{3} a la mezcla de ensayo que
contiene el anticuerpo marcado provoca la separación del grupo etoxi
C9 de la molécula de acridinio antes de que se active la reacción de
quimioluminiscencia por la adición de NaOH.
La estabilidad comparativa del
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridinio-9-carboxilato
("DMC") y del
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridano-9-etoxi-9-carboxilato
("DME") se comparó a pH 9,6 a 25ºC. Los compuestos se
disolvieron en DMF (aproximadamente 0,5 mg/ml). Se añadieron
entonces 10 ul de solución a 1 ml de tampón bicarbonato (bicarbonato
0,1M, de Timerosal al 0,00025%, albúmina de suero bovino al 0,1%).
Se diluyó adicionalmente la solución para proporcionar
aproximadamente 300.000 cuantos de quimioluminiscencia en 10 ul. Los
datos del estudio de estabilidad se muestran en la Fig. 36. El DME
mostró ser más estable que el DMC en el transcurso del tiempo.
La estabilidad comparativa del conjugado TSH del
DMC-marcado y del conjugado TSH del
DME-marcado se comparó a pH 6,0 a 25, 30 y 35ºC. El
conjugado TSH del DME-marcado mostró ser más estable
en el transcurso del tiempo.
Las presentes realizaciones se deben considerar
en todos los aspectos como ilustrativas y no limitativas del alcance
de la invención que está indicado en las siguientes
reivindicaciones.
Claims (69)
1. Un compuesto quimioluminiscente que tiene la
fórmula general I
en la
que:
R4 es tal que la caja representada con una línea
de puntos marcada con L contiene un enlace éster, tioéster o
amida;
Q representa un anillo heterocíclico o sistema
cíclico heterocíclico que contiene un átomo de carbono al que se une
el enlace L, en el que el heteroátomo dentro del anillo o sistema
cíclico está en, o es capaz de estar en, un estado de oxidación que
vuelve susceptible al átomo de carbono de ser atacado por peróxido u
oxígeno molecular para formar un intermediario que disminuye la
producción de luminiscencia;
R3 representa un anillo arilo o sistema cíclico
que contiene al menos un anillo de seis miembros;
cada uno de R2 y R2' representa individualmente
grupos que ocultan estéricamente la hidrólisis del enlace L;
R1 representa un grupo receptor de electrones que
es -NO_{2}, -SO_{2}Cl, -Br o
-N(CH_{3})_{3}^{+};
uno entre R1, R2 y R2' puede representar también
un grupo capaz de fijar el compuesto a una proteína o ácido
nucleico; o una sal de los mismos.
2. Un compuesto según la Reivindicación 1 en el
que cada uno de R2 y R2' representan individualmente el grupo -R,
-OR o -SR en los que R representa un grupo arilo.
3. Un compuesto según las Reivindicaciones 1 ó 2
en el que R2 y R2' están en las posiciones orto respecto a R3,
cuando R3 es un anillo fenilo con el enlace éster unido en la
posición 1.
4. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que Q representa un grupo
acridinio, benz(a,b o c)acridinio, catión
1,2,4-triazol, catión isooxazol, catión isotiazol,
catión 1,2-azol, catión imidazol, catión
bencimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, un quinolio
cíclico sustituido en C3, C4 o C5, piridinio, pirimidinio,
piridazinio, pirazinio, fenantridinio y quinoxalinio, o una forma
reducida de los mismos.
