DE69925032T2

DE69925032T2 - Fluoreszenzfarbstoffe zum festphasen- und flüssigphasen-screening

Info

Publication number: DE69925032T2
Application number: DE69925032T
Authority: DE
Inventors: Manfred Auer; Hubert Gstach
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1998-12-21
Filing date: 1999-12-20
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2019-12-21
Also published as: US20050227299A1; JP2002533329A; DE69925032D1; US6207831B1; US20010005752A1; CA2356344A1; ATE294164T1; EP1140856A1; AU3040300A; EP1140856B1; WO2000037448A1

Description

Technisches Gebiet:
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Screenings mit untrahohem Durchsatz am festen Träger und in homogener Lösung durch eine neue allgemeine Markierungstechnologie. Die neue Markierungstechnologie basiert auf neuen chemisch stabilen Fluorophoren, die reaktive chemische Funktionalitäten zur Bindung an einen festen Träger aufweisen und den anschließenden Start einer kombinatorischen Synthese von Verbindungsbänken.
Hintergrund:
Drei neue wissenschaftliche Disziplinen weisen das größte Potential auf, den Bedarf für eine erhöhte Vorhersagbarkeit und zur Verringerung der gesamten Ausfallrate des Arzneimittelauffindungsprozesses zu erfüllen. (1) Funktionelle Genomics wurden erfunden, um neue innovative Molekülziele zu erzeigen. (2) Die kombinatorische Chemie liefert zunehmend effiziente Wege zur Erzeugung einer molekularen Diversität, mit der die Ziele sondiert werden. (3) Screeningplattformen mit hohem Durchsatz (HTS) liefern die Effizienz und Qualität bei der Auffindung von potentiellen Leitverbindungen. Das Hochdurchsatzscreening umfasst in den meisten pharmazeutischen Firmen derzeit die Ausführung von mehreren Million Tests pro Jahr. Mittlerweile wurde HTS zu einer eigenen Disziplin, die Biochemie, Biophysik und Zell/Molekularbiologie in Kombination mit Detektion/Flüssigkeitsverwendungstechnologien und Automatisierungsprozesse miteinbezieht. Mit all den phantastischen Chancen, die diese neuen wissenschaftlichen Disziplinen bieten, wird es bereits deutlich, dass das zeitaufwändige Verfahren in den funktionellen Genomics die Identifizierung der physiologischen Funktion eines neuen Proteins ist. Während die kombinatorische Chemie Hilfe bereitstellt, eine Vielzahl an Verbindungen während der Zeit zu synthetisieren, die für die klassische Synthese erforderlich ist, ist jetzt bekannt, dass zwischen dem Fünf- und Zehnfachen der Anzahl an Tests erforderlich ist, um Verbindungen aus Screenings zu identifizieren. Die Herausforderung, der die Gemeinschaft der angewandten Wissenschaft derzeit ausgesetzt ist, ist die vollständige Ausnutzung der Vorteile von (1) und (2) auf der Zeitschiene, indem sie den Prozess der Synthese, Proteinfunktionsidentifizierung und des Screenings beschleunigt. Die vorliegende Erfindung öffnet eine neue Möglichkeit zur Integration der Vorteile der kombinatorischen Chemie und der Genomics mit HTS durch die Bereitstellung der Effizienz, die für das Screenen von Verbindungen direkt am festen Träger erforderlich ist. Die Zielmakromoleküle mit sogar bisher unbekannter Funktionalität können auf ihre direkte Bindungsaffinität zu Verbindungen von Interesse getestet werden. Die neue Fluoreszenzchemie, die im folgenden allgemein als AIDA-Chemie beschrieben wird, ist auch für Screeningstests in homogener Lösung geeignet, entweder durch direkte Anwendung der an die AIDA Chemie konjugierten Verbindungen oder durch Spaltung der AIDA Konjugate vom festen Träger durch gut bekannte chemische oder photophysikalische Mittel. Nach der Freisetzung des AIDA konjugierten "Binders", der in einer Festphasenscreeningtechnologie identifiziert wurde, kann die Affinität zum Makromolekül von Interesse durch herkömmliche Ensemble-mittelnde, spektroskopische Fluoreszenztechniken in Testvolumina bestimmt werden, die in Mikrotiterplatten verwendet werden. Zusätzlich können spektroskopische Einzelmolekültechniken, die in Mikrotitervolumina ausgeführt und in sogenannten Nanoträgern angewendet werden, verwendet werden.
Zusammenfassung der Erfindung:
Die Erfindung bezieht sich auf spezifische Fluoreszenzfarbstoffe, die im Hochdurchsatzscreening sowohl in der festen Phase als auch in homogener Lösung verwendet werden können. Die neuen Fluoreszenzfarbstoffe, die allgemein als AIDA Chemie bezeichnet werden, sind für verschiedene Festphasenverfahren und organische Flüssigphasenchemie zur Synthese von zu untersuchenden Molekülen geeignet, die auf eine therapeutische Verwendung in Krankheitszuständen untersucht werden sollen. Diese Moleküle von therapeutischem Interesse können als Fluoreszenzkonjugate durch zwei Verfahren synthetisiert werden: (a) Ein fester Träger wird mit einem spaltbaren Linker (säure-, base-, redox- oder lichtempfindlich) beladen, an den anfänglich der Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist. Diese Farbstoffe weisen eine zweite Funktionalität auf, die als Bindungsstelle für Spacerelemente dient. Der Spacer trägt eine weitere funktionelle Gruppe, die als Startpunkt der Synthese der zu untersuchenden Moleküle verwendet wird, und (b) der Fluoreszenzfarbstoff kann auch als Abschluss im letzten Syntheseschritt einer Reaktionssequenz eingeführt werden. Die spezifischen in der Erfindung beschriebenen Farbstoffe sind chemisch in einem breiten Bereich an Reaktionsbedingungen stabil, die gewöhnlich in der organischen Festphasen- und Flüssigphasenchemie verwendet werden. Die Konjugate emittieren eine Fluoreszenz im sichtbaren Spektrum und UV Spektrum auf eine Anregung bei Wellenlängen ihrer Absorption. Diese Fluoreszenzeigenschaften erlauben mehrere Anwendungen in auf Fluoreszenz basierenden Prozessen zur Identifizierung von Inhibitoren molekularer Wechselwirkungen und zur Identifizierung von Molekülen, die an Zielmakromoleküle binden, wie Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Kohlenhydrate usw.. Die zur Verfolgung der Bindung von AIDA-konjugierten Verbindungen an Makromoleküle verwendeten Fluoreszenzdetektionstechnologien umfassen herkömmliche makroskopische Techniken (Ensemblemittelung), die die Veränderungen in der Fluoreszenzintensität detektieren, Anisotropie (Polarisation), Fluoreszenzresonanzenergietransfer, Fluoreszenzdauer, rotierende Korrelationszeit wie auch spektroskopische Einzelmolekültechniken (SMS). Die SMS umfasst die Anregung durch ein oder zwei Laserwellenlängen, die die Laserlinien bei 325 nm, 351 nm, 453 nm, 488 nm, 514 nm, 543 nm, 632 nm und andere Anregungsmöglichkeiten umfassenas von Einzelmolekülen emittierte Fluoreszenzlicht, das durch einen konfokalen Fokus dringt, wie er in der Einzelmolekülspektroskopie angewendet wird, passiert ein oder zwei Filter und Polarisatoren, bevor das Licht den Lawinenphotodiodendetektor erreicht. Die umfassenden Detektionstechnologien bei der SMS, die auf AIDA angewendet werden, sind unter anderem Translationsdiffusion, Rotationsdiffusion, Fluoreszenzdauer, Fluoreszenzhelligkeit, Spektralverschiebungen, Fluoreszenzenergietransfer, Triplettübergangsmöglichkeiten und Multiplexdetektion. Die Farbstoffe zeigen eine ausreichende Stabilität bei chemischen Umwandlungen, haben eine geringe Bildung des Triplettzustands und sind unter den zur Detektion der Bindungsereignisse an Biomoleküle verwendeten Bedingungen nicht lichtreaktiv, was sie zu einem ausgezeichneten Werkzeug zur Kombination der kombinatorischen Chemie (Festphasen- und Flüssigphasenchemie) und biologischen Untersuchungen (Screening mit ultrahohem Durchsatz) macht.
Die Anwendungen des Farbstoffs umfassen organische Festphasen und Lösungsphasenchemie, Markierung einer niedermolekularen Verbindung, Peptidmarkierung, Proteinmarkierung, optische Spektroskopie und Fluoreszenz. Die Synthese der funktionalisierten Farbstoffe und der Farbstoffkonjugate (auf einem festen Träger und in Lösung) sind beschrieben.
Detaillierte chemische Aspekte der Erfindung:
Ein erster Aspekt der Erfindung betrifft einen Fluoreszenzfarbstoff, der durch die Formel (I) dargestellt wird
(Formel (I)) worin
einer der Reste von R¹ oder R² und einer der Reste von R³ oder R⁴ für Wasserstoff steht und der andere unabhängig steht für -COOH, -COOR⁷, -CONH₂, -CONR⁸R⁹, -CONH(CH₂)_nOH, worin n für 2 bis 8 steht, -CH₂OH-, -CH₂NH₂, -NO₂, NR¹⁰R¹¹, NHCOR¹², Cl, Br, F, -CF₃, O(C₁-C₄)Alkyl (wahlweise substituiert durch Methyl oder Phenyl an einem der Kohlenstoffe C₁-C₄), -N=C=O, N=C=S, -SO₃H, -SO₂NH(CH₂)_nNH₂, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₁₆ Alkyl, das am terminalen Kohlenstoff substituiert ist mit -COOH, -COOR⁷, -CONH₂, -CONR⁸R⁹, -CONH(CH₂)_nOH, worin n für 2 bis 8 steht, -CH₂OH, -CH₂NH₂, -N=C=O, N=C=S, -SO₃H, -SO₂NH(CH₂)_nNH₂, -CONH(CH₂)_nNH₂, worin n für 2 bis 8 steht und die NH₂-Gruppe unsubstituiert oder durch C₁-C₄ Alkyl oder eine herkömmlich verwendete Aminoschutzgruppe substituiert ist, wie tert-Butyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Phthalimido, Trifluoracetamido, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl und 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, und
einer der Reste von R⁵ oder R⁶ für Wasserstoff steht und der andere steht für Wasserstoff, Halogen, O(C₁-C₄)Alkyl (wahlweise durch Methyl oder Phenyl an einem der Kohlenstoffe C₁-C₄ substituiert), -NO₂, NR¹⁰R¹¹, NHCOR¹², C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₁₆ Alkyl, das am terminalen Kohlenstoff substituiert ist mit -COOH, -COOR⁷, -CONH₂, -CONR⁸R⁹, -CONH(CH₂)_nOH, worin n für 2 bis 8 steht, -CH₂OH, -CH₂NH₂, -N=C=O, N=C=S, -SO₃H, -SO₂NH(CH₂)_nNH₂, -CONH(CH₂)_nNH₂, worin n für 2 bis 8 steht und die NH₂-Gruppe unsubstituiert oder durch C₁-C₄ Alkyl oder eine herkömmlich verwendete Aminoschutzgruppe substituiert ist, wie tert-Butyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Phthalimido, Trifluoracetamido, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl und 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl, und
R⁷ für eine herkömmlich verwendete Carboxylschutzgruppe oder Carboxylaktivierungsgruppe steht, wie jeweils Succinimidyl, Azido, Phenyl, 4-Nitrophenyl und Pentafluorphenyl zur Aktivierung und Methyl, β-substituiertes Ethyl, 2,2,2-Trichlorethyl, tert-Butyl, Allyl, Benzyl, Benzhydryl, 4-Nitrobenzyl, 2-(4-Toluolsulfonyl)ethyl, Silyl, 2-(Trimethylsilyl)ethyl, MEM, MOM, BOM, MTM und SEM als Schutz
R⁸ oder R⁹ für Wasserstoff steht und das andere für C₁-C₄ Alkyl, Phenyl oder Benzyl steht oder R⁸ und R⁹ Teil eines fünf- oder sechsgliedrigen Rings sind, wie bei Piperazin,
R¹⁰ und R¹¹ unabhängig für Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder eine Aminoschutzgruppe stehen (geeignete Schutzgruppen sind oben erwähnt),
R¹² für C₁-C₁₀ Alkyl, Phenyl, wobei das Alkyl oder Phenyl unsubstituiert oder durch C₁-C₄ Alkyl substituiert ist, oder für eine geschützte (geeignete Schutzgruppen sind oben erwähnt) Aminogruppe oder Halogen steht,
mit der Maßgabe, dass die Verbindungen 3-(m-Nitrophenyl)-1-(p-nitrophenyl)-1H-indazol und 6-Methyl-1,3-di-p-tolyl-1H-indazol ausgeschlossen sind.
Bevorzugte Ausführungsformen dieser Aspekte sind Fluoreszenzindazolfarbstoffe, die durch die folgenden Strukturen a bis x dargestellt werden:
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Fluoreszenzkonjugate, die durch die Formel (II) oder (III) dargestellt werden A-B-D-C-D'-E (Formel (II)) A-B-D-E-D'-C (Formel (III))worin
A für einen festen Träger steht, der aus Standardmaterialien ausgewählt ist, die in der organischen Festphasen- und Flüssigphasenchemie verwendet werden (beispielsweise funktionalisierte auf Polystyrol basierende Harze, auf Polyacrylamid, basierende Polymere, Polystyrol/Polydimethylacrylamidkomposite, PEGA Harze, auf Polystyrol-Polyoxyethylen basierende Träger, Tentagel, PEG-Polystyrolpfropfpolymerträger, Glasoberflächen, funktionalisierte Oberflächen, Materialen, die mit funktionalisierten Oberflächen ausgestattet sind oder Polyethylenglycol),
B für einen Linker steht, der eine Abspaltung der Fluoreszenzkonjugate der Formel (II) oder (III) unter Freisetzung jeweils des D-C-D'-E oder D-E-D'-C Fragments erlaubt. B wird aus den bekannten säureempfindlichen, basenempfindlichen, lichtempfindlichen, redoxempfindlichen und maskierten Linkern ausgewählt, die in der kombinatorischen Synthese, Peptidsynthese und Oligonukleotidsynthese angewendet werden (beispielsweise auf Benzyl, Benzhydryl, Benzhydryliden, Trityl, Xanthenyl, Benzoin, Silicium oder Allyl basierende Linker),
C für eine Verbindung steht, die aus der Formel (I) ausgewählt ist,
D und D' unabhängig für eine Bindung oder einen Spacer stehen, der ausgewählt ist aus α,ω-Diaminoalkanen, Diaminocyclohexyl, Bisaminomethyl-substituiertem Phenyl, α-Amino-ω-hydroxyalkanen, Alkylaminen, cyclischen Alkylaminen, cyclischen Alkyldiaminen oder Aminosäuren ohne oder mit einer zusätzlichen Funktionalität in der Seitenkette,
E für das zu untersuchende Molekül steht, beispielsweise eine niedermolekulare Verbindung, ein Peptid, ein Protein, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder ein Lipid, das eine funktionelle Gruppe zur Anbindung trägt.
Die Konjugate der Formel (II) können über zwei unabhängige Protokolle erzeugt werden: (a) Durch de novo Synthese des Moleküls E, wie Einbau in eine funktionelle Gruppe des Spacers D' jeweils des A-B-C-D' oder A-B-D-C-D' Fragments, (b) durch Anbindung eines vorgebildeten Moleküls E, das eine geeignet funktionelle Gruppe zur Kupplung jeweils an das A-B-C-D' oder A-B-D-C-D' Fragment enthält (beispielsweise einen Amino- oder Carboxyterminus).
Die Konjugate der Formel (III) können entweder durch de novo Synthese des Moleküls E ausgehend vom A-B oder A-B-D Konjugat und der anschließenden Anfügung eines D'-C oder C Fragments oder durch die Anbindung eines vorgeformten Moleküls E, das geeignete funktionelle Gruppen zur Kupplung jeweils an das A-B oder A-B-D und D'-C oder C Fragment enthält (beispielsweise einen Amino- und Carboxyterminus), erzeugt werden.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I), die als C zur Synthese von Konjugaten verwendet werden, die durch die Formel (II) dargestellt werden, sind die Strukturen a, b, g, i–k, m–x des ersten Aspekts der Erfindung.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I), die als C zur Synthese von Konjugaten verwendet werden, die durch die Formel (III) dargestellt werden, sind die Strukturen a–p, u–x des ersten Aspekts der Erfindung.
Bevorzugte Konjugate der Formel (II) werden durch die folgenden Strukturen dargestellt:
Bevorzugte Konjugate der Formel (III) werden durch die folgenden Strukturen dargestellt:
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft AIDA Konjugate, die durch die Formel (IV) dargestellt werden: E-D'-C (Formel (IV)worin
E das zu untersuchende Molekül ist, beispielsweise eine niedermolekulare Verbindung, ein Peptid, ein Protein, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder ein Lipid, das eine funktionelle Gruppe zur Bindung aufweist.
D' für eine Bindung oder einen Spacer steht, der ausgewählt ist aus α,ω-Diaminoalkanen, Diaminocyclohexyl, Bisaminomethyl-substituiertem Phenyl, α-Amino-ω-hydroxyalkanen, Alkylaminen, cyclischen Alkylaminen, cyclischen Alkyldiaminen oder Aminosäuren ohne oder mit einer zusätzlichen Funktionalität in der Seitenkette,
C für eine Verbindung steht, die aus Formel (I) ausgewählt ist.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (I) werden als C zur Synthese von Konjugaten verwendet, die durch die Formel (IV) dargestellt werden, wie dies für die Formeln II und III angegeben ist.
Bevorzugte Verbindungen der Formel (IV) werden durch die folgenden Strukturen dargestellt:
Detaillierte methodische/technische Aspekte der Erfindung:
Unter den sehr vielen möglichen Anwendungen, die auf AIDA Farbstoffmolekülen basieren, sind die vielversprechendsten Detektionsverfahren die folgenden:

