JP2002533329A - 固相および液相スクリーニング用の蛍光色素 - Google Patents
固相および液相スクリーニング用の蛍光色素Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、式(Ｉ)
【化１】
Description
【０００１】 (技術分野) 本発明は、新規な包括的標識技術による、固相および均一溶液における超高速
処理スクリーニングの分野に関連する。新規標識技術は、新規な化学的に安定な
フルオロホアに基づき、それは、固体支持体への付加とその後の化合物ライブラ
リーのコンビナトリアル合成の開始のための反応性化学的機能を有する。
処理スクリーニングの分野に関連する。新規標識技術は、新規な化学的に安定な
フルオロホアに基づき、それは、固体支持体への付加とその後の化合物ライブラ
リーのコンビナトリアル合成の開始のための反応性化学的機能を有する。
【０００２】 (背景技術) ３つの新しい科学的研究分野は、薬物発見過程における予測性の増加の必要性
および全体的損耗率低下の必要性を満たす極めて高い見込みを示す。(１)機能ゲ
ノミクスは、新規な革新的分子標的を生ずることを目的とした。(２)コンビナト
リアル化学は、標的を探索する分子多様性を生ずる、ますます効率のよい方法を
提供する。(３)高速処理量スクリーニング(ＨＴＳ)プラットフォームは、可能性
あるリード化合物の発見に効率および品質を提供する。殆どの製薬会社における
高速処理スクリーニングは、現在、１年あたり数百万アッセイの実施を含む。同
時に、ＨＴＳは、検出／液体を扱う技術および自動化工程と組合せた、生化学、
生物物理学および細胞／分子生物学を吸収した確立された学問分野となった。こ
れら新規の科学的研究分野がもたらしたすべての素晴らしい機会と共に、機能ゲ
ノミクスにおける時間のかかる過程は新規タンパク質の生理的機能の同定である
ということが明らかとなった。コンビナトリアル化学が、古典的な合成に必要な
時間の間に数倍の化合物の合成を行う一方で、５から１０倍のアッセイがスクリ
ーニングからのヒット化合物の同定に必要となることが現在知られている。応用
科学の社会が現在直面する挑戦は、合成、タンパク質機能同定およびスクリーニ
ングの過程をスピードアップすることにより時間的に(１)および(２)の利点を十
分に利用することである。本発明は、固相上の直接の化合物のスクリーニングに
必要な効率を提供することにより、コンビナトリアル化学およびゲノミクスの利
点をＨＴＳと統合する新しい可能性を開示する。標的巨大分子は、たとえ機能が
知られていなくても、目的化合物に対する直接の結合親和性につい試験し得る。
以下でＡＩＤＡ化学として一般的に述べられている、新規蛍光化学はまた、ＡＩ
ＤＡ化学と結合する化合物の直接の適用によるか、または既知の化学的もしくは
光物理学的手段による固相からのＡＩＤＡ結合物の切断によるか、何れかにより
、均一溶液中のスクリーニングアッセイに適当である。固相スクリーニング技術
において同定されたＡＩＤＡ結合“バインダー”の解離後、目的の巨大分子への
親和性は、マイクロタイタープレートで使用のアッセイ容積における通常の全体
平均蛍光分光学的技術により決定され得る。加えて、マイクロタイター容積で実
施され、いわゆるナノキャリアーに適用される単一分子分光学的技術が、使用さ
れ得る。
および全体的損耗率低下の必要性を満たす極めて高い見込みを示す。(１)機能ゲ
ノミクスは、新規な革新的分子標的を生ずることを目的とした。(２)コンビナト
リアル化学は、標的を探索する分子多様性を生ずる、ますます効率のよい方法を
提供する。(３)高速処理量スクリーニング(ＨＴＳ)プラットフォームは、可能性
あるリード化合物の発見に効率および品質を提供する。殆どの製薬会社における
高速処理スクリーニングは、現在、１年あたり数百万アッセイの実施を含む。同
時に、ＨＴＳは、検出／液体を扱う技術および自動化工程と組合せた、生化学、
生物物理学および細胞／分子生物学を吸収した確立された学問分野となった。こ
れら新規の科学的研究分野がもたらしたすべての素晴らしい機会と共に、機能ゲ
ノミクスにおける時間のかかる過程は新規タンパク質の生理的機能の同定である
ということが明らかとなった。コンビナトリアル化学が、古典的な合成に必要な
時間の間に数倍の化合物の合成を行う一方で、５から１０倍のアッセイがスクリ
ーニングからのヒット化合物の同定に必要となることが現在知られている。応用
科学の社会が現在直面する挑戦は、合成、タンパク質機能同定およびスクリーニ
ングの過程をスピードアップすることにより時間的に(１)および(２)の利点を十
分に利用することである。本発明は、固相上の直接の化合物のスクリーニングに
必要な効率を提供することにより、コンビナトリアル化学およびゲノミクスの利
点をＨＴＳと統合する新しい可能性を開示する。標的巨大分子は、たとえ機能が
知られていなくても、目的化合物に対する直接の結合親和性につい試験し得る。
以下でＡＩＤＡ化学として一般的に述べられている、新規蛍光化学はまた、ＡＩ
ＤＡ化学と結合する化合物の直接の適用によるか、または既知の化学的もしくは
光物理学的手段による固相からのＡＩＤＡ結合物の切断によるか、何れかにより
、均一溶液中のスクリーニングアッセイに適当である。固相スクリーニング技術
において同定されたＡＩＤＡ結合“バインダー”の解離後、目的の巨大分子への
親和性は、マイクロタイタープレートで使用のアッセイ容積における通常の全体
平均蛍光分光学的技術により決定され得る。加えて、マイクロタイター容積で実
施され、いわゆるナノキャリアーに適用される単一分子分光学的技術が、使用さ
れ得る。
【０００３】 本発明の要旨 本発明は、特定の蛍光色素について述べ、それは、固相および均一溶液の両方
における高速処理スクリーニングに使用され得る。一般的にＡＩＤＡ化学と呼ば
れる新規蛍光色素は、疾病に対する治療的使用のために検討されるべき分子の合
成のための固相および溶液相有機化学の種々の方法に適当である。治療目的の当
該分子は、以下の２つの方法によって蛍光結合体として合成される：(ａ)固体支
持体に最初に蛍光色素を付加した切断可能なリンカー(酸、塩基、酸化還元、ま
たは光感受性)を負荷する。当該色素は、スペーサーエレメントのための付加点
としての役割をする第２官能性を有する。当該スペーサーは、検討されるべき分
子の合成の開始点として使用される更なる官能基を有する；(ｂ)蛍光色素はまた
、一連の反応の最後の合成ステップにおいてエンドキャップとして導入され得る
。本発明で述べられる特定色素は、固相および溶液相有機化学において通常適用
される広範囲の反応条件の下、化学的に安定である。当該結合体は、吸収波長の
励起により可視およびＵＶスペクトルの蛍光を放射する。これら蛍光性は、分子
相互作用の阻害剤の同定ための、およびペプチド、タンパク質、核酸、炭化水素
などのような標的巨大分子に結合する分子の同定のための蛍光に基く方法におい
て複数の適用がなされ得る。巨大分子とＡＩＤＡ結合する化合物の結合のモニタ
ーに使用する蛍光検出技術には、蛍光強度、非等方性(偏光性)、蛍光共鳴エネル
ギー移動、蛍光寿命、回転相関時間および単一分子分光学的技術(ＳＭＳ)におけ
る変化を検出する通常の巨視的技術(全体平均)が含まれる。ＳＭＳには、３２５
nm、３５１nm、４５３nm、４８８nm、５１４nm、５４３nm、６３２nmおよび他の
励起可能性のある波長であるレーザー光線を含む１つまたは２つのレーザー波長
による励起が含まれる。単一分子から放射され、単一分子スペクトル分析で適用
される共焦点法により分散された蛍光は、１または２個のフィルターを経て、光
がアバランシュ光ダイオード検出器に到達する前に、偏光子を通過する。ＡＩＤ
Ａに適用されるＳＭＳの包括的検出技術には、移転放散(translational diffusi
on)、回転放散(rotational diffusion)、蛍光寿命(fluorescence lifetime)、蛍
光明度(fluorescence brightness)、スペクトルシフト(spectral shift)、蛍光
エネルギー移動(fluorescence energy transfer)、三重線遷移可能性および複合
検出(triplet transition probabilities and multiplex detection)が含まれる
。化学変換において有意な安定性を示す色素は、わずかに三重状態形成し、生体
分子群への結合イベントの検出に使用される条件下で光化学反応せず、コンビナ
トリアル化学(固相および溶液相化学)および生物学的調査(超高速処理スクリー
ニング)の組合せのための優れたツールとなる。色素の使用には、固相および溶
液相有機化学、低分子量化合物標識、ペプチド標識、タンパク質標識、光学的ス
ペクトル分析および蛍光が含まれる。官能性色素および色素結合体の合成(固相
および溶液において)を開示する。
における高速処理スクリーニングに使用され得る。一般的にＡＩＤＡ化学と呼ば
れる新規蛍光色素は、疾病に対する治療的使用のために検討されるべき分子の合
成のための固相および溶液相有機化学の種々の方法に適当である。治療目的の当
該分子は、以下の２つの方法によって蛍光結合体として合成される：(ａ)固体支
持体に最初に蛍光色素を付加した切断可能なリンカー(酸、塩基、酸化還元、ま
たは光感受性)を負荷する。当該色素は、スペーサーエレメントのための付加点
としての役割をする第２官能性を有する。当該スペーサーは、検討されるべき分
子の合成の開始点として使用される更なる官能基を有する；(ｂ)蛍光色素はまた
、一連の反応の最後の合成ステップにおいてエンドキャップとして導入され得る
。本発明で述べられる特定色素は、固相および溶液相有機化学において通常適用
される広範囲の反応条件の下、化学的に安定である。当該結合体は、吸収波長の
励起により可視およびＵＶスペクトルの蛍光を放射する。これら蛍光性は、分子
相互作用の阻害剤の同定ための、およびペプチド、タンパク質、核酸、炭化水素
などのような標的巨大分子に結合する分子の同定のための蛍光に基く方法におい
て複数の適用がなされ得る。巨大分子とＡＩＤＡ結合する化合物の結合のモニタ
ーに使用する蛍光検出技術には、蛍光強度、非等方性(偏光性)、蛍光共鳴エネル
ギー移動、蛍光寿命、回転相関時間および単一分子分光学的技術(ＳＭＳ)におけ
る変化を検出する通常の巨視的技術(全体平均)が含まれる。ＳＭＳには、３２５
nm、３５１nm、４５３nm、４８８nm、５１４nm、５４３nm、６３２nmおよび他の
励起可能性のある波長であるレーザー光線を含む１つまたは２つのレーザー波長
による励起が含まれる。単一分子から放射され、単一分子スペクトル分析で適用
される共焦点法により分散された蛍光は、１または２個のフィルターを経て、光
がアバランシュ光ダイオード検出器に到達する前に、偏光子を通過する。ＡＩＤ
Ａに適用されるＳＭＳの包括的検出技術には、移転放散(translational diffusi
on)、回転放散(rotational diffusion)、蛍光寿命(fluorescence lifetime)、蛍
光明度(fluorescence brightness)、スペクトルシフト(spectral shift)、蛍光
エネルギー移動(fluorescence energy transfer)、三重線遷移可能性および複合
検出(triplet transition probabilities and multiplex detection)が含まれる
。化学変換において有意な安定性を示す色素は、わずかに三重状態形成し、生体
分子群への結合イベントの検出に使用される条件下で光化学反応せず、コンビナ
トリアル化学(固相および溶液相化学)および生物学的調査(超高速処理スクリー
ニング)の組合せのための優れたツールとなる。色素の使用には、固相および溶
液相有機化学、低分子量化合物標識、ペプチド標識、タンパク質標識、光学的ス
ペクトル分析および蛍光が含まれる。官能性色素および色素結合体の合成(固相
および溶液において)を開示する。
【０００４】 本発明は、式(Ｉ)
【化５】 [式中、基Ｒ１またはＲ２の１つおよび基Ｒ３またはＲ４の１つは、水素であり
、その他は、独立して−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８ Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ ＮＨ２、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、−ＣＦ ３ 、Ｏ(Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により任意の炭素Ｃ１−Ｃ４においてメチ
ルまたはフェニルにより置換されている)、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ
３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、末端炭素が−Ｃ
ＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２) ｎ ＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ
＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎ ＮＨ２{ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルによ
り、またはtert−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２,２,２−
トリクロロエトキシカルボニル、２−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルの
ような通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(Ｃ１−Ｃ １６ )−アルキルであり、そして
、その他は、独立して−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８ Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ ＮＨ２、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、−ＣＦ ３ 、Ｏ(Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により任意の炭素Ｃ１−Ｃ４においてメチ
ルまたはフェニルにより置換されている)、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ
３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、末端炭素が−Ｃ
ＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２) ｎ ＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ
＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎ ＮＨ２{ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルによ
り、またはtert−ブチルオキシカルボニル、９−フルオレニルメトキシカルボニ
ル、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシ
カルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２,２,２−
トリクロロエトキシカルボニル、２−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルの
ような通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(Ｃ１−Ｃ １６ )−アルキルであり、そして
【０００５】 基Ｒ５またはＲ６の１つは、水素であり、その他のものは水素、ハロゲン、Ｏ(
Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により、任意の炭素Ｃ１−Ｃ４でメチルまたはフェ
ニルで置換されている)、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、(Ｃ１−
Ｃ４)アルキル、末端炭素が−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯ
ＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−
ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２) ｎ ＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２{式中、ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２
−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルにより、またはtert−ブチルオキシカルボニ
ル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フタルイミド、トリフルオロアセト
アミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル
、アリルオキシカルボニル、２,２,２−トリクロロエトキシカルボニル、２−(
トリメチルシリル)エトキシカルボニルのような通常使用されるアミノ保護基に
より置換され得る}で置換された(Ｃ１−Ｃ１６)−アルキルであり、
Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により、任意の炭素Ｃ１−Ｃ４でメチルまたはフェ
ニルで置換されている)、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、(Ｃ１−
Ｃ４)アルキル、末端炭素が−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯ
ＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−
ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２) ｎ ＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２{式中、ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２
−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルにより、またはtert−ブチルオキシカルボニ
ル、９−フルオレニルメトキシカルボニル、フタルイミド、トリフルオロアセト
アミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル
、アリルオキシカルボニル、２,２,２−トリクロロエトキシカルボニル、２−(
トリメチルシリル)エトキシカルボニルのような通常使用されるアミノ保護基に
より置換され得る}で置換された(Ｃ１−Ｃ１６)−アルキルであり、
【０００６】 Ｒ７は、スクシンイミジル、アジド、フェニル、４−ニトロフェニルのようなカ
ルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基、およびそれぞれ活性化用にペン
タフルオロフェニルおよび保護用にメチル、β−置換エチル、２,２,２−トリク
ロロエチル、tert−ブチル、アリル、ベンジル、ベンズヒドリル、４−ニトロベ
ンジル、２−(４−トルエンスルホニル)エチル、シリル、２−(トリメチルシリ
ル)エチル、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＢＯＭ、ＭＴＭおよびＳＥＭを通常使用し、
ルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基、およびそれぞれ活性化用にペン
タフルオロフェニルおよび保護用にメチル、β−置換エチル、２,２,２−トリク
ロロエチル、tert−ブチル、アリル、ベンジル、ベンズヒドリル、４−ニトロベ
ンジル、２−(４−トルエンスルホニル)エチル、シリル、２−(トリメチルシリ
ル)エチル、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＢＯＭ、ＭＴＭおよびＳＥＭを通常使用し、
【０００７】 Ｒ８またはＲ９は、水素であり、その他のものは、低級アルキル(Ｃ１−Ｃ４)、
フェニル、ベンジルまたはＲ８およびＲ９は、ピペラジンのような５または６員
環の一部であり、
フェニル、ベンジルまたはＲ８およびＲ９は、ピペラジンのような５または６員
環の一部であり、
【０００８】 Ｒ１０およびＲ１１は、独立して水素、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはアミノ保護
基(適当な保護基は上記の通り)であり、
基(適当な保護基は上記の通り)であり、
【０００９】 Ｒ１２は、何れも(Ｃ１−Ｃ４)アルキルで置換され得る(Ｃ１−Ｃ１０)アルキル
、フェニル、保護(適当な保護基は上記の通り)アミノ基またはハロゲンである]
により示される蛍光色素を目的とする。
、フェニル、保護(適当な保護基は上記の通り)アミノ基またはハロゲンである]
により示される蛍光色素を目的とする。
【００１０】 これら態様の好ましい実施態様は、下記構造ａ−ｘにより示される蛍光性イン
ダゾール色素である。
ダゾール色素である。
【化６】
【００１１】 本発明の他の態様は、式(II−III)により示される蛍光性結合体を目的とする
Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'−Ｅ(式(II)) Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(III))
Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'−Ｅ(式(II)) Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(III))
【００１２】 [式中、Ａは、固相および溶液相有機化学に適用される標準的物質(例えば、官能
化ポリスチレン基礎樹脂、ポリアクリルアミド基礎ポリマー、ポリスチレン／ポ
リジメチルアクリルアミド組成物、ＰＥＧＡ樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエ
チレン基礎支持体、Tentagel、ＰＥＧ−ポリスチレングラフトポリマー性支持体
、ガラス表面、官能化表面、官能化表面でグラフトした物質またはポリエチレン
グリコール)から選択される固体支持体であり、
化ポリスチレン基礎樹脂、ポリアクリルアミド基礎ポリマー、ポリスチレン／ポ
リジメチルアクリルアミド組成物、ＰＥＧＡ樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエ
チレン基礎支持体、Tentagel、ＰＥＧ−ポリスチレングラフトポリマー性支持体
、ガラス表面、官能化表面、官能化表面でグラフトした物質またはポリエチレン
グリコール)から選択される固体支持体であり、
【００１３】 Ｂは、Ｄ−Ｃ−Ｄ'−ＥまたはＤ−Ｅ−Ｄ'−Ｃフラグメント、それぞれの均衡の
ために式(II−III)の蛍光性結合体を切断し得るリンカーであり、Ｂは、既知の
酸不安定性、塩基不安定性、光不安定性、酸化還元不安定性、およびマスクされ
たリンカーであって、コンビナトリアル合成、ペプチド合成、およびオリゴヌク
レオチド合成に適当されるリンカー(例えば、ベンジル、ベンズヒドリル、ベン
ズヒドリリデン(benzhydryliden)、トリチル、キサンチエニル、ベンゾイン、シ
リコンまたはアリル基礎リンカー)であり、
ために式(II−III)の蛍光性結合体を切断し得るリンカーであり、Ｂは、既知の
酸不安定性、塩基不安定性、光不安定性、酸化還元不安定性、およびマスクされ
たリンカーであって、コンビナトリアル合成、ペプチド合成、およびオリゴヌク
レオチド合成に適当されるリンカー(例えば、ベンジル、ベンズヒドリル、ベン
ズヒドリリデン(benzhydryliden)、トリチル、キサンチエニル、ベンゾイン、シ
リコンまたはアリル基礎リンカー)であり、
【００１４】 Ｃは、式(Ｉ)から選択された化合物であり、
【００１５】 ＤおよびＤ'は、独立した結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミ
ノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒ
ドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジ
アミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択
されるスペーサーであり、
ノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒ
ドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジ
アミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択
されるスペーサーであり、
【００１６】 Ｅは、調査される分子、例えば、低分子量化合物、ペプチド、タンパク質、炭化
水素、核酸、または付加用の官能基を生ずる脂質である]。
水素、核酸、または付加用の官能基を生ずる脂質である]。