5. Un compuesto quimioluminiscente que tiene la
fórmula general I:
en la
que:
R4 es tal que la caja representada con una línea
de puntos marcada con L contiene un enlace éster, tioéster o
amida;
Q representa un anillo heterocíclico o sistema
cíclico heterocíclico que contiene un átomo de carbono al que está
unido el enlace L, en el que el heteroátomo dentro del anillo o
sistema cíclico está en un estado de oxidación que vuelve
susceptible al átomo de carbono de ser atacado por peróxido u
oxígeno molecular para formar un intermediario que reduce la
producción de qumioluminiscencia, en el que el sistema cíclico es
acridinio, benz(a,b o c)acridinio, un catión
bencimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, un quinolinio
cíclico sustituido en C3, C4 o C5, fenantridinio o quinoxalinio, o
una forma reducida de tales sistemas cíclicos;
estando Q adicionalmente sustituido con uno o más
peri sustituyentes cada uno de los cuales está situado en un átomo
de carbono dentro del sistema cíclico Q que es capaz de aceptar un
sustituyente y que es el más cercano al átomo de carbono al que está
unido el enlace L éster, tioéster o amida y que provoca un
impedimento estérico a ese átomo de carbono;
R3 representa un anillo arilo o sistema cíclico
que contiene al menos un anillo de seis miembros;
R2 y R2' representan sustituyentes que junto con
el (los) peri sustituyente(s) impiden estéricamente la
hidrólisis del enlace L;
R1 representa un grupo receptor de electrones que
tiene un valor \sigma_{p} por encima de 0,0 y en el que el valor
aditivo \sigma_{p} para R1, R2 y R2', en el que R2 y/o R2' son
grupos receptores de electrones, es menor o igual a 1,0; y
uno entre R1, R2 y R2' puede también representar
un grupo capaz de fijar el compuesto a una proteína o ácido
nucleico; o a una sal de los mismos.
6. Un compuesto según la Reivindicación 5 en el
que cada peri sustituyente individualmente representa un grupo
metilo, etilo o fenilo.
7. Un compuesto según las Reivindicaciones 5 ó 6
en el que Q representa un grupo acridinio, fenantridinio,
quinolixinio o quinolinio.
8. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 5 a 7 en el que los peri sustituyentes están
situados en las siguientes posiciones:
(a) en C1 y C8, cuando Q representa un
acridinio;
(b) en C7 cuando Q representa un grupo
fenantridinio; o
(c) en C3 cuando Q representa un grupo
quinolinio.
9. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 5 a 8 en el que al menos un peri sustituyente es
-CH_{3}.
10. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 5 a 9 en el que R_{3} representa un grupo fenilo
y la suma de todos los valores de \sigma_{p} para R1, R2 y R2',
cuando representan un grupo receptor de electrones, es menor o igual
a 1,0.
11. Un compuesto quimioluminiscente que tiene la
fórmula general II:
En la que:
R4 es tal que la caja representada con una línea
de puntos marcada con L contiene un enlace éster, tioéster o
amida;
Q representa un anillo heterocíclico o sistema
cíclico heterocíclico que contiene un átomo de carbono al que está
unido el enlace L, en el que el heteroátomo dentro del anillo o
sistema cíclico está, o es capaz de estar, en un estado de oxidación
que vuelve susceptible al átomo de carbono de ser atacado por
peróxido u oxígeno molecular para formar un intermediario que reduce
la producción de quimioluminiscencia;
R3 representa un anillo arilo o sistema cíclico
arilo que contiene al menos un anillo de seis miembros;
cada uno de R2 y R2' representan individualmente
sustituyentes que impiden estéricamente la hidrólisis del enlace
L;
R1 representa un grupo receptor de electrones que
tiene un valor \sigma_{p} por encima de 0,0 y en el que el valor
aditivo \sigma_{p} para R1, R2 y R2', en el que R2 y/o R2' son
grupos receptores de electrones, es menor o igual a 1,0;
uno entre R1, R2 y R2' puede también representar
un grupo capaz de unir el compuesto a una proteína o ácido
nucleico;
Z representa un sustituyente unido al átomo de
carbono hibridado sp^{3} al que está unido el enlace L y es:
- un hidrógeno o átomo de halógeno;
- CN;
- OR;
- NR_{2};
- NR_{3}^{+};
- SR;
- SR_{2}^{+};
- S_{2}R;
- NRCO_{2}R;
- NHNR_{2};
- NRNR_{2};
- ONR_{2};
- NHOR;
- CR(CN)_{2};
- CR(COR)_{2};
- CR_{2}NO_{2};
- C\equivCOR;
- XR_{n};
- un fármaco o molécula esteroide;
- 2-oxazol;
- 1-imidazol;
en donde:
R representa un grupo alquilo, un grupo arilo, un
aminoácido, un azúcar o grupos R múltiples pueden representar
X representa un átomo de oxígeno, nitrógeno,
azufre o carbono;
n es un número entero de 1 a 3 cuyo valor se
determina por la valencia del átomo representado por X; o una sal
del mismo.
12. Un compuesto según la Reivindicación 11, que
es
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-etoxi-9-carboxilato.
13. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 11 ó 12 en el que cuando Z es R_{n}X puede ser
separado por tratamiento del compuesto con ácido.
14. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que Q representa un acridinio,
benz(a,b o c)acridinio, catión
1,2,4-triazol, catión isooxazol, catión isotiazol,
catión 1,2-azol, catión imidazol, catión
bencimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, un grupo
quinolinio cíclico sustituido en C3, C4 o C5, piridinio,
pirimidinio, piridazinio, pirazinio, fenantridinio o quinoxalinio, o
una forma reducida de los mismos.
15. Un compuesto quimioluminiscente que tiene la
fórmula general I:
en el
que:
R4 es tal que la caja representada con una línea
de puntos marcada con L contiene un enlace éster, tioéster o
amida;
Q representa un anillo heterocíclico o sistema
cíclico que contiene un átomo de carbono al que está unido el enlace
L, en el que el heteroátomo dentro del anillo o sistema cíclico
está, o es capaz de estar, en un estado de oxidación que vuelve
susceptible al átomo de carbono de ser atacado por peróxido u
oxígeno molecular para formar un intermediario que reduce la
producción de quimioluminiscencia;
estando Q adicionalmente sustituido por un
sustituyente capaz de ser conjugado con un material de unión
específico unido a Q a través de un grupo alquilo, alquenilo,
alquinilo, alquilamino, oxoalquilo, tioalquilo o un
alquiloxocarbonilo, teniendo el sustituyente al menos uno de los
siguientes grupos funcionales:
- COOR, en el que R representa un grupo alquilo o
arilo;
- C(OR)=NH^{+}_{2}, en el que R
representa un residuo de un alcohol funcional;
- SO_{2}Cl;
- NCS;
- N(CH_{3})(CH_{2})_{m}Cl, en
el que m es al menos uno;
- N_{3};
- NH_{2}; o
- un ion, azúcar, poliamina, polioxietileno o
polioxibutileno;
R3 representa un anillo arilo o sistema cíclico
que contiene al menos un anillo de seis miembros;
cada uno de R2 y R2' representan individualmente
sustituyentes que impiden estéricamente la hidrólisis del enlace
L;
R1 representa un grupo receptor de electrones que
tiene un valor \sigma_{p} por encima de 0.0 y en el que el valor
aditivo \sigma_{p} para R1, R2 y R2', en el que R2 y/o R2' son
grupos receptores de electrones, es menor o igual a 1,0; o una sal
del mismo.
16. Un compuesto según la Reivindicación 15 en el
que el sustituyente está unido a través de un grupo oxoalquilo o
alquiloxicarbonilo.
17. Un compuesto según las Reivindicaciones 15 ó
16 en el que el grupo funcional es succinimida o
N-carboxil succinimida.
18. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 15 a 17 en el que Q representa un acridinio,
benz(a,b o c)acridinio, catión
1,2,4-triazol, catión isooxazol, catión isotiazol,
catión 1,2-azol, catión imidazol, catión
bencimidazol, quinolinio, isoquinolinio, quinolizinio, un grupo
quinolinio cíclico sustituido en C3, C4 o C5, piridinio,
pirimidinio, piradazinio, pirazinio, fenantridinio o quinoxalinio, o
una forma reducida de los mismos.
19. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que R4 representa -O- de manera
que L es un enlace éster.
20. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que R3 representa un grupo
fenilo.
21. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que R1 representa -NO_{2},
-SO_{2}Cl, o -N(CH_{3})_{3}^{+}.
22. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que R1 representa
-SO_{2}Cl.
23. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que R2 y R2' representan
-CH_{3} o -OCH_{3}.
24. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que R_{3} representa un grupo
fenilo y la suma de todos los valores \sigma_{p} para R1, R2 y
R2', cuando representan un grupo receptor de electrones, es menor o
igual a 1,0.
25. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones precedentes en el que Q representa un grupo
acridinio.
26. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, 19, 20 y 23 a 25 que es:
27. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 y 19 a 25 que es:
28. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 y 19 a 25 que es:
29. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, 19 a 21 y 23 a 25 que es:
30. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, 19 a 21, 23 y 24 que es:
31. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 y 19 a 24 que es:
32. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4 y 19 a 24 que es:
33. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 4, 19, 20, 23 y 24 que es:
34. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 11 a 14 que es
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-etoxi-9-carboxilato,
(2,6-dimetoxi-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-metoxi-9-carboxilato
o
(2,6-dimetil-3-clorosulfonil)fenil-N-metil-acridan-9-metoxi-9-carboxilato.
35. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 15 a 21 y 23 a 25 que es:
36. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 15 a 21 y 23 a 25 que es:
37. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 15 a 21 y 23 a 25 que es:
38. Un compuesto según cualquiera de las
Reivindicaciones 15 a 21 y 23 a 25 que es:
39. Un conjugado que comprende un compuesto
quimioluminiscente según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 38
unido a otro compuesto de unión específico para formar una especie
biológica, bioquímica o química.
40. Un conjugado según la Reivindicación 39 que
puede unirse específicamente por una inmunoreacción, reacción de
unión a proteína o hibridación nucleica.
41. Una composición que comprende un compuesto
quimioluminiscente según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 38 o
un conjugado según las Reivindicaciones 39 ó 40.
42. Un estuche de ensayo de unión específica que
comprende un vial que contiene una composición según la
Reivindicación 41.
43. Un ensayo de unión específica para detectar
la presencia de un analito en una muestra en el que el ensayo
utiliza un conjugado quimioluminiscente según las Reivindicaciones
39 ó 40 o un compuesto quimioluminiscente según cualquiera de las
Reivindicaciones 1 a 38 unido a un material de unión específico en
el que la presencia del analito en la muestra es proporcional a la
formación de uno o más productos de reacción de unión específica que
contienen el conjugado, comprendiendo el ensayo:
permitir, bajo condiciones adecuadas la formación
sustancial de uno o más productos de reacción de unión específica
que contienen el conjugado; y
medir la quimioluminiscencia de (i) uno o más de
los productos de reacción de unión específica o (ii) el conjugado
que no está contenido en los productos de reacción de unión.
44. Un ensayo según la Reivindicación 43 en el
que el material de unión específica es capaz de unirse
específicamente con el analito y el producto de reacción de unión
específico es un complejo analito-conjugado,
comprendiendo el ensayo:
permitir, bajo condiciones adecuadas la formación
sustancial del complejo analito-conjugado; y
medir la quimioluminiscencia de (i) el complejo
analito-conjugado o (ii) el conjugado que no está
contenido en el complejo analito-conjugado.
45. Un ensayo según la Reivindicación 44 que es
un ensayo de antígeno de superficie y el material de unión
específica es un anticuerpo que es específico para un antígeno de
superficie sobre una célula.
46. Un ensayo según las Reivindicaciones 44 ó 45
que utiliza adicionalmente un reactivo que es capaz de unirse
específicamente tanto con (i) el analito, para formar un complejo
analito-reactivo, como con (ii) el material de unión
específica para formar un complejo
conjugado-reactivo que es el producto de reacción de
unión específica, comprendiendo el ensayo:
permitir, bajo condiciones adecuadas la formación
sustancial del complejo analito-reactivo y del
complejo conjugado-reactivo; y
medir la quimioluminiscencia de (i) el complejo
conjugado-reactivo o (ii) el conjugado que no está
contenido en el complejo conjugado-reactivo.
47. Un ensayo según la Reivindicación 43 que es
un ensayo competitivo.
48. Un ensayo según las Reivindicaciones 46 ó 47
en el que el reactivo se une a una fase sólida o se precipitan los
complejos que contienen el reactivo.
49. Un ensayo según la Reivindicación 43 que es
un ensayo de saturación secuencial y el analito reacciona primero
con el reactivo antes de la reacción del conjugado con cualquier
reactivo que quede por reaccionar.
50. Un ensayo según la Reivindicación 43 que es
un ensayo de desplazamiento competitivo en el que el conjugado
desplaza competitivamente al analito que se ha unido ya con el
reactivo.
51. Un ensayo según la Reivindicación 43 que es
un ensayo de amortiguación y el reactivo se une a un resto
amortiguador.
52. Un ensayo según la Reivindicación 51 en el
que el resto amortiguador reduce o amortigua la quimioluminiscencia
del compuesto cuando se lleva a la proximidad del compuesto.
53. Un ensayo según la Reivindicación 43 en el
que el material de unión específica es capaz de unirse
específicamente con el analito y el ensayo utiliza adicionalmente un
reactivo capaz de unirse específicamente con el analito para formar
un complejo
reactivo-analito-conjugado, que es
el producto de reacción de unión específica, comprendiendo el
ensayo:
permitir, bajo condiciones adecuadas la formación
sustancial del complejo
reactivo-analito-conjugado; y
medir la quimioluminiscencia de, (i) el complejo
reactivo-analito-conjugado o, (ii)
el conjugado que no está contenido en el complejo
reactivo-analito-conjugado.