(1) AIDA Moleküle am festen Träger können nicht durch die herkömmlichen Ar-Ionen oder HeNe Laserlinien zur Fluoreszenz angeregt werden, die bei 453 nm beginnen und vorwiegend Wellenlängen mit 488 nm, 514 nm und 543 nm verwenden, um Farbstoffmoleküle anzuregen, wie Fluoresceine oder Rhodamine usw.. AIDA Farbstoffe können daher als "silente" Fluoreszenzmarker am festen Träger ohne eine Wechselwirkung mit jeder Art von Detektionstechnologie verwendet werden, die eine rote (> 453 nm) Fluoreszenz verwendet.
(2) Wenn sie vom festen Träger abgespalten wurden oder auf löslichen Verbindungen verwendet werden, können die AIDA Marker direkt oder nach der Abspaltung mit einem UV-Laser mit einer Anregungsquelle von 325 nm oder 351 nm angeregt werden, um durch verschiedene Verfahren detektiert zu werden, die in der Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden.
(a) Bei herkömmlichen Küvetten, die in Fluoreszenzexperimenten oder in Mikrotiterplatten verwendet werden, kann die Bindung der AIDA-enthaltenden Verbindungen zur Auffindung von Makromolekülen durch die Verringerung der Rotationsfrequenz detektiert werden. Der verwendete Detektionsparameter ist die Rotationskorrelationszeit bei zeitauflösenden Fluoreszenzexperimenten (mittels der Zählung der einzelnen Photonen oder Phasendomänendetektionsarten) oder durch Anisotropie/Polarisation in Fluorometern mit continous wave = promten = Dauerstrichbetrieb.
(b) Bei Einzelmolekülfluoreszenzexperimenten ist die Verringerung der Translationsdiffusionszeit, die aus Autokorrelationsberechnungen der Zeitspur der Fluoreszenzfluktuationen bestimmt wird, der analoge Detektionsparameter.
(3) Mit Anregungswellenlängen, die etwa von 300 nm bis 400 nm reichen, sind die Emissionswellenlängen der AIDA Farbstoffe gewöhnlich sehr breit und reichen von etwa 350 nm bis 600 nm. Es ist in der Literatur gut bekannt, dass durch UV anregbare Farbstoffe eine starke Empfindlichkeit auf die Umgebung zeigen. Durch verschiedene Arten von photophysikalischen Wechselwirkungen mit Bindungsparametern, wie Proteinen, zeigt die Fluoreszenzemission dieser Farbstoffe einschließlich AIDA die Abschwächung oder Erhöhung der Fluoreszenz durch verschiedene Mechanismen, einschließlich Ladungstransfer und Elektronentransfermechanismen. Dies führt zu einer Veränderung der Quantenausbeuten oder einer Verschiebung der Spektren zu längeren oder kürzeren Wellenlängen. Diese Signalparameter werden zur Verfolgung der Bindungsreaktionen verwendet.
(4) Für Anwendungen mit auf AIDA basierten Farbstoffen ist ein weiterer geeigneter Wechselwirkungsparameter der Fluoreszenzresonanzenergietransfer (FRET). Der Bereich und die Form der Absorptionsspektren der stabilen AIDA Konjugate (auf den festen Träger wie auch in Lösung) zeigen eine ausgezeichnete spektrale Überlappung mit der Emission der fluoreszierenden Aminosäure Tryptophan in Proteinen. Die Emissionsspektren der AIDA-Konjugate (gewöhnlich zwischen 350 nm und 600 nm) überlappen mit verschiedenen herkömmlich verwendeten Fluoreszenzmarkierungen auf Proteinen (beispielsweise BODIPY, Rhodamin, Fluorescein, Cy). Diese Spektraleigenschaften ermöglichen die Detektion von Bindungsereignissen zwischen Konjugaten und Biomolekülen (markiert oder unmarkiert) durch Fluoreszenzresonanzenergietransfer vom angeregten Tryptophan (Donor) zum Farbstoffmolekül (Akzeptor) des Konjugats. In einem unterschiedlichen experimentellen Ansatz kann der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen dem AIDA-enthaltenden Molekül und einer Fluoreszenzmarkierung (Akzeptor), der mit dem Biomolekül konjugiert ist, bei der Anregung des AIDA (Donors) erreicht werden. Zusammengefasst können in makroskopischen Fluoreszenzexperimenten (durch Mitteln der Signale von vielen Molekülen in einer Küvette oder Mikrotiterplatte) AIDA-Konjugate als Fluoreszenzdonoren oder als Fluoreszenzakzep toren in FRET Experimenten am festen Träger oder in homogener Lösung verwendet werden. Eine Komplexbildung mit Tryptophan- und/oder Tyrosin-enthaltenden Proteinen kann durch Donorabschwächung (Tryptophan) oder Akzeptorsensibilisierung (AIDA) detektiert werden. Eine Komplexbildung mit fluoreszent markierten Makromolekülen (Markierungen umfassen alle Farbstoffe, die zwischen 350 nm und 680 nm zur Fluoreszenz anregbar sind) kann durch Donor (AIDA) Abschwächung und Akzeptorsensibilisierung (Emissionsenergien geringer als 350 nm) detektiert werden.
(5) In SMS können AIDA-Konjugate auch als Donoren und Akzeptoren verwendet werden. Die aus FRET stammende Abschwächung oder Steigerung des Tryptophans, AIDA oder roten Akzeptorfarbstoffs (beispielsweise Rhodamin) wird durch die Veränderung in der molekularen Helligkeit verfolgt. Die UV Anregung der Tryptophane ist jedoch nur durch Anregung von zwei oder drei Photonen durch gepulste Laser im Femtosekundenfrequenzbereich möglich, während AIDA durch cw-UV Laser bei 325 nm oder 351 nm angeregt werden kann.
(6) Die folgenden Testdetektionsschemata sind mit AIDA und SMS möglich.

(6.1) Am festen Träger:

(a) Silentes AIDA-1: Die direkte Detektion der Bindung von fluoreszent markierten Makromolekülen an AIDA enthaltende feste Träger durch Anwendung von konfokalen Mikroskoptechniken, wie denen, die in WO 95/35492 A beschrieben sind (M. Eigen & K. Henco, Process and device for selectively extracting components from complex mixtures).
(b) Silentes AIDA-2: Mit fluoreszent markierten festen Trägern, die AIDA an gebundenen Verbindungen enthalten, kann das in 6.1a beschriebene Verfahren mittels zwei Anregungs- und zwei Detektionskanälen angewendet werden. Wenn die Markierung am festen Träger (beispielsweise im Inneren eines Kügelchens) bei 543 nm angeregt und bei 570 nm bis 580 nm detektiert werden kann, kann das Zielmolekül, das auf die Bindung an die AIDA-enthaltende Verbindung am festen Träger getestet wird, bei 632 nm angeregt und zwischen beispielsweise 670 nm und 690 nm detektiert werden. Diese duale Farbanregungs- und Emissionsmethode kann stark die Spezifität der Detektion der Komplexbildung am festen Träger durch Kreuzkorrelation der Emissionssignale der zwei Farbstoffe oder durch das Verfolgen der Coinzidenz der zwei Farben auf der Detektionszeitskala innerhalb des konfokalen Scanningfokus erhöhen.
(c) Einbeziehung der AIDA Fluoreszenz-2: Die Veränderung der molekularen Heiligkeit kann durch chemische Bindung von AIDA an ein zweites auf die Umgebung sensitives Molekül, wie es gewöhnlich in der herkömmlichen Fluoreszenzspektroskopie verwendet wird, erhöht werden, was während der Synthese der Verbindung am festen Träger ausgeführt wird.
(d) Einbeziehung der AIDA Fluoreszenz-3: Wie dies allgemein in (5) beschrieben ist, kann FRET von AIDA an einen geeigneten langwelligen Farbstoff, der hierdurch mittels AIDA UV-Anregung sensibilisiert wird, durch die Veränderung der molekularen Helligkeit bei der Emissionswellenlänge des langwelligen Farbstoffs detektiert werden. Diese Akzeptorsensibilisierung muss durch lichtphysikalische Regeln eine Abschwächung des Donorsignals umfassen. Die Verringerung der spezifischen Helligkeit bei einer Anregungswellenlänge von 351 nm und einer Emissionwellenlänge von 400 nm kann daher auch für die Verfolgung der Bindungsreaktion mit FRET-geeigneten markierten Makromolekülen verwendet werden.
(e) Da die Ladungen in der molekularen Helligkeit eines Moleküls sehr oft mit einer Veränderung der Quantenausbeute verbunden sind, sind alle potenziell möglichen Anwendungen, die Veränderungen in der molekularen Helligkeit verfolgen, auch in einem zeitauflösenden Modus in SMS detektierbar.

(6.2) In homogener Lösung
Im allgemeinen können alle in 6.1 beschriebenen spektroskopischen Einzelmoleküldetektionstechnologien auch in Lösung nach einer Abspaltung des AIDA Konjugats vom festen Träger mit Ausnahme von 6.1-a angewendet werden.
Die Erfindung betrifft daher auch ein Verfahren zur Identifizierung einer Wechselwirkung zwischen einem mit AIDA markierten Molekül und einem Bindungsmolekül in homogener Lösung, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Schritt 1A: Bereitstellung eines AIDA-markierten Moleküls, das aus Formel (IV) ausgewählt ist
Schritt 1B: Mischen des AIDA-markierten Moleküls der Formel (IV) mit einem Bindungsmolekül und dann
Schritt 1C: Selektive Detektion eines Bindungsereignisses mit dem AIDA-markierten Molekül, das in Schritt 1B beschrieben ist, und dem Bindungsmolekül durch Methoden der Fluoreszenzspektroskopie.
Die Methoden der Fluoreszenzspektroskopie sind Messungen der

• Zunahme der Fluoreszenzanisotropie/-polarisation der AIDA Emission in Fluorometern mit Continuous Wave = promptem = Dauerstrichbetrieb
• Erhöhung der rotierenden Korrelationszeit in zeitlich auflösenden Fluoreszenzgeräten
• Erhöhung der Translationsdiffusionszeit in Einzelmolekülfluoreszenzexperimenten, die aus Autokorrelationsberechnungen auf der Zeitachse der Fluoreszenzfluktuationen bestimmt werden
• Erhöhung oder Verringerung der AIDA Fluoreszenzemission im Wellenlängenbereich zwischen 350 nm und 750 nm mit Anregungswellenlängen im Bereich zwischen 300 nm und 400 nm,
• Fluoreszenzresonanzenergietransfer (Donorabschwächung oder Akzeptorsensibilisierung) des angeregten Tryptophans (Donor) im Bindemolekül, das in diesem Fall ein Peptid oder Protein ist, zum AIDA Farbstoff (Akzeptor) im Molekül des Konjugats,
• Fluoreszenzresonanzenergietransfer (Donorabschwächung oder Akzeptorsensibilisierung) des angeregten AIDA Farbstoffs im Konjugatmolekül (Donor) zur Fluoreszenzmarkierung (Akzeptor) des Bindemoleküls, das in diesem Fall jede Verbindungsklasse umfassen kann,

Darüberhinaus betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung einer Wechselwirkung zwischen einem mit AIDA markierten Molekül am festen Träger, der herkömmlich in der organischen Festhasenchemie verwendet wird, und einem Bindemolekül in homogener Lösung, die den festen Träger enthält, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
Schritt 2A: Bereitstellung eines mit AIDA markierten Moleküls als Konjugat der Formel (II oder III),
Schritt 2B: Mischung des mit AIDA markierten Moleküls als Konjugat der Formel (II oder III) mit einem Bindemolekül, und dann
Schritt 2C: Selektive Detektion eines Bindungsereignisses mit dem in Schritt 2B beschriebenen AIDA-markierten Molekül und dem Bindungsmolekül durch Verfahren, die in der Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, unter Bildung eines quantitativen Signals, das ein Mittel zur Identifizierung des an AIDA gebundenen Moleküls mit der höchsten Bindungsaffinität an das Bindungsmolekül bereitstellt,
Schritt 2D: Isolierung des festen Trägers, der das identifizierte, mit AIDA markierte Molekül enthält, das durch die Formel (II oder III) dargestellt wird, und
Schritt 2E: Selektive Detektion eines Bindungsereignisses zwischen dem in Schritt 2D beschriebenen mit AIDA markierten Molekül und dem Bindungsmolekül durch verschiedene Methoden, die in der Fluoreszenzspektroskopie verwendet werden, wie dies in Verfahren 1A–C beschrieben ist.
Die Fluoreszenzspektroskopiemethoden in Schritt 2C sind

• Direkte Detektion der Bindung der Fluoreszenz-markierten Makromoleküle an AIDA enthaltende feste Träger unter Anwendung von konfokalen mikroskopischen und spektroskopischen Techniken
• Messung der Erhöhung der Veränderung in der molekularen Helligkeit durch chemische Bindung von AIDA an ein zweites auf die Umgebung sensitives Molekül, das herkömmlich bei der konventionellen Fluoreszenzspektroskopie verwendet wird, die während der Synthese der Verbindung am festen Träger ausgeführt wird,
• Messung des Fluoreszenzresonanzenergietransfers: Von AIDA auf einen geeigneten langwelligen Farbstoff, der hierdurch mittels AIDA UV-Anregung sensibilisiert wurde, und durch die Veränderung in der molekularen Helligkeit an der Emissionswellenlänge des langwelligen Farbstoffs detektiert wird,
• Messung des Fluoreszenzresonanzenergietransfers: Verringerung der spezifischen Helligkeit von AIDA am Molekül, das an den festen Träger gebunden ist, bei einer Anregung bei Wellenlängen von 351 nm und einer Emission von 400 nm,
• Detektion der Veränderung der Quantenausbeute durch die Messung der Verringerung oder Erhöhung der molekularen Helligkeit durch eine zeitlich auflösende Einzelmolekülspektroskopie.