【００１７】 式(II)の結合体は、以下の２つの独立したプロトコールを通じて：(ａ)Ａ−Ｂ
−Ｃ−Ｄ'またはＡ−Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'フラグメントそれぞれのスペーサーＤ'の
官能基を組み込む分子Ｅの新たな合成により、(ｂ)Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ'またはＡ−
Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'フラグメントそれぞれへ(例えば、アミノまたはカルボキシ末端
)の結合に適当な官能基を含む事前に形成された分子Ｅの付加により、生じ得る
。
−Ｃ−Ｄ'またはＡ−Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'フラグメントそれぞれのスペーサーＤ'の
官能基を組み込む分子Ｅの新たな合成により、(ｂ)Ａ−Ｂ−Ｃ−Ｄ'またはＡ−
Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'フラグメントそれぞれへ(例えば、アミノまたはカルボキシ末端
)の結合に適当な官能基を含む事前に形成された分子Ｅの付加により、生じ得る
。
【００１８】 式(III)の結合体は、Ａ−ＢまたはＡ−Ｂ−Ｄ結合で開始しその後Ｄ'−Ｃまた
はＣフラグメントでキャッピングされる分子Ｅの新たな合成によるか、またはＡ
−ＢまたはＡ−Ｂ−ＤおよびＤ'−ＣまたはＣフラグメント、それぞれへ(例えば
、アミノおよびカルボキシ末端)の結合に適当な官能基を含む事前に形成された
分子Ｅの付加により、生じ得る。
はＣフラグメントでキャッピングされる分子Ｅの新たな合成によるか、またはＡ
−ＢまたはＡ−Ｂ−ＤおよびＤ'−ＣまたはＣフラグメント、それぞれへ(例えば
、アミノおよびカルボキシ末端)の結合に適当な官能基を含む事前に形成された
分子Ｅの付加により、生じ得る。
【００１９】 式(II)により示される結合体の合成用のＣとして使用される式(Ｉ)の好ましい
化合物は、本発明の第１の態様の構造ａ、ｂ、ｇ、ｉ−ｋ、ｍ−ｘである。
化合物は、本発明の第１の態様の構造ａ、ｂ、ｇ、ｉ−ｋ、ｍ−ｘである。
【００２０】 式(III)により示される結合体の合成用のＣとして使用される式(Ｉ)の好まし
い化合物は、本発明の第１の態様の構造ａ−ｐ、ｕ−ｘである。
い化合物は、本発明の第１の態様の構造ａ−ｐ、ｕ−ｘである。
【００２１】 式(II)の好ましい結合体は、下記の構造により示される。
【化７】
【００２２】 式(III)の好ましい結合体は、下記の構造により示される。
【化８】
【００２３】 更なる本発明の態様は、式(IV) Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(IV)) [式中、Ｅは、調査する分子、例えば、低分子量化合物、ペプチド、タンパク質
、炭化水素、核酸、または付加用の官能基を生ずる脂質であり、
、炭化水素、核酸、または付加用の官能基を生ずる脂質であり、
【００２４】 Ｄ'は、結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル
、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アル
カン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖
に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサー
であり、
、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アル
カン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖
に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサー
であり、
【００２５】 Ｃは、式(Ｉ)から選択される化合物である] により示されるＡＩＤＡ結合体を目的とする。
【００２６】 式(IV)により示される結合体の合成用のＣとして使用する式(Ｉ)の好ましい化
合物は、式IIおよびIIIで与えられる。
合物は、式IIおよびIIIで与えられる。
【００２７】 式(IV)の好ましい化合物は、下記の構造により示される。
【化９】
【００２８】 本発明の詳細な方法論的／技術的態様 ＡＩＤＡ色素分子に基づく多くの可能な適用において、殆どの有望な検出法は
以下のものである。
以下のものである。
【００２９】 (１)固体支持体におけるＡＩＤＡ分子は、４５３nmで開始する通常のＡｒ−イ
オンおよびＨｅＮｅレーザー光線によっては、蛍光に励起し得ず、そのため、フ
ルオレセインまたはローダミンなどのような色素分子を励起する主に４８８nm、
５１４および５４３nm波長を用い、ＡＩＤＡ色素が、赤色(＞４５３nm)蛍光を用
いる任意の種類の検出技術による妨げなしに固体支持体における“サイレント”
蛍光マーカーとして使用され得る。
オンおよびＨｅＮｅレーザー光線によっては、蛍光に励起し得ず、そのため、フ
ルオレセインまたはローダミンなどのような色素分子を励起する主に４８８nm、
５１４および５４３nm波長を用い、ＡＩＤＡ色素が、赤色(＞４５３nm)蛍光を用
いる任意の種類の検出技術による妨げなしに固体支持体における“サイレント”
蛍光マーカーとして使用され得る。
【００３０】 (２)一旦、固体支持体から切断され、または可溶性化合物上で使用されると、
直接または切断後、ＡＩＤＡマーカーは、蛍光スペクトル分析に使用される種々
の方法により検出される励起源を３２５または３５１nmのＵＶレーザーで励起し
得る。
直接または切断後、ＡＩＤＡマーカーは、蛍光スペクトル分析に使用される種々
の方法により検出される励起源を３２５または３５１nmのＵＶレーザーで励起し
得る。
【００３１】 (ａ)蛍光実験に使用する通常のキュベットまたはマイクロタイタープレートで
は、標的巨大分子へのＡＩＤＡ含有化合物の結合は、回転数の減少により検出さ
れ得る。適用される検出パラメーターは、時間分解蛍光装置における回転相関時
間であるか(単一プロトンカウンティングまたは相ドメイン検出モードを用いる)
、または連続波＝プロンプト＝安定状態フルオロメーターの非等方性／偏光性に
よる。
は、標的巨大分子へのＡＩＤＡ含有化合物の結合は、回転数の減少により検出さ
れ得る。適用される検出パラメーターは、時間分解蛍光装置における回転相関時
間であるか(単一プロトンカウンティングまたは相ドメイン検出モードを用いる)
、または連続波＝プロンプト＝安定状態フルオロメーターの非等方性／偏光性に
よる。
【００３２】 (ｂ)単一分子蛍光実験では、蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決
定される移行放散時間の減少は、類似性の検出パラメーターである。
定される移行放散時間の減少は、類似性の検出パラメーターである。
【００３３】 (３)約３００nmから４００nmへの範囲の励起波長により、ＡＩＤＡ色素の放射
波長は、通常非常に広く約３５０nmから６００nmに到達する。文献において、Ｕ
Ｖ励起可能な色素は、強力な環境感受性を示すことが知られる。種々異なる種類
の、タンパク質などの結合パートナーとの光物理学的相互作用により、ＡＩＤＡ
を含むこれら色素の蛍光性放射は、荷電移動および電子移動機構を含む種々異な
る機構による蛍光の消光(quenching)または促進を示す。これは、量子収量の変
化またはより長いまたはより短い波長へのスペクトルのシフトを生じる。これら
は、シグナルパラメーターを用い、結合反応をモニターする。
波長は、通常非常に広く約３５０nmから６００nmに到達する。文献において、Ｕ
Ｖ励起可能な色素は、強力な環境感受性を示すことが知られる。種々異なる種類
の、タンパク質などの結合パートナーとの光物理学的相互作用により、ＡＩＤＡ
を含むこれら色素の蛍光性放射は、荷電移動および電子移動機構を含む種々異な
る機構による蛍光の消光(quenching)または促進を示す。これは、量子収量の変
化またはより長いまたはより短い波長へのスペクトルのシフトを生じる。これら
は、シグナルパラメーターを用い、結合反応をモニターする。
【００３４】 (４)ＡＩＤＡ基礎色素による適用の場合、他の適当な相互作用パラメーターは
、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)である。安定ＡＩＤＡ結合体(固体支持体
および溶液において)の吸収スペクトルの範囲および形は、タンパク質中の蛍光
性アミノ酸トリプトファンの放射と部分的に重複する優れたスペクトルを示す。
ＡＩＤＡ結合体の放射スペクトル(通常３５０と６００nmとの間)は、種々通常に
使用の、タンパク質の蛍光性標識(例えば、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミン、フルオ
レセイン、Ｃｙ)と部分的に重複する。これらスペクトルの性質は、励起トリプ
トファン(ドナー)から結合体の色素分子(アクセプター)への蛍光共鳴エネルギー
移動により、結合体と生体分子(標識または非標識)との結合イベントの検出を可
能とする。種々の実験構成では、蛍光共鳴エネルギー移動が、ＡＩＤＡ(ドナー)
の励起において生体分子と結合する、ＡＩＤＡ含有分子と蛍光標識(アクセプタ
ー)との間で生じ得る。要するに、巨視的蛍光実験(キュベットまたはマイクロタ
イタープレートにおいて多くの分子のシグナルを平均する)では、ＡＩＤＡ結合
体は、固体支持体のＦＲＥＴ実験において、または均一溶液において、蛍光ドナ
ーとしてまたは蛍光アクセプターとして使用され得る。トリプトファンおよび／
またはチロシン含有タンパク質による複合体形成は、ドナー(トリプトファン)消
光またはアクセプター(ＡＩＤＡ)増感により検出され得る。蛍光標識巨大分子(
標識には、３５０nmと６８０nmとの間で蛍光を励起できる全色素を含む)による
複合体形成は、ドナー(ＡＩＤＡ)消光またはアクセプター(３５０nmの場合より
も低い放射エネルギー)増感により検出され得る。
、蛍光共鳴エネルギー移動(ＦＲＥＴ)である。安定ＡＩＤＡ結合体(固体支持体
および溶液において)の吸収スペクトルの範囲および形は、タンパク質中の蛍光
性アミノ酸トリプトファンの放射と部分的に重複する優れたスペクトルを示す。
ＡＩＤＡ結合体の放射スペクトル(通常３５０と６００nmとの間)は、種々通常に
使用の、タンパク質の蛍光性標識(例えば、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミン、フルオ
レセイン、Ｃｙ)と部分的に重複する。これらスペクトルの性質は、励起トリプ
トファン(ドナー)から結合体の色素分子(アクセプター)への蛍光共鳴エネルギー
移動により、結合体と生体分子(標識または非標識)との結合イベントの検出を可
能とする。種々の実験構成では、蛍光共鳴エネルギー移動が、ＡＩＤＡ(ドナー)
の励起において生体分子と結合する、ＡＩＤＡ含有分子と蛍光標識(アクセプタ
ー)との間で生じ得る。要するに、巨視的蛍光実験(キュベットまたはマイクロタ
イタープレートにおいて多くの分子のシグナルを平均する)では、ＡＩＤＡ結合
体は、固体支持体のＦＲＥＴ実験において、または均一溶液において、蛍光ドナ
ーとしてまたは蛍光アクセプターとして使用され得る。トリプトファンおよび／
またはチロシン含有タンパク質による複合体形成は、ドナー(トリプトファン)消
光またはアクセプター(ＡＩＤＡ)増感により検出され得る。蛍光標識巨大分子(
標識には、３５０nmと６８０nmとの間で蛍光を励起できる全色素を含む)による
複合体形成は、ドナー(ＡＩＤＡ)消光またはアクセプター(３５０nmの場合より
も低い放射エネルギー)増感により検出され得る。
【００３５】 (５)ＳＭＳでは、ＡＩＤＡ結合体はまた、ドナーおよびアクセプターとして使
用され得る。ＦＲＥＴを生ずるトリプトファンの消光または促進、ＡＩＤＡまた
は赤色アクセプター色素(例えば、ローダミン)は、分子明度の変化によりモニタ
ーされる。しかし、トリプトファンのＵＶ励起は、フェムト秒周波数範囲のパル
スレーザーにより２−または３プロトン励起で可能となるのみであり、その一方
、ＡＩＤＡは、３２５nmまたは３５１nmのｃｗ−ＵＶ−レーザーにより励起され
得る。
用され得る。ＦＲＥＴを生ずるトリプトファンの消光または促進、ＡＩＤＡまた
は赤色アクセプター色素(例えば、ローダミン)は、分子明度の変化によりモニタ
ーされる。しかし、トリプトファンのＵＶ励起は、フェムト秒周波数範囲のパル
スレーザーにより２−または３プロトン励起で可能となるのみであり、その一方
、ＡＩＤＡは、３２５nmまたは３５１nmのｃｗ−ＵＶ−レーザーにより励起され
得る。
【００３６】 (６)下記のアッセイ検出スキームが、ＡＩＤＡおよびＳＭＳで可能となる。
【００３７】 (６.１)固相支持体において、 (ａ)サイレントＡＩＤＡ−１：ＡＩＤＡ含有固体支持体への蛍光標識巨大分子
の結合の直接の検出は、ＷＯ９５／３５４９２(Eigen, M. & Henco, K., Proces
sおよび複合混合物から選択的に抽出される成分用の装置)に述べられているもの
のような共焦点顕微鏡技術に適用される。
の結合の直接の検出は、ＷＯ９５／３５４９２(Eigen, M. & Henco, K., Proces
sおよび複合混合物から選択的に抽出される成分用の装置)に述べられているもの
のような共焦点顕微鏡技術に適用される。
【００３８】 (ｂ)サイレントＡＩＤＡ−２：連結化合物において蛍光的に標識したＡＩＤＡ
含有固体支持体により、６.１に述べられている方法を、２つの励起および２つ
の検出チャンネルを用い、適用し得る。固体支持体上の標識(例えば、ビーズの
内部において)は、５４３nmで励起され、５７０から５８０nmで検出され得る一
方、固体支持体上でＡＩＤＡ含有化合物への結合試験をする標的巨大分子は、６
３２nmで励起され、例えば、６７０と６９０nmの間で検出され得る。この２色励
起および放射方法は、２つの色素の放射シグナルを交差相関することにより、ま
たはスキャンニング共焦点内の検出時間スケールにおける２色の一致をモニター
することにより、固体支持体上の複合体形成の検出の特異性を強力に増大し得る
。
含有固体支持体により、６.１に述べられている方法を、２つの励起および２つ
の検出チャンネルを用い、適用し得る。固体支持体上の標識(例えば、ビーズの
内部において)は、５４３nmで励起され、５７０から５８０nmで検出され得る一
方、固体支持体上でＡＩＤＡ含有化合物への結合試験をする標的巨大分子は、６
３２nmで励起され、例えば、６７０と６９０nmの間で検出され得る。この２色励
起および放射方法は、２つの色素の放射シグナルを交差相関することにより、ま
たはスキャンニング共焦点内の検出時間スケールにおける２色の一致をモニター
することにより、固体支持体上の複合体形成の検出の特異性を強力に増大し得る
。
【００３９】 (ｃ)ＡＩＤＡ蛍光−２を含む：分子明度の変化は、固体支持体における化合物
合成の間に実施する通常の蛍光スペクトル分析に通常使用するため、第２環境的
感受性分子へのＡＩＤＡの化学的結合により、促進し得る。
合成の間に実施する通常の蛍光スペクトル分析に通常使用するため、第２環境的
感受性分子へのＡＩＤＡの化学的結合により、促進し得る。
【００４０】 (ｄ)ＡＩＤＡ蛍光−３を含む：(５)に一般的に述べるように、ＡＩＤＡから適
当な長波長色素のＦＲＥＴであって、それにより、ＡＩＤＡ ＵＶ−励起を用い
増感するＦＲＥＴは、長波長色素の放射波長の分子明度の変化により検出され得
る。このアクセプター増感は、光物理学的法則により、ドナーシグナルの消光を
含まなければならない。そのため、３５１nm励起および４００nm放射波長の特定
明度の減少は、そのうえ、巨大分子を適当に標識するＦＲＥＴとの結合反応のモ
ニターに適用し得る。
当な長波長色素のＦＲＥＴであって、それにより、ＡＩＤＡ ＵＶ−励起を用い
増感するＦＲＥＴは、長波長色素の放射波長の分子明度の変化により検出され得
る。このアクセプター増感は、光物理学的法則により、ドナーシグナルの消光を
含まなければならない。そのため、３５１nm励起および４００nm放射波長の特定
明度の減少は、そのうえ、巨大分子を適当に標識するＦＲＥＴとの結合反応のモ
ニターに適用し得る。
【００４１】 (ｅ)分子の分子明度における変化が、非常にしばしば、量子収量の変化と結び
ついているために、分子明度の変化をモニターする可能性ある全ての適用がまた
、ＳＭＳにおける時間分解モードで検出可能である。
ついているために、分子明度の変化をモニターする可能性ある全ての適用がまた
、ＳＭＳにおける時間分解モードで検出可能である。
【００４２】 (６.２)均一溶液において、 一般的に、６.１で述べる全ての単一分子分光学的検出技術はまた、６.１−ａ
を除く固相支持体からのＡＩＤＡ結合体の切断後、溶液中で適用され得る。
を除く固相支持体からのＡＩＤＡ結合体の切断後、溶液中で適用され得る。
【００４３】 それゆえ、本発明はまた、均一溶液中のＡＩＤＡ標識分子と結合分子との相互
作用の同定のための方法であって、下記ステップを含む方法に関係する： ステップ１Ａ：式(IV)から選択されるＡＩＤＡ標識分子を提供すること、 ステップ１Ｂ：式(IV)のＡＩＤＡ標識分子を結合分子と混合すること、そして、
次いで、 ステップ１Ｃ：蛍光スペクトル分析の方法により、ステップ１Ｂに述べたＡＩＤ
Ａ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること。
作用の同定のための方法であって、下記ステップを含む方法に関係する： ステップ１Ａ：式(IV)から選択されるＡＩＤＡ標識分子を提供すること、 ステップ１Ｂ：式(IV)のＡＩＤＡ標識分子を結合分子と混合すること、そして、
次いで、 ステップ１Ｃ：蛍光スペクトル分析の方法により、ステップ１Ｂに述べたＡＩＤ
Ａ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること。
【００４４】 蛍光スペクトル分析の方法は、 ・連続波＝プロンプト＝安定状態フルオロメーターのＡＩＤＡ放射の蛍光非等方
性／偏光性の増加、 ・時間分解蛍光装置における回転相関時間の増加、 ・蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決定される単一分子蛍光実験に
おける移行放散時間の増大 ・３００と４００nmの範囲の励起波長による３５０と７００nmの範囲の波長のＡ
ＩＤＡ蛍光放射の増加または減少 ・結合分子中の励起トリプトファン(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(ド
ナー消光またはアクセプター増感)、この場合、結合体の分子中のＡＩＤＡ色素(
アクセプター)に対するペプチドまたはタンパク質である、 ・結合分子の蛍光標識(アクセプター)に対する結合分子(ドナー)中の励起ＡＩＤ
Ａ色素からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、こ
の場合、任意の化合物クラスを含む、 の測定である。
性／偏光性の増加、 ・時間分解蛍光装置における回転相関時間の増加、 ・蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決定される単一分子蛍光実験に
おける移行放散時間の増大 ・３００と４００nmの範囲の励起波長による３５０と７００nmの範囲の波長のＡ
ＩＤＡ蛍光放射の増加または減少 ・結合分子中の励起トリプトファン(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(ド
ナー消光またはアクセプター増感)、この場合、結合体の分子中のＡＩＤＡ色素(
アクセプター)に対するペプチドまたはタンパク質である、 ・結合分子の蛍光標識(アクセプター)に対する結合分子(ドナー)中の励起ＡＩＤ
Ａ色素からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、こ
の場合、任意の化合物クラスを含む、 の測定である。
【００４５】 更に、本発明は、固相有機化学において通常使用される固体支持体上のＡＩＤ
Ａ標識分子と固体支持体を含む均一溶液中の結合分子との間の相互作用の同定の
方法であって、下記ステップを含む方法に関係する： ステップ２Ａ：式(IIまたはIII)の結合体としてＡＩＤＡ標識分子を提供するこ
と、 ステップ２Ｂ：式(IIまたはIII)の結合体としてのＡＩＤＡ標識分子を結合分子
と混合すること、そして、次いで、 ステップ２Ｃ：結合分子に対する最も高い結合親和性でＡＩＤＡ連結分子を同定
する方法を提供する定量的シグナルを生ずる蛍光スペクトル分析で使用する方法
により、ステップ２Ｂに述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イ
ベントを選択的に検出すること、 ステップ２Ｄ：式(IIまたはIII)により示される同定されたＡＩＤＡ分子を含む
固体支持体の単離、 ステップ２Ｅ：方法１Ａ−Ｃに述べた蛍光スペクトル分析を用いる種々の方法に
より、ステップ２Ｄで述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベ
ントを選択的に結合すること。
Ａ標識分子と固体支持体を含む均一溶液中の結合分子との間の相互作用の同定の
方法であって、下記ステップを含む方法に関係する： ステップ２Ａ：式(IIまたはIII)の結合体としてＡＩＤＡ標識分子を提供するこ
と、 ステップ２Ｂ：式(IIまたはIII)の結合体としてのＡＩＤＡ標識分子を結合分子
と混合すること、そして、次いで、 ステップ２Ｃ：結合分子に対する最も高い結合親和性でＡＩＤＡ連結分子を同定
する方法を提供する定量的シグナルを生ずる蛍光スペクトル分析で使用する方法
により、ステップ２Ｂに述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イ
ベントを選択的に検出すること、 ステップ２Ｄ：式(IIまたはIII)により示される同定されたＡＩＤＡ分子を含む
固体支持体の単離、 ステップ２Ｅ：方法１Ａ−Ｃに述べた蛍光スペクトル分析を用いる種々の方法に
より、ステップ２Ｄで述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベ
ントを選択的に結合すること。
【００４６】 ステップ２Ｃの蛍光分光学的方法は、 ・共焦点顕微鏡および分光学的技術に適用されるＡＩＤＡ含有固体支持体への蛍
光標識巨大分子の結合の直接検出、 ・固体支持体上の化合物の合成の間に実施される通常の蛍光スペクトル分析に通
常使用するための、第２環境的感受性分子へのＡＩＤＡの化学的結合による、分
子明度の変化の促進の測定、 ・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：ＡＩＤＡから適当な長波長色素の蛍光共鳴エ
ネルギー移動であって、それにより、長波長色素の放射波長の分子明度の変化に
より検出さるＡＩＤＡ ＵＶ−励起を用い増感する蛍光共鳴エネルギー移動、 ・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：３５１nm励起および４００nm放射波長の、固
体支持体に連結する分子上のＡＩＤＡの特定明度の減少、 ・時間分解単一分子スペクトル分析による分子明度の減少または増加を測定する
ことによる量子収量の変化の検出、 である。
光標識巨大分子の結合の直接検出、 ・固体支持体上の化合物の合成の間に実施される通常の蛍光スペクトル分析に通
常使用するための、第２環境的感受性分子へのＡＩＤＡの化学的結合による、分
子明度の変化の促進の測定、 ・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：ＡＩＤＡから適当な長波長色素の蛍光共鳴エ
ネルギー移動であって、それにより、長波長色素の放射波長の分子明度の変化に
より検出さるＡＩＤＡ ＵＶ−励起を用い増感する蛍光共鳴エネルギー移動、 ・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：３５１nm励起および４００nm放射波長の、固
体支持体に連結する分子上のＡＩＤＡの特定明度の減少、 ・時間分解単一分子スペクトル分析による分子明度の減少または増加を測定する
ことによる量子収量の変化の検出、 である。
【００４７】 既知のインダゾール化学および光物理学に関係する開示ＡＩＤＡ化学の位置付け 本発明は、官能化１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾール(ＡＩＤＡ)により
示される蛍光色素を目的とする。本発明は、固体支持体および溶液において固有
の蛍光標識でコンビナトリアル化学ライブラリーを合成し得る。その標識は、生
体分子に対する合成リガンドの結合イベントの検出用の強力なツールである。合
成分子と生物学的標的との結合イベントは、前のセクションで述べたような分光
学的方法により測定され得る。これらの実験は、固体支持体または溶液において
固定化された色素結合体で実施され得る。
示される蛍光色素を目的とする。本発明は、固体支持体および溶液において固有
の蛍光標識でコンビナトリアル化学ライブラリーを合成し得る。その標識は、生
体分子に対する合成リガンドの結合イベントの検出用の強力なツールである。合
成分子と生物学的標的との結合イベントは、前のセクションで述べたような分光
学的方法により測定され得る。これらの実験は、固体支持体または溶液において
固定化された色素結合体で実施され得る。
【００４８】 本発明に延べた分子は、開示適用において使用するための幾つかの化学的およ
び分光学的要件を満たす。開示インダゾール基礎色素、１Ｈ−インダゾールの親
化合物は、２９４nmの最大吸収および２９８nmの最大蛍光放射を有する蛍光分子
である(両方の値は、アセトニトリル中である；Saha, S. K. & Dogra, S. K. J.