54. Un ensayo según la Reivindicación 53 que es
un ensayo de sándwich.
55. Un ensayo según las Reivindicaciones 53 ó 54
en el que el reactivo se une a una fase sólida.
56. Un ensayo según cualquiera las
Reivindicaciones 53 a 55 en el que el reactivo se une a una varilla
de aforar, cápsulas, tubos, papel o láminas de polímero.
57. Un ensayo según las Reivindicaciones 55 ó 56
en el que el reactivo unido a la fase sólida reacciona con el
analito en la muestra después de lo cual la fase sólida que contiene
el complejo de analito se separa de la muestra restante y el
complejo reacciona después con el conjugado.
58. Un ensayo de unión específica para detectar
la presencia de un analito en una muestra en el que el ensayo
utiliza un resto quimioluminiscente que comprende un compuesto
quimioluminiscente según cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 38,
y la presencia del analito en la muestra es proporcional a la
formación de uno o más productos de reacción de unión específica que
no contienen el compuesto quimioluminiscente y el compuesto produce
quimioluminiscencia en proporción a la formación de los productos de
reacción de unión específica, comprendiendo el ensayo:
permitir, bajo condiciones adecuadas, la
formación sustancial de los productos de reacción de unión
específica; y
medir la quimioluminiscencia del compuesto
generado por la formación de los productos de reacción de unión
específica.
59. Un ensayo según la Reivindicación 58 que
utiliza adicionalmente un reactivo capaz de unirse con el analito
para formar un complejo analito-reactivo y en el que
el compuesto produce quimioluminiscencia en proporción a la
formación del complejo analito reactivo.
60. Un ensayo según la Reivindicación 59 que es
un ensayo enzima-substrato en el que la formación
del complejo enzima-substrato activa el compuesto
quimioluminiscente.
61. Un ensayo según la Reivindicación 60 en el
que el analito es el substrato glucosa y el reactivo es la enzima
glucosa oxidasa.
62. Un ensayo según la Reivindicación 61 en el
que la formación del producto de reacción de unión específica
produce o inhibe la quimioluminiscencia del compuesto.
63. Un ensayo según la Reivindicación 58 en el
que un primer reactivo, que es un reactivo de cruce con el analito,
se une a una enzima cerca de su sitio activo y un segundo reactivo,
que es específico tanto para el analito como para un material
inmunorreactivo se añade a la muestra y la enzima en la presencia de
un substrato.
64. Un ensayo según la Reivindicación 63 en el
que el segundo reactivo se une al primer reactivo para bloquear el
sitio activo sobre la enzima de manera que el substrato no puede
unirse a la enzima en el sitio activo o la unión del substrato en el
sitio activo decrece significativamente.
65. Un ensayo según cualquiera de las
Reivindicaciones 43 a 64 que es un inmunoensayo, ensayo de unión a
proteína o ensayo de hibridación de ácido nucleico.
66. Un ensayo según la Reivindicación 65 que es
un ensayo de hibridación de ácido nucleico en el que se convierte
cualquier ADN o ARN de doble cadena a una forma de cadena simple
antes de la hibridación y se inmoviliza sobre un portador o se trata
por electroforesis sobre una matriz de gel.
67. Un ensayo según cualquiera de las
Reivindicaciones 43 a 66 que es un ensayo heterogéneo en el que los
productos de reacción, cuya formación es proporcional a la presencia
del analito en la muestra, se separan de otros productos de la
reacción.
68. Un ensayo según cualquiera de las
Reivindicaciones 43 a 66 que es un ensayo homogéneo en el que los
productos de reacción no se separan de otros productos de la
reacción y la quimioluminiscencia se mide a partir de la mezcla de
ensayo completa.
69. Un ensayo según cualquiera de las
Reivindicaciones 43 a 68 en el que la medida de la
quimioluminiscencia comprende, en caso necesario, tratar el
compuesto con un ácido para separar Z, si Z está presente y cuando
representa un grupo R_{n}X, y activar la quimioluminiscencia si el
compuesto de formación del producto de reacción no lo ha hecho
todavía.
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