Positionierung der beschriebenen AIDA Chemie relativ zur bekannten Chemie und Photophysik der Indazole
Die Erfindung betrifft Fluoreszenzfarbstoffe, die durch funktionalisierte 1,3-Diaryl-1H-indazole (AIDA) dargestellt werden. Die vorliegende Erfindung erlaubt die Synthese von kombinatorischen Verbindungsbänken mit einer inhärenten Fluoreszenzmarkierung am festen Träger und in Lösung. Solche Markierungen sind starke Werkzeuge zur Detektion von Bindungsereignissen von synthetisierten Liganden für Biomoleküle. Die Bindungsereignisse zwischen synthetisierten Molekülen und biologischen Zielen können durch spektroskopische Verfahren gemessen werden, wie es im vorherigen Abschnitt beschrieben wurde. Diese Experimente können mit Farbstoffkonjugaten ausgeführt werden, die auf einem festen Träger immobilisiert oder in Lösung vorliegen.
Die in der Erfindung beschriebenen Moleküle erfüllen mehrere chemische und spektroskopische Erfordernisse zur Verwendung in den beschriebenen Anwendungen. Die Ausgangsverbindung der beschriebenen auf Indazol basierenden Farbstoffe, nämlich 1H-Indazol, ist ein fluoreszierendes Molekül mit einem Absorptionsmaximum bei 294 nm und einem Fluoreszenzemissionsmaximum bei 298 nm (beide Werte in Acetonitril, S. K. Saha und S. K. L. Dogra, Photochem. Photobiol., A (1997), 110 257–266). Diese spektroskopischen Eigenschaften erfüllen nicht die Anforderungen, die ein Farbstoff zur Verwendung in den oben beschriebenen Anwendungen hat. Nur wenn der Indazolchromophor durch eine geeignete Substitution mit Arylsubstituenten ausgedehnt wird (die zusätzlich funktionelle Gruppen für die synthetischen Anwendungen der Farbstoffe tragen, die als solche auch zur weiteren Ausdehnung der Konjugation beitragen) können die erforderlichen bathochromen Verschiebungen des Absorptionsmaximums wie auch des Fluoreszenzemissionsmaximums erreicht werden, um die in den späteren Abschnitten beschriebenen Anwendungen bereitzustellen. Die erwähnten synthetischen Modifikationen des Ausgangsheterocyclus etablieren die spezielle Überlappung der Absorption der 1,3-Diaryl-1H-indazole (Absorptionsmaxima 326 nm bis 361 nm jeweils für die Verbindungen 4a–l, 8 und 11) mit der Emission des Tryptophans. Nicht alle Modifikationen in Bezug auf die Erweiterung des Chromophors des Indazols sind nützlich: Die zusätzliche Erweiterung des Fluorophors, das durch die 1,3-Diaryl-1H-indazole dargestellt wird, mit einem zusätzlichen annelierten Benzolring am Heterocyclus erfüllt die spektralen Anforderungen. Das Absorptionsspektrum von 4-(3-Phenylbenzo[g]indazol-1-yl)benzoesäure verändert sich in ein Spektrum vom Naphthalintyp und die Fluoreszenzemission wird dramatisch verringert.
Die 1,3-Aryl-1H-indazole zeigen Stokes-Verschiebungen im Bereich von 60 bis 200 nm in Abhängigkeit des Substitutionsmusters und sind durch ein sehr breites Emissionsband gekennzeichnet. Die Emissionsmaxima liegen im Bereich von 364 bis 439 nm jeweils für die Derivate 4a–e, 4g–h, 8 und 11 und 524 nm bis 565 nm jeweils für die Derivate 4f und 4i–l, was die breiten Möglichkeiten für die Einstellung der lichtphysikalischen Eigenschaften einer solchen substituierten 1,3-Diaryl-1H-indazolstruktur zeigt. Eine detaillierte spektroskopische Charakterisierung eines repräsentativen AIDA Derivats (4e, 1, Struktur: Schema 1) ist in Beispiel 1A beschrieben. Die spektroskopische Variabilität erlaubt das spezifische Design der Wechselwirkungs- oder Bindungstests mit markierten oder unmarkierten Zielmakromolekülen in Lösung und am festen Träger. Die Variabilität in den spektroskopischen Eigenschaften, die einen ungewöhnlich breiten Bereich an Fluoreszenzemissionswellenlängen mit einer Absorptionswellenlänge in der Lückenregion zwischen der natürlichen Proteinfluoreszenz und herkömmlichen in der Fluoreszenzspektroskopie für HTS verwendeten Farbstoffen abdeckt, erlaubt eine einzigartige Kombination der Testtechnologie, nämlich (a) ein schnelles und effizientes Screenen auf Bindemoleküle am festen Träger (silenter AIDA Farbstoff, der keine Fluoreszenz zeigt) und (b) eine unmittelbare Bestätigung der identifizierten wirksamen Trefferverbindungen nach einer Abspaltung vom Träger durch unterschiedliche mögliche Anwendungen der AIDA Fluoreszenz.
Ein Aspekt der Erfindung, wie er in den Beispielen 2A und 3A später gezeigt wird, beschreibt die Verfahren, die verwendet werden, um eine Bindung eines Proteins (Avidin) an dessen Liganden (Biotin) zu zeigen, der mit einem Farbstoffmolekül der Erfindung konjugiert ist.
Das Konjugat 11 wird verwendet, um die Bindung des Konjugats 11 an Avidin durch die Veränderung des Anisotropiewerts des freien Konjugats nach einer Bindung an das Protein zu zeigen (Beispiel 2A). Die feste Bindung des AIDA-Biotinkonjugats 11 an Avidin wird auch durch FRET von Tryptophanen, die in Avidin enthalten sind, an den AIDA Farbstoff und vom AIDA Farbstoff an die BODIPY Markierung an Avidin bestätigt.
Das Konjugat 8 wird auf festen Träger (Beispiel 3B(a)) synthetisiert. Das Emissionsspektrum des immobilisierten Konjugats 8 ähnelt dem in Lösung. Das AIDA-Konjugat 8 wird vom Harz abgespalten und der FRET von Tryptophan auf Avidin, wie auch von AIDA auf BODIPY an Avidin wird gezeigt (Beispiel 3A). Der Energietransfer zwischen dem AIDA Rest im Konjugat 8 und der BODIPY Fluoreszenzmarkierung an Avidin wird ebenfalls durch eine zeitauflösende Fluoreszenzspektroskopie untersucht.
Die Beispiele 2A und 3A stellen beispielhaft die Verwendung der AIDA Farbstoffe dar, um die Bindungsereignisse zwischen AIDA Konjugaten (8, 11) und unmarkierten oder markierten Biomolekülen (Avidin, Avidin-BODIPY-FL) anzuzeigen.
Hierzu werden 1,3-Diaryl-substituierte 1H-indazole (4a–q, 5, 6, Beispiele 1B und 2B, Schemata 1 und 2) synthetisiert, die aufweisen (1) eine funktionelle Gruppe zur (a) Bindung des Farbstoffs an einen festen Träger, der vorher mit einem abspaltbaren Linker versehen wurde oder (b) Markierung einer Verbindungsbank durch die Abschlussreaktion mit einem geeigneten AIDA-Derivat und (2) eine zusätzliche funktionelle Gruppe zur Konjugation mit dem Liganden. Die letztere Funktionalität wird als Teil eines (variablen) Spacerelements präsentiert, das zwischen dem Farbstoff und dem Liganden eingebaut ist. Der Spacer selbst ist kovalent an den Farbstoff durch eine Amidbindung gebunden. Unter den vielen bekannten Möglichkeiten zur Synthese des Indazolheterocyclus (Zusammenfassung siehe: R. C. Elderfield in "Heterocyclic Compounds", Herausgeber R. C. Elderfield, Band 5, John Wiley & Sons., Inc. New York, 1957, Seite 162) und spezifischer 1,3-Diaryl-1H-indazole ermöglichen die von Gladstone et al. beschriebenen Verfahren (W. A. F. Gladstone und R. O. C. Norman, J. Chem. Soc. (1965), 3048–3052, W. A. F. Gladstone und R. O. C. Norman, J. Chem. Soc. (1965), 5177–5182, W. A. F. Gladstone et al. J. Chem Soc. (1966), 1781–1784) einen effizienten Zugang zu den gewünschten Verbindungen. Die Synthese beginnt mit den substituierten Benzophenonen. Eine der aromatischen Substituenten des Ketons wird schließlich in das Indazolskelett eingebaut, während der zweite als Quelle für den funktionalisierten 3-Arylsubstituenten des Indazols dient. Die Benzophenonderivate werden zuerst zu Arylhydrazonen durch die Umsetzung mit substituierten Arylhydrazinen umgewandelt. Die letzteren sind die Quelle für die funktionelle Gruppe, die am 1-Arylsubstituenten des schließlichen, funktionalisierten 1,3-Diarylindazols gebunden ist. Die Ben zophenonarylhydrazone werden zu Essigsäure-1-(arylazo)-1,1-diarylmethylestern durch die Oxidation mit Bleitetraacetat nach einem Verfahren umgesetzt, das zuerst von Iffland beschrieben wurde (D. C. Iffland et al. (1961), J. Am. Chem. Soc. 83, 747). Die Arylazoacetate machen einen Ringschluss zu Indazolheterocyclen nach einer Behandlung mit Lewis-Säuren durch. Die Reaktion läuft über ein Zwischenprodukt 1-Aza-2-azoniaallen (Q. Wang et al. Synthesis (1992), 7, 710–718) und ist hoch regioselektiv für die geminalen Arylsubstituenten der Arylazoacetate, die um den Ringschluss konkurrieren. Die Cyclisierung tritt nicht bei aromatischen Ringen auf, die starke elektronenziehende Substituenten aufweisen, wie jeweils Carboxyl-, Ester-, Amid- oder Nitrogruppen. Die Substitution der Arylringe, entweder in Position 1 oder Position 3 des Indazols durch einen Nitrosubstituenten verursacht eine bathochrome Verschiebung des Emissionsmaximums von etwa 150 nm im Vergleich zu den anderen untersuchten Substitutionsmustern (Tabelle 1). Die durch Nitro induzierte Rotverschiebung der Emission der AIDA Derivate erweitert die oben beschriebenen spektroskopischen Anwendungen. Dasselbe gilt für eine Nitrogruppe, die direkt am Kern des Heterocyclus gebunden ist, aber solche Indazolderivate sind durch die diskutierte Gladston-Indazolsynthese wegen der oben angegebenen Gründe nicht zugänglich. 5-Nitro-substituierte, funktionalisierte 1,3-Diaryl-1H-indazole können durch eine sorgfältige Nitrierung eines entsprechenden Indazols synthetisiert werden, wie dies in Beispiel 1B(b) dargestellt ist. Funktionalisierte 1,3-diarylsubstituierte Indazole können auch auf einem festen Träger ausgehend von immobilisierten Arylhydrazonen der geeigneten Benzophenonderivate immobilisiert werden (B. Yan und H. Gstach, Tetrahedron Lett. (1996), 37 (46), 8325–8328).
Genauer gesagt beschreibt Beispiel 3B(a) das Prinzip der Festphasensynthese von Fluoreszenzkonjugaten, wie sie durch die Formeln (II) und (IV) dargestellt werden. Der einen Spacer tragende AIDA Farbstoff (beschrieben in Beispiel 2B(b)) wird zuerst an einen Linker an einen festen Träger gebunden, wonach die Kupplung des Liganden und eine anschließende Abspaltung des AIDA-Ligandenkonjugats (8) folgt.
Die AIDA Konjugate, wie sie in Formel (IV) dargestellt werden, können auch in Lösung synthetisiert werden, wie dies in Beispiel 4B(a–c) gezeigt wird. Die synthetisierten Verbindungen 8 und 9 unterscheiden sich nicht nur in der Art des für die Kupplung des Liganden (Biotin) an den AIDA Farbstoff eingeführten Spacers (4e), sondern auch in Bezug auf die Arylsubstituenten des Indazols. Das Konjugat an Biotin wird über den 1-Arylsubstituenten in Derivat 8 aufgebaut, während der Ligand in Derivat 11 am 3-Arylsubstituenten präsentiert wird. Beide Geometrien können zur Detektion der Bindungsereignisse verwendet werden (Pseudosymmetrie der AIDA Farbstoffe). Das Prinzip der Synthese von Verbindungsbänken an Fluoreszenzkonjugaten, wie sie durch die Formeln (III) und (IV) dargestellt werden, sind in den Beispielen 5B und 7B beschrieben. Der AIDA Farbstoff (4c) wird in den letzten Schritt einer Reaktionssequenz eingeführt, wonach eine Spaltung jeweils der AIDA Ligandenkonjugate 12a–j und 14 erfolgt.
Die Synthese einer Verbindungssammlung an Sulfonamiden, die mit dem AIDA Farbstoff konjugiert sind (13a–d) werden durch die Formeln (II) und (IV) dargestellt, wie dies in Beispiel 6B beschrieben ist.
Experimentelle Protokolle
Teil A: Spektroskopie
Allgemeines
Reagenzien und Proteine: 10 mM und 5 μM Stammlösungen der Verbindungen 4e, 9 und 11 werden in THF (4e) oder DMSO hergestellt und bei 4°C gelagert. Avidin und Avidinkonjugate werden von Molecular Probes (Eugene, Oregon) bezogen: A-2767, unmarkiert, A-883, Lucifer Yellow (LY), A-2641, BODIPY FL.
200 μM Stammlösungen werden in PBS, 0,01% NaN₃ oder 0,1 M NaHCO₃ pH = 8,3 (A-2641) hergestellt und bei –20°C gelagert. Die Konzentrationen werden gravimetrisch bestimmt, wobei man ein Molekulargewicht von 67 000 für Avidin und Konjugate annimmt. Aus Löslichkeitsgründen wird die Verbindung 4e spektroskopisch in THF charakterisiert. Alle Komplexierungsreaktionen und Fluoreszenzresonanzenergietransfermessungen werden in PBS/5% DMSO bei 25°C ausgeführt, falls nichts anderes angegeben ist.
UV-VIS Spektroskopie:
Die UV-VIS Absorptionsspektrometrie wird auf einem Cary 1E Spektrophotometer ausgeführt. Das Absorptionsspektrum der Verbindung 4e wird in THF detektiert.
Die Bestimmung des Extinktionskoeffizienten (ε) der Verbindung 4e erfolgt am Absorptionsmaximum bei 337 nm:
Es werden drei unterschiedliche Mengen der Proben (E1 = 5,751 mg, E2 = 7,933 mg, E3 = 10,933 mg) in Tetrahydrofuran (THF für UV Spektroskopie, Fluka) auf ein Endvolumen von 25 ml gelöst. Dies führt zu Konzentrationen von 577,5 μM, 796,6 μM und 1,0979 mM jeweils für E1, E2 und E3. Aus jeder Stammlösung werden 5 Verdünnungen mit Konzentrationen von 2,5 μM, 10 μM, 17 μM, 25 μM und 35 μM hergestellt. Die UV Spektren jeder Verdünnung werden von 200 bis 400 nm mittels einer Quartzküvette mit einer Schichtdicke von 1 cm aufgezeichnet. Der Extinktionskoeffizient ε bei 337 nm wird durch die Steigung der linearen Regression angegeben.
Statische Fluoreszenzspektroskopie:
Es werden statische Fluoreszenzmessungen auf einem SLM 8000C Spektrofluorometer ausgeführt, das mit JD-490 Photomultiplier und einer 450 W Xenonbogenlampe ausgestattet ist (SLM Instruments, Urbana, IL).
Statische Fluoreszenzspektroskopie der Verbindung 4e:
Die statischen Fluoreszenzmessungen werden in Tetrahydrofuran (THF) bei einer Probenkonzentration von 1 μM ausgeführt. Die Spektralbandbreiten werden für die Anregung und Emission jeweils auf 1 und 4 nm eingestellt. Die Spektren werden in einem Einzelphotonenzählmodus aufgezeichnet. Die Veränderungen in der Lampenintensität werden mit einem Quantenzähler im Referenzkanal korrigiert, der in einem langsamen Modus gemessen wird. Die Verstärkung wird auf × 100 mit einer Hochspannung (HV) von 640 V eingestellt. Die Integrationszeit beträgt 2 Sekunden. Zur Messung der Anregungsspektren wird die Emissionswellenlänge auf 397 nm eingestellt und die Probe wird von 200 nm bis 400 nm angeregt. Zur Aufzeichnung der Emissionsspektren wird die Probe bei 342 nm angeregt und die Emission wird von 350 nm bis 540 nm aufgezeichnet. Die Daten werden über zwei Scans gemittelt.
Quantenausbeutebestimmung der Verbindung 4e [Demas und Cosby, 1971, Chen et al., 1972]:
Die Quantenausbeute der Verbindung 4e wird mittels Chininsulfat als Standard bestimmt [Melhuish, 1961].
Der Kreuzungspunkt zwischen den UV Spektren der Verbindung 4e und Chininsulfat (CS) wird durch Messungen einer Lösung der zwei Substanzen auf einem Cary 1E Spektrophotometer bestimmt. Die Konzentrationen betragen 25 μM in THF für die Verbindung 4e und 50 mM in 1 N H₂SO₄ für CS. Die Spektren werden von 260 nm bis 380 nm mittels einer Quartzküvette mit einer optischen Schichtdicke von 10 mm bestimmt und der Nullwert wird durch die Substraktion der Lösemittelabsorption korrigiert. Der Kreuzungspunkt der zwei resultierenden UV Spektren wird mit 348,3 nm bestimmt, was 352,8 nm auf dem SLM-8000 C Fluorometer aufgrund von Monochromatorverschiebungen entspricht. Die Fluoreszenzemissionsspektren der Verbindung 4e und CS werden mittels derselben Lösungen wie für die UV Messungen in Einzelphotonenzählmodus aufgezeichnet. Die Lampenintensitätsveränderungen werden mit einem Quantenzähler im Referenzkanal bestimmt, der im langsamen Modus gemessen wird. Die Verstärkung wird auf × 100 eingestellt und die verwendete Hochspannung beträgt 830 V. Die Integrationszeit beträgt 0,5 Sekunden.
Die Spektralbandbreiten werden auf 1 nm für die Anregung, 2 nm und 4 nm für die Emission eingestellt. Zur Aufzeichnung der Emissionsspektren wird die Anregung auf 352,8 nm eingestellt und die Emission wird von 360 nm bis 550 nm für IAE und 360 nm bis 650 nm für CS aufgezeichnet.
Berechnung von R₀ (Förster Abstand) zwischen Verbindung 4e und N-Acetyltryptophanamid (NATA):
Zur Berechnung von R₀ zwischen der Verbindung 4e (Akzeptor) und NATA (Donor) werden das Emissionspektrum von NATA und das Absorptionsspektrum der Verbindung 4e zur Bestimmung der Überlappungsregion zwischen 300 nm und 380 nm verwendet. Das Emissionsspektrum von NATA wird bei einer Konzentration von 15 μM in THF mittels einer 750 μl Quartzküvette mit einer optimalen Schichtdicke von 10 mm gemessen. Der Messmodus ist die Einzelphotonenzählung. Die Veränderungen in der Lampenintensität werden mittels eines Quantumzählers im Referenzkanal korrigiert. Die Verstärkung wird auf × 100 eingestellt, die verwendete Hochspannung beträgt 640 V und die Integrationszeit beträgt 2 Sekunden. Die Fluoreszenzemission wird um eine photometrische Genauigkeit des Systems durch die Multiplikation mit Korrelationsfaktoren korrigiert, die durch eine Standardlampenkalibrierung erhalten wurden. Die Spaltbreiten werden jeweils auf 1 nm und 4 nm für die Anregung und Emission eingestellt. Die Probe wird bei 293 nm angeregt und die Emission wird von 300 bis 480 nm aufgezeichnet.