Photochem. Photobiol., A (1997), 110, 257-266)。これらの分光学的性質は
、色素が上記の適用における使用のために満たさなければならない、当該要件と
は一致しない。インダゾール発色団が、アリール置換基(それはまた、更なる結
合の拡張に寄与するため、色素の合成適用用の更なる官能基を作成する)による
適当な置換により拡張するときのみ、最大吸収のおよび最大蛍光放射の必要な深
色団性シフトが生じ、上記セクションで述べた適用を提供し得る。親複素環にお
ける既述合成修飾は、１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールの吸収の、トリ
プトファンの放射とのスペクトル重複を生ずる(化合物４ａ−ｌ、８、および１
１、それぞれ最大吸収３２６−３６１nmの範囲)。インダゾールの発色団の拡張
に関する修飾は、全てが利点となることはない：複素環の更なるアヌレン化(ann
ellated)ベンゼン環を伴う１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールにより示さ
れるフルオロホアの更なる拡張は、スペクトルの要求を強める。４−(３−フェ
ニル−ベンゾ[g]インダゾール−１−イル)−安息香酸のスペクトル吸収は、ナフ
タレン型スペクトルに変化し、蛍光放射は劇的に減少する。
び分光学的要件を満たす。開示インダゾール基礎色素、１Ｈ−インダゾールの親
化合物は、２９４nmの最大吸収および２９８nmの最大蛍光放射を有する蛍光分子
である(両方の値は、アセトニトリル中である；Saha, S. K. & Dogra, S. K. J.
Photochem. Photobiol., A (1997), 110, 257-266)。これらの分光学的性質は
、色素が上記の適用における使用のために満たさなければならない、当該要件と
は一致しない。インダゾール発色団が、アリール置換基(それはまた、更なる結
合の拡張に寄与するため、色素の合成適用用の更なる官能基を作成する)による
適当な置換により拡張するときのみ、最大吸収のおよび最大蛍光放射の必要な深
色団性シフトが生じ、上記セクションで述べた適用を提供し得る。親複素環にお
ける既述合成修飾は、１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールの吸収の、トリ
プトファンの放射とのスペクトル重複を生ずる(化合物４ａ−ｌ、８、および１
１、それぞれ最大吸収３２６−３６１nmの範囲)。インダゾールの発色団の拡張
に関する修飾は、全てが利点となることはない：複素環の更なるアヌレン化(ann
ellated)ベンゼン環を伴う１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールにより示さ
れるフルオロホアの更なる拡張は、スペクトルの要求を強める。４−(３−フェ
ニル−ベンゾ[g]インダゾール−１−イル)−安息香酸のスペクトル吸収は、ナフ
タレン型スペクトルに変化し、蛍光放射は劇的に減少する。
【００４９】 １,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールは、置換パターンに依存して６０−
２００nmの範囲でストークスシフトを示し、非常に広範囲の放射バンドで特性解
析される。最大放射は、誘導体４ａ−ｅ、４ｇ−ｈ、８および１１の場合、それ
ぞれ３６４−４３９nmであり、誘導体４ｆおよび４ｉ−ｌの場合、それぞれ５２
４−５６５nmであり、その置換された１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾール
構造の光物理学的性質を一致させる広範囲の可能性を示す。典型的なＡＩＤＡ誘
導体(４ｅ；図１；構造：スキーム１)の詳細な分光学的特性解析は、実施例１Ａ
に述べられている。分光学的変化は、相互作用の特定設計または溶液および固体
支持体における標識もしくは非標識標的巨大分子による結合アッセイを行い得る
。ＨＴＳの蛍光スペクトル分析に使用される天然タンパク質蛍光と通常色素との
ギャップ領域における吸収波長による並みはずれた広範囲の蛍光放射波長をカバ
ーする分光学的性質の変化が、アッセイ技術の特有の組合せをし得、すなわち、
(ａ)固体支持体における結合剤の迅速で効率的なスクリーニング(蛍光を示さな
いサイレントＡＩＤＡ色素)および(ｂ)ＡＩＤＡ蛍光の異なる可能性ある適用に
よる支持体からの切断後の同定活性化ヒット化合物の直接の確認をし得る。
２００nmの範囲でストークスシフトを示し、非常に広範囲の放射バンドで特性解
析される。最大放射は、誘導体４ａ−ｅ、４ｇ−ｈ、８および１１の場合、それ
ぞれ３６４−４３９nmであり、誘導体４ｆおよび４ｉ−ｌの場合、それぞれ５２
４−５６５nmであり、その置換された１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾール
構造の光物理学的性質を一致させる広範囲の可能性を示す。典型的なＡＩＤＡ誘
導体(４ｅ；図１；構造：スキーム１)の詳細な分光学的特性解析は、実施例１Ａ
に述べられている。分光学的変化は、相互作用の特定設計または溶液および固体
支持体における標識もしくは非標識標的巨大分子による結合アッセイを行い得る
。ＨＴＳの蛍光スペクトル分析に使用される天然タンパク質蛍光と通常色素との
ギャップ領域における吸収波長による並みはずれた広範囲の蛍光放射波長をカバ
ーする分光学的性質の変化が、アッセイ技術の特有の組合せをし得、すなわち、
(ａ)固体支持体における結合剤の迅速で効率的なスクリーニング(蛍光を示さな
いサイレントＡＩＤＡ色素)および(ｂ)ＡＩＤＡ蛍光の異なる可能性ある適用に
よる支持体からの切断後の同定活性化ヒット化合物の直接の確認をし得る。
【００５０】 下記実施例２Ａおよび３Ａに説明するような本発明のある態様は、本発明の色
素分子と結合するリガンド(ビオチン)に対しタンパク質(アビジン)の結合を示す
ために使用される方法について述べている。
素分子と結合するリガンド(ビオチン)に対しタンパク質(アビジン)の結合を示す
ために使用される方法について述べている。
【００５１】 結合体１１は、タンパク質に対する結合における遊離結合体の非等方性値の変
化による、アビジンに対する１１の結合を説明するために使用する(実施例２Ａ)
。アビジンに対するＡＩＤＡビオチン結合体１１の強固な結合はまた、アビジン
中に含まれるトリプトファンからＡＩＤＡ色素への、およびアビジンにおいてＡ
ＩＤＡ色素からＢＯＤＩＰＹ標識へのＦＲＥＴによって確認される。
化による、アビジンに対する１１の結合を説明するために使用する(実施例２Ａ)
。アビジンに対するＡＩＤＡビオチン結合体１１の強固な結合はまた、アビジン
中に含まれるトリプトファンからＡＩＤＡ色素への、およびアビジンにおいてＡ
ＩＤＡ色素からＢＯＤＩＰＹ標識へのＦＲＥＴによって確認される。
【００５２】 結合体８は、固体支持体上で合成される(実施例３Ｂ(ａ))。固定化された８の
放射スペクトルは、溶液中のものに類似する。ＡＩＤＡ結合体８は、樹脂から切
断され、アビジン中のトリプトファンから、およびアビジンにおいてＡＩＤＡか
らＢＯＤＩＰＹへのＦＲＥＴが説明される(実施例３Ａ)。８におけるＡＩＤＡ成
分とアビジンにおけるＢＯＤＩＰＹ蛍光標識とのエネルギー移動はまた、時間分
解蛍光スペクトル分析により研究される。
放射スペクトルは、溶液中のものに類似する。ＡＩＤＡ結合体８は、樹脂から切
断され、アビジン中のトリプトファンから、およびアビジンにおいてＡＩＤＡか
らＢＯＤＩＰＹへのＦＲＥＴが説明される(実施例３Ａ)。８におけるＡＩＤＡ成
分とアビジンにおけるＢＯＤＩＰＹ蛍光標識とのエネルギー移動はまた、時間分
解蛍光スペクトル分析により研究される。
【００５３】 実施例２Ａおよび３Ａは、ＡＩＤＡ結合体(８、１１)と非標識または標識生体
分子(アビジン、アビジン−ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ)との結合イベントをレポートす
るＡＩＤＡ色素の使用を例示する。
分子(アビジン、アビジン−ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ)との結合イベントをレポートす
るＡＩＤＡ色素の使用を例示する。
【００５４】 この目的のために、１,３−ジアリール置換１Ｈ−インダゾールの誘導体(４ａ
−ｑ、５、６；実施例１Ｂおよび２Ｂ；スキーム１および２)は、(１)(ａ)切断
可能リンカーで事前に負荷された固体支持体対する色素の付加ための、または(
ｂ)適当なＡＩＤＡ誘導体との反応をキャッピングすることにより化合物ライブ
ラリーを標識する官能基、および(２)リガンドとの結合体の更なる官能基を有す
るように、合成される。後者の官能基は、色素とリガンドとの間に挿入された(
種々の)スペーサーエレメントの一部として存在する。スペーサー自体は、アミ
ド結合により色素に共有結合的に連結する。インダゾール複素環を合成する多く
の既知可能性において(例えば、Elderfield, R.C. in "Heterocyclic Compounds
" ed. Elderfield, R.C., vol 5, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1957,
p.162参照)、および特に１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールにおいて、Gla
dstone et al.(Gladston, W. A. F. & Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1965)
, 3048-52; Gladstone, W. A. F. & Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1965),
5177-82; Gladstone, W. A. F. et al. J. Chem. Soc. (1966), 1781-4)により
述べられる方法は、望ましい化合物への効率的なアクセスを可能とする。合成は
、置換されたベンゾフェノンから出発する。ケトンの芳香性置換基の１つは、最
終的にインダゾール骨格に組み込まれ、その一方、第２のものは、インダゾール
の官能化３−アリール置換基の源としての役割をする。ベンゾフェノン誘導体は
、置換されたアリールヒドラジンとの反応により、最初にアリールヒドラゾンに
変換される。後者は、最終的な官能化１,３−ジアリールインダゾールの１−ア
リール置換基に付加する官能基の源である。ベンゾフェノンアリールヒドラゾン
を、lffland(lffland, D. C. et al. (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 747)によ
り最初に述べられた方法に従い、四酢酸鉛を用いる酸化により、１−(アリール
アゾ)−１,１−ジアリールメチルエステル酢酸に反応させた。アリールアゾ−酢
酸は、閉環をルイス酸での処理においてインダゾール複素環とする。当該反応は
、中間体１−アザ−２−アゾニアアレンを通じて進み(Wang, Q. et al. Synthes
is (1992), 7, 710-8)、閉環と競争する酢酸アリールアゾのジェミナルアリール
置換基を高度に部位選択的する。環状化は、カルボキシル、エステル、アミド、
またはニトロ基のような、それぞれの置換基を回収する強力な電子を生ずる芳香
環内には生じない。ニトロ置換基によるインダゾールの１位または３位の何れか
のアリール環の置換は、調査された他の置換パターンと比較して約１５０nmの最
大放射の深色団シフトの要因となる(表１)。ＡＩＤＡ誘導体の放射の窒素誘導赤
色シフトは、上記分光学的適用を拡張する。同一物が、複素環の核に直接付加す
る窒素基を保持するが、そのインダゾール誘導体は、与えられた理由のため、考
察Gladstonインダゾール合成によりアクセスできない。５−ニトロ置換された、
官能化１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールは、実施例１Ｂ(ｂ)に例示され
るように、相当するインダゾールの注意深い窒素化により合成され得る。官能化
１,３−ジアリール置換インダゾールはまた、適当なベンゾフェノン誘導体の固
定化アリールヒドラゾンで開始し固体支持体上で合成され得る(Yan, B. & Gstac
h, H. Tetrahedron Lett. (1996), 37(46), 8325-8)。
−ｑ、５、６；実施例１Ｂおよび２Ｂ；スキーム１および２)は、(１)(ａ)切断
可能リンカーで事前に負荷された固体支持体対する色素の付加ための、または(
ｂ)適当なＡＩＤＡ誘導体との反応をキャッピングすることにより化合物ライブ
ラリーを標識する官能基、および(２)リガンドとの結合体の更なる官能基を有す
るように、合成される。後者の官能基は、色素とリガンドとの間に挿入された(
種々の)スペーサーエレメントの一部として存在する。スペーサー自体は、アミ
ド結合により色素に共有結合的に連結する。インダゾール複素環を合成する多く
の既知可能性において(例えば、Elderfield, R.C. in "Heterocyclic Compounds
" ed. Elderfield, R.C., vol 5, John Wiley & Sons, Inc., New York, 1957,
p.162参照)、および特に１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールにおいて、Gla
dstone et al.(Gladston, W. A. F. & Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1965)
, 3048-52; Gladstone, W. A. F. & Norman, R. O. C. J. Chem. Soc. (1965),
5177-82; Gladstone, W. A. F. et al. J. Chem. Soc. (1966), 1781-4)により
述べられる方法は、望ましい化合物への効率的なアクセスを可能とする。合成は
、置換されたベンゾフェノンから出発する。ケトンの芳香性置換基の１つは、最
終的にインダゾール骨格に組み込まれ、その一方、第２のものは、インダゾール
の官能化３−アリール置換基の源としての役割をする。ベンゾフェノン誘導体は
、置換されたアリールヒドラジンとの反応により、最初にアリールヒドラゾンに
変換される。後者は、最終的な官能化１,３−ジアリールインダゾールの１−ア
リール置換基に付加する官能基の源である。ベンゾフェノンアリールヒドラゾン
を、lffland(lffland, D. C. et al. (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 747)によ
り最初に述べられた方法に従い、四酢酸鉛を用いる酸化により、１−(アリール
アゾ)−１,１−ジアリールメチルエステル酢酸に反応させた。アリールアゾ−酢
酸は、閉環をルイス酸での処理においてインダゾール複素環とする。当該反応は
、中間体１−アザ−２−アゾニアアレンを通じて進み(Wang, Q. et al. Synthes
is (1992), 7, 710-8)、閉環と競争する酢酸アリールアゾのジェミナルアリール
置換基を高度に部位選択的する。環状化は、カルボキシル、エステル、アミド、
またはニトロ基のような、それぞれの置換基を回収する強力な電子を生ずる芳香
環内には生じない。ニトロ置換基によるインダゾールの１位または３位の何れか
のアリール環の置換は、調査された他の置換パターンと比較して約１５０nmの最
大放射の深色団シフトの要因となる(表１)。ＡＩＤＡ誘導体の放射の窒素誘導赤
色シフトは、上記分光学的適用を拡張する。同一物が、複素環の核に直接付加す
る窒素基を保持するが、そのインダゾール誘導体は、与えられた理由のため、考
察Gladstonインダゾール合成によりアクセスできない。５−ニトロ置換された、
官能化１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾールは、実施例１Ｂ(ｂ)に例示され
るように、相当するインダゾールの注意深い窒素化により合成され得る。官能化
１,３−ジアリール置換インダゾールはまた、適当なベンゾフェノン誘導体の固
定化アリールヒドラゾンで開始し固体支持体上で合成され得る(Yan, B. & Gstac
h, H. Tetrahedron Lett. (1996), 37(46), 8325-8)。
【００５５】 特に、実施例３Ｂ(ａ)は、式(II)および(IV)により示されるような蛍光結合体
の固体相合成の原理について述べる。ＡＩＤＡ色素を生ずるスペーサー(実施例
２Ｂ(ｂ)で述べた)を最初に固相支持体上のリンカーに付加させ、その後、リガ
ンドのカップリングを行い、ＡＩＤＡリガンド結合体(８)を切断をする。
の固体相合成の原理について述べる。ＡＩＤＡ色素を生ずるスペーサー(実施例
２Ｂ(ｂ)で述べた)を最初に固相支持体上のリンカーに付加させ、その後、リガ
ンドのカップリングを行い、ＡＩＤＡリガンド結合体(８)を切断をする。
【００５６】 式(IV)で示されるＡＩＤＡ結合体はまた、実施例４Ｂ(ａ−ｃ)で解説するよう
に、溶液中で合成され得る。合成された化合物８および９は、ＡＩＤＡ色素(４
ｅ)へのリガンド(ビオチン)の結合を導入するスペーサーの性質ばかりでなく、
インダゾールのアリール置換基に関しても異なる。ビオチンに対する結合体は、
誘導体８の１−アリール置換基を介して形成され、その一方、リガンドは、誘導
体１１中の３−アリール置換基に存在する。両方の結合構造を、結合イベントの
検出に用い得る(ＡＩＤＡ色素の擬対称)。式(III)および(VI)に示すような蛍光
結合体の化合物ライブラリーの合成の原理は、実施例５Ｂおよび７Ｂに述べてい
る。ＡＩＤＡ色素(４ｃ)を反応順序の最終ステップに導入し、その後、ＡＩＤＡ
リガンド結合体１２ａ−ｊおよび１４、それぞれを切断した。
に、溶液中で合成され得る。合成された化合物８および９は、ＡＩＤＡ色素(４
ｅ)へのリガンド(ビオチン)の結合を導入するスペーサーの性質ばかりでなく、
インダゾールのアリール置換基に関しても異なる。ビオチンに対する結合体は、
誘導体８の１−アリール置換基を介して形成され、その一方、リガンドは、誘導
体１１中の３−アリール置換基に存在する。両方の結合構造を、結合イベントの
検出に用い得る(ＡＩＤＡ色素の擬対称)。式(III)および(VI)に示すような蛍光
結合体の化合物ライブラリーの合成の原理は、実施例５Ｂおよび７Ｂに述べてい
る。ＡＩＤＡ色素(４ｃ)を反応順序の最終ステップに導入し、その後、ＡＩＤＡ
リガンド結合体１２ａ−ｊおよび１４、それぞれを切断した。
【００５７】 式(II)および(IV)により示されるＡＩＤＡ色素(１３ａ−ｄ)と結合するスルホ
ンアミドの化合物コレクションの合成は、実施例６Ｂに述べられている。
ンアミドの化合物コレクションの合成は、実施例６Ｂに述べられている。
【００５８】 実験プロトコール パートＡ：分光学 一般 試薬およびタンパク質：４ｅ、９および１１の１０ｍＭおよび５μＭストック
溶液は、ＴＨＦ(４ｅ)またはＤＭＳＯ中で調製され、４℃で維持される。アビジ
ンおよびアビジン結合体は、Molecular Probes(Eugene, Oregon): A-2767, 非標
識; A-883, Lucifer Yellow(LY); A-2641, BODIPY FLを購入する。
溶液は、ＴＨＦ(４ｅ)またはＤＭＳＯ中で調製され、４℃で維持される。アビジ
ンおよびアビジン結合体は、Molecular Probes(Eugene, Oregon): A-2767, 非標
識; A-883, Lucifer Yellow(LY); A-2641, BODIPY FLを購入する。
【００５９】 ２００μＭストック溶液は、ＰＢＳ、０.０１％ＮａＮ３、または０.１Ｍ Ｎ
ａＨＣＯ３、ｐＨ＝８.３(A-2641)中に調製され、−２０℃で保存する。濃度は
、アビジンおよび結合体を分子量６７０００と重量測定的にみなして決定した。
ａＨＣＯ３、ｐＨ＝８.３(A-2641)中に調製され、−２０℃で保存する。濃度は
、アビジンおよび結合体を分子量６７０００と重量測定的にみなして決定した。
【００６０】 溶解性の理由のために、４ｅをＴＨＦ中で分光学的に特性解析する。全複合反
応および蛍光共鳴エネルギー移動測定は、特記しない限り、ＰＢＳ／５％ＤＭＳ
Ｏ中、２５℃で行う。
応および蛍光共鳴エネルギー移動測定は、特記しない限り、ＰＢＳ／５％ＤＭＳ
Ｏ中、２５℃で行う。
【００６１】 ＵＶ−ＶＩＳスペクトル分析： ＵＶ−Ｖｉｓ吸光スペクトル分析を、Cary 1Eスペクトロフォトメーターで行
う。４ｅの吸光スペクトルをＴＨＦ中で検出する。
う。４ｅの吸光スペクトルをＴＨＦ中で検出する。
【００６２】 ３３７nmでの吸光最大での４ｅの吸光度計数(ε)の決定： ３つの異なる量のサンプル(Ｅ１＝５.７５１mg、Ｅ２＝７.９３３mg、Ｅ３＝
１０.９３３mg)をテトラヒドロフラン(ＴＨＦ、ＵＶ−スペクトル分析用、Fluka
)に溶解し、最終容量２５mLとする。これは各々５７７.５μM、７９６.６μMお
よび１.０９７９ｍＭのＥ１、Ｅ２およびＥ３の濃度をもたらす。各ストック溶
液から、２.５μm、１０μM、１７μM、２５μmおよび３５μMの５希釈を作る。
各希釈のＵＶスペクトルを２００から４００nmで、１cmの通過長の石英キュベッ
トを使用して記録する。ＴＨＦを対照として使用する。直線適合を測定の各シリ
ーズで行う。３３７nmでの吸光度計数は、直線回帰の傾斜により得られる。
１０.９３３mg)をテトラヒドロフラン(ＴＨＦ、ＵＶ−スペクトル分析用、Fluka
)に溶解し、最終容量２５mLとする。これは各々５７７.５μM、７９６.６μMお
よび１.０９７９ｍＭのＥ１、Ｅ２およびＥ３の濃度をもたらす。各ストック溶
液から、２.５μm、１０μM、１７μM、２５μmおよび３５μMの５希釈を作る。
各希釈のＵＶスペクトルを２００から４００nmで、１cmの通過長の石英キュベッ
トを使用して記録する。ＴＨＦを対照として使用する。直線適合を測定の各シリ
ーズで行う。３３７nmでの吸光度計数は、直線回帰の傾斜により得られる。
【００６３】 定常状態蛍光スペクトル分析： 定常状態蛍光測定は、JD-490光電子増倍管および４５０Ｗ Xenon Arclampを備
えたSLM 8000Cスペクトロフルオロメーターで行う(SLM Instruments, Urbana, I
L)。
えたSLM 8000Cスペクトロフルオロメーターで行う(SLM Instruments, Urbana, I
L)。
【００６４】 ４ｅの定常状態蛍光スペクトル分析： 定常状態蛍光測定を、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)中、１μMサンプル濃度で
行う。スペクトルの帯域幅は励起および放出に関して各々１および４nmに設定す
る。スペクトルを１光子計数モードで記録する。ランプ強度の変化は、スローモ
ードで測定した、対照チャンネルにおける量子カウンターで補正する。ゲインは
６４０Ｖの高ボルト数(ＨＶ)で×１００に設定する。集積時間は２秒である。励
起スペクトル測定のために、放出波長を３９７nmに設定し、サンプルを２００か
ら４００nmに励起させる。放出スペクトルの記録のために、サンプルを３４２nm
で励起させ、放出を３５０から５４０nmで測定する。データは２つのスキャンの
平均である。
行う。スペクトルの帯域幅は励起および放出に関して各々１および４nmに設定す
る。スペクトルを１光子計数モードで記録する。ランプ強度の変化は、スローモ
ードで測定した、対照チャンネルにおける量子カウンターで補正する。ゲインは
６４０Ｖの高ボルト数(ＨＶ)で×１００に設定する。集積時間は２秒である。励
起スペクトル測定のために、放出波長を３９７nmに設定し、サンプルを２００か
ら４００nmに励起させる。放出スペクトルの記録のために、サンプルを３４２nm
で励起させ、放出を３５０から５４０nmで測定する。データは２つのスキャンの
平均である。
【００６５】 ４ｅの量子収率決定[Demans & Cosby, 1971; Chen et al., 1972]： ４ｅの量子収率を、標準としてキニンスルフェートを使用して決定する[Melhu
ish, 1961]。 ４ｅのＵＶスペクトルとキニンスルフェート(ＣＳ)の間の交差をCary 1Eスペ
クトロフォトメーターでの二つの物質の溶液の測定により決定する。濃度は４ｅ
に関してはＴＨＦ中２５μMおよびＣＳに関しては１Ｎ Ｈ２ＳＯ４中５０mMで
あった。スペクトルを２６０nmから３８０nm、光学的通過長１０mmの石英キュベ
ットを使用して記録し、ブランクを溶媒吸光を引くことにより補正する。二つの
得られるＵＶスペクトルの交差の点は３４８.３nmと決定され、モノクロメータ
ーシフトのために、SLM-8000Cフルオロメーターで３５２.８nmに対応する。４ｅ
およびＣＳの蛍光放出スペクトルを、１光子計数モードでのＵＶ測定と同じ溶液
を使用して記録する。ランプ強度補正を対照チャンネルにおける量子カウンター
を使用して補正する。ゲインは×１００に設定し、適用した高ボルト数は８３０
Ｖである。集積時間は０.５秒である。スリット幅は各々励起および放出に関し
て１nmおよび４nmである。放出スペクトルの記録のため、励起を３５２.８に設
定し、放出を、ＩＡＥに関しては３６０から５５０nm、ＣＳに関しては３６０か
ら６５０nmでモニターする。
ish, 1961]。 ４ｅのＵＶスペクトルとキニンスルフェート(ＣＳ)の間の交差をCary 1Eスペ
クトロフォトメーターでの二つの物質の溶液の測定により決定する。濃度は４ｅ
に関してはＴＨＦ中２５μMおよびＣＳに関しては１Ｎ Ｈ２ＳＯ４中５０mMで
あった。スペクトルを２６０nmから３８０nm、光学的通過長１０mmの石英キュベ
ットを使用して記録し、ブランクを溶媒吸光を引くことにより補正する。二つの
得られるＵＶスペクトルの交差の点は３４８.３nmと決定され、モノクロメータ
ーシフトのために、SLM-8000Cフルオロメーターで３５２.８nmに対応する。４ｅ
およびＣＳの蛍光放出スペクトルを、１光子計数モードでのＵＶ測定と同じ溶液
を使用して記録する。ランプ強度補正を対照チャンネルにおける量子カウンター
を使用して補正する。ゲインは×１００に設定し、適用した高ボルト数は８３０
Ｖである。集積時間は０.５秒である。スリット幅は各々励起および放出に関し
て１nmおよび４nmである。放出スペクトルの記録のため、励起を３５２.８に設
定し、放出を、ＩＡＥに関しては３６０から５５０nm、ＣＳに関しては３６０か
ら６５０nmでモニターする。
【００６６】 ４ｅとＮ−アセチル−トリプトファンアミド(ＮＡＴＡ)の間のＲ０(Foester距離
)の計算： ４ｅ(アクセプター)およびＮＡＴＡ(ドナー)の間のＲ０を計算するために、Ｎ
ＡＴＡの放出スペクトルおよび４ｅの吸収スペクトルを使用して、３００nmと３
８０nmの間の重複の領域を決定する。ＮＡＴＡの放出スペクトルは、ＴＨＦ中１
５μＭの濃度で、１０mmの光学的通過の７５０μl石英キュベットを使用して測
定する。測定モードは１光子係数である。ランプ強度の変化を、対照チャンネル
における量子カウンターを使用して補正する。ゲインは×１００に設定し、適用
した高ボルト数は６４０Ｖであり、集積時間は２秒であった。蛍光放出を標準ラ
ンプ目盛りにより得た補正係数の乗法により、システムの光学的精度を正す。ス
リット幅は励起および放出に関して、各々１nmおよび４nmに設定する。サンプル
を２９３nmで励起させ、３００から４８０nmでモニターした。
)の計算： ４ｅ(アクセプター)およびＮＡＴＡ(ドナー)の間のＲ０を計算するために、Ｎ
ＡＴＡの放出スペクトルおよび４ｅの吸収スペクトルを使用して、３００nmと３
８０nmの間の重複の領域を決定する。ＮＡＴＡの放出スペクトルは、ＴＨＦ中１
５μＭの濃度で、１０mmの光学的通過の７５０μl石英キュベットを使用して測
定する。測定モードは１光子係数である。ランプ強度の変化を、対照チャンネル
における量子カウンターを使用して補正する。ゲインは×１００に設定し、適用
した高ボルト数は６４０Ｖであり、集積時間は２秒であった。蛍光放出を標準ラ
ンプ目盛りにより得た補正係数の乗法により、システムの光学的精度を正す。ス
リット幅は励起および放出に関して、各々１nmおよび４nmに設定する。サンプル
を２９３nmで励起させ、３００から４８０nmでモニターした。
【００６７】 Ｒ０は式
【数１】 〔式中、κ２はドナーおよびアクセプタークロモフォアの伝達双極子の空間にお
ける相対的配向の配向定数である。蛍光寿命の時間規模における等方性回転を有
するドナー−アクセプター対に関して、２／３の値を使用できる[Chen, 1972]。
ηは溶媒の反射計数であり、この場合１.４０６４の値のＴＨＦである。ΘＮＡ
ＴＡはドナーの量子収率であり、これは０.１２−０.１４として文献から取る[S
zabo & Rainer, 1980; Petrich et al, 1983]。 Ｊは
ける相対的配向の配向定数である。蛍光寿命の時間規模における等方性回転を有
するドナー−アクセプター対に関して、２／３の値を使用できる[Chen, 1972]。
ηは溶媒の反射計数であり、この場合１.４０６４の値のＴＨＦである。ΘＮＡ
ＴＡはドナーの量子収率であり、これは０.１２−０.１４として文献から取る[S
zabo & Rainer, 1980; Petrich et al, 1983]。 Ｊは
【数２】 (式中、ＦＮＡＴＡはドナーの補正蛍光放出、合計は均一性のために標準化され
、ε４ｅは波長λでのアクセプターの励起係数であり、ＤＳは増分検出範囲であ
る) に近づくことができるスペクトル重複積分である〕 を使用して計算する。
、ε４ｅは波長λでのアクセプターの励起係数であり、ＤＳは増分検出範囲であ
る) に近づくことができるスペクトル重複積分である〕 を使用して計算する。
【００６８】 ＦＲＥＴ測定： スペクトルバンド幅は、各々励起および放出に関して８および１６nmに設定す
る。測定は２５℃で、最初に混合した後に撹拌せずに、７５０μL石英キュベッ
ト(１０mm光学的通過長)で行う。５０nMの濃度の９または１１を、１μMの(蛍光
)アビジンとの錯化に使用する。アビジンビオチン相互作用で通常の１０−１５
Ｍの範囲の解離定数で、標識ビオチンプラットフォームの錯体飽和が達成される
。全ての力価測定をマジックアングル設定で行い、インダゾールがアクセプター
であるとき、放射波長を本実験では５００nmに設定し、励起スペクトルを２５０
から３６０nmで記録する。インダゾールをドナーとして使用し、Lucifer Yellow
またはBODIPY FLがアクセプターであるとき、励起波長を３３８nmまたは３２５n
mに設定する。蛍光放出を３６０nmから７００nmの間で集める。スペクトルを、
希釈、およびタンパク質添加による内部フィルター作用のために、ＰＢＳ溶液の
ラマン分散に対して補正する。シグナルを、対照チャンネルにおけるRhodamine
B量子カウンターでの比率モード検出によるランプ強度変化について調節する。W
G 360放出カットオフフィルターを迷光減少のために使用する。データを２nm増
加で、１秒の集積時間で集める。
る。測定は２５℃で、最初に混合した後に撹拌せずに、７５０μL石英キュベッ
ト(１０mm光学的通過長)で行う。５０nMの濃度の９または１１を、１μMの(蛍光
)アビジンとの錯化に使用する。アビジンビオチン相互作用で通常の１０−１５
Ｍの範囲の解離定数で、標識ビオチンプラットフォームの錯体飽和が達成される
。全ての力価測定をマジックアングル設定で行い、インダゾールがアクセプター
であるとき、放射波長を本実験では５００nmに設定し、励起スペクトルを２５０
から３６０nmで記録する。インダゾールをドナーとして使用し、Lucifer Yellow
またはBODIPY FLがアクセプターであるとき、励起波長を３３８nmまたは３２５n
mに設定する。蛍光放出を３６０nmから７００nmの間で集める。スペクトルを、
希釈、およびタンパク質添加による内部フィルター作用のために、ＰＢＳ溶液の
ラマン分散に対して補正する。シグナルを、対照チャンネルにおけるRhodamine
B量子カウンターでの比率モード検出によるランプ強度変化について調節する。W
G 360放出カットオフフィルターを迷光減少のために使用する。データを２nm増
加で、１秒の集積時間で集める。
【００６９】 蛍光異方性測定： 蛍光異方性を[Lakowicz, 1983]にしたがって計算する。スペクトルバンド幅を
各々励起および放出に関して４および８nmに設定し、５秒の集積時間である。蛍
光異方性計算のために、１０のデータ点を平均する。
各々励起および放出に関して４および８nmに設定し、５秒の集積時間である。蛍
光異方性計算のために、１０のデータ点を平均する。
【００７０】 ピコセカンド時間固定蛍光分光法： ピコセカンド時間固定蛍光測定を、１光子係数法により記録する[Lacowicz, 1
963 p52-93, 112-153, 156-185]。Ａｒ＋ポンプ輸送Ｔｉ：Sapphireレーザー(モ
デルMIRA 900, Coherent, Santa Clara, USA)は、モード固定条件下で７５mHaz
の周波数の超短波パルス(FWHM＝５０fs)を提供する。反復速度を４.７MHzに減少
させるために、パルスピッカー(モデル9200, Coherent, Santa Clara, USA)をビ
ーム間に挿入する。次いで、ビームを分け、一方では速い光ダイオードの引金を
引き、それは弁別後(Ortec pico-timing discriminator 9307, Oak Ridge, USA)
、ＳＰＣ測定(逆モード)のための停止シグナルを産生し、他方ではサンプルを励
起させる。３６０nmの励起波長が、MIRA 900を最初に手動で７２０nmにチューニ
ングし、次いでビームの周波数を、超高速調波産生システム5-050(Inrad, North
vale, USA)で２倍にする。励起パワーは０.１−０.３mWの間にあり、装置応答機
能の最大の班部での完全幅は７０−８０psである。蛍光光子をSpex 1681一回折
格子単色光分光器(Spex, Edison, USA)に回収し、Hamamatsu R3809Uマイクロチ
ャンネルプレート(浜松、下神増、日本)で検出する。
963 p52-93, 112-153, 156-185]。Ａｒ＋ポンプ輸送Ｔｉ：Sapphireレーザー(モ
デルMIRA 900, Coherent, Santa Clara, USA)は、モード固定条件下で７５mHaz
の周波数の超短波パルス(FWHM＝５０fs)を提供する。反復速度を４.７MHzに減少
させるために、パルスピッカー(モデル9200, Coherent, Santa Clara, USA)をビ
ーム間に挿入する。次いで、ビームを分け、一方では速い光ダイオードの引金を
引き、それは弁別後(Ortec pico-timing discriminator 9307, Oak Ridge, USA)
、ＳＰＣ測定(逆モード)のための停止シグナルを産生し、他方ではサンプルを励
起させる。３６０nmの励起波長が、MIRA 900を最初に手動で７２０nmにチューニ
ングし、次いでビームの周波数を、超高速調波産生システム5-050(Inrad, North
vale, USA)で２倍にする。励起パワーは０.１−０.３mWの間にあり、装置応答機
能の最大の班部での完全幅は７０−８０psである。蛍光光子をSpex 1681一回折
格子単色光分光器(Spex, Edison, USA)に回収し、Hamamatsu R3809Uマイクロチ