R₀ wird mittels der folgenden Formel berechnet: R0 = (9,97 × 103)(Jκ2η–4ΘNATA)1/6 Åworin κ² ein Orientierungsfaktor der relativen Orientierung im Raum der Übergangsdipole der Donor- und Akzeptorchromophoren ist. Für die Donor-Akzetorpaare, die eine isotrope Rotation auf der Zeitachse der Fluoreszenzlebensdauer aufweisen, kann ein Wert von 2/3 verwendet werden [Chen, 1972].
η steht für den Brechungsindex des Lösemittels, in diesem Fall THF mit einem Wert von 1,4064. Θ_NATA steht für die Quantenausbeute des Donors, der aus der Literatur mit 0,12 bis 0,14 entnommen wird [Szabo & Rainer, 1980, Petrich et al., 1983].
J steht für das spektrale Überlappungsintegral, das angenähert werden kann mittels J = SFNATA(λ)ε4e(λ)λ4Δλ (2)worin F_NATA für die korrigierte Fluoreszenzemission des Donors steht, die Summe zu einer Einheit normalisiert wird, ε_4e für den Extinktionskoeffizienten des Akzeptors bei einer Wellenlänge λ steht und DS für den inkrementellen Detektionsbereich steht.
FRET Messungen:
Die spektralen Bandbreiten werden zur Anregung und Emission jeweils auf 8 nm und 16 nm eingestellt. Die Messungen werden bei 25°C in einer 750 μl Quartzküvette (10 mm Schichtdicke) ohne Rühren nach dem anfänglichen Mischen ausgeführt. Eine Konzentration von 50 nM der Verbindung 9 oder 11 wird zur Komplexierung mit 1 μM (fluoreszierendem) Avidin verwendet. Mit einer Dissoziationskonstante im Bereich von 10^–15 M, wie dies für Avidin-Biotin-Wechselwirkungen normal ist, wird eine vollständige Sättigung der mit Biotin markierten Plattform erreicht. Alle Titrationen werden in einer magic Winkeleinstellung ausgeführt, wobei die Emissionswellenlänge in Experimenten auf 500 nm eingestellt wird, worin das Indazol der Akzeptor ist und das Emissionsspektrum wird von 250 nm bis 360 nm aufgezeichnet. Bei Experimenten, bei denen das Indazol als Donor verwendet wird, und Lucifer Yellow oder BODIPY FL der Akzeptor ist, wird die Anregungswellenlänge auf 338 nm oder 325 nm eingestellt. Die Fluoreszenzemission wird zwischen 360 nm und 700 nm gesammelt. Die Spektren werden um die Ramanbrechung aus der PBS Lösung, die Verdünnung und um innere Filtereffekte aufgrund Proteinanlagerungen korrigiert. Das Signal wird auf die Lampenintensitätsveränderungen durch eine Verhältnismodusdetektion mit einem Rhodamin B Quantumzähler im Referenzkanal eingestellt. Ein WG 360 Emissionsblockierungsfilter wird zur Verringerung des Streulichts verwendet. Die Daten werden in 2 nm Stufen mit einer Integrationszeit von 1 Sekunde gewonnen.
Fluoreszenzanisotropiemessungen:
Die Fluoreszenzanisotropie wird gemäß [Lakowicz, 1983] berechnet. Die spektralen Bandbreiten werden für die Anregung und Emission jeweils auf 4 nm und 8 nm mit einer Integrationszeit von 5 Sekunden eingestellt. Zur Berechnung der Fluoreszenzanisotropie werden 10 Datenpunkte gemittelt.
Zeitauflösende Fluoreszenzspektroskopie im Pikosekundenbereich
Im Pikosekundenbereich auflösende Fluoreszenzmessungen werden gemäß der Einzelphotonenzählungstechnik aufgezeichnet [Lakowitz, 1983, Seiten 52–93, 112–153, 156–185]. Ein Ar⁺-getriebener Ti:Saphir Laser (Modell MIRA 900, Coherent, Santa Clara, USA) liefert unter Mode-locked Bedingungen ultrakurze Pulse (FWHM = 150 fs) mit einer Frequenz von 75 MHz. Um die Repetitionsrate auf 4,7 MHz zu verringern wird ein Puls Picker (Modell 9200, Coherent, Santa Clara, USA) in den Strahl eingebracht. Der Strahl wird dann gespalten, um einerseits eine schnelle Photodiode anzusprechen, die nach der Diskriminierung (Ortec Pico-timing Discrimiator 9307, Oak Ridge, USA) das Stopsignal für die SPC Messungen (reverser Modus) ergibt, und um andererseits die Probe anzuregen. Die Anregungswellenlänge von 360 nm wird erhalten, indem man zuerst manuell den MIRA 900 auf 720 nm einstellt und dann die Frequenz des Strahls mit dem ultraschnellen Harmonic Generation System 5-050 (Inrad, Northvale, USA) verdoppelt. Die Anregungsstärke reicht von 0,1 bis 0,3 mW, wobei die volle Breite beim halben Maximum der Instrumentenansprechfunktion 70 bis 80 ps beträgt. Die Fluoreszenzphotonen werden in einem Spex 1681 Single Grating Monochromator (Spex, Edison, USA) gesammelt und mit der Hamamatsu R3809U Mikrokanalplatte detektiert (Hamamatsu, Shimokanzo, Japan). Das so erhaltene Startsignal wird vorverstärkt (Vorverstärker 9306, Ortec, Oak Ridge, USA) und diskriminiert (Diskriminator 9307, Ortec, Oak Ridge, USA) bevor der Spannungsanstieg im Zeit-zu-Amplitiuden-Umwandler gestartet wird, der im reversen SPC Modus durch das nächste Signal der Photodiode gestoppt wird. Die Spannungswerte, die der Zeit entsprechen, die zwischen der Anregung und der Emission eines Fluoreszenzphotons in einem einzelnen Experiment vergangen ist, werden im Spektrum Master 921 (Ortec, Oak Ridge, USA) gespeichert, der an das Mehrkanalemulationsprogramm Maestro (Ortec, Oak Ridge, USA) angeschlossen ist. Die SPC Daten werden iterativ mit dem FLA900 Programm von Edinburgh Instruments (Edinburgh, UK) gemäß dem multiexponentiellen Modell aufgerollt wird F(t) = A + Σbiexp(–(t + δt)/τi)worin A für das Hintergrundrauschen des Experiments steht, b_i für die präexponentiellen Werte der entsprechenden Fluoreszenzlebensdauer τ_i steht und δt für einen wahlweisen, temporären Verschiebungsausdruck steht, um die Verschiebungen der Gerätereaktion zu kompensieren. Die relativen Amplituden B_i werden durch Berechnung erhalten Bi = [(biτi)/Σ(biτi)] × 100 (%)
Der zeitaufgelöste Zerfall der Verbindung 4e wird mit einer Konzentration von 25 μM in THF bestimmt. Die Anregung reicht von 350 nm bis 380 nm, wobei die Fluoreszenzemission bei 400 nm detektiert wird, wobei die Spaltbreiten auf 0,5 nm eingestellt sind. Die mittlere Breite beim halben Maximum des Laserpulses beträgt 130 fsec, die des Anregungspulses 65 psec. Maximal werden 15 000 Zählungen gesammelt.
Beispiel 1A
Detaillierte, spektroskopische Charakterisierung des ausgewählten Beispiels 4-[3-(4-Allyloxycarbonylphenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäure (4e):
Das AIDA Derivat 4e zeigt ein Absorptionsmaximum bei 342 nm und eine maximale Emissionsintensität bei 403 nm. Die Verbindung weist eine starke Stokeverschiebung von etwa 60 nm auf und liegt energetisch idealerweise zwischen der Emission der Tryptophane in den meisten makromolekularen Umgebungen und vielen Fluorophoren, die im Handel erhältlich sind und als Tracer in der Biochemie verwendet werden (1–2). Die fast perfekte Überlappung zwischen der Absorption und der Fluoreszenzanregungsspektren legt eine geringe Wahrscheinlichkeit für photochemische und photophysikalische Effekte im angeregten Zustand nahe. Der Absorptionskoeffizient ε beträgt bei 337 nm 29926 M^–1cm^–1, das etwa 50% unter dem von Fluorescein- oder Rhodaminderivaten liegt, aber hoch genug ist, um als Akzeptor in FRET Messungen im nanomolaren Konzentrationsbereich zu dienen. Die Quantenausbeute der Verbindung 4e, Q_4e, beträgt 0,591. Im Vergleich zu Tryptophan (~0,1) oder Fluorescein (in organischen Lösemitteln ~0,9, an Proteine oder RNA gebunden ~0,2–0,4) ist dies für eine kleine Verbindung, wie 4e, eine überraschend hohe Quantenausbeute, die gute Fluoreszenzdonoreigenschaften nahe legt.
Förster-Abstand zu NATA:
R₀ wird als Abstand definiert, bei der die Transferrate (k_T) gleich der Zerfallsrate des Donors in Abwesenheit des Akzeptors ist. Bei diesem Abstand zerfällt die Hälfte der Donormoleküle durch den Energietransfer und eine Hälfte durch die gewöhnlichen bestrahlenden und nicht-bestrahlenden Prozesse. Daher kann R₀ verwendet werden, um zu überprüfen, ob die von der Indazolplattform abgeleiteten Moleküle als Donor oder Akzeptor in Energietransferexperimenten in einer gewöhnlichen Situation von Abständen in Protein-Liganden-Wechselwirkungen verwendet werden können.
Der R₀ Wert des Farbstoffpaars 4e und NATA liegt zwischen 25,2 und 26,3 Å. Bei mittleren Linkerabständen zwischen 4 und 10 Å, die den Fluoreszenzindazoltracer vom potentiellen Inhibitor trennen, ist es sehr wahrscheinlich, dass ein Tryptophan in einer Substratbindungsstelle innerhalb von weiteren 15–20 Å vorkommt. Andererseits kann die Markierungshäufigkeit für externe Tracer angepasst werden, um zumindest 1 Markierungsmolekül innerhalb von 20 Å der Ligandenbindungsstelle zu erhalten.
Das AIDA Derivat 4e zeigt einen monoexponentiellen Zerfall mit einer Fluoreszenzlebenszeit λ₁ von 1,055 ± 0,117 nsec mit einer relativen Amplitude von 99,73%.
Schlussfolgerung: Die Verbindung 4e ist photophysikalisch und photochemisch stabil mit vielversprechenden spektroskopischen Eigenschaften als Fluoreszenzlinkermolekül zur Detektion der Ligandenbindung an Zielproteine.
Beispiel 2A:
Detektion der Bindung des AIDA-Biotinkonjugats Triethylammonium-(2-[4-[3-(4-Allyloxycarbonylphenyl)-1H-indazol-1-yl-benzoylamino]-6-((+)-biotinoylamino)hexanoat (11) an Avidin
Mit einer K_d von 1,3 × 10^–15 M bei pH 5 zeigt der Avidin-Biotin-Komplex einen der stabilsten bekannten biomolekularen Wechselwirkungen. Beide Komponenten sind ausgiebig charakterisiert. Um die Eigenschaften von AIDA Farbstoffen als Reporter oder Detektor der Wechselwirkungen mit einer Proteinbindungsstelle zu untersuchen, stellt Biotin daher einen idealen Liganden dar, um einen potentiellen Inhibitor nachzuahmen. Die Bindungsstelle für Biotin in Avidin umfasst 4 Tryptophane. Zwei hiervon, das Tryptophan 70 und 97, liegen innerhalb von 5 Å vom Biotin entfernt in der Bindetasche. Tryptophan 10 befindet sich in einem Abstand von 12 Å vom Biotin, Tryptophan 110 in einem Abstand von 20 Å. Die Verbindung 11 wird auf ihre Eigenschaften in PBS Puffer und auf die Überlappung mit der Fluoreszenz von Tryptophan, Lucifer Yellow und BODIPY-FL in Avidin evaluiert (2b, 2e, 2h).
2b: Die Anregungs- und Emissionsspektren der Verbindung 11 und von Avidin zeigen die Überlappung zwischen der Tryptophanemission und den Anregungsspektren der Verbindung 11.
Das AIDA Derivat 11 hat ein sehr breites Fluoreszenzemissionsband mit etwa 50% der Emissionsintensität bei 500 nm. Die spektrale Überlappung zwischen der Tryptophanemission in Avidin und der Absorption der Verbindung 11 ist nahezu perfekt.
2e: Spektrale Überlappung der Verbindung 11 mit Lucifer Yellow markiertem Avidin.
Lucifer Yellow wird als möglicher Akzeptor für die Indazole aufgrund der Absorption zwischen 400 und 500 nm ausgewählt. Die Überlappung mit dem Emissionsspektrum der Verbindung 11 in Wasser ist nahezu quantitativ.
BODIPY FL absorbiert zwischen 480 nm und 500 nm mit einem etwa zehnfach höheren Extinktionskoeffizienten als Lucifer Yellow. Es kann als Überprüfung für die relative Wichtigkeit des Ausmaßes des Überlappungsintegrals in Bezug auf ε verwendet werden.
Schlussfolgerung: Das spektrale Überlappungsintegral zwischen Donor-(Tryptophan) und Akzeptor-(Lucifer Yellow, BODIPY FL)Markierungen in Avidin und dem fluoreszierenden AIDA Molekül zeigt die ideale energetische Position des Indazols für Interaktionsstudien. Es bleibt daher nur eine Frage des Abstands und der nicht-bestrahlenden Dezimierungsbedingungen, ob ein effizienter Energietransfer stattfindet oder nicht.
AIDA Konjugat 11 – Avidinkomplexe
(a) Fluoreszenzanisotropie der Verbindung 11 als Signal für die Biotinbindung an Avidin im Modellsystem
Das AIDA Konjugat 11 hat bei einer Konzentration von 50 nM eine Grundfluoreszenzanisotropie von 0,034, wenn es bei der Anregungswellenlänge von 338 nm und dem Emissionsmaximum von 438 nm verfolgt wird. Dieser Wert zeigt ein kleines, monomeres Molekül an, das in Lösung frei rotiert. Wenn es an Avidin gebunden ist, das im Überschuss von 1 μM zugegeben wird, beträgt der Anisotropiewert 0,151 (+444%), was die Fixierung des an das Biotin gebundenen Indazolrests an oder nahe der Bindungsstelle von Avidin darstellt. Wenn 1 μM BODIPY-FL markiertes Avidin als Substrat verwendet wird, beträgt der r-Wert 0,100. Diese verringerte Veränderung der Anisotropie spiegelt wahrscheinlich die geringere Affinität des BODIPY-FL markierten Avidins im Vergleich zum unmarkierten Material wider.
(b) Resonanzenergietransferexperimente mit der Verbindung 11 als Donor oder Akzeptor.
Die 3a zeigt die Fluoreszenzanregungsspektren von 50 nM der Verbindung 11 und 1 μM an unmarkiertem Avidin. Eine Emissionswellenlänge bei 480 nm wird ausgewählt, da die Tryptophanfluoreszenz von Avidin fast die Basislinie bei dieser Emissionsenergie erreicht hat, was nur zu einer geringen Avidin-Fluoreszenzbeteiligung zwischen 250 nm und 370 nm führt. Das Differenzspektrum [I(11_(frei)) + I(Avidin_(frei))] – I(11-Avidin_Komplex) in 3a Kurve 5 zeigt, dass die Fluoreszenz der Verbindung 11 um etwa 25,5% durch die Komplexierung der Avidinbindungsstelle abgeschwächt wird. Dieser Abschwächungseffekt kann allen bestrahlenden und nicht-bestrahlenden Prozessen zugeschrieben werden, die in der Verbindung 11 in der Nähe des Tryptophans der Bindungsstelle auftreten. Dem Verhältnis von negativen und positiven Flächen unter der Fluoreszenzdifferenzkurve (schwarz) entsprechend, kommen 62% dieses gesamten Abschwächungseffekts vom Fluoreszenzresonanzenergietransfer. Von 250 nm bis 305 nm beträgt die Steigerung der Tryptophan- und Tyrosinfluoreszenzintensität 72% auf der Grundlage der Summe der Verbindung 11 und Avidin.
Schlussfolgerung: Wenn die Verbindung 11 als Akzeptor verwendet wird und die Proteinfluoreszenz in Avidin als Donor verwendet wird, kann sowohl ein Energietransfer als auch ein abschwächender Effekt auf die Verbindung 11 als Signal für die Komplexbildung verwendet werden.
Die 3c zeigt das Fluoreszenzemissionsspektrum von 50 nM der Verbindung 11, 1 μM Avidin-BODIPY-FL, die des Komplexes und die relevanten Differenzspektren. In diesen Experimenten wird die Verbindung 11 als Donor und BODIPY-FL als Akzeptor verwendet. Bei einer Anregungswellenlänge von 338 nm wird die Emission der Verbindung 11 zwischen 360 nm und 516 nm stark um etwa 80% in der komplexierten Form abgeschwächt. Die Standarddefinition für die Energietransfereffizienz E = 1 – F_da/F_d würde zu E ~ 0,8 führen. Für intermolekulare FRET Messungen oder für intramolekulare FRET Bestimmungen, bei denen eine zweite Komponente potentielle Konformationsänderungen in den Bindungsstellen umfasst, ist diese klassische Definition für E nicht gültig. Die Verringerung der Signalintensität um etwa 80% der Verbindung 11 kann entweder durch FRET oder von einer lokalen Abschwächung der Fluoreszenz der Verbindung 11 hauptsächlich durch Grundzustandswechselwirkungen verursacht werden. Jedoch legt eine kleine Steigerung der BODIPY-FL Fluoreszenzintensität zwischen 500 nm und 600 nm, bei der ein Energietransfer sichtbar wird, eine Grundzustandskomplexierung als Hauptursache für den abschwächenden Effekt nahe. Jedoch kann es nicht ausgeschlossen werden, dass die BODIPY-FL Markierung ihre Anregungsenergie durch nicht-bestrahlende Zerfallsprozesse verliert, obwohl die meiste Emissionsenergie der Verbindung 11 durch BODIPY-FL absorbiert wird. Der Extinktionskoeffizient von etwa 90 000 M^–1cm^–1 bestimmt, dass der abschwächende Effekt von fast 80% auf die Verbindung 11 zwischen 360 nm und 516 nm ein extrem effizientes Signal für die Biotinwechselwirkung mit Avidin ist, das durch die Verbindung 11 bei Wellenlängen zwischen 440 nm und 500 nm aufgezeichnet wird. Aufgrund der breiten Fluoreszenzemission der Verbindung 11 in Wasser kann die Detektionswellenlänge um bis zu 500 nm verschoben werden, die bei einer geringeren Energie stattfindet, als die meisten Hintergrundfluoreszenzsignale aus kleinen chemischen Verbindungen.
Schlussfolgerung:

1. Die Fluoreszenzanisotropie/Polarisation erlaubt die Verfolgung der Komplexbildung mit hoher Empfindlichkeit. Basierend auf der photophysikalischen Beziehung zwischen der Fluoreszenzanisotropie und der Rotations- und Translationsdiffusion kann geschlossen werden, dass die Verbindung 11 und verwandte AIDA Farbstoffderivate auch in einer Einzelmolekülspektroskopie geeignete Tracer sind.
2. Mit Avidin-Biotin als Modellsystem wird ein Energietransfer von 70% von Tryptophan auf die Verbindung 11 relativ zu freiem Avidin plus Verbindung 11 bei 480 nm als effizientes Signal für eine Komplexbildung detektiert.
3. Eine Verringerung von 70–80% der Fluoreszenzintensität der Verbindung 11, die FRET, eine Grundzustandsabschwächung des Indazols und eine Abschwächung des angeregten Zustands der Avidinmarkierung BODIPY-FL umfasst, stellt eine dritte Möglichkeit zur Verfolgung des Protein-Liganden-Komplexes zwischen 440 nm und 500 nm bereit.

Beispiel 3A:
Detektion der Bindung des AIDA-Biotinkonjugats 4-[1-[4-Carbamoylphenyl]-1H-indazol-3-yl]benzoesäure-3-(biotinoylamino)propylamid (8) an Avidin

(a) Die Anregungs- und Emissionsspektren der Verbindung 8 und Avidin, die die Überlappung zwischen den Tryptophanemissions- und -anregungsspektren der Verbindung 8 zeigen, sind in 2c dargestellt. Während die Verbindung 11 ein sehr breites Fluoreszenzemissionsband mit etwa 50% der Emissionsintensität bei 500 nm aufweist (2b), fehlt dem Fluoreszenzemissionsspektrum der Verbindung 8 mit dem an die Indazolposition 3 gebundenen Biotin der breite Übergang der Verbindung 11 mit einem Maximum bei 450 nm, was zu einem viel engerem Spektrum führt. Die 2f und 2i zeigen das spektrale Überlappungsintegral zwischen Donor (dem AIDA Fluoreszenzmolekül) und dem Akzeptor, nämlich jeweils den Lucifer Yellow und BODIPY-FL Markierungen, bei Avidin. Das unterschiedliche Überlappungsintegral für die Fluoreszenzemission jeweils der Verbindung 11 und 8 und der BODIPY Absorption erlaubt eine qualitative Abschätzung des relativen Orientierungsfaktors, der im Energietransferprozess involviert ist. Es bleibt daher eine Frage des Abstands und der nicht-bestrahlenden Depopulationsbedingungen, ob ein effizienter Energietransfer stattfindet oder nicht.
(b) Fluoreszenzresonanzenergietransferexperimente mit Verbindung 11 als Donor oder Akzeptor

AIDA Konjugat 8 als Akzeptor: (3b)
Die Differenzspektren [I(8_(frei) + I(Avidin_(frei)) – I(8-Avidin_Komplex) (3b, Kurve 5). Die Bindung des Biotins an die Position 3 im Indazolmolekül in der Verbindung 8 (von der Position 1 in der Verbindung 11) verändert nicht nur die Fluoreszenzspektren, sondern auch die FRET Eigenschaften von Tryptophan zu Indazol: Angedeutet durch eine Zunahme der Indazolfluoreszenzemission um 26% (anstelle einer Abschwächung) wird ein gesteigerter Energietransfer zu Tryptophan (120%) durch eine starke Zunahme der Indazolquantenausbeute in der Avidinumgebung überlagert.
AIDA Konjugat 8 als Donor: (3d)
Obwohl das Überlappungsintegral zwischen der Indazolemission und des BODIPY-FL Absorptionsspektrums für die Verbindung 8 kleiner ist als für die Verbindung 11 tritt eine höhere Sensibilisierung der Akzeptorfluoreszenz im Verbindung 8-Avidin-BODIPY Komplex auf, was zu einem Fluoreszenzenergietransfer von 48% und einer Indazoldonorabschwächung um 93,5% führt. Dieser Effekt kann durch eine höhere Donorquantenausbeute oder eine bevorzugte relative Orientierung der Donoremission und der Akzeptorabsorptiondipole in der Verbindung 8 verursacht werden.
Schlussfolgerungen:
Mit beiden molekularen Geometrien, nämlich mit dem Indazoltracer der über die Position 1 (Verbindung 11) und die Position 3 (Verbindung 8) gebunden ist, verursacht die Bindung von BODIPY-FL markiertem Avidin eine Abschwächung von 70–90% der Indazolemission. Diese Reduktion der Signalintensität kann durch eine Grundzustandsabschwächung des Indazols oder des FRET auf die BODIPY Markierungen in Avidin mit einer gleichzeitigen nicht-bestrahlenden Dezimierung des angeregten Zustands verursacht werden. Neben dem Donorabschwächungssignal liefert die Akzeptorsensibilisierung ein selektives Interaktionssignal der AIDA Konjugate mit Zielmakromolekülen, die mit herkömmlichen Farbstoffen markiert sind, die bei > 500 nm mit FRET Effizienzen von 40% und mehr fluoreszieren.

c. Bindung des AIDA Konjugats 8 an Avidin-BODIPY, die durch Rotationsdifussion und Energietransfer detektiert wird: Der Energietransfer zwischen dem Indazolrest in Verbindung 8 und den 3.3 BODIPY-FL Markierungen am Avidin durch zeitauflösende Fluoreszenzspektroskopie

Das AIDA Konjugat 8 zeigt eine schnelle Fluoreszenzdepolarisierung in wässriger Lösung (PBS/5% DMSO), die für Chromophoren typisch ist, die an ein kleines Molekül gebunden sind. Die Bindung von Avidin (unmarkiert) führt zu einer langsameren Depolarisierung der Verbindung 8 aufgrund der verringerten Rotationsdiffusion des Komplexes. Die Bindung des mit BODIPY-FL markierten Avidins an die Verbindung 8 bildet einen weiteren Depolarisationsmodus für die Indazolfluoreszenz: Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer zwischen dem Indazolrest der Verbindung 8 und den BODIPY-FL Markierungen. Daher wird, obwohl die Verbindung 8 über Biotin an Avidin bindet, die Rotationsdiffusion der an Avidin-BODIPY gebundenen Verbindung 8, die an der Indazolemissionswellenlänge aufgezeichnet wird, schnell depolarisiert, wie in der ungebundenen Form. Wenn der Komplex aus Verbindung 8-Avidin BODIPY-FL bei 550 nm verfolgt wird (BODIPY Emissionswellenlänge) ist die durch den Fluoreszenzanisotropiezerfall gemessene Rotationsdiffusion nur ein bisschen langsamer als das unkomplexierte Avidin-BODIPY Konstrukt.
Schlussfolgerung: Die Wechselwirkung zwischen den Fluoreszenz-markierten Zielmakromolekülen und den AIDA Konjugaten kann auch in einer zeitauflösenden Einstellung für Fluoreszenzmessungen entweder durch Verfolgung der Veränderungen in der Fluoreszenzdauer, den Rotationskorrelationszeiten oder den Rotations- und Translationsdiffusionszeiten in einer Einzelmolekülspektroskopie detektiert werden.
Teil B: Chemisch
Allgemein
Die ¹H NMR Spektren werden mit einem Bruker WC-250 oder einem AMX-500 Spektrometer aufgezeichnet, die chemischen Verschiebungen werden in ppm (ä) relativ zu Me₄Si als interner Standard angegeben. Die J Werte werden in Hertz angegeben und basieren auf einer Spektralinterpretation erster Ordnung. Die Elementaranalysen werden durch das Analytical Department, Novartis Basel, Schweiz ausgeführt und liegen innerhalb von ±0,4% des theoretischen Werts, falls nichts anderes angegeben ist. Die ESI-MS Spektren werden auf einem Finnigan-SSQ 7000 erhalten und die CI-MS Spektren auf einem Finnigan-TSQ 700. Die Schmelzpunkte werden mit einem Thermovar-Mikroskop (Reichert-Jung) bestimmt und sind nicht korrigiert. Analytische Dünnschichtchromatographie (TLC): Merck vorbeschichtete Kieselgel 60 F254 Platten, Detektion: (a) λ = 254 nm, (b) λ = 366 nm, (c) Färben mit MOSTAIN (5% (NH₄)₆Mo₇O₂₄ × 4H₂O, 0,1% Ce(SO₄)₂ in 10% H₂SO₄) oder (d) Färben mit Ninhydrin (gesättigte Lösung in Ethanol) und anschließendes Erhitzen auf einer heißen Platte. Mitteldruckchromatographie (MPLC): Silicagel Merck 60 (40–63 μm). Die Reagenzien und Lösemittel werden in analytischer oder der besten im Handel erhältlichen Qualität bezogen und ohne weitere Reinigung verwendet, falls nichts anderes angegeben ist. Die Verdampfungen werden im Vakuum mit einem Rotationsverdampfer ausgeführt, wobei eine Trocknung im Hochvakuum (HV) unter einem Ölpumpenvakuum von weniger als 0,1 mbar ausgeführt wird.
Abkürzungen

BOP (Benzotriazol-1-yloxy)-tris-(dimethylamino)phosphoniumhexafluorphosphat (Castro's Reagenz), CI (Chemische Ionisierung), zers. (Zersetzung), DCM (Dichlormethan), DIC (Diisopropylcarbodiimid), DIAE (Diisopropylethylamin (Hünig's base)), DMA (N,N-Dimethylacetamid), DMF (Dimethylformamid), DMEM (N,N'-Dimethyletylenharnstoff), DMPU (N,N'-Dimethylpropylenharnstoff), DMSO (Dimethylsulfoxid), ESI (Elektronensprayionisation), Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), HOBt (1-Hydroxybenzotriazol), HV (Hochvakuum), Smp. (Schmelzpunkt), MS (Massenspektrum), n.b. (nicht bestimmt), RT (Raumtemperatur), TEA (Triethylamin), TEAA (Triethylammoniumacetat), TFA (Trifluoressigsäure), THF (Tetrahydrofuran), TSTU (O-(N-Succinimidyl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluorborat).

Syntheseverfahren Beispiel 1B: (a) Allgemeine Verfahren zur Synthese der funktionalisierten 1,3-Diaryl-1H-indazole (4a–j), wie dies in Schema 1 gezeigt ist: Schema 1

Bedingungen: (a) 4-Hydrazinbenzoesäure oder 4-Nitrophenylhydrazin, MeOH, Rückfluss, 50 Stunden, (b) Bleitetraacetat, DCM, RT, 30–60 Minuten, (c) DCM, Bortrifluoridetherat, 0°C, 20 Minuten, RT, 30 Minuten.

Synthese von Arylhydrazonen (2a–j) aus Diarylketonen (1a–j), wie dies in Schema 1 gezeigt ist
Eine Suspension des Diarylketons (1a–j, 10 mmol) und des Arylhydrazins (11 mmol) in Methanol (50 ml) wird für 50 Stunden am Rückfluss gekocht. Nach dem Erhitzen erhält man eine klare Lösung. Während des Verlaufs der Reaktion bildet sich ein kristalliner Niederschlag. Nach dem Kühlen in einem Eisbad wird das kristalline Produkt (2a–j) durch Filtration gewonnen, zweimal mit kaltem Methanol und mehrmals mit Diethylether gewaschen. Die Kristalle der Verbindungen 2a–j werden über Nacht in einem Trocknungsofen bei 70°C gehalten. Asymmetrisch substituierte Diarylketone (1b–f, 1i–j) ergeben Gemische an E/Z-Isomeren (2b–f, 2i–j), die im nächsten Reaktionsschritt ohne Trennung eingeführt werden.
Ausbeuten und analytische Daten von 2a–j:
Synthese der Essigsäure-1,1-diaryl-1-arylazomethylester (3a–j), wie dies in Schema 1 gezeigt ist
Ein Arylhydrazon der Struktur 2a–j (10 mmol) wird in Dichlormethan gelöst (50 ml, vollständige Lösung kann durch die Zugabe von 10% Essigsäure im Fall der geringen Löslichkeit des Ausgangsmaterials erhalten werden). Eine Lösung von Bleitetraacetat (10 mmol) in Dichlormethan (10 ml) wird bei Raumtemperatur zugegeben. Das homogene Reaktionsgemisch wird für 30 bis 60 Minuten gerührt. Die Vollständigkeit der Umsetzung wird durch Dünnschichtchromatographie verfolgt. Eine Suspension des Natriumoxalats (1 g in Wasser) wird zu der orange-gelben Lösung gegeben. Nach 15 Minuten starkem Rühren wird das gesamte Gemisch filtriert. Die wässrige Phase wird verworfen. Die organische Phase wird ausgiebig mit Wasser gewaschen und unter verringertem Druck eingedampft. Das verbleibende orange Öl wird in Ethylacetat gelöst. Die organische Phase wird erneut mit mehreren Portionen Wasser gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und unter verringertem Druck zur Trockne eingedampft. Der verbleibende orange Schaum der Substanzen 3a–j wird weiter bei Raumtemperatur im Vakuum über Nacht getrocknet. Die Verbindungen 3a–j sind homogen, wie dies durch Dünnschichtchromatographie gezeigt wird und sie werden im nächsten Reaktionsschritt ohne weitere Reinigung eingeführt.
Ausbeuten und analytische Daten der Verbindungen 3a–j:
Synthese von 1,3-Diaryl-1H-indazolen (4a–j) wie dies in Schema 1 gezeigt ist
Ein Essigsäure-1,1-diaryl-1-arylazomethylester der Verbindungen 3a–j (10 mmol) wird in Dichlormethan (50 ml) gelöst. Die Lösung wird in einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Es wird Bortrifluoridetherat (13 mmol) unter Rühren innerhalb von 5 Minuten zugegeben. Die Zugabe von Bortrifluoridetherat führt zu einer sofortigen Bildung eines Niederschlags. Das Reaktionsgemisch wird bei 0°C für 20 Minuten und bei Raumtemperatur für weitere 30 Minuten gerührt. Der kristalline Niederschlag wird durch Vakuumfiltration gewonnen. Die Kristalle werden zweimal mit kaltem Methanol und dreimal mit Diethylether gewaschen. Die 1,3-Diaryl-1H-indazole 4a–j werden unter verringertem Druck in einem Trocknungsofen bei 70°C getrocknet. Eine Dünnschichtchromatographie zeigt eine Homogenität der Verbindungen 4a–j an (Eine Umkristallisation kann aus heißem Dimethylformamid entweder pur oder nach der Zugabe von Methanol erreicht werden).
Ausbeuten und analytische Daten der Verbindungen 4a–j
(b) Synthese von 1,3-Diaryl-5-nitro-1H-indazolen (4k, 4l):
4-[3-(4-Carboxyphenyl)-5-nitro-1H-indazol-1yl]-benzoesäure (4k)
Salpetersäure (65%, 4 ml) wird in einem Eisbad auf 0°C abgekühlt und Schwefelsäure (95%, 4 ml) wird zugegeben. 1,3-Bis-(4-carboxyphenyl)-1H-indazol (4b) (300 mg, 0,835 mmol) wird bei 0°C unter Rühren zugegeben. Das Kühlen und Rühren wird für 10 Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wird in Eiswasser (150 ml) gegossen und der pH wird durch die Zugabe von 2 N NaOH auf 4–5 eingestellt. Die Kristalle werden durch Filtration gewonnen und mit Kochsalzlösung gewaschen, bis das Filtrat fast neutral ist. Die Kristalle werden für 2 Stunden bei 90°C getrocknet und aus Dimethylformamid/Methanol umkristallisiert. Das Produkt wird durch Filtration gewonnen und bei 120°C unter verringertem Druck getrocknet, was 153 mg (45%) der Verbindung 4k ergibt: Smp. 348–350°C.
4-[3-(4-Carbamoylphenyl)-5-nitro-1H-indazol-1yl]benzoesäure (4l)
Die Salpetersäure (65%, 4 ml) wird auf 0°C in einem Eisbad gekühlt und Schwefelsäure (95%, 4 ml) wird zugegeben. 4-[3-(4-Carbamoylphenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäure (4c) (300 mg, 0,84 mmol) wird bei 0°C unter Rühren zugegeben. Das Kühlen und Rühren wird für 15 Minuten fortgesetzt. Das Gemisch wird in Eiswasser (150 ml) gegossen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugation gewonnen und mit Kochsalzlösung gewaschen, bis das Filtrat fast neutral ist. Die Kristalle werden für 30 Minuten bei 120°C getrocknet und aus Dimethylformamid/Methanol umkristallisiert. Das Produkt wird durch Filtration gewonnen und bei 120°C unter verringertem Druck getrocknet, wobei man 211 mg (62%) der Verbindung 4l erhält: Smp. 320–322°C.
(c) Reduktion von 4-[1-(4-Nitrophenyl)-1H-indazol-3-yl]benzoesäure (4l)
Zu einer Lösung aus SnCl₂ × 2H₂O (280 mg, 1,24 mmol) in konzentrierter HCl (3 ml) wird 4-[1-(4-Nitrophenyl)-1H-indazol-3-yl]benzoesäure (4i) (80 mg, 0,233 mmol) gegeben. Die Suspension wird für 7 Stunden auf 70°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen. Das Rohprodukt (enthält 12% des nicht reagierten Ausgangsmaterials) wird einem zweiten Reduktionszyklus unterzogen, wie dies oben beschrieben ist. Der Niederschlag wird ausgiebig mit Wasser und anschließend mit trockenem Ether gewaschen. Das kristalline 4-[1-(4-Aminophenyl)-1H-indazol-3-yl]benzoesäurehydrochlorid (4 m) wird unter verringertem Druck (50 mg, 61%) getrocknet. MS (APCI): m/z = 330 (MH)⁺.
d) Reduktion von 4-[3-(4-Nitrophenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäure (4f).
Zu einer Lösung aus SnCl₂ × 2H₂O (280 mg, 1,24 mmol) in konzentrierter HCl (3 ml) wird 4-[3-(4-Nitrophenyl)-1H-indazol-3-yl]benzoesäure (4f) (80 mg, 0,223 mmol) gegeben. Die Suspension wird für 7 Stunden auf 70°C gehalten. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen. Das Rohprodukt (enthält 12% des nicht reagierten Ausgangsmaterials) wird einem zweiten Reduktionszyklus unterzogen, wie dies oben beschrieben ist. Der Niederschlag wird ausgiebig mit Wasser und anschließend mit trockenem Ether gewaschen. Das kristalline 4-[1-(4-Aminophenyl)-1H-indazol-3-yl]benzoesäurehydrochlorid (4n) wird unter verringertem Druck (70 mg, 85%) getrocknet. MS (APCI): m/z = 330 (MH)⁺, 371 ([M + CH₃CN]H⁺.
(e) Acylierungen von 4-[3-(4-Aminophenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäurehydrochlorid (4n)
4-[3-(4-Acetylaminopheny)-1H-indazol-1-yl]benzoesäure (4o)
Zu einer Lösung aus 4-[3-[4-Aminphenyl]-1H-indazol-1-yl]benzoesäurehydrochorird (4n) (183 mg, 0,5 mmol) in Pyridin (10 ml) wird Acetylchlorid (47 mg, 0,6 mmol) gegeben. Die Lösung wird für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Flüchtiges Material wird unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wird mit MeOH behandelt. Das kristalline Produkt wird durch Filtration gewonnen, mit MeOH gewaschen und getrocknet: Ergibt 165 mg (89%) der Verbindung 4o.
MS (ESI): m/z = 372 (61%) (MH)⁺, 426 (50%), (M + Na + MeOH)⁺, 765 (100%), (2M + Na)⁺.
4-{3-{4-[N-(9H-Fluoren-9-yl)methyloxycarbonylglycinoylamino]phenyl-1H-indazol-1-yl}benzoesäure (4p)
Zu einer Lösung aus 4-[3-(4-Aminophenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäurehydrochlorid (4n) (183 mg, 0,5 mmol) in Pyridin (10 ml) wird Fmoc-Gly-Cl (220 mg, 0,7 mmol) gegeben. Die Lösung wird gerührt, bis das Ausgangsmaterial (4n) verbraucht ist (HPLC). Das Lösemittel wird unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in MeOH suspendiert. Das kristalline Produkt wird durch Filtration gewonnen, mit MeOH gewaschen und unter verringertem Druck getrocknet: Ergibt 203 mg (67%) der Verbindung 4p. MS (ESI): m/z = 631 (100%) (M + Na)⁺.
(f) Chlorsulfonylierung von 4-[3-(4-Carboxyphenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäure (4b)
Das Indazolderivat 4b (21 mg, 0,06 mmol) wird mit Chlorschwefelsäure (1 ml) bei 120°C für 10 Minuten behandelt. Das Reaktionsgemisch wird in einem Eisbad gekühlt und tropfenweise zu Wasser (0°C, 4 ml) gegeben. Der Niederschlag wird durch Filtration gewonnen, mit Wasser gewaschen und unter verringertem Druck bei 80°C getrocknet: Ergibt 19 mg an 4-[3-(4-Carboxyphenyl)-5-chlorsulfonyl-1H-indazol-1-yl]benzoesäure (4q) (69%). MS (ESI): 457 (100%) (MH⁺).
¹H NMR der Verbindungen 4m–4g:

4m: ¹H NMR (DMSO-d₆): 7,42 (dd [t], J = 7,4, J = 7,4, 1H), 7,52, 7,56, 7,92, 7,95, (AA'BB', 4H), 7,57–7,63 (m, 1H), 7,92 (d, J = 8,4, 1H), 8,12, 8,15, 8,20, 8,23 (AA', BB', 4H), 8,26 (d, J = 8,3, 1H).
4n: ¹H NMR (DMSO-d₆): 7,38–7,64 (m, 3H), 7,61 (dd, breit, 1H), 7,99–8,10 (m, 3H), 8,15–8,22 (m, 5H).
4o: ¹H NMR (DMSO-d₆): 2,10 (s, 3H), 7,39 (ddd, 1H), 7,59 (ddd, 1H), 7,76–7,82 (m, 2H), 7,98–8,03 (m, 5H), 8,12–8,22 (m, 3H), 10,14 (s, 1H).
4p: ¹H NMR (DMSO-d₆, 500 MHz): 3,86 (d, 2H, J = 6,1, CH ₂), 4,25 (t, J = 6,8, 1H, CHCH₂), 4,33 (d, J = 7,0, 2H, CHCH ₂), 7,34 (dt, J = 0,6, 7,4, 2H, Fmoc-Aryl-H), 7,40 (t, J = 7,5, 1H, CH₂NH), 7,42 (t, J = 7,4, 2H, Fmoc-Aryl-H), 7,60 (t, breit, 1H, Indazol-H), 7,67 (t, breit, 1H, Indazol-H), 7,74 (d, J = 7,5, 2H, Fmoc-Aryl-H), 7,82 (d, breit, 2H, Aryl-H), 7,89 (d, J = 7,6, 2H, Fmoc-Aryl-H), 8,01, 8,02, 8,16, 8,17 (AA'BB', 4H, Aryl-H), 8,03 (d, breit, 2H, Aryl-H), 8,04 (d, breit, 1H, Indazol-H7), 8,21 (d, J = 8,2 Hz, 1H, Indazol-H4), 10,19 (s, Aryl-NH), 13,05 (s, breit, CO₂ H).

Beispiel 2B: (a) Synthese von 4-{3-{4-[(3-Aminopropyl)aminocarbonyl]phenyl}-1H-indazol-1yl}benzoesäure (5), wie dies in Schema 2 gezeigt ist Schema 2:

Bedingungen: (a) 1,3-Diaminopropan (pur), 90°C, 4 Stunden, (b) K₂CO₃, Wasser, 1,4-Dioxan, Fmoc-Cl, 0°C, 10 Minuten, RT, 12 Stunden.

1,3-Diaminopropan (80 ml) wird zur Verbindung 4d (10,0 g, 26,85 mmol) gegeben. Das heterogene Reaktionsgemisch wird unter Rühren auf 90°C erhitzt. Die Verbindung 4d löst sich, wenn das Lösemittel die Reaktionstemperatur erreicht hat und die Lösung kann dann für 4 Stunden reagieren. Das 1,3-Diaminopropan wird unter verringertem Druck abdestilliert, wobei ein viskoses Öl zurückbleibt. Das rohe Produkt wird mit Methanol (200 ml) verdünnt und auf Rückfluss erhitzt. Bevor das Methanol die Siedetemperatur erreicht, beginnt kristallines Produkt auszufallen. Die Suspension wird für 10 Minuten am Rückfluss erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Kristalle werden dann durch Vakuumfiltration gewonnen. Die farblosen Kristalle werden mit einem Teil eiskaltem Methanol und dann mit mehreren Portionen an Diethylether gewaschen. Das Produkt wird in einem Trocknungsofen unter verringertem Druck bei 120°C unter Bildung von 9,86 g (89%) der Verbindung 5 getrocknet: Smp. 285–288°C (hängt von der Heizrate ab, Zersetzung). ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,85–2,05 (m, 2H), 2,90–3,05 (m, 2H), 3,35–3,55 (m, 2H), 7,32 (t, 1H), 7,51 (t, 1H), 7,75–8,30 (m, 10H), 9,20 (breit, t, 1H, CONH), MS: e/m 415 (MH⁺)
(b) Synthese von 4-{3-{4-[N-3-[(9H-Fluoren-9-yl)methyloxycarbonylamino]propyl]aminocarbonyl}phenyl-1H-indazol-1-yl}benzoesäure (6), wie dies in Schema 2 gezeigt ist
Kaliumcarbonat (2,67 g, 15,45 mmol) wird zu einer Suspension der Aminosäure 5 (3,20 g, 7,73 mmol) in Wasser (60 ml) und 1,4 Dioxan (35 ml) gegeben. Das Gemisch wird für 5 Minuten gerührt und in einem Eisbad auf 0°C gekühlt. Fmoc-Chlorid (2,20 g, 8,5 mmol) in 1,4-Dioxan (35 ml) wird tropfenweise innerhalb von 10 Minuten zugegeben. Die Kühlung wird entfernt und das Rühren wird bei Raumtemperatur für 12 Stunden fortgesetzt. Es entsteht ein voluminöser Niederschlag. Die wässrige Suspension wird mit Diethylether extrahiert. Der pH wird mit verdünnter HCl auf 1 eingestellt und dann weiter mit Kochsalzlösung (100 ml) verdünnt. Der Niederschlag wird durch Vakuumfiltration gewonnen und ausgiebig mit Diethylether unter Bildung von klumpigen Kristallen gewaschen. Das Produkt wird für 24 Stunden bei 35°C in einem Trocknungsofen unter verringertem Druck getrocknet, wobei man 4,14 g (84%) der Verbindung 6 erhält: Smp. 217–219,5°C (in Abhängigkeit der Heizrate, Zersetzung). ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,68–1,77 (m, 2H), 3,05–3,12 (m, 2H), 3,25–3,35 (m, 2H), 4,22 (t, 1H, H-9 Fluorenyl), 4,33 (d, 2H, OCH₂-9-Fluorenyl), 7,27–7,35 (m, 3H), 7,37–7,46 (m, 3H), 7,63 (t, 1H), 7,70 (d, 2H, H-Fluorenyl), 7,88 (d, 2H, H-Fluorenyl), 8,01–8,08 (m, 5H), 8,15–8,20 (m, 4H), 8,24 (d, 1H), 8,58 (t, 1H, CONH), MS: 635 (M – H)^–.
(c) Synthese von 4-{3-{4-[(3-Methylaminopropyl)aminocarbonyl]phenyl}-1H-indazol-1yl}benzoesäure (5a)
Zum Indazol 4d (186 mg, 0,5 mmol) wird 3-Methylaminopropylamin (5 ml) gegeben. Die Lösung wird für 8 Stunden auf Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, mit Wasser (20 ml) verdünnt und mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure angesäuert. Es bildet sich ein farbloser Niederschlag. Die Suspension wird zentrifugiert (4500 Upm). Die wässrige Phase wird verworfen. Das zurückbleibende Gel wird mit Chlorwasserstoffsäure (0,1 N, 30 ml, fünfmal) gewaschen und im Vakuum bei 70°C für 8 Stunden getrocknet. Das rohe Material wird in heißem DMF (2 ml) gelöst. Die Lösung wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit Ether (20 ml) verdünnt. Es bildet sich eine weiße Suspension und es trennt sich ein brauner Niederschlag am Boden des Kolbens ab. Die Suspension wird entfernt und zentrifugiert (4500 Upm). Die organische Phase wird entfernt. Der verbleibende farblose Feststoff wird mit Ether (2 ml, zweimal) gewaschen und im Vakuum für 2 Stunden getrocknet: Ergibt 93 mg (43%) der Verbindung 5a: Smp. 186–190°C, MS (ESI) m/z = 429 (100%) (M + H)⁺, ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,85–1,89 (m, 2H, CH₂CH ₂CH₂), 2,56 (s, 3H, NHCH ₃), 2,96 (t, breit, 2H, CH ₂NH), 3,33–3,45 (m, 2H, CONHCH ₂), 7,45 (t, 1H, Indazol-H), 7,64 (t, 1H, Indazol-H), 7,95–8,28 (m, 10H), 8,89 (t, 1H, CONHCH₂) Beispiel 3B: (a) Synthese von 3'(+)-4-{3-[4-(3'-Biotinoylaminopropyl)aminocarbonyl]phenyl-1H-indazol-1-yl}benzoesäureamid (8), wie dies in Schema 3 gezeigt ist Schema 3:
Bedingungen: (a) DCM/Piperidin. (b) 6 oder 4d, DIC, HOBt, DMF. (c) DCM/TFA (d) (+)-Biotin, DIC, HOBt, DMF.
Rinkamidharz (500 mg, 0,28 mmol) wird mit Piperidin (20%) in Dichlormethan (10 l) bei Raumtemperatur für 1 Stunde geschüttelt. Das Harz wird mit Teilen an Dichlormethan, Methanol und schließlich Dichlormethan gewaschen, bis eine Probe des letzten Filtrats kein Vorkommen der abgespaltenen Schutzgruppe mehr zeigt. Das Harz wird in einer Lösung über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt, die aus der Verbindung 6 (0,56 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (1,68 mmol), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (2,24 mmol) und Dimethylformamid (35 ml) hergestellt wurde. Das Harz wird ausgiebig mit mehreren Portionen Dimethylformamid, dann Methanol und schließlich Dichlormethan gewaschen. Das Waschen wird fortgesetzt, bis das letzte Filtrat keine Fluoreszenz mehr zeigt. Die Lösemittel werden unter verringertem Druck bei Raumtemperatur verdampft. Die Fmoc Schutzgruppe der Harz-gebundenen Verbindung 6 wird entfernt, wie dies oben für die Schutzgruppenabspaltung des Rinkamidharzes beschrieben wurde. Zu einer Lösung aus (+)-Biotin (0,84 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (2,52 mmol) in Dimethylformamid (40 ml) wird N,N'-Diisopropylcarbodiimid (5,04 mmol) gegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur für 1 Stunde stehengelassen und dann auf das Harz überführt. Das Reaktionsgefäß wird langsam durch kreisende Bewegungen für 24 Stunden geschüttelt. Die Lösemittel werden durch Vakuumfiltration entfernt. Das Harz wird ausgiebig mit Portionen an Dimethylformamid, Methanol und schließlich mit Dichlormethan gewaschen. Das rohe Produkt (8) wird vom Träger durch die Behandlung des Harzes mit einem 1:1 Gemisch aus Dichlormethan und Trifluoressigsäure (15 ml) für 2 Minuten abgespalten. Die Lösung wird durch Vakuumfiltration gewonnen. Das Harz wird weiter mit 3 Portionen an Dichlormethan extrahiert. Die Lösemittel werden unter verringertem Druck entfernt, was zur Verbindung 8 als viskoses Öl mit einer hohen Reinheit führt, wie dies durch ¹H NMR gezeigt wird. Die Behandlung mit Ether induziert die Kristallisation. Eine Umkristallisation aus einem Gemisch aus Dimethylsulfoxid, Methanol und Diethylether ergibt 60 mg (33%) der Verbindung 8: Smp. 222–225°C, ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,25–1,66 (m, 6H, Biotin), 1,67–1,72 (m, 2H, NHCH₂CH ₂CH₂NH), 2,09 (t, 2H, COCH ₂), 2,56, 2,58, 2,79, 2,80, 2,81, 2,82 (2H, CH ₂S, AB-Teil von ABX), 3,08–3,10 (m, 1H, CHS-Biotin), 3,11–3,15 (m, 2H, NCH ₂), 3,30–3,34 (m, 2H, NCH ₂), 4,11–4,14 (m, 1H, CH-Biotin), 4,28–4,30 (m, 1H, CH-Biotin, X-Teil von ABX), 6,34 (s, breit, 1H, NHCONH), 6,42 (s, breit, 1H, NHCONH), 7,44 (ddd, 1H), 7,47 (s, breit, 1H von CONH ₂), 7,61 (ddd, 1H), 7,84 (t, 1H, NHCO), 7,97–8,06 (m, 5H), 8,12 (s, breit, 1H von CONH ₂), 8,13–8,26 (m, 5H), 8,59, (t, 1H, NHCO). MS: e/m 640 (MH)⁺.
Mikroanalyse: (C₃₄H₃₇N₇O₄S₁ × H₂O) Berechnet C 62,08, H 5,98, N 14,91, S 4,87. Gefunden C 62,19, H 5,82, N 14,78, S 4,67.
(b) Synthese von 4-[3-(4-Methoxycarbonylphenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäureamid (7a), wie dies in Schema 3 dargestellt ist
Rinkamidharz (1,786 g, 1,00 mmol) wird wie vorher beschrieben von den Schutzgruppen befreit. Das von den Schutzgruppen befreite Harz wird über Nacht bei Raumtemperatur in einer Lösung geschüttelt, die aus der Verbindung 4d (745 mg, 2,00 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (810 mg, 6,00 mmol), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (1,010 g, 8,00 mmol) und Dimethylformamid (100 ml) hergestellt wurde. Das Harz wird ausgiebig mit mehreren Portionen an Dimethylformamid, dann Methanol und schließlich Dichlormethan gewaschen. Das Waschen wird fortgesetzt, bis das letzte Filtrat ohne Fluoreszenz ist. Die Lösemittel werden unter verringertem Druck bei Raumtemperatur verdampft. Ein Aliquot des Produkts (7a) wird vom festen Träger (200 mg) durch die Behandlung des Harzes mit einem 2:1 Gemisch aus Dichlormethan und Trifluoressigsäure (10 ml) für 10 Minuten abgespalten. Die Lösung wird durch Vakuumfiltration gewonnen. Das Harz wird weiter mit drei Portionen an Dichlormethan, gefolgt von zwei Portionen an Dimethylformamid extrahiert. Die Entfernung der Lösemittel unter verringertem Druck und einer Trocknung über Nacht in einem Exsikkator liefert 34,0 mg (98%) der Verbindung 7a: Smp: 267–269°C, homogen gemäß Dünnschichtchromatographie: R_f = 0,68, Dichlormethan:Methanol = 9:1), ¹H NMR (DMSO-d₆): 3,92 (s, 3H, OCH ₃), 7,43 (ddd, 1H), 7,61 (ddd, 1H), 7,95–8,00 (m, 3H), 8,13–8,16 (m, 4H), 8,23–8,25 (m, 3H), CONH ₂ breit, (nicht zuzuordnen).
(c) Synthese von 4-{3-{4-{3-[(9H-Fluoren-9-yl)-methyloxycarbonylamino]propyl}aminocarbonyl}phenyl-1H-indazol-1-yl}benzoesäureamid (7b), wie dies in Schema 3 gezeigt ist.
Rink-Amidharz (1,00 g, 0,56 mmol) wird wie vorher beschrieben von den Schutzgruppen befreit. Das von den Schutzgruppen befreite Harz wird in einer Lösung, die aus der Verbindung 6 (1,12 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (3,36 mmol), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (4,48 mmol) und Dimethylformamid (50 ml) hergestellt wurde, über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Harz wird ausgiebig mit mehreren Portionen an Dimethylformamid, dann Methanol und schließlich Dichlormethan gewaschen. Das Waschen wird fortgesetzt, bis das letzte Filtrat ohne Fluoreszenz ist. Die Lösemittel werden unter verringertem Druck bei Raumtemperatur verdampft. Ein Aliquot des Produkts (7b) wird vom festen Träger (51 mg) durch die Behandlung des Harzes mit einem 2:1 Gemisch aus Dichlormethan und Trifluoressigsäure (3 ml) für 10 Minuten abgespalten. Die Lösung wird durch Vakuumfiltration gewonnen. Das Harz wird weiter mit drei Portionen an Dichlormethan, gefolgt von zwei Portionen an Dimethylformamid extrahiert. Die Entfernung der Lösemittel unter verringertem Druck liefert 40,5 mg (88%) der Verbindung 7b als amorphen Feststoff in hoher Reinheit, wie dies durch ¹H NMR und Dünnschichtchromatographie angezeigt wird (R_f = 0,64, Dichlormethan:Methanol = 9,5:0,5 + Spur an Essigsäure), ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,71 (m, 2H, CONHCH₂CH ₂CH₂NHCOO), 3,09 (m, 2H, NHCH₂CH₂CH ₂NHCOO), 3,32 (m, 2H, CONHCH ₂CH₂CH₂NHCOO), 4,22 (verzerrtes t, 1H, H-9 Fluorenyl), 4,32 (verzerrtes d, 2H, COOCH ₂-(9-Fluorenyl), 7,30–7,35 (m, 2H, Fluorenyl, 1H, -CONHCH₂CH₂CH₂NHCOO)), 7,40–7,44 (m, 2H, Fluorenyl, 1H, Indazol), 7,47 (s, breit, 1H von -CONH ₂), 7,60–7,63 (ddd, 1H, Indazol), 7,70 (d, 2H, Fluorenyl), 7,88 (d, 2H, Fluorenyl), 7,97–8,06 (m, 5H, Indazol), 8,12 (s, breit, 1H von -CONH ₂), 8,13–8,25 (m, 3H, Indazol), 8,58 (t, 1H, CONH(CH₂)₃NHCOO). Beispiel 4B: (a) Synthese von 4-[3-(4-Allyloxycarbonylphenyl)indazol-1-yl]benzoesäure-2,5-dioxopyrrolidin-1-ylester (10), wie dies in Schema 4 gezeigt ist Schema 4:
Bedingungen: (a) (+)-Biotin-3-hydroxypropylamid, BOP, DIEA, DMPU. (b) N-Hydroxysuccinimid, DIC, 1,4-Dioxan, (c) (N6)-(+)-Biotinoyl-(L)-Lysin, NaHCO₃, Wasser.
Zu einer gerührten Lösung der Verbindung 4e (355 mg, 0,891 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (106 mg, 0,891 mmol) in Dioxan (20 ml), wird Diisopropylcarbodiimid (0,141 ml, 0,891 mmol) langsam über einer Spritze unter einer Argonatmosphäre gegeben. Das Gemisch wird für 72 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und anschließend bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in Ethylacetat (60 ml) rückgelöst und nacheinander mit NH₄Cl_{gesätt.wäss.,} NaCl_{gesätt.wäss.} und Wasser (jeweils 10 ml) gewaschen. Die gesammelten wässrigen Phasen werden einmal mit Ethylacetat (10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über MgSO₄ getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der entstehende gelbe, amorphe Feststoff wird zweimal durch MPLC (Eluent der ersten Chromatographie: Cyclohexan:Ethylacetat = 2:1, Eluent der zweiten Chromatographie: Toluol:Ethylacetat = 12:1) unter Bildung von 370 mg (83%) der Verbindung 10 gereinigt: Smp. 178°C, homogen gemäß Dünnschichtchroma tographie: R_f = 0,20 (Cyclohexan:Ethylacetat = 2:1). ¹H NMR (DMSO-d₆): 2,93 (s, 4H), 4,85–4,88 (m, 2H), 5,30–5,33 (m, 1H), 5,42–5,47 (m, 1H), 6,05–6,13 (m, 1H), 7,45–7,49 (t, 1H), 7,64–7,68 (t, 1H), 8,11–8,32 (m, 10H). MS m/e 496 (MH⁺). Mikroanalyse: (C₂₈H₂₁N₃O₆) Berechnet: C 67,87, H 4,27, N 8,48. Gefunden: C 67,99, H 4,34, N 8,70.
(b) (5S)-4-{1-[4-(5-Carboxy-5-(biotinoylamino)pentylcarbamoyl)phenyl]-1H-indazol-3-yl}benzoesäureallylestertriethylammoniumsalz (11), wie dies in Schema 4 gezeigt ist
Zu einer gerührten Lösung aus ω-(+)-Biotinoyl-(L)-Lysin (50 mg, 0,134 mmol) und NaHCO₃ (23 mg, 0,268 mmol) in Wasser (2 ml) wird die Verbindung 10 (100 mg, 0,201 mmol) gegeben. Die Suspension wird mit Dioxan/Dimethylformamid (1/1,4 ml) verdünnt und bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre für 6 Tage unter Bildung einer leicht trüben Lösung gerührt, die weiter mit Wasser (10 ml) verdünnt und unter Bildung eines gelblichen Pulvers lyophilisiert wird. Das Rohmaterial wird über eine präparative RP18-HPLC unter Verwendung eines linearen Gradienten aus 0,1 M TEAA (pH 7,0)/CH₃CN (90:10 bis 10:90) gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, mit Wasser verdünnt und unter Bildung von 99 mg (86%) der Verbindung 11 als weißes Pulver lyophilisiert (dessen Reinheit größer als 98% ist, wie dies durch analytische RP18-HPLC bestimmt wird, UV/Fluoreszenzdetektion): Smp. 45°C, ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,00 (t, 9H, (CH ₃CH₂)₃NH⁺), 1,22–1,63 (m, 11H), 1,72–1,88 (m, 2H), 2,03 (t, 2H), 2,55 (d, 1H), 2,62 (q, 6H, (CH₃CH ₂)₃NH⁺), 2,77 (dxd, 1H), 3,00–3,07 (m, 2H), 4,07–4,10 (m, 1H), 4,25–4,30 (m, 2H, -O-CH₂-CH=CH₂), 5,30–5,33 (m, 1H, =CH ₂), 5,43–5,47 (m, 1H, =CH ₂), 6,06–6,13 (m, 1H, -CH=CH₂), 6,32 (s, 1H, NH, Biotin), 6,40 (s, 1H, NH, Biotin), 7,45 (dxd, J₁ = J₂, 1H), 7,63 (dxd, J₁ = J₂, 1H), 7,76 (t, 1H, -CONH-(CH₂)₄-, Lysin), 7,99, 8,00 und 8,13, 8,14 (AA'BB', 4H), 8,02 (d, J = 5,5, 1H), 8,17, 8,19 und 8,26, 8,28 (AA'BB', 4H), 8,27 (d, J = 6,6, 1H), 8,44 (d, J = 7,4, 1H, -NH-). MS: m/e 753 (MH⁺), 775 [M + Na]⁺. Mikroanalyse: (C₄₆N₅₉N₇O₇S × 2,5H₂O), Berechnet C 61,45, H 7,18, N 10,90, S 3,56. Gefunden: C 61,64, H 6,35, N 10,76, S 3,14.
(c) 4-[3-(4-Allyloxycarbonylphenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäure-(5S)-3-(biotinoylamino)propylester (9), wie dies in Schema 4 dargestellt ist
Zu einer gerührten Lösung der Verbindung 4e (1070 mg, 2,677 mmol), BOP (1303 mg, 2,945 mmol) und DIEA (688 μl, 4,016 mmol) in DMPU (15 ml) wird eine Lösung aus (+)-Biotin-3-hydroxypropylamid (807 mg, 2,677 mmol) und 1,2,4-Triazol (203 mg, 2,945 mmol) in DMPU (10 ml) langsam in ein Septum bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre injiziert. Die entstehende gelbe Lösung wird weiter für 6 Tage unter Argon gerührt und zur Trockne eingedampft (HV, Badtemperatur: 75°C). Das entstehende gelbe Öl wird durch MPLC (Dichlormethan:Methanol = 20:1) unter Bildung eines gelblichen Feststoffs (1,258 g, 69%) gereinigt, der durch Umkristallisation aus Acetonitril/Wasser (1:1) unter Bildung von 820 mg (45%) der Verbindung 9 gereinigt wird: Smp. 154–157°C (Acetonitril/Wasser), homogen, wie dies durch Dünnschichtchromatographie angezeigt wird: R_f = 0,24 Dichlormethan:Methanol = 15:1). ¹H NMR (DMSO-d₆): 1,25–1,38 (m, 2H, Biotin), 1,42–1,57 (m, 3H, Biotin), 1,58–1,63 (m, 1H, Biotin), 1,88 (txt, J = 5,6, 2H, -OCH₂-CH ₂-CH₂NH-), 2,08 (t, 2H, -CO-CH ₂-), 2,56 (d, 1H, Biotin), 2,79 (dxd, 1H, Biotin), 3,05–3,10 (m, 1H, Biotin), 3,22–3,26 (m, 2H, -OCH₂CH₂-CH ₂-NH-), 4,10–4,13 (m, 1H, Biotin), 4,27–4,30 (m, 1H, Biotin), 4,32 (t, 2H, -O-CH ₂-CH₂CH₂NH-), 4,86–4,88 (m, 2H, -O-CH₂-CH=CH₂), 5,30–5,33 (m, 1H, =CH₂), 5,42–5,47 (m, 1H, =CH ₂), 6,05–6,13 (m, 1H, -CH=CH₂), 6,34 (s, 1H, NH, Biotin), 6,41 (s, 1H, NH, Biotin), 7,44 (t, 1H), 7,64 (t, 1H), 7,90 (t, 1H, NH-(CH₂)₃-O-), 8,03–8,08 (m, 3H), 8,17–8,21 (m, 4H), 8,24–8,27 (m, 3H). MS: m/e 682 (MH⁺). Mikroanalyse: (C₃₇H₃₉N₅O₆S × H₂O), berechnet C 63,50, H 5,90, N 10,01, S 4,57. Gefunden: C 64,00, H 5,73, N 10,42, S 4,24. Beispiel 5B: Synthese von 4-[3-(4-Aminocarbonylphenyl)-1H-indazol-1-yl]benzoesäureamiden (12a–j), wie dies in Schema 5 gezeigt ist Schema 5:
Bedingungen: (a) Amin (RHNH₂), THF, 24 Stunden, RT. (b) 4c, HOBT, DIC, DMF, 24 Stunden, RT, (c) DCM/MeOH, Bestrahlung, 24 Stunden (366 nm).
Aminoethyl-Tentagelharz (Kapazität: 0,29 mmol/g) wird mit photolabilem 4-Brommethyl-3-nitrobenzoesäurelinker durch ein Standardverfahren beladen. Portionen des Harzes (200 mg Beladung: 0,27 mmol/g) werden mit unterschiedlichen primären Aminen (a–j) (1,08 mmol in 5 ml Tetrahydrofuran) für 24 Stunden bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Harze werden mit mehreren Portionen an Tetrahydrofuran, Methanol und schließlich mit Dichlormethan gewaschen und unter verringertem Druck in einem Exsikkator getrocknet. Zu einer Lösung der Verbindung 4c (579 mg, 1,62 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (657 mg, 4,86 mmol) in Dimethylformamid (30 ml) wird N,N'-Diisopropylcarbodiimid (1,23 g, 9,72 mmol) gegeben. Das Reaktionsgemisch wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Die Stammlösung wird in 10 Aliquots (3 ml) aufgeteilt, die zu den präparierten Harzen gegeben werden. Die Harze werden bei Raumtemperatur für 24 Stunden geschüttelt. Reagenzien, die Lösungen enthalten, werden durch Vakuumfiltration entfernt. Die Harze werden mit mehreren Portionen an Dimethylformamid, Methanol und schließlich mit Dichlormethan gewaschen. Die Harze werden in Gläschen überführt und mit Dichlormethan (5 ml) überschichtet. Es wird Methanol zugegeben, um gleichmäßig dichte Lösungen zu erhalten. Die Gläschen werden unter Bestrahlung mit einer UV Lampe (366 nm) für 24 Stunden geschüttelt. Nach dieser Zeit werden die Harze durch Vakuumfiltration entfernt und die Lösemittel werden zur Trockne eingedampft. Die Reinheit der Produkte (12a–j) wird durch RP-HPLC analysiert und die Anwesenheit der Verbindungen 12a–j wird durch Massenspektrometrie verifiziert. Beispiel 6B: Synthese von 4-(3-{4-[3-(Arylsulfonylamino)propylcarbamoyl]phenyl}indazol-1-yl)benzoesäureamiden (13a–d), wie dies in Schema 6 gezeigt ist. Schema 6:
Bedingungen: (a) DCM/Piperidin, (b) 6, DIC, HOBT, DMF, RT, 7 Stunden, (c) DCM/TEA, ArSO₂Cl, RT, 3 Stunden, (d) DCM/TFA, RT, 20 Minuten.
Das Rinkamidharz (500 mg, 0,28 mmol) wird mit Piperidin (20%) in Dichlormethan (10 ml) bei Raumtemperatur für 1 Stunde geschüttelt. Das Harz wird mit Portionen an Dichlormethan, Methanol und schließlich Dichlormethan gewaschen bis eine Probe des letzten Filtrats keine abgespaltene Schutzgruppe mehr aufweist. Das Harz wird in einer Lösung geschüttelt, die aus der Verbindung 6 (0,56 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (1,68 mmol), N,N'-Diisopropylcarbodiimid (2,24 mmol) und Dimethylformamid (35 ml) über Nacht bei Raumtemperatur hergestellt wird. Das Harz wird sorgfältig mit mehreren Portionen an Dimethylformamid, dann Methanol und schließlich Dichlormethan gewaschen. Das Waschen wird fortgesetzt, bis das letzte Filtrat keine Fluoreszenz mehr aufweist. Die Lösemittel werden unter verringertem Druck bei Raumtemperatur verdampft. Die Fmoc Schutzgruppe der an das Harz gebundenen Verbindung 6 wird entfernt, wie dies oben für die Schutzgruppenabspaltung des Rink-Amidharzes beschrieben ist. Das Harz wird für 30 Minuten unter verringertem Druck getrocknet. Portionen des Harzes (jeweils 80 mg) werden leicht in Dichlormethan (5 ml) gerührt, worin Triethylamin (10% V/V) enthalten ist. Es werden unterschiedliche Arylsulfonylchloride (a–d, jeweils 0,16 mmol) bei Raumtemperatur zugegeben. Nach 3 Stunden werden die Reagenzien abfiltriert und die Harze werden mit mehreren Portionen an Dichlormethan, Methanol und schließlich mit Dichlormethan gewaschen. Nach dem Trocknen in einem Exsikkator unter verringertem Druck wird jedes Harz mit 3 ml an Dichlormethan/Trifluoressigsäure (4/1) zur Abspaltung der Produkte behandelt. Die Spaltungslösungen werden durch Filtration gewonnen und die Harze werden mit 3 Portionen an Dichlormethan gewaschen (jeweils 2 ml). Die Lösemittel werden unter verringertem Druck in einem Exsikkator entfernt, der Natriumhydroxid enthält. Die Reinheit der Produkte (13a–d) wird durch RP-HPLC analysiert und die Anwesenheit der Verbindungen 13a–d wird durch Masenspektrometrie verifiziert:
13a: R = 4-Methylphenyl, Ausbeute: 31%, HPLC: 92%, MS (ESI⁺): 568 (M + H)⁺.
13b: R = 5-Dimethylamino-1-naphthyl, Ausbeute: 57%, HPLC: 85%, MS (ESI⁺): 647 (M + H)⁺.
13c: R = 3-Nitrophenyl, Ausbeute: 57%, HPLC: 85%, MS (ESI⁺): 599 (M + H)⁺.
13d: R = 4-Methoxyphenyl, Ausbeute: 79%, HPLC: 87%, MS (ESI⁺): 584 (M + H)⁺. (HPLC: 254 nm, prozentuale Fläche unter der Kurve). Beispiel 7B: 4-[3-(4-Carbamoylphenyl)indazol-1-yl]-N-[2-(cyclopropylmethylcarbamoyl)ethyl]benzamid (14), wie dies in Schema 7 gezeigt ist Schema 7:
Bedingungen:
(a) Fmoc-β-Alanin, HOBt, DIC, DMF, (b) DCM/Piperidin, (c) 4c, HOBt, DIC, DMF, (d) DCM/MeOH, Bestrahlung, 24 Stunden (366 nm).
Aminoethyl-Tentagelharz (Kapazität: 0,29 mmol/g) wird mit photolabilem 4-Brommethyl-3-nitrobenzoesäurelinker durch ein Standardverfahren beladen und anschließend mit Cyclopropylmethylamin umgesetzt, wie dies in Beispiel 5B beschrieben ist. Zu einer Lösung aus Fmoc-β-Alanin (181 mg, 0,58 mmol) und 1-Hydroxybenzotriazol (235 mg, 1,74 mmol) in DMF (5 ml) wird N,N'-Diisopropylcarbodiimid (293 mg, 2,32 mmol) gegeben. Die Lösung lässt man für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehen. Das mit Cyclopropylmethylamin beladene Harz (500 mg) wird zugegeben und es wird leicht für 12 Stunden gerührt. Das Harz wird abfiltriert und mit DMF, MeOH und DCM gewaschen. Das Harz wird zu einer Lösung (5 ml) des aktiven Esters der Verbindung 4c gegeben, der wie in Beispiel 5B beschrieben hergestellt wurde. Das Reaktionsgemisch wird bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Die Reagenzien werden durch Filtration entfernt. Das Harz wird mit mehreren Portionen an DMF, MeOH und schließlich DCM gewaschen. Das Harz wird in ein Gläschen überführt und mit DCM (5 ml) überschichtet. Es wird MeOH zugegeben, um eine Lösung gleicher Dichte zu erhalten. Das Gläschen wird unter Bestrahlung mit einer UV Lampe (366 nm) für 24 Stunden geschüttelt. Nach dieser Zeit wird das Harz durch Vakuumfiltration entfernt und die Lösemittel werden zur Trockne eingedampft. Die Reinheit des Produkts (14) wird durch RP-HPLC analysiert und die Anwesenheit der Verbindung 14 wird durch Massenspektrometrie verifiziert: m/e = 482 (MH⁺).
Lösemittel: Acetonitril/2% DMSO, Bereich in Klammern
Lösemittel: Acetonitril/2% DMSO, Bereich in Klammern
Literaturangaben:
Literatur, die sich auf die Synthese von 1,3-Diarylindazolen bezieht

Elderfield, R. C. in "Heterocyclic Compounds" (1957), Herausgeber Elderfield, R. C., Band 5, John Wiley & Sons, Inc., New York, Seite 162.
Dalla Croce, Piero, La Rosa, Concetta. Synthesis (1984), 11, 982–983.
Yan, B., Gstach, H. Tetrahedron Lett. (1996), 37(46), 8325–8328.
Wang, Q., Jochims, J., Koehlbrandt, S., Dahlenburg, L., Al-Talib, M., Hamed, A., Ismail, Abd El Hamid. Synthesis (1992), 7, 710–718.
Krishnan, R., Lang, S. A., Jr., Lin, Yang I, Wilkinson, R. G. J. Heterocycl. Chem. (1988), 25(2), 447–452.
Matsugo, Seiichi, Saito, Mitsuo, Kato, Yohko, Takamizawa, Akira. Chem. Pharm. Bull. (1984), 32(6), 2146–2153.
Matsugo, Seiichi, Takamizawa, Akira. Synthesis (1983), 10, 852.
Theilacker, W., Raabe, C. Tetrahedron Lett. (1966), 91–92.
Gladstone, W. A. F., Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1965), 3048–3052.
Fries, K., Fabel, K., Eckhardt, H. Justus Liebigs Ann. Chem. (1942), 550, 31–49.
Borsche, W., Scriba, W. Justus Liebigs Ann. Chem. (1939), 540, 83–98.
Huisgen, R., Seidel, M., Walibillich, G., Knupfer, H. Tetrahedron (19.62), 17, 3–29.
Gladstone, W. A. F., Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1965), 5177–5182.
Huisgen, R., Knupfer, H., Sustmann, R., Walibillich, G., Weberndörfer, V. Chem. Ber. (1967), 100, 1580–1592.
Fries, K., Tampke, H. Justus Liebigs Ann. Chem. (1927), 454, 303–324.
Pummerer, R., Buchta, E., Deimler, E. Chem. Ber. (1951), 84(7), 583–590.
Dennler, E. B., Frasca, A. R. Tetrahedron (1966), 22, 3131–3141.
Gladstone, W. A. F., Harrison, M. J., Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1966), 1781.