ャンネルプレート(浜松、下神増、日本)で検出する。
【００７１】 このように得た開始シグナルを、逆ＳＰＣモードを光ダイオードの次シグナル
により停止させる、時間対振幅コンバーターにおけるボルト数ランプを開始する
前に、前増幅し(preamplifier 9306, Ortec, Oak Ridge, USA)、弁別する(discr
iminator 9307 Ortec, Oak Ridge, USA)。蛍光光子の一つの実験における励起と
放出の間の時間経かに対応する時間ボルト数値をSpectrum Master 921(Ortec, O
ak Ridge, USA)に貯蔵し、これは多チャンネルエミュレーションプログラムMaes
tro(Ortec, Oak Ridge, USA)に接続する。ＳＰＣ生データを、Edingurgh Instru
ments(Edingurgh, UK)のFLA9000プログラムで、多指数モデル
により停止させる、時間対振幅コンバーターにおけるボルト数ランプを開始する
前に、前増幅し(preamplifier 9306, Ortec, Oak Ridge, USA)、弁別する(discr
iminator 9307 Ortec, Oak Ridge, USA)。蛍光光子の一つの実験における励起と
放出の間の時間経かに対応する時間ボルト数値をSpectrum Master 921(Ortec, O
ak Ridge, USA)に貯蔵し、これは多チャンネルエミュレーションプログラムMaes
tro(Ortec, Oak Ridge, USA)に接続する。ＳＰＣ生データを、Edingurgh Instru
ments(Edingurgh, UK)のFLA9000プログラムで、多指数モデル
【数３】 〔式中、Ａは実験のバックグラウンドノイズを示し、ｂｉは一致した蛍光寿命τ ｉ の前曝露時間を示し、δｔは装置応答のシフトを補う任意の維持知的シフト時
間である〕 にしたがって、反復して再巻き込みする。Ｂｉはコンピューター計算
間である〕 にしたがって、反復して再巻き込みする。Ｂｉはコンピューター計算
【数４】 により得る。
【００７２】 ４ｅの時間固定崩壊を、ＴＨＦ中２５μMの濃度で測定する。励起は３５０nm
から３８０nm、蛍光放出は０.５nmに設定したスリット幅で４００nmで検出する
。レーザーパルスの最大の半分の平均幅は１３０fsecであり、励起パスルは６５
psecである。１５０００カウントを最大で集める。
から３８０nm、蛍光放出は０.５nmに設定したスリット幅で４００nmで検出する
。レーザーパルスの最大の半分の平均幅は１３０fsecであり、励起パスルは６５
psecである。１５０００カウントを最大で集める。
【００７３】 実施例１Ａ 選択実施例４−[３−(４−アリルオキシカルボニル−フェニル)−１Ｈ−インダ
ゾル−１−イル]安息香酸(４ｅ)の詳細な分光学特徴付： ＡＩＤＡ誘導体４ｅは、３４２nmで吸収最大を、および４０３nmで最大放出強
度を示す。本化合物は、約６０nmの大ストークシフトを有し、殆どの巨大分子環
境下でトリプトファン類の放出と商品として入手可能な多くのフルオロフォアの
間に位置し、生化学でトレーサーとして使用される(図１−２)。吸収と蛍光励起
スペクトルの間の殆ど完全な重複は、励起状態における光化学および光物理作用
の可能性が低いことを示す。３３７nmでの吸収係数εは３９９２６Ｍ−１cm−１ であり、これはフルオレッシンまたはローダミン誘導体から既知の値の約５０％
であるが、ナノモル濃度範囲におけるＦＲＥＴ測定においてアクセプターとして
働くには十分高い。ｅ４の量子収率、Ｑ４ｅは０.５９１である。トリプトファ
ン(≒０.１)またはフルオレッシン(有機溶媒中、≒０.９、タンパク質またはＲ
ＮＡに結合≒０.２−０.４)と比較して、４ｅのような小化合物で、これは良好
な蛍光ドナー特性を示す驚くべき高い量子収率である。
ゾル−１−イル]安息香酸(４ｅ)の詳細な分光学特徴付： ＡＩＤＡ誘導体４ｅは、３４２nmで吸収最大を、および４０３nmで最大放出強
度を示す。本化合物は、約６０nmの大ストークシフトを有し、殆どの巨大分子環
境下でトリプトファン類の放出と商品として入手可能な多くのフルオロフォアの
間に位置し、生化学でトレーサーとして使用される(図１−２)。吸収と蛍光励起
スペクトルの間の殆ど完全な重複は、励起状態における光化学および光物理作用
の可能性が低いことを示す。３３７nmでの吸収係数εは３９９２６Ｍ−１cm−１ であり、これはフルオレッシンまたはローダミン誘導体から既知の値の約５０％
であるが、ナノモル濃度範囲におけるＦＲＥＴ測定においてアクセプターとして
働くには十分高い。ｅ４の量子収率、Ｑ４ｅは０.５９１である。トリプトファ
ン(≒０.１)またはフルオレッシン(有機溶媒中、≒０.９、タンパク質またはＲ
ＮＡに結合≒０.２−０.４)と比較して、４ｅのような小化合物で、これは良好
な蛍光ドナー特性を示す驚くべき高い量子収率である。
【００７４】 ＮＡＴＡに対するFoerster距離： Ｒ０を、アクセプターの非存在下で、伝達速度(ｋＴ)がドナーの崩壊速度と同
じである距離として定義する。この距離で、ドナー分子の半分がエネルギー伝達
により、半分が通常の放射および非放射過程により崩壊する。したがって、Ｒ０ はインダゾール由来プラットフォーム分子が、タンパク質リガンド相互作用にお
ける通常の状態の距離におけるエネルギー伝達実験において、ドナーまたはアク
セプターとして使用できるかどうかのチェックに使用できる。
じである距離として定義する。この距離で、ドナー分子の半分がエネルギー伝達
により、半分が通常の放射および非放射過程により崩壊する。したがって、Ｒ０ はインダゾール由来プラットフォーム分子が、タンパク質リガンド相互作用にお
ける通常の状態の距離におけるエネルギー伝達実験において、ドナーまたはアク
セプターとして使用できるかどうかのチェックに使用できる。
【００７５】 色素対４ｅとＮＡＴＡのＲ０値は２５.２−２６.３Åの間である。蛍光インダ
ゾールトレーサーを可能性のある阻害剤から離す４から１０Åの間の平均リンカ
ー距離で、基質結合部位中のトリプトファンは、更に１５−２０Å以内である。
他方、外的トレーサーのための標識周波数は、リガンド結合部位の２０Å以内に
少なくとも一つの標識の分子を得るように調節できる。ＡＩＤＡ誘導体４ｅは、
１.０５５±０.１１７nsecの蛍光寿命λ１で、９９.７３％の相対的増幅で、単
指数的崩壊を示した。
ゾールトレーサーを可能性のある阻害剤から離す４から１０Åの間の平均リンカ
ー距離で、基質結合部位中のトリプトファンは、更に１５−２０Å以内である。
他方、外的トレーサーのための標識周波数は、リガンド結合部位の２０Å以内に
少なくとも一つの標識の分子を得るように調節できる。ＡＩＤＡ誘導体４ｅは、
１.０５５±０.１１７nsecの蛍光寿命λ１で、９９.７３％の相対的増幅で、単
指数的崩壊を示した。
【００７６】 結論：４ｅは、標的タンパク質へのリガンド結合の検出のための蛍光リンカー分
子としての将来有望な分光学特性を有して、光物理的および光化学的に安定であ
る。
子としての将来有望な分光学特性を有して、光物理的および光化学的に安定であ
る。
【００７７】 実施例２Ａ： ＡＩＤＡ−ビオチン結合体トリエチルアンモニウム：(２−{４−[３−(４−アロ
イルオキシカルボニルフェニル)−１Ｈ−インダゾル−１−イル]−ベンゾイルア
ミノ}−６−((＋)−ビオチニルアミノ)−ヘキサノエート(１１)のアビジンへの
結合の検出 １.３×１０−１５ＭのＫｄで、ｐＨ５で、アビジン−ビオチン複合体は既知
の最も安定な生分子相互作用の一つを代表する。両方の成分とも十分特徴付けさ
れている。ＡＩＤＡ色素の、タンパク質結合部位との相互作用のレポーターまた
はディテクターとしての特性を試験するために、ビオチンは、したがって、可能
性のある阻害剤を模倣する理想的リガンドを代表する。アビジン中のビオチンの
結合部位は４トリプトファンを含む。２つのトリプトファン７０および９７は結
合ポケットにおいてビオチンから５Å以内である。ビオチンから、各々トリプト
ファン１０は１２Åの、トリプトファン１１０は２０Åの距離である。１１はＰ
ＢＳ緩衝液中でそのスペクトルの特性に関して、およびアビジン中でトリプトフ
ァン、Lucifer YellowおよびBODIPY-FL蛍光との重複を評価された(図２ｂ、２ｅ
、２ｈ)。
イルオキシカルボニルフェニル)−１Ｈ−インダゾル−１−イル]−ベンゾイルア
ミノ}−６−((＋)−ビオチニルアミノ)−ヘキサノエート(１１)のアビジンへの
結合の検出 １.３×１０−１５ＭのＫｄで、ｐＨ５で、アビジン−ビオチン複合体は既知
の最も安定な生分子相互作用の一つを代表する。両方の成分とも十分特徴付けさ
れている。ＡＩＤＡ色素の、タンパク質結合部位との相互作用のレポーターまた
はディテクターとしての特性を試験するために、ビオチンは、したがって、可能
性のある阻害剤を模倣する理想的リガンドを代表する。アビジン中のビオチンの
結合部位は４トリプトファンを含む。２つのトリプトファン７０および９７は結
合ポケットにおいてビオチンから５Å以内である。ビオチンから、各々トリプト
ファン１０は１２Åの、トリプトファン１１０は２０Åの距離である。１１はＰ
ＢＳ緩衝液中でそのスペクトルの特性に関して、およびアビジン中でトリプトフ
ァン、Lucifer YellowおよびBODIPY-FL蛍光との重複を評価された(図２ｂ、２ｅ
、２ｈ)。
【００７８】 図２ｂ：１１およびアビジンの励起および放出スペクトルは、１１のトリプトフ
ァン放出および励起スペクトルの間の重複を示す。ＡＩＤＡ誘導体１１は、非常
に広い蛍光放出バンド幅を有し、約５０％の放出強度が５００nmである。アビジ
ン中のトリプトファン放出および１１の吸収の間のスペクトル重複は殆ど完全で
ある。
ァン放出および励起スペクトルの間の重複を示す。ＡＩＤＡ誘導体１１は、非常
に広い蛍光放出バンド幅を有し、約５０％の放出強度が５００nmである。アビジ
ン中のトリプトファン放出および１１の吸収の間のスペクトル重複は殆ど完全で
ある。
【００７９】 図２ｅ：１１とLucifer Yellow標識アビジンのスペクトル重複。 Lucifer Yellowを、その４００から５００nmの間の吸収のため、インダゾールの
可能性のあるアクセプターとして選択した。水中の１１の放出スペクトルとの重
複は殆ど定量的である。
可能性のあるアクセプターとして選択した。水中の１１の放出スペクトルとの重
複は殆ど定量的である。
【００８０】 BODIPY FLは、Lucifer Yellowより約１０倍高い励起係数で、４８０から５０
０nmの間を吸収する。それは、εに関連する重複積分の強度の相対的な重要性の
チェックとして使用できる。
０nmの間を吸収する。それは、εに関連する重複積分の強度の相対的な重要性の
チェックとして使用できる。
【００８１】 結論：アビジンおよび蛍光ＡＩＤＡ分子におけるドナー(トリプトファン)とアク
セプター(Lucifer Yellow、BODIPY FL)標識の重複は、相互作用試験のためのイ
ンダゾールの理想的エネルギー位置を示す。したがって、有効なエネルギー伝達
が起こるか起こらないかという、距離および非放射デポピュレーション(depopul
ation)期間の唯一の問題が残る。
セプター(Lucifer Yellow、BODIPY FL)標識の重複は、相互作用試験のためのイ
ンダゾールの理想的エネルギー位置を示す。したがって、有効なエネルギー伝達
が起こるか起こらないかという、距離および非放射デポピュレーション(depopul
ation)期間の唯一の問題が残る。
【００８２】 ＡＩＤＡ結合体１１−アビジン複合体： (ａ)モデルシステムにおけるアビジンに結合したビオチンのためのシグナルとし
ての１１の蛍光異方性。 ５０nMの濃度のＡＩＤＡ結合体１１は、３３８nmの励起波長および４３８nmの
放出最大でモニターしたとき、０.０３４の基本的蛍光異方性を有する。この値
は、溶液中で自由に回転している小モノマー分子を暗示する。１μM過剰に添加
したアビジンに結合したとき、異方性値は０.１５１(＋４４４％)であり、ビオ
チンに、アビジン上の結合部位でまたはその近くに結合したインダゾール部分の
固定を示す。１μMのBODIPY-FL標識アビジンを基質として使用したとき、ｒ−値
は０.１００であった。この異方性における減少的変化は、恐らく、非標識物質
と比較して、BODIPY-FL標識アビジンの低親和性を反映する。
ての１１の蛍光異方性。 ５０nMの濃度のＡＩＤＡ結合体１１は、３３８nmの励起波長および４３８nmの
放出最大でモニターしたとき、０.０３４の基本的蛍光異方性を有する。この値
は、溶液中で自由に回転している小モノマー分子を暗示する。１μM過剰に添加
したアビジンに結合したとき、異方性値は０.１５１(＋４４４％)であり、ビオ
チンに、アビジン上の結合部位でまたはその近くに結合したインダゾール部分の
固定を示す。１μMのBODIPY-FL標識アビジンを基質として使用したとき、ｒ−値
は０.１００であった。この異方性における減少的変化は、恐らく、非標識物質
と比較して、BODIPY-FL標識アビジンの低親和性を反映する。
【００８３】 (ｂ)ドナーまたはアクセプターとしての１１での共鳴エネルギー伝達試験。 図３は、５０nMの１１および１μMの非標識アビジンの蛍光励起スペクトルを
示す。４８０nmの放出波長は、アビジンのトリプトファン蛍光がこの放出エネル
ギーでベースラインレベルに殆ど到達しており、２５０と３７０nmの間の僅かな
アビジン蛍光寄与のみもたらすため、選択した。差異スペクトル：[Ｉ(１１(遊
離))＋Ｉ(アビジン(遊離))]−Ｉ(１１−アビジン複合体)、図３ａ曲線５は、１
１の蛍光がアビジン結合部位における複合体化により、約２５.５％消光するこ
とを示す。この消光効果は、結合割れ目におけるトリプトファンの付近の１１に
発生する全ての放射および非放射過程に寄与できる。蛍光差異曲線(黒)の下のネ
ガティブおよびポジティブ領域の比率に対応して、６２％のこの総消光効果が蛍
光共鳴エネルギー伝達である。２５０から３００nmで、トリプトファンおよびチ
ロシン蛍光高度の促進は、１１およびアビジンの合計を基本にして７２％である
。
示す。４８０nmの放出波長は、アビジンのトリプトファン蛍光がこの放出エネル
ギーでベースラインレベルに殆ど到達しており、２５０と３７０nmの間の僅かな
アビジン蛍光寄与のみもたらすため、選択した。差異スペクトル：[Ｉ(１１(遊
離))＋Ｉ(アビジン(遊離))]−Ｉ(１１−アビジン複合体)、図３ａ曲線５は、１
１の蛍光がアビジン結合部位における複合体化により、約２５.５％消光するこ
とを示す。この消光効果は、結合割れ目におけるトリプトファンの付近の１１に
発生する全ての放射および非放射過程に寄与できる。蛍光差異曲線(黒)の下のネ
ガティブおよびポジティブ領域の比率に対応して、６２％のこの総消光効果が蛍
光共鳴エネルギー伝達である。２５０から３００nmで、トリプトファンおよびチ
ロシン蛍光高度の促進は、１１およびアビジンの合計を基本にして７２％である
。
【００８４】 結論：１１をアクセプターとして、アビジン中のタンパク質蛍光をドナーとして
使用したとき、１１へのエネルギー伝達および１１の消光効果の両方を、複合体
形成のシグナルとして使用できる。
使用したとき、１１へのエネルギー伝達および１１の消光効果の両方を、複合体
形成のシグナルとして使用できる。
【００８５】 図３ｃは、５０nMの１１、１μMアビジン−BODIPY-FL、複合体および相対的差
異スペクトルの蛍光放出スペクトルを示す。これらの実験において、１１をドナ
ーとしてBODIPY-FLをアクセプターとして使用した。３３８nmの励起波長におい
て、１１の３６０nmおよび５１６nmの間の放出は複合体形成において約８０％ま
で強く消光する。エネルギー伝達効率の標準定義、Ｅ＝１−Ｆｄａ／Ｆｄは
異スペクトルの蛍光放出スペクトルを示す。これらの実験において、１１をドナ
ーとしてBODIPY-FLをアクセプターとして使用した。３３８nmの励起波長におい
て、１１の３６０nmおよび５１６nmの間の放出は複合体形成において約８０％ま
で強く消光する。エネルギー伝達効率の標準定義、Ｅ＝１−Ｆｄａ／Ｆｄは
【数５】 をもたらす。分子内ＦＲＥＴ測定または、第２成分が結合部位における可能性の
ある立体的変化を誘導する分子間ＦＲＥＴ測定に関して、Ｅのこの“古典的”定
義は意味が無い。１１のシグナル強度の約８０％の減少は、ＦＲＥＴにより、ま
たは主に基底状態相互作用による１１の蛍光の局所消光のいずれかに由来できる
。しかし、エネルギー伝達が眼に見えるようになる５００から６００nmの間のBO
DIPY-FL−蛍光強度の小さい促進は、基底状態複合体が消光効果の主な理由であ
ることを示唆する。しかし、BODIPY-FL標識が非放射崩壊過程によりその励起エ
ネルギーを失うが、１１の放出エネルギーの殆どはBODIPY-FLに吸収されたと結
論付けることはできない。約９００００Ｍ−１cm−１の励起係数は、３６０から
５１６nmの間の１１の殆ど８０％の消光効果が４４０nm５５０nmの間の波長で１
１によりモニターされるビオチンのアビジンとの相互作用に関する非常に有効な
シグナルであることを決定する。水中での１１の広い蛍光放出のため、決定波長
は殆どの小化学化合物由来のバックグラウンド蛍光シグナルよりも低いエネルギ
ーである５００nmまでシフトできる。
ある立体的変化を誘導する分子間ＦＲＥＴ測定に関して、Ｅのこの“古典的”定
義は意味が無い。１１のシグナル強度の約８０％の減少は、ＦＲＥＴにより、ま
たは主に基底状態相互作用による１１の蛍光の局所消光のいずれかに由来できる
。しかし、エネルギー伝達が眼に見えるようになる５００から６００nmの間のBO
DIPY-FL−蛍光強度の小さい促進は、基底状態複合体が消光効果の主な理由であ
ることを示唆する。しかし、BODIPY-FL標識が非放射崩壊過程によりその励起エ