Literatur bezüglich optischer Spektroskopie, die sich auf Indazole bezieht

Saha, Subit K., Dogra, Sneh K. J. Photochem. Photobiol., A (1997), 110(3), 257–266.
Phaniraj, P., Mishra, Ashok K., Dogra, S. K. Indian J. Chem., Sect. A (1985), 24A(11), 913–917.
Mishra, A. K., Swaminathan, M., Dogra, S. K. J. Photochem. (1984), 26(1), 49–56.

Spezifische Literatur für Fluoreszenz- und UV Spektroskopie die in den Experimentalteilen verwendet wird

Melhuish, W. H. (1961) J. Phys. Chem. 65, 229.
Demas, J. N., & Crosby, G. A. (1971) J. Phys. Chem. 75, 991–1024.
Chen, R. F. (1972) J. of Research of the International Bureau of Standards, Band 76A Nr. 6, 593–606.
Lakowicz, J. R. (1983, Seiten 52–93, 112–153, 156–185) Principles of Fluorescence Spectroscopy, Plenum Press, New York und London.
Savage, M. D. et al., Avidin-Biotin Chemistry, Pierce Chemical Company, (1992).
Petrich, J. W., Chang, M. C., McDonald, D. B., Fleming, G. R., (1983) J. Am. Chem. Soc. 105, 3824–3832.
Szabo, A. G., Rayner, D. M. (1980) J. Am. Chem. Soc. 102, 554–563.
Pugliese, L., Coda, A., Malcovati, M., Bolognesi, M. (1993) J. Mol. Biol. 231, 698

Legenden zu den Figuren:
(i) 1

(a) Absorptionsspektrum von 25 μM der Verbindung 4e in THF und Fluoreszenzanregungssprektrum (---). Die kleine Rotverschiebung im Fluoreszenzanregungsspektrum wird durch Monochromatorabweichungen zwischen dem UV und dem Fluoreszenzinstrument verursacht.
(b) Fluoreszenzemission, 1 μM in THF, Anregung bei 342 nm.

(ii) 2

(a)–(i) Anregungs- und Emissionsspektren der AIDA-Konjugate 11, 9 und 8 (in der graphischen Darstellung jeweils als BLI, BPI und IBP bezeichnet) und Avidin-Tryptophan, Avidin-Lucifer Yellow und Avidin-BODIPY-FL zeigen die Überlappung der Emission und Anregung jeweils zwischen Tryptophan, BODIPY-FL und Lucifer Yellow.

(iii) 3
Obere Graphen:
Fluoreszenzresonanzenergietransfer und Grundzustandsabschwächung der 11 (BLI) (a) und 8 (IPB) (b) Tryptophan-Avidin-Komplexe, Die Kurven sind durch die Nummern 1 bis 5 zugeordnet. Die unterschiedlichen Spektren [I(11 oder 8(frei)) + I(Avidin(frei))] – I(11- oder 8-Avidinkomplex) sind in den Kurven 5 gezeigt. Die Fluoreszenz der Verbindung 11 wird durch Komplexierung in der Avidinbindungsstelle um etwa 25,5% abgeschwächt. Etwa 62% dieses gesamten Abschwächungseffekts ist Fluoreszenzresonanzenergietransfer. Von 250 nm bis 305 nm beträgt die Steigerung der Tryptophan- und Tyrosinfluoreszenzintensität 72% basierend auf der Summe der Verbindung 11 und Avidin. Die Bindung von Biotin an die Position 3 im Indazolmolekül (von Position 1 in der Verbindung 11) verändert nicht nur die Fluoreszenzspektren, sondern auch die Tryptophan → Indazol FRET Charakteristiken: Angedeutet durch eine Zunahme der Indazolfluoreszenzemission um 26% (anstelle einer Abschwächung) wird ein gesteigerter Energietransfer zu Tryptophan (120%) durch eine starke Zunahme der IndazolQuantenausbeute in der Avidinumgebung überlagert.
Untere Graphen:
Der Fluoreszenzresonanzenergietransfer und die Grundzustandsabschwächung in den 11(c) und 8(d) BODIPY-FL Avidinkomplexen. Die Kurven werden durch die Nummern 1 bis 5 zugeordnet. Bei beiden molekularen Geometrien, bei denen der Indazoltracer über die Position 1 (11) und die Position 3 (8) gebunden ist, verursacht die Bindung von BODIPY-FL-markiertem Avidin eine Abschwächung der Indazolemission von 70–90%. Diese Verringerung der Signalintensität kann durch eine Grundzustandsabschwächung des Indazols oder der FRET zu den BODIPY Markierungen an Avidin mit gleichzeitiger nicht-bestrahlender Dezimierung des angeregten Zustands verursacht werden. Obwohl das Überlappungsintegral zwischen der Indazolemission und dem BODIPY-FL Absorptionsspektrum für die Verbindung 8 kleiner ist als für die Verbindung 11, tritt eine stärkere Sensibilisierung der Akzeptorfluoreszenz im 8-Avidin-BODIPY-Komplex auf, was zu einem Fluoreszenzenergietransfer von 48% und einer Indazoldonorabschwächung von 93,5% führt. Dieser Effekt kann durch eine höhere Donorquantenausbeute oder eine bevorzugte relative Orientierung der Donoremissions- und Akzeptorabsorptionsdipole in der Verbindung 8 verursacht werden.

Claims

Verbindung, die durch die Formel (I) dargestellt wird
(Formel (I)) worin eines von R¹ oder R² und eines von R³ oder R⁴ für Wasserstoff steht und das andere unabhängig steht für -COOH, -COOR⁷, -CONH₂, -CONH(CH₂)_nOH, -CONR⁸R⁹, -CH₂OH-, -CH₂NH₂, -NO₂, NR¹⁰R¹¹, NHCOR¹², Cl, Br, F, -CF₃, C₁-C₄ Alkoxy, das unsubstituiert oder durch Methyl oder Phenyl an einem der Kohlenstoffe C₁-C₄ substituiert sein kann, -N=C=O, N=C=S, -SO₃H, -SO₂NH(CH₂)_nNH₂, C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₁₆ Alkyl, das am terminalen Kohlenstoff substituiert ist mit -COOH, -COOR⁷, -CONH₂, -CONR⁸R⁹, -CONH(CH₂)_nOH, -CH₂OH, -CH₂NH₂, -N=C=O, N=C=S, -SO₃H, -SO₂NH(CH₂)_nNH₂, -CONH(CH₂)_nNH₂, worin die NH₂-Gruppe unsubstituiert oder durch eine herkömmlich verwendete Aminoschutzgruppe oder durch C₁-C₄ Alkyl substituiert ist, eines von R⁵ oder R⁶ für Wasserstoff steht und das andere steht für Wasserstoff, Halogen, C₁-C₄ Alkoxy, das unsubstituiert oder durch Methyl oder Phenyl an einem der Kohlenstoffe C₁-C₄ substituiert ist, -NO₂, NR¹⁰R¹¹, NHCOR¹², C₁-C₄ Alkyl, C₁-C₁₆ Alkyl, das am terminalen Kohlenstoff substituiert ist mit -COOH, -COOR⁷, -CONH₂, -CONR⁸R⁹, -CONH(CH₂)_nOH, -CH₂OH, -CH₂NH₂, -N=C=O, N=C=S, -SO₃H, -SO₂NH(CH₂)_nNH₂, -CONH(CH₂)_nNH₂, worin die NH₂-Gruppe unsubstituiert oder durch C₁-C₄ Alkyl oder eine herkömmlich verwendete Aminoschutzgruppe substituiert ist, R⁷ für eine herkömmlich verwendete Carboxylschutzgruppe oder Carboxylaktivierungsgruppe steht, R⁸ oder R⁹ für Wasserstoff steht und das andere für C₁-C₄ Alkyl, Phenyl oder Benzyl steht oder R⁸ und R⁹ Teil eines fünf- oder sechsgliedrigen Rings sind, R¹⁰ und R¹¹ unabhängig für Wasserstoff, C₁-C₄ Alkyl oder eine Aminoschutzgruppe stehen, R¹² für C₁-C₁₀ Alkyl, Phenyl, wobei das Alkyl oder Phenyl unsubstituiert oder durch C₁-C₄ Alkyl substituiert ist, oder für eine geschützte Aminogruppe steht, worin die Schutzgruppe eine herkömmlich verwendete Aminoschutzgruppe oder Halogen ist und n für 2 bis 8 steht, mit der Maßgabe, dass die Verbindung
und die Verbindung der Formel
ausgeschlossen sind.
Verbindungen nach Anspruch 1, worin eine herkömmlich verwendete Aminoschutzgruppe aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus tert-Butyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethoxycarbonyl, Phthalimido, Trifluoracetamido, Methoxycarbonyl, Ethoxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Allyloxycarbonyl, 2,2,2-Trichlorethoxycarbonyl und 2-(Trimethylsilyl)ethoxycarbonyl.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 oder 2 der Formeln
Verbindung der Formel (II) oder (III) A-B-D-C-D'-E (Formel (II)) A-B-D-E-D'-C (Formel (III))worin A für einen festen Träger steht, der aus Standardmaterialien ausgewählt ist, die in der organischen Festphasen- und Flüssigphasenchemie verwendet werden, B für einen Linker steht, der eine Abspaltung der Fluoreszenzkonjugate der Formel (II) oder (III) unter Freisetzung jeweils des D-C-D'-E oder D-E-D'-C Fragments erlaubt, C für eine Verbindung steht, die aus der Formel (I) ausgewählt ist, D und D' unabhängig für eine Bindung oder einen Spacer stehen, der ausgewählt ist aus α,ω-Diaminoalkanen, Diaminocyclohexyl, Bisaminomethyl-substituiertem Phenyl, α-Amino-ω-hydroxyalkanen, Alkylaminen, cyclischen Alkylaminen oder cyclischen Alkyldiaminen oder Aminosäuren ohne oder mit einer zusätzlichen Funktionalität in der Seitenkette, E für das zu untersuchende Molekül steht.
Verbindung nach Anspruch 4, worin A ausgewählt ist aus funktionalisierten auf Polystyrol basierenden Harzen, auf Polyacrylamid basierenden Polymeren, Polystyrol/Polydimethylacrylamidkompositen, PEGA^® Harzen, auf Polystyrol-Polyoxyethylen-basierenden Trägern, Tentagel^®-PRG^®-Polystyrolpfropfpolymerträgern, Glasoberflächen, funktionalisierten Oberflächen, Materialien, die mit funktionalisierten Oberflächen ausgestattet sind oder Polyethylenglycol, B ausgewählt ist aus Benzyl, Benzhydryl, Benzhydryliden, Trityl, Xanthenyl, Benzoin, Silicium oder Allyl-basierten Linkern, C für eine Verbindung steht, die aus der Formel (I) ausgewählt ist, E für eine niedermolekulare Verbindung, ein Peptid, ein Protein, ein Kohlenhydrat, eine Nukleinsäure oder ein Lipid steht, das eine funktionelle Gruppe für eine Konjugatbildung enthält.
Verbindungen nach Anspruch 4 oder 5, die durch die folgenden Strukturen dargestellt werden
Verbindungen, die durch die Formel (IV) dargestellt werden E-D'-C (Formel (IV))worin E das zu untersuchende Molekül ist, D' für eine Bindung oder einen Spacer steht, der ausgewählt ist aus α,ω-Diaminoalkanen, Diaminocyclohexyl, Bisaminomethyl-substituiertem Phenyl, α-Amino-ω-hydroxyalkanen, Alkylaminen, cyclischen Alkylaminen, cyclischen Alkyldiaminen oder Aminosäuren ohne oder mit einer zusätzlichen Funktionalität in der Seitenkette, C für eine Verbindung steht, die aus Formel (I) ausgewählt ist.
Verbindungen nach Anspruch 7, die durch die folgenden Strukturen dargestellt werden
Verfahren zur Identifizierung einer Wechselwirkung zwischen einem mit AIDA markierten Molekül und einer zu untersuchenden Verbindung in homogener Lösung, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Schritt 1A: Bereitstellung eines mit AIDA markierten Moleküls, das aus der Formel (IV) nach Anspruch 7 oder 8 ausgewählt ist, Schritt 1B: Mischung des mit AIDA markierten Moleküls von Schritt 1A mit der zu untersuchenden Verbindung und dann Schritt 1C: Selektive Detektion eines Bindungsereignisses zwischen dem mit AIDA markierten Molekül und der zu untersuchenden Verbindung durch Fluoreszenzspektroskopiemethoden.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Verfahren der Fluoreszenzspektroskopie Messungen sind der • Zunahme der Fluoreszenzanisotropie/-polarisation der AIDA Emission in Fluorometern mit Continuous Wave = promptem = Dauerstrichbetrieb • Erhöhung der rotierenden Korrelationszeit in zeitlich auflösenden Fluoreszenzgeräten • Erhöhung der Translationsdiffusionszeit in Einzelmolekülfluoreszenzexperimenten, die aus Autokorrelationsberechnungen auf der Zeitachse der Fluoreszenzfluktuationen bestimmt werden • Erhöhung oder Verringerung der AIDA Fluoreszenzemission im Wellenlängenbereich zwischen 350 nm und 750 nm mit Anregungswellenlängen im Bereich 300 nm und 400 nm, • Fluoreszenzresonanzenergietransfer (Donorabschwächung oder Akzeptorsensibilisierung) des angeregten Tryptophans (Donor) im Bindemolekül, das in diesem Fall ein Peptid oder Protein ist, zum AIDA Farbstoff (Akzeptor) im Molekül des Konjugats, • Fluoreszenzresonanzenergietransfer (Donorabschwächung oder Akzeptorsensibilisierung) des angeregten AIDA Farbstoffs im Konjugatmolekül (Donor) zur Fluoreszenzmarkierung (Akzeptor) des Bindemoleküls, das in diesem Fall jede Verbindungsklasse umfassen kann.
Verfahren zur Identifizierung einer Wechselwirkung zwischen dem mit AIDA markierten Molekül auf dem festen Träger, der herkömmlich in der organischen Festphasenchemie verwendet wird, und einem Bindemolekül in homogener Lösung, die den festen Träger enthält, worin das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: Schritt 2A: Bereitstellung eines mit AIDA markierten Moleküls der Formel (II oder III) nach einem der Ansprüche 4 bis 6, Schritt 2B: Mischung des mit AIDA markierten Moleküls von Schritt 2A mit einer zu untersuchenden Verbindung, Schritt 2C: Selektive Detektion eines Bindungsereignisses mit dem AIDA-markierten Molekül und der zu untersuchenden Verbindung durch Fluoreszenzspektroskopie unter Bildung eines quantitativen Signals, das ein Mittel zur Identifizierung des an AIDA gebundenen Moleküls der zu untersuchenden Verbindung der Formel IV mit der höchsten Bindungsaffinität bereitstellt, Schritt 2D: Isolierung des festen Trägers, der das identifizierte, mit AIDA markierte Molekül enthält, das durch die Formel (II oder III) dargestellt wird, wobei ein Bindungseffekt in Schritt 2C detektiert wird, und Schritt 2E: Selektive Detektion eines Bindungsereignisses zwischen dem mit AIDA markierten Molekül und der zu untersuchenden Verbindung durch Fluoreszenzspektroskopie.
Verfahren nach Anspruch 11, worin die spektroskopischen Fluoreszenzverfahren in Schritt 2C oder Schritt 2E bewirkt werden durch • Direkte Detektion der Bindung der Fluoreszenz-markierten Makromoleküle an AIDA enthaltende feste Träger unter Anwendung von konfokalen mikroskopischen und spektroskopischen Techniken • Messung der Erhöhung der Veränderung in der molekularen Helligkeit durch chemische Bindung von AIDA an ein zweites auf die Umgebung sensitives Molekül, das herkömmlich bei der konventionellen Fluoreszenzspektroskopie verwendet wird, die während der Synthese der Verbindung am festen Träger ausgeführt wird, • Messung des Fluoreszenzresonanzenergietransfers: Von AIDA auf einen geeigneten langwelligen Farbstoff, der hierdurch mittels AIDA UV-Anregung sensibilisiert wurde, und durch die Veränderung in der molekularen Helligkeit an der Emissionswellenlänge des langwelligen Farbstoffs detektiert wird, • Messung des Fluoreszenzresonanzenergietransfers: Verringerung der spezifischen Helligkeit von AIDA am Molekül, das an den festen Träger gebunden ist, bei einer Anregung bei Wellenlängen von 351 nm und einer Emission von 400 nm, • Detektion der Veränderung der Quantenausbeute durch die Messung der Verringerung oder Erhöhung der molekularen Helligkeit durch eine zeitlich auflösende Einzelmolekülspektroskopie.