ネルギーを失うが、１１の放出エネルギーの殆どはBODIPY-FLに吸収されたと結
論付けることはできない。約９００００Ｍ−１cm−１の励起係数は、３６０から
５１６nmの間の１１の殆ど８０％の消光効果が４４０nm５５０nmの間の波長で１
１によりモニターされるビオチンのアビジンとの相互作用に関する非常に有効な
シグナルであることを決定する。水中での１１の広い蛍光放出のため、決定波長
は殆どの小化学化合物由来のバックグラウンド蛍光シグナルよりも低いエネルギ
ーである５００nmまでシフトできる。
【００８６】 結論： １.蛍光異方性／偏光は、高感受性での複合体形成のモニターを可能にする。蛍
光異方性と回転的および変質的(translational)分散の間の光物理的関係に基づ
いて、１１と関連するＡＩＤＡ色素誘導体は、同様に１分子スペクトルの適当な
トレーサーであると結論付けできる。 ２.モデルシステムとしてのアビジン−ビオチンで、遊離アビジン＋１１に関し
て７０％のトリプトファンから１１へのエネルギー伝達が、複合体形成の効率シ
グナルとして４８０nmで検出された。 ３.ＦＲＥＴ、インダゾールの基底状態消光およびアビジン標識BODIPY-FLの励起
状態消光を含むことができる１１の蛍光強度の７０−８０％減少は、４４０から
５００nmの間のタンパク質−リガンド複合体のモニターの第３の可能性を提供す
る。
光異方性と回転的および変質的(translational)分散の間の光物理的関係に基づ
いて、１１と関連するＡＩＤＡ色素誘導体は、同様に１分子スペクトルの適当な
トレーサーであると結論付けできる。 ２.モデルシステムとしてのアビジン−ビオチンで、遊離アビジン＋１１に関し
て７０％のトリプトファンから１１へのエネルギー伝達が、複合体形成の効率シ
グナルとして４８０nmで検出された。 ３.ＦＲＥＴ、インダゾールの基底状態消光およびアビジン標識BODIPY-FLの励起
状態消光を含むことができる１１の蛍光強度の７０−８０％減少は、４４０から
５００nmの間のタンパク質−リガンド複合体のモニターの第３の可能性を提供す
る。
【００８７】 実施例３Ａ： ＡＩＤＡ−ビオチン結合体４−[１−[４−カルバモイルフェニル]−１Ｈ−イン
ダゾル−３−イル]−安息香酸３−(ビオチノイルアミノ)−プロピルアミド(８)
のアビジンへの結合の検出。 (ａ)トリプトファン放出と８の励起スペクトルの重複を示す、８およびアビジン
の励起および放出スペクトルは図２ｃに示す。１１は５００nmの約５０％の放出
強度の非常に広い蛍光放出バンドを有したが(図２ｂ)、８の、３位でインダゾー
ルに結合したビオチンによる放出スペクトルは、最大４５０nmで１１の広い伝達
を欠き、狭いスペクトルをもたらす。図２ｆおよび図２ｉは、ドナー(ＡＩＤＡ
蛍光分子)とアビジンの、各々アクセプター、Lucifer YellowおよびBODIPY FL標
識の間のスペクトル重複積分を示す。１１と８各々の蛍光放出の異なる重複積分
およびBODIPY吸収は、エネルギー伝達過程に関与する相対的配向因子の定質的評
価を可能にする。したがって、有効なエネルギー伝達が起こるか起こらないかと
いう、距離および非放射デポピュレーション期間の唯一の問題が残る。
ダゾル−３−イル]−安息香酸３−(ビオチノイルアミノ)−プロピルアミド(８)
のアビジンへの結合の検出。 (ａ)トリプトファン放出と８の励起スペクトルの重複を示す、８およびアビジン
の励起および放出スペクトルは図２ｃに示す。１１は５００nmの約５０％の放出
強度の非常に広い蛍光放出バンドを有したが(図２ｂ)、８の、３位でインダゾー
ルに結合したビオチンによる放出スペクトルは、最大４５０nmで１１の広い伝達
を欠き、狭いスペクトルをもたらす。図２ｆおよび図２ｉは、ドナー(ＡＩＤＡ
蛍光分子)とアビジンの、各々アクセプター、Lucifer YellowおよびBODIPY FL標
識の間のスペクトル重複積分を示す。１１と８各々の蛍光放出の異なる重複積分
およびBODIPY吸収は、エネルギー伝達過程に関与する相対的配向因子の定質的評
価を可能にする。したがって、有効なエネルギー伝達が起こるか起こらないかと
いう、距離および非放射デポピュレーション期間の唯一の問題が残る。
【００８８】 (ｂ)ドナーまたはアクセプターとしての１１での共鳴エネルギー伝達試験。 アクセプターとしてのＡＩＤＡ結合体８：(図３ｂ) ８のインダゾール分子における３位(１１における１位から)へのビオチンの結
合は、蛍光スペクトルを変えるだけでなく、トリプトファンからインダゾールＦ
ＲＥＴ特徴も変える：インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の２６％増加によ
り示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(１２０％)は、アビジ
ン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
合は、蛍光スペクトルを変えるだけでなく、トリプトファンからインダゾールＦ
ＲＥＴ特徴も変える：インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の２６％増加によ
り示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(１２０％)は、アビジ
ン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
【００８９】 ドナーとしてのＡＩＤＡ結合体８：(図３ｄ) インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分が１１よりも８
で小さいが、アクセプターのより大きな増感が、８−アビジン−BODIPY複合体で
起こり、４８％蛍光エネルギー伝達および９３.５％インダゾールドナー昇汞を
もたらす。この効果は、高ドナー量子収率により、または８におけるドナー放出
とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらされることができ
る。
で小さいが、アクセプターのより大きな増感が、８−アビジン−BODIPY複合体で
起こり、４８％蛍光エネルギー伝達および９３.５％インダゾールドナー昇汞を
もたらす。この効果は、高ドナー量子収率により、または８におけるドナー放出
とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらされることができ
る。
【００９０】 結論： 両方の分子幾何学で、１位(１１)および３位(８)を介して結合したインダゾー
ルトレーサー、BODIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の７０−９
０％消光をもたらす。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるイン
ダゾールまたはＦＲＥＴのＢＯＤＩＰＹ標識に対する基底状態消光により、励起
状態の同時非放射デポピュレーションと共にもたらされることができる。ドナー
消光シグナルの他に、アクセプター増感が、慣用の色素で標識した標的巨大分子
と結合したＡＩＤＡの選択的相互作用シグナルにより提供され、４０％以上のＦ
ＲＥＴ効果で＞５００nmを発光する。
ルトレーサー、BODIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の７０−９
０％消光をもたらす。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるイン
ダゾールまたはＦＲＥＴのＢＯＤＩＰＹ標識に対する基底状態消光により、励起
状態の同時非放射デポピュレーションと共にもたらされることができる。ドナー
消光シグナルの他に、アクセプター増感が、慣用の色素で標識した標的巨大分子
と結合したＡＩＤＡの選択的相互作用シグナルにより提供され、４０％以上のＦ
ＲＥＴ効果で＞５００nmを発光する。
【００９１】 ｃ.回転的分散およびエネルギー伝達により検出されたＡＩＤＡ結合体８のアビ
ジン−BODIPYへの結合：８におけるインダゾール部分とアビジン上の３.３BODIP
Y-FL標識の間の、時間固定蛍光スペクトルによるエネルギー伝達。ＡＩＤＡ結合
体８は、水溶液(ＰＢＳ／５％ＤＭＳＯ)中で速い蛍光脱分極を示し、小分子に結
合したクロモフォアに一般的である。アビジン(非標識)の結合は、複合体中の減
少した回転的分散のために、８の遅い脱分極を導く。BODIPY-FLで標識したアビ
ジンの８への結合は、インダゾール蛍光の更なる脱分極モードを産生する：８の
インダゾール部分とBODIPY-FL標識の間の蛍光共鳴エネルギー伝達。したがって
、８はビオチンを介してアビジンに結合するが、インダゾール放出波長でモニタ
ーするアビジン−BODIPYに結合した８の回転的分散は、非結合形のように、速く
脱分極する。８−アビジンBODIPY-FL複合体を５５０nmでモニターしたとき(BODI
PY放出波長)、蛍光異方性崩壊により測定される回転的分散は、非複合体化アビ
ジン−BODIPY構築物よりも僅かに遅い。
ジン−BODIPYへの結合：８におけるインダゾール部分とアビジン上の３.３BODIP
Y-FL標識の間の、時間固定蛍光スペクトルによるエネルギー伝達。ＡＩＤＡ結合
体８は、水溶液(ＰＢＳ／５％ＤＭＳＯ)中で速い蛍光脱分極を示し、小分子に結
合したクロモフォアに一般的である。アビジン(非標識)の結合は、複合体中の減
少した回転的分散のために、８の遅い脱分極を導く。BODIPY-FLで標識したアビ
ジンの８への結合は、インダゾール蛍光の更なる脱分極モードを産生する：８の
インダゾール部分とBODIPY-FL標識の間の蛍光共鳴エネルギー伝達。したがって
、８はビオチンを介してアビジンに結合するが、インダゾール放出波長でモニタ
ーするアビジン−BODIPYに結合した８の回転的分散は、非結合形のように、速く
脱分極する。８−アビジンBODIPY-FL複合体を５５０nmでモニターしたとき(BODI
PY放出波長)、蛍光異方性崩壊により測定される回転的分散は、非複合体化アビ
ジン−BODIPY構築物よりも僅かに遅い。
【００９２】 結論：蛍光標識した標的巨大分子とＡＩＤＡ結合体の間の相互作用は、１分子ス
ペクトルにおける蛍光寿命、回転的補正時間、または回転的または変質的分散時
間の変化のモニターにより、蛍光測定のために時間固定設定においても検出でき
る。
ペクトルにおける蛍光寿命、回転的補正時間、または回転的または変質的分散時
間の変化のモニターにより、蛍光測定のために時間固定設定においても検出でき
る。
【００９３】 パートＢ：化学 全般 １Ｈ−ＮＭＲスペクトルはBruker WC-250およびAMX-500スペクトロメーターで
記録する；化学シフトは内部標準としてのＭｅ４Ｓｉに対するppm(ae)で示す。
Ｊ値はヘルツで示し、第１番目のスペクトル回折に基づく。元素分析はAnalytic
al Department, Novartis Basle, Switzerlandが行い、特記しない限り理論値の
±０.４％以内である。ESI-MSスペクトルはFinnigan-SSq 7000で、およびCI-MS
スペクトルはFinnigan-TSQ 700で得る。融点はTermovar顕微鏡(Reichert-Jung)
で測定し、未補正である。分析的薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)：Merckプレ
コートシリカゲル60 F254プレート；検出(ａ)λ＝２５４nm、(ｂ)λ＝３６６nm
、(ｃ)MOSTAIN(５％(ＮＨ４)６Ｍｏ７Ｏ２４×４Ｈ２Ｏ、０.１％Ｃｅ(ＳＯ４)
２の１０％Ｈ２ＳＯ４溶液)または(ｄ)ニンヒドリン(エタノール中飽和溶液)で
の染色、およびホットプレートでの続く加熱。中圧クロマトグラフィー(ＭＰＬ
Ｃ)：シリカゲルMerck 60(４０−６３μm)。試薬および溶媒は、分析用または最
良の入手可能な商品品質で購入し、特記しない限り、更に精製することなく使用
する。エバポレーションは真空でローターリーエバポレーターで行う；高真空(
ＨＶ)での乾燥は０.１mbarより良いオイルポンプバキューム下で行う。
記録する；化学シフトは内部標準としてのＭｅ４Ｓｉに対するppm(ae)で示す。
Ｊ値はヘルツで示し、第１番目のスペクトル回折に基づく。元素分析はAnalytic
al Department, Novartis Basle, Switzerlandが行い、特記しない限り理論値の
±０.４％以内である。ESI-MSスペクトルはFinnigan-SSq 7000で、およびCI-MS
スペクトルはFinnigan-TSQ 700で得る。融点はTermovar顕微鏡(Reichert-Jung)
で測定し、未補正である。分析的薄層クロマトグラフィー(ＴＬＣ)：Merckプレ
コートシリカゲル60 F254プレート；検出(ａ)λ＝２５４nm、(ｂ)λ＝３６６nm
、(ｃ)MOSTAIN(５％(ＮＨ４)６Ｍｏ７Ｏ２４×４Ｈ２Ｏ、０.１％Ｃｅ(ＳＯ４)
２の１０％Ｈ２ＳＯ４溶液)または(ｄ)ニンヒドリン(エタノール中飽和溶液)で
の染色、およびホットプレートでの続く加熱。中圧クロマトグラフィー(ＭＰＬ
Ｃ)：シリカゲルMerck 60(４０−６３μm)。試薬および溶媒は、分析用または最
良の入手可能な商品品質で購入し、特記しない限り、更に精製することなく使用
する。エバポレーションは真空でローターリーエバポレーターで行う；高真空(
ＨＶ)での乾燥は０.１mbarより良いオイルポンプバキューム下で行う。
【００９４】 略語 ＢＯＰ(ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ)−トリス−(ジメチルアミノ)−ホ
スホニウムヘキサフルオロホスフェート(Castro's Reagent))；ＣＩ(化学イオン
化)；dec.(分解)；ＤＣＭ(ジクロロメタン)；ＤＩＣ(ジイソプロピルカルボジイ
ミド)；ＤＩＥＡ(ジイソプロピルエチルアミン(Huening's base))；ＤＭＡ(Ｎ,
Ｎ−ジメチルアセトアミド)；ＤＭＦ(ジメチルホルムアミド)；ＤＭＥＵ(Ｎ,Ｎ'
−ヂメチルエチレンウレア)；ＤＭＰＵ(Ｎ,Ｎ'−ジメチルプロピレンウレア)；
ＤＭＳＯ(ジメチルスルフオキシド)；ＥＳＩ(電子スプレーイオン化)；Ｆｍｏｃ
(９−フルオレニルメトキシカルボニル)；ＨＯＢｔ(１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール)；ＨＶ(高真空)；m.p.(融点)；ＭＳ(マススペクトル)；n.d.(試験せず
)；ＲＴ(室温)；ＴＥＡ(トリエチルアミン)；ＴＥＡＡ(トリエチルアンモニウム
アセテート)；ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)；ＴＨＦ(テトラヒドロフラン)；ＴＳ
ＴＵ(Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテ
トラフルオロボレート)。
スホニウムヘキサフルオロホスフェート(Castro's Reagent))；ＣＩ(化学イオン
化)；dec.(分解)；ＤＣＭ(ジクロロメタン)；ＤＩＣ(ジイソプロピルカルボジイ
ミド)；ＤＩＥＡ(ジイソプロピルエチルアミン(Huening's base))；ＤＭＡ(Ｎ,
Ｎ−ジメチルアセトアミド)；ＤＭＦ(ジメチルホルムアミド)；ＤＭＥＵ(Ｎ,Ｎ'
−ヂメチルエチレンウレア)；ＤＭＰＵ(Ｎ,Ｎ'−ジメチルプロピレンウレア)；
ＤＭＳＯ(ジメチルスルフオキシド)；ＥＳＩ(電子スプレーイオン化)；Ｆｍｏｃ
(９−フルオレニルメトキシカルボニル)；ＨＯＢｔ(１−ヒドロキシベンゾトリ
アゾール)；ＨＶ(高真空)；m.p.(融点)；ＭＳ(マススペクトル)；n.d.(試験せず
)；ＲＴ(室温)；ＴＥＡ(トリエチルアミン)；ＴＥＡＡ(トリエチルアンモニウム
アセテート)；ＴＦＡ(トリフルオロ酢酸)；ＴＨＦ(テトラヒドロフラン)；ＴＳ
ＴＵ(Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,Ｎ,Ｎ',Ｎ'−テトラメチルウロニウムテ
トラフルオロボレート)。
【００９５】 合成法 実施例１Ｂ： (ａ)スキーム１に説明のような、官能化１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾー
ル(４ａ−ｊ)の合成のための一般法：
ル(４ａ−ｊ)の合成のための一般法：
【化１０】
【００９６】 スキーム１に説明するような、ジアリールケトン(１ａ−ｊ)からのアリールヒ
ドラゾン(２ａ−ｊ)の合成。ジアリールケトン(１ａ−ｊ；１０mmol)とアリール
ヒドラジン(１１mmol)のメタノール(５０mL)中の懸濁液を、５０時間環流する。
加熱すると、透明溶液が得られる。一連の反応の間に結晶性沈殿が形成される。
氷浴で冷却後、結晶性生産物(２ａ−ｊ)を濾過して回収し、２回冷メタノールで
、数回ジエチルエーテルで洗浄する。２ａ−ｊの結晶を、一晩７０℃の乾燥オー
ブンに保つ。非対称的に置換されたジアリールケトン(１ｂ−ｆ、１ｉ−ｊ)がＥ
／Ｚ−異性体混合物として産生され(２ｂ−ｆ；２ｉ−ｊ)それを更に分割するこ
となく次段階に挿入する。 ２ａ−ｊの収率および分析的データ
ドラゾン(２ａ−ｊ)の合成。ジアリールケトン(１ａ−ｊ；１０mmol)とアリール
ヒドラジン(１１mmol)のメタノール(５０mL)中の懸濁液を、５０時間環流する。
加熱すると、透明溶液が得られる。一連の反応の間に結晶性沈殿が形成される。
氷浴で冷却後、結晶性生産物(２ａ−ｊ)を濾過して回収し、２回冷メタノールで
、数回ジエチルエーテルで洗浄する。２ａ−ｊの結晶を、一晩７０℃の乾燥オー
ブンに保つ。非対称的に置換されたジアリールケトン(１ｂ−ｆ、１ｉ−ｊ)がＥ
／Ｚ−異性体混合物として産生され(２ｂ−ｆ；２ｉ−ｊ)それを更に分割するこ
となく次段階に挿入する。 ２ａ−ｊの収率および分析的データ
【表１】 ＊：Ｅ／Ｚ−異性体の比率(指定していない)；１Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル
：２ａ−ｊの構造に一致して。
：２ａ−ｊの構造に一致して。
【００９７】 スキーム１に説明のような、１,１−ジアリール−１−アリールアゾメチル酢
酸エステル(３ａｊ)の合成。２ａ−ｊのアリールヒドラゾン(１０mmol)をジクロ
ロメタン(５０mL；出発物質が低溶解性の場合、１０％酢酸を添加することによ
り、完全な溶液が得ることができる)に溶解する。鉛四酢酸(１０mmol)のジクロ
ロメタン(１０mL)溶液を室温で添加する。均質な反応混合物を３０−６０分撹拌
する。反応の完了を薄層クロマトグラフィーでモニターする。シュウ酸ナトリウ
ム(１ｇ水溶液)の懸濁液をオレンジ−黄色溶液に添加する。１５分の激しい撹拌
の後、全混合物を濾過する。水性層を廃棄する。有機層を水で激しく洗浄し、減
圧下で蒸発させる。残りのオレンジ色油状物を酢酸エチルに溶解する。有機層を
再び数倍の水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、減圧下で蒸発乾固する。３ａ
−ｊの残りのオレンジ色泡状物を、更に一晩室温で真空で乾燥させる。３ａ−ｊ
は薄層クロマトグラフィーで示されるように均質であり、次段階に更に精製する
ことなく使用する。 ３ａ−ｊの収率および分析的データ：
酸エステル(３ａｊ)の合成。２ａ−ｊのアリールヒドラゾン(１０mmol)をジクロ
ロメタン(５０mL；出発物質が低溶解性の場合、１０％酢酸を添加することによ
り、完全な溶液が得ることができる)に溶解する。鉛四酢酸(１０mmol)のジクロ
ロメタン(１０mL)溶液を室温で添加する。均質な反応混合物を３０−６０分撹拌
する。反応の完了を薄層クロマトグラフィーでモニターする。シュウ酸ナトリウ
ム(１ｇ水溶液)の懸濁液をオレンジ−黄色溶液に添加する。１５分の激しい撹拌
の後、全混合物を濾過する。水性層を廃棄する。有機層を水で激しく洗浄し、減
圧下で蒸発させる。残りのオレンジ色油状物を酢酸エチルに溶解する。有機層を
再び数倍の水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、減圧下で蒸発乾固する。３ａ
−ｊの残りのオレンジ色泡状物を、更に一晩室温で真空で乾燥させる。３ａ−ｊ
は薄層クロマトグラフィーで示されるように均質であり、次段階に更に精製する
ことなく使用する。 ３ａ−ｊの収率および分析的データ：
【表２】 １Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：３ａ−ｊの構造に一致して。
【００９８】 スキーム１に説明のような、１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾール(４ａ−
ｊ)の合成。３ａ−ｊの１,１−ジアリール−１−アリールアゾメチル酢酸エステ
ル(１０mmol)をジクロロメタン(５０mL)に溶解する。溶液を氷浴で０℃に冷却す
る。ホウ素トリフルオリドエーテラート(１３mmol)を、撹拌しながら５分以内に
添加する。ホウ素トリフルオリドエーテラートの添加は、沈殿の即座の形成をも
たらす。反応混合物を０℃で２０分撹拌し、室温で更に３０分撹拌する。結晶性
沈殿を真空濾過により回収する。結晶を冷メタノールで２回、およびジエチルエ
ーテルで３回洗浄する。１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾール４ａ−ｊを、
減圧下、７０℃の乾燥オーブンで乾燥させる。薄層クロマトグラフィーは４ａ−
ｊの均質性を示す(再結晶は、純粋またはメタノール添加した、温ジメチルホル
ムアミドから達成できる)。 ４ａ−ｊの収率および分析的データ：
ｊ)の合成。３ａ−ｊの１,１−ジアリール−１−アリールアゾメチル酢酸エステ
ル(１０mmol)をジクロロメタン(５０mL)に溶解する。溶液を氷浴で０℃に冷却す
る。ホウ素トリフルオリドエーテラート(１３mmol)を、撹拌しながら５分以内に
添加する。ホウ素トリフルオリドエーテラートの添加は、沈殿の即座の形成をも
たらす。反応混合物を０℃で２０分撹拌し、室温で更に３０分撹拌する。結晶性
沈殿を真空濾過により回収する。結晶を冷メタノールで２回、およびジエチルエ
ーテルで３回洗浄する。１,３−ジアリール−１Ｈ−インダゾール４ａ−ｊを、
減圧下、７０℃の乾燥オーブンで乾燥させる。薄層クロマトグラフィーは４ａ−
ｊの均質性を示す(再結晶は、純粋またはメタノール添加した、温ジメチルホル
ムアミドから達成できる)。 ４ａ−ｊの収率および分析的データ：
【表３】 １Ｈ／１３Ｃ−ＮＭＲスペクトル：４ａ−ｊの構造に一致して。
【００９９】 (ｂ)１,３−ジアリール−５−ニトロ−ｌＨ−インダゾール(４ｋ、４ｌ)の合成
： ４−[３−(４−カルボキシ−フェニル)−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−１
−イル]−安息香酸(４ｋ)。硝酸(６５％、４mL)を氷浴で０℃に冷却し、硫酸(９
５％、４mL)を添加する。１,３−ビス−(４−カルボキシフェニル)−１Ｈ−イン
ダゾール(４ｂ)(３００mg、０.８３５mmol)を、０℃で撹拌下に添加する。冷却
および撹拌を１０分続ける。混合物を氷水(１５０mL)に注ぎ、ｐＨを４−５に２
Ｎ−ＮａＯＨの添加により調節する。結晶を濾過により回収し、濾液が中性に近
くなるまで食塩水で洗浄する。結晶を２時間、９０℃で乾燥させ、ジメチルホル
ムアミド／メタノールから再結晶する。生産物を濾過により回収し、１２０℃で
減圧下乾燥させ、１５３mg(４５％)の４ｋを得る：ｍ.ｐ. ３４８−３５０℃。
： ４−[３−(４−カルボキシ−フェニル)−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−１
−イル]−安息香酸(４ｋ)。硝酸(６５％、４mL)を氷浴で０℃に冷却し、硫酸(９
５％、４mL)を添加する。１,３−ビス−(４−カルボキシフェニル)−１Ｈ−イン
ダゾール(４ｂ)(３００mg、０.８３５mmol)を、０℃で撹拌下に添加する。冷却
および撹拌を１０分続ける。混合物を氷水(１５０mL)に注ぎ、ｐＨを４−５に２
Ｎ−ＮａＯＨの添加により調節する。結晶を濾過により回収し、濾液が中性に近
くなるまで食塩水で洗浄する。結晶を２時間、９０℃で乾燥させ、ジメチルホル
ムアミド／メタノールから再結晶する。生産物を濾過により回収し、１２０℃で
減圧下乾燥させ、１５３mg(４５％)の４ｋを得る：ｍ.ｐ. ３４８−３５０℃。
【０１００】 ４−[３−(４−カルバモイル−フェニル)−５−ニトロ−１Ｈ−インダゾール−
１−イル]−安息香酸(４ｌ)。硝酸(６５％、４mL)を０℃に氷浴中で冷却し、硫
酸(９５％、４mL)を添加する。４−[３−(４−カルバモイル−フェニル)−ｌＨ
−インダゾール−１−イル]−安息香酸(４ｃ)(３００mg、０.８４mmol)を０℃で
撹拌下添加する。冷却および撹拌を１５分続ける。混合物を氷水(１５０mL)に注
ぐ。沈殿を遠心により回収し、食塩水で濾液が中性に近くなるまで洗浄した。結
晶を３０分、１２０℃で乾燥させ、ジメチルホルムアミド／メタノールから再結
晶させる。生産物を濾過により回収し、１２０℃で減圧下乾燥させ、２１１mg(
６２％)の４ｌを得る：ｍ.ｐ. ３２０−３２２℃。
１−イル]−安息香酸(４ｌ)。硝酸(６５％、４mL)を０℃に氷浴中で冷却し、硫
酸(９５％、４mL)を添加する。４−[３−(４−カルバモイル−フェニル)−ｌＨ
−インダゾール−１−イル]−安息香酸(４ｃ)(３００mg、０.８４mmol)を０℃で
撹拌下添加する。冷却および撹拌を１５分続ける。混合物を氷水(１５０mL)に注
ぐ。沈殿を遠心により回収し、食塩水で濾液が中性に近くなるまで洗浄した。結
晶を３０分、１２０℃で乾燥させ、ジメチルホルムアミド／メタノールから再結
晶させる。生産物を濾過により回収し、１２０℃で減圧下乾燥させ、２１１mg(
６２％)の４ｌを得る：ｍ.ｐ. ３２０−３２２℃。
【０１０１】 (ｃ)４−[１−(４−ニトロフェニル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル]−安息香
酸(４ｌ)の還元。 ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ(２８０mg、１.２４mmol)の濃ＨＣｌ(３mL)溶液に、４
−[１−(４−ニトロフェニル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル]−安息香酸(４
ｉ)(８０mg、０.２２３mmol)を添加する。懸濁液を７時間、７０℃に保つ。反応
混合物を水で希釈し、沈殿を濾過により回収する。粗生産物(まだ１２％の未反
応出発物質を含む)を上記のような第２還元サイクルに付す。沈殿を水、および
続いて乾燥エーテルで激しく洗浄する。結晶性４−[１−(４−アミノフェニル)
−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−安息香酸塩酸塩(４ｍ)を減圧下乾燥させる(
５０mg、６１％)。ＭＳ(ＡＰＣＩ)：ｍ／ｚ＝３３０(ＭＨ)＋。
酸(４ｌ)の還元。 ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ(２８０mg、１.２４mmol)の濃ＨＣｌ(３mL)溶液に、４
−[１−(４−ニトロフェニル)−１Ｈ−インダゾール−３−イル]−安息香酸(４
ｉ)(８０mg、０.２２３mmol)を添加する。懸濁液を７時間、７０℃に保つ。反応
混合物を水で希釈し、沈殿を濾過により回収する。粗生産物(まだ１２％の未反
応出発物質を含む)を上記のような第２還元サイクルに付す。沈殿を水、および
続いて乾燥エーテルで激しく洗浄する。結晶性４−[１−(４−アミノフェニル)
−１Ｈ−インダゾール−３−イル)−安息香酸塩酸塩(４ｍ)を減圧下乾燥させる(
５０mg、６１％)。ＭＳ(ＡＰＣＩ)：ｍ／ｚ＝３３０(ＭＨ)＋。
【０１０２】 ｄ)４−[３−(４ニトロフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸(
４ｆ)の還元 ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ(２８０mg、１.２４mmol)の濃ＨＣｌ(３mL)溶液に、４
−[３−(４ニトロフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸(４ｆ)
(８０mg、０.２２３mmol)を添加する。懸濁液を７時間、７０℃に保つ。反応混
合物を水で希釈し、沈殿を濾過により回収する。粗生産物(まだ１２％の未反応
出発物質を含む)を上記のような第２還元サイクルに付す。沈殿を水、および続
いて乾燥エーテルで激しく洗浄する。結晶性４−[３−(４−アミノフェニル)−
１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸塩酸塩(４ｎ)を減圧下で乾燥させる(
７０mg、８５％)。ＭＳ(ＡＰＣＩ)：ｍ／ｚ＝３３０(ＭＨ)＋、３７１([Ｍ＋Ｃ
Ｈ３ＣＮ]Ｈ)＋。
４ｆ)の還元 ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ(２８０mg、１.２４mmol)の濃ＨＣｌ(３mL)溶液に、４
−[３−(４ニトロフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸(４ｆ)
(８０mg、０.２２３mmol)を添加する。懸濁液を７時間、７０℃に保つ。反応混
合物を水で希釈し、沈殿を濾過により回収する。粗生産物(まだ１２％の未反応
出発物質を含む)を上記のような第２還元サイクルに付す。沈殿を水、および続
いて乾燥エーテルで激しく洗浄する。結晶性４−[３−(４−アミノフェニル)−
１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香酸塩酸塩(４ｎ)を減圧下で乾燥させる(
７０mg、８５％)。ＭＳ(ＡＰＣＩ)：ｍ／ｚ＝３３０(ＭＨ)＋、３７１([Ｍ＋Ｃ
Ｈ３ＣＮ]Ｈ)＋。
【０１０３】 (ｅ)４−[３−(４−アミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安息香
酸塩酸塩のアシル化(４ｎ)。 ４−[３−(４−アセチルアミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−
安息香酸(４０)。４−[３−(４−アミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−
イル]−安息香酸塩酸塩(４ｎ)(１８３mg、０.５mmol)のピリジン(１０mL)溶液に
、塩化アセチル(４７mg、０.６mmol)を添加する。その溶液を、１.５時間、室温
で撹拌する。揮発性物質を減圧下で除去する。残渣をＭｅＯＨで処理する。結晶
性生産物を濾過により回収し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させる：１６５mg(８９
％)の４ｏ。ＭＳ(ＥＳｌ)：ｍ／ｚ＝３７２(６１％)(ＭＨ)＋；４２６(５０％)(
Ｍ＋Ｎａ＋ＭｅＯＨ)＋；７６５(１００％)(２Ｍ＋Ｎａ)＋。
酸塩酸塩のアシル化(４ｎ)。 ４−[３−(４−アセチルアミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−
安息香酸(４０)。４−[３−(４−アミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−
イル]−安息香酸塩酸塩(４ｎ)(１８３mg、０.５mmol)のピリジン(１０mL)溶液に
、塩化アセチル(４７mg、０.６mmol)を添加する。その溶液を、１.５時間、室温
で撹拌する。揮発性物質を減圧下で除去する。残渣をＭｅＯＨで処理する。結晶
性生産物を濾過により回収し、ＭｅＯＨで洗浄し、乾燥させる：１６５mg(８９
％)の４ｏ。ＭＳ(ＥＳｌ)：ｍ／ｚ＝３７２(６１％)(ＭＨ)＋；４２６(５０％)(
Ｍ＋Ｎａ＋ＭｅＯＨ)＋；７６５(１００％)(２Ｍ＋Ｎａ)＋。
【０１０４】 ４−{３−{４−[Ｎ−(９Ｈ−フルオレン−９−イル)−メチルオキシカルボニ
ル−グリシノイルアミノ]−フェニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル−安息香
酸(４ｐ)。４−[３−(４−アミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イルｌ
−安息香酸塩酸塩(４ｎ)(１８３mg、０.５mmol)のピリジン(１０mL)溶液に、Ｆ
ｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｃｌ(２２０mg、０.７mmol)を添加する。溶液を、出発物質(４
ｎ)が消費されるまで(ＨＰＬＣ)撹拌する。溶媒を減圧下除去する。残渣をＭｅ
ＯＨに懸濁する。結晶性生産物を濾過により回収し、ＭｅＯＨで洗浄し、減圧下
乾燥させる：２０３mg(６７％)の４ｐ。ＭＳ(ＥＳＩ)：ｍ／ｚ＝６３１(１００
％)(Ｍ＋Ｎａ)＋。
ル−グリシノイルアミノ]−フェニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル−安息香
酸(４ｐ)。４−[３−(４−アミノフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イルｌ
−安息香酸塩酸塩(４ｎ)(１８３mg、０.５mmol)のピリジン(１０mL)溶液に、Ｆ
ｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ｃｌ(２２０mg、０.７mmol)を添加する。溶液を、出発物質(４
ｎ)が消費されるまで(ＨＰＬＣ)撹拌する。溶媒を減圧下除去する。残渣をＭｅ
ＯＨに懸濁する。結晶性生産物を濾過により回収し、ＭｅＯＨで洗浄し、減圧下
乾燥させる：２０３mg(６７％)の４ｐ。ＭＳ(ＥＳＩ)：ｍ／ｚ＝６３１(１００
％)(Ｍ＋Ｎａ)＋。
【０１０５】 (ｆ)４−[３−(４−カルボキシフェニル)−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−安
息香酸のクロロスルホニル化 (４ｂ)。インダゾール誘導体４ｂ(２１mg、０.０６mmol)をクロロ硫酸(１mL)で
１２０℃で１０分処理する。反応混合物を氷浴で冷却し、水に滴下する(０℃、
４mL)。沈殿を濾過し、８０℃で減圧下乾燥させる：１９ｍｇの４−[３−(４−
カルボキシフェニル)５−クロロスルホニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−
安息香酸(４ｑ)(６９％)。ＭＳ(ＥＳＩ)：４５７(１００％)(ＭＨ)＋。
息香酸のクロロスルホニル化 (４ｂ)。インダゾール誘導体４ｂ(２１mg、０.０６mmol)をクロロ硫酸(１mL)で
１２０℃で１０分処理する。反応混合物を氷浴で冷却し、水に滴下する(０℃、
４mL)。沈殿を濾過し、８０℃で減圧下乾燥させる：１９ｍｇの４−[３−(４−
カルボキシフェニル)５−クロロスルホニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル]−
安息香酸(４ｑ)(６９％)。ＭＳ(ＥＳＩ)：４５７(１００％)(ＭＨ)＋。
【０１０６】 化合物４ｍ−４ｑの１Ｈ−ＮＭＲ： ４ｍ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：７.４２(ｄｄ［ｔ］, Ｊ＝７.４, Ｊ＝
７.４，１Ｈ)；７.５２, ７.５６, ７.９２, ７.９５(ＡＡ'ＢＢ', ４Ｈ)；７.
５７−７.６３(ｍ，１Ｈ)；７.９２(ｄ, Ｊ＝８.４，１Ｈ)；８.１２, ８.１５,
８.２０, ８.２３(ＡＡ'ＢＢ', ４Ｈ)；８.２６(ｄ, Ｊ＝８.３，１Ｈ)。 ４ｎ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：７.３８−７.６４(ｍ, ３Ｈ)；７.６１(
ｄｄ, ブロード, １Ｈ)；７.９９−８.１０(ｍ, ３Ｈ)；８.１５−８.２２(ｍ,
５Ｈ)。 ４ｏ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：２.１０(ｓ, ３Ｈ)；７.３９(ｄｄｄ，
１Ｈ)；７.５９(ｄｄｄ, １Ｈ)；７.７６−７.８２(ｍ, ２Ｈ)；７.９８−８.０
３(ｍ, ５Ｈ)；８.１２−８.２２(ｍ, ３Ｈ)；１０.１４(ｓ，１Ｈ)。 ４ｐ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６, ５００ＭＨｚ)：３.８６(ｄ, ２Ｈ, Ｊ＝
６.１, ＣＨ２)；４.２５(ｔ, Ｊ＝６.８, １Ｈ, ＣＨＣＨ２)；４.３３(ｄ, Ｊ
＝７.０, ２Ｈ, ＣＨＣＨ ２), ７.３４(ｄｔ, Ｊ＝０.６, ７.４, ２Ｈ, Ｆｍｏ
ｃ−アリール−Ｈ)；７.４０(ｔ, Ｊ＝７.５，１Ｈ, ＣＨ２ＮＨ)；７.４２(ｔ,
Ｊ＝７.４, ２Ｈ, Ｆｍｏｃ−アリール−Ｈ)；７.６０(ｔ, ブロード, ｌＨ,
インダゾール−Ｈ)；７.６７(ｔ, ブロード，ｌＨ, インダゾール−Ｈ)；７.７
４(ｄ, Ｊ＝７.５, ２Ｈ, Ｆｍｏｃ−アリールＨ)；７.８２(ｄ, ブロード, ２
Ｈ, アリール−Ｈ)；７.８９(ｄ, Ｊ＝７.６, ２Ｈ, Ｆｍｏｃ−アリール−Ｈ)
；８.０１, ８.０２, ８.１６, ８.１７(Ｍ'ＢＢ', ４Ｈ, アリール−Ｈ)；８.
０３(ｄ, ブロード, ２Ｈ, アリール−Ｈ)；８.０４(ｄ, ブロード, １Ｈ, イン
ダゾール−Ｈ７)；８.２１(ｄ, Ｊ＝８.２Ｈｚ，１Ｈ, インダゾール−Ｈ４)；
１０.１９(ｓ, アリール−ＮＨ)；１３.０５(ｓ, ブロード, ＣＯ２ Ｈ)。
７.４，１Ｈ)；７.５２, ７.５６, ７.９２, ７.９５(ＡＡ'ＢＢ', ４Ｈ)；７.
５７−７.６３(ｍ，１Ｈ)；７.９２(ｄ, Ｊ＝８.４，１Ｈ)；８.１２, ８.１５,
８.２０, ８.２３(ＡＡ'ＢＢ', ４Ｈ)；８.２６(ｄ, Ｊ＝８.３，１Ｈ)。 ４ｎ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：７.３８−７.６４(ｍ, ３Ｈ)；７.６１(
ｄｄ, ブロード, １Ｈ)；７.９９−８.１０(ｍ, ３Ｈ)；８.１５−８.２２(ｍ,
５Ｈ)。 ４ｏ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：２.１０(ｓ, ３Ｈ)；７.３９(ｄｄｄ，
１Ｈ)；７.５９(ｄｄｄ, １Ｈ)；７.７６−７.８２(ｍ, ２Ｈ)；７.９８−８.０
３(ｍ, ５Ｈ)；８.１２−８.２２(ｍ, ３Ｈ)；１０.１４(ｓ，１Ｈ)。 ４ｐ：１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６, ５００ＭＨｚ)：３.８６(ｄ, ２Ｈ, Ｊ＝
６.１, ＣＨ２)；４.２５(ｔ, Ｊ＝６.８, １Ｈ, ＣＨＣＨ２)；４.３３(ｄ, Ｊ
＝７.０, ２Ｈ, ＣＨＣＨ ２), ７.３４(ｄｔ, Ｊ＝０.６, ７.４, ２Ｈ, Ｆｍｏ
ｃ−アリール−Ｈ)；７.４０(ｔ, Ｊ＝７.５，１Ｈ, ＣＨ２ＮＨ)；７.４２(ｔ,
Ｊ＝７.４, ２Ｈ, Ｆｍｏｃ−アリール−Ｈ)；７.６０(ｔ, ブロード, ｌＨ,
インダゾール−Ｈ)；７.６７(ｔ, ブロード，ｌＨ, インダゾール−Ｈ)；７.７
４(ｄ, Ｊ＝７.５, ２Ｈ, Ｆｍｏｃ−アリールＨ)；７.８２(ｄ, ブロード, ２
Ｈ, アリール−Ｈ)；７.８９(ｄ, Ｊ＝７.６, ２Ｈ, Ｆｍｏｃ−アリール−Ｈ)
；８.０１, ８.０２, ８.１６, ８.１７(Ｍ'ＢＢ', ４Ｈ, アリール−Ｈ)；８.
０３(ｄ, ブロード, ２Ｈ, アリール−Ｈ)；８.０４(ｄ, ブロード, １Ｈ, イン
ダゾール−Ｈ７)；８.２１(ｄ, Ｊ＝８.２Ｈｚ，１Ｈ, インダゾール−Ｈ４)；
１０.１９(ｓ, アリール−ＮＨ)；１３.０５(ｓ, ブロード, ＣＯ２ Ｈ)。
【０１０７】 実施例２Ｂ：(ａ)スキーム２に説明のような、４−{３−{４−[(３−アミノプロ
ピル)−アミノカルボニル]−フェニル}−１Ｈ−インダゾール−１−イル}−安息
香酸(５)の合成 スキーム２：
ピル)−アミノカルボニル]−フェニル}−１Ｈ−インダゾール−１−イル}−安息
香酸(５)の合成 スキーム２：
【化１１】 条件(ａ)１,３−ジアミノプロパン(純)、９０℃、４時間。(ｂ)Ｋ２ＣＯ３、水
、１,４−ジオキソラン、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ、０℃、１０分、ＲＴ、１２時間。
、１,４−ジオキソラン、Ｆｍｏｃ−Ｃｌ、０℃、１０分、ＲＴ、１２時間。
【０１０８】 １,３−ジアミノ−プロパン(８０mL)を、４ｄ(１０.０ｇ、２６.８５mmol)に
添加する。異成分から成る反応混合物を、９０℃に撹拌下加熱する。４ｄを一度
溶媒に反応温度で溶解し、次いで溶液を４時間放置して反応させる。１,３−ジ
アミノ−プロパンを減圧下蒸留し、粘性油状物を後に残す。粗生産物をメタノー
ル(２００mL)で希釈し、加熱還流する。メタノールが沸騰温度に到達する前に、
結晶性生産物は沈殿を始める。懸濁液を１０分還流させ、次いで室温に冷却する
。無色結晶を氷状メタノールで１回、次いでジエチルエーテルで数回洗浄する。
生産物を乾燥オーブン中、減圧下、１２０℃で乾燥させ、９.８６ｇ(８９％)の
５を得る：ｍｐ ２８５−２８８℃(加熱速度に依存；分解)；１Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ
ＭＳＯ−ｄ６)：１.８５−２.０５(ｍ, ２Ｈ)；２.９０−３.０５(ｍ, ２Ｈ)；
３.３５−３.５５(ｍ, ２Ｈ)；７.３２(ｔ，１Ｈ)；７.５１(ｔ，１Ｈ)；７.７
５−８.３０(ｍ, １０Ｈ)；９.２０(ブロード, ｔ, １Ｈ, ＣＯＮＨ)；ＭＳ：ｅ
／ｍ ４１５(ＭＨ＋)。
添加する。異成分から成る反応混合物を、９０℃に撹拌下加熱する。４ｄを一度
溶媒に反応温度で溶解し、次いで溶液を４時間放置して反応させる。１,３−ジ
アミノ−プロパンを減圧下蒸留し、粘性油状物を後に残す。粗生産物をメタノー
ル(２００mL)で希釈し、加熱還流する。メタノールが沸騰温度に到達する前に、
結晶性生産物は沈殿を始める。懸濁液を１０分還流させ、次いで室温に冷却する
。無色結晶を氷状メタノールで１回、次いでジエチルエーテルで数回洗浄する。
生産物を乾燥オーブン中、減圧下、１２０℃で乾燥させ、９.８６ｇ(８９％)の
５を得る：ｍｐ ２８５−２８８℃(加熱速度に依存；分解)；１Ｈ−ＮＭＲ(Ｄ
ＭＳＯ−ｄ６)：１.８５−２.０５(ｍ, ２Ｈ)；２.９０−３.０５(ｍ, ２Ｈ)；
３.３５−３.５５(ｍ, ２Ｈ)；７.３２(ｔ，１Ｈ)；７.５１(ｔ，１Ｈ)；７.７
５−８.３０(ｍ, １０Ｈ)；９.２０(ブロード, ｔ, １Ｈ, ＣＯＮＨ)；ＭＳ：ｅ
／ｍ ４１５(ＭＨ＋)。
【０１０９】 (ｂ)スキーム２に説明のような、４−{３−{４−[Ｎ−３−[(９Ｈ−フルオレン
−９−イル)−メチルオキシカルボニルアミノ]−プロピル]−アミノカルボニル}
−フェニル−ｌＨ−インダゾール−ｌ−イル}安息香酸(６)の合成。炭酸カリウ
ム(２.６７ｇ；１５.４５mmol)をアミノ酸５(３.２０ｇ；７.７３mmol)の水(６
０mL)溶液および１,４−ジオキサン(３５mL)の懸濁液に添加する。混合物を５分
撹拌し、氷浴中で０℃に冷却する。Ｆｍｏｃ−クロライド(２.２０ｇ；８.５mmo
l)の１,４−ジオキサン(３５mL)溶液を、１０分以内に滴下する。冷却浴を外し
、撹拌を室温で１２時間続ける。巨大な沈殿が形成される。水性懸濁液をジエチ
ルエーテルで抽出する。ｐＨを希釈ＨＣｌで１に調節し、更に食塩水(１００mL)
で希釈する。沈殿を真空濾過により回収し、ジエチルエーテルで激しく洗浄し、
塊りだらけの結晶を得る。生産物を２４時間、３５℃で減圧下、乾燥オーブンで
乾燥させ、４.１４ｇ(８４％)の６を得る：ｍｐ ２１７−２１９.５℃(加熱速
度に依存、分解)；１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：１.６８−１.７７(ｍ, ２Ｈ
)；３.０５−３.１２(ｍ, ２Ｈ), ３.２５−３.３５(ｍ, ２Ｈ)；４.２２(ｔ,
１Ｈ, Ｈ−９フルオレニル)；４.３３(ｄ, ２Ｈ, ＯＣＨ２−９−フルオレニル)
；７.２７−７.３５(ｍ, ＯＨ), ７.３７−７.４６(ｍ, ＯＨ)；７.６３(ｔ, １
Ｈ)；７.７０(ｄ, ２Ｈ，Ｈ−フルオレニル)；７.８８(ｄ, ２Ｈ，Ｈフルオレニ
ル)；８.０１−８.０８(ｍ, ５Ｈ)；８.１５−８.２０(ｍ, ４Ｈ)；８.２４(ｄ,
１Ｈ)；８.５８(ｔ, １Ｈ, ＣＯＮＨ)；ＭＳ：６３５(Ｍ−Ｈ)。
−９−イル)−メチルオキシカルボニルアミノ]−プロピル]−アミノカルボニル}
−フェニル−ｌＨ−インダゾール−ｌ−イル}安息香酸(６)の合成。炭酸カリウ
ム(２.６７ｇ；１５.４５mmol)をアミノ酸５(３.２０ｇ；７.７３mmol)の水(６
０mL)溶液および１,４−ジオキサン(３５mL)の懸濁液に添加する。混合物を５分
撹拌し、氷浴中で０℃に冷却する。Ｆｍｏｃ−クロライド(２.２０ｇ；８.５mmo
l)の１,４−ジオキサン(３５mL)溶液を、１０分以内に滴下する。冷却浴を外し
、撹拌を室温で１２時間続ける。巨大な沈殿が形成される。水性懸濁液をジエチ
ルエーテルで抽出する。ｐＨを希釈ＨＣｌで１に調節し、更に食塩水(１００mL)
で希釈する。沈殿を真空濾過により回収し、ジエチルエーテルで激しく洗浄し、
塊りだらけの結晶を得る。生産物を２４時間、３５℃で減圧下、乾燥オーブンで
乾燥させ、４.１４ｇ(８４％)の６を得る：ｍｐ ２１７−２１９.５℃(加熱速
度に依存、分解)；１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)：１.６８−１.７７(ｍ, ２Ｈ
)；３.０５−３.１２(ｍ, ２Ｈ), ３.２５−３.３５(ｍ, ２Ｈ)；４.２２(ｔ,
１Ｈ, Ｈ−９フルオレニル)；４.３３(ｄ, ２Ｈ, ＯＣＨ２−９−フルオレニル)
；７.２７−７.３５(ｍ, ＯＨ), ７.３７−７.４６(ｍ, ＯＨ)；７.６３(ｔ, １
Ｈ)；７.７０(ｄ, ２Ｈ，Ｈ−フルオレニル)；７.８８(ｄ, ２Ｈ，Ｈフルオレニ
ル)；８.０１−８.０８(ｍ, ５Ｈ)；８.１５−８.２０(ｍ, ４Ｈ)；８.２４(ｄ,
１Ｈ)；８.５８(ｔ, １Ｈ, ＣＯＮＨ)；ＭＳ：６３５(Ｍ−Ｈ)。
【０１１０】 (ｃ)４−{３−{４−ｔ(３−メチルアミノプロピル)−アミノカルボニル−フェニ
ル}−１Ｈ−インダゾール−１−イル}−安息香酸(５ａ)の合成。インダゾール４
ｄ(１８６mg、０.５mmol)に、３−メチルアミノ−プロピルアミン(５mL)を添加
する。溶液を還流温度に８時間保つ。反応混合物を室温に冷却し、水(２０mL)で
希釈し、濃塩酸で酸性化する。無色沈殿が形成される。懸濁液を遠心(４５００
ｒｐｍ)する。水性層を廃棄する。残りのゲルを塩酸(０.１Ｎ、３０ｍＬ、５回)
で洗浄し、真空で７０℃で８時間乾燥させる。粗材料を温ＤＭＦ(２mL)に溶解さ
せる。溶液を室温に冷却し、エーテル(２０mL)で希釈する。白色懸濁液が形成さ
れ、茶色沈殿がフラスコの底に分離する。懸濁液を分離し、遠心(４５００ｒｐ
ｍ)する。有機層を除去する。残りの無色固体をエーテル(２ｍＬ、２回)で洗浄
し、真空で２時間乾燥させる：９３mg(４３％)の５ａ：ｍｐ １８６−１９０℃
；ＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ＝４２９(１００％)(Ｍ＋Ｈ)＋；１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ
−ｄ６)：１.８５−１.８９(ｍ, ２Ｈ, ＣＨ２ＣＨ ２ＣＨ２)；２.５６(ｓ, Ｏ
Ｈ, ＮＨＣＨ ３)；２.９６(ｔ, ブロード, ２Ｈ, ＣＨ ２ＮＨ)；３.３３−３.４
５(ｍ, ２Ｈ, ＣＯＮＨＣＨ ２)；７.４５(ｔ, １Ｈ, インダゾール−Ｈ)；７.６
４(ｔ, １Ｈ, インダゾール−Ｈ)；７.９５−８.２８(ｍ, １０Ｈ)；８.８９(ｔ
, １Ｈ, ＣＯＮＨＣＨ２)。
ル}−１Ｈ−インダゾール−１−イル}−安息香酸(５ａ)の合成。インダゾール４
ｄ(１８６mg、０.５mmol)に、３−メチルアミノ−プロピルアミン(５mL)を添加
する。溶液を還流温度に８時間保つ。反応混合物を室温に冷却し、水(２０mL)で
希釈し、濃塩酸で酸性化する。無色沈殿が形成される。懸濁液を遠心(４５００
ｒｐｍ)する。水性層を廃棄する。残りのゲルを塩酸(０.１Ｎ、３０ｍＬ、５回)
で洗浄し、真空で７０℃で８時間乾燥させる。粗材料を温ＤＭＦ(２mL)に溶解さ
せる。溶液を室温に冷却し、エーテル(２０mL)で希釈する。白色懸濁液が形成さ
れ、茶色沈殿がフラスコの底に分離する。懸濁液を分離し、遠心(４５００ｒｐ
ｍ)する。有機層を除去する。残りの無色固体をエーテル(２ｍＬ、２回)で洗浄
し、真空で２時間乾燥させる：９３mg(４３％)の５ａ：ｍｐ １８６−１９０℃
；ＭＳ(ＥＳＩ)ｍ／ｚ＝４２９(１００％)(Ｍ＋Ｈ)＋；１Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ
−ｄ６)：１.８５−１.８９(ｍ, ２Ｈ, ＣＨ２ＣＨ ２ＣＨ２)；２.５６(ｓ, Ｏ
Ｈ, ＮＨＣＨ ３)；２.９６(ｔ, ブロード, ２Ｈ, ＣＨ ２ＮＨ)；３.３３−３.４
５(ｍ, ２Ｈ, ＣＯＮＨＣＨ ２)；７.４５(ｔ, １Ｈ, インダゾール−Ｈ)；７.６
４(ｔ, １Ｈ, インダゾール−Ｈ)；７.９５−８.２８(ｍ, １０Ｈ)；８.８９(ｔ
, １Ｈ, ＣＯＮＨＣＨ２)。
【０１１１】 実施例３Ｂ (ａ)スキーム３に説明する、３' (＋)−４−{３−[４−(３'−ビオチノイルアミ
ノプロピル)アミノカルボニル]フェニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル}安息
香酸アミド(８)の合成
ノプロピル)アミノカルボニル]フェニル−１Ｈ−インダゾール−１−イル}安息
香酸アミド(８)の合成
【０１１２】 スキーム３：
【化１２】 ７ａ：Ｒ＝ＣＯＯＭe； ７ｂ：Ｒ＝−ＮＨ−(ＣＨ２)３−ＮＨ−Ｆmoc； 条件：(ａ)ＤＣＭ／ピペリジン； (ｂ)６または４ｄ、ＤＩＣ、ＨＯＢt、ＤＭＦ； (ｃ)ＤＣＭ／ＴＦＡ； (ｄ)(＋)−ビオチン、ＤＩＣ、ＨＯＢt、ＤＭＦ。
【０１１３】 Ｒinkアミド樹脂(５００mg；０.２８mmol)をジクロロメタン(１０ml)中のピペ
リジン(２０％)と共に室温で１時間振盪する。最後の濾液試料が切断された保護
基の存在を示さなくなるまで、その樹脂を、ジクロロメタン、メタノール、そし
て最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄する。６(０.５６mmol)、１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール(１.６８mmol)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(
２.２４mmol)およびジメチルホルムアミド(３５ml)から調製した溶液中、その樹
脂を室温で一晩振盪する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、次いでメタノー
ル、そして最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。最後の濾液に蛍光
がなくなるまで、洗浄し続ける。溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。Ｒinkアミ
ド樹脂の脱保護に関して上記した通り、６が結合した樹脂のＦmoc保護基を除去
する。ジメチルホルムアミド(４０ml)中の(＋)−ビオチン(０.８４mmol)および
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(２.５２mmol)の溶液に、Ｎ,Ｎ'−ジイソプ
ロピルカルボジイミド(５.０４mmol)を加える。その溶液を室温で１時間放置し
た後、樹脂に移す。反応容器を円運動により２４時間穏やかに撹拌する。溶媒を
減圧濾過により除去する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、メタノール、そ
して最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。その樹脂をジクロロメタ
ンとトリフルオロ酢酸との１：１の混合物(１５ml)で２分間処理することにより
、粗製の生成物(８)を固形担体から切断する。その溶液を減圧濾過により集める
。その樹脂をさらにジクロロメタンで３回抽出する。溶媒を減圧下に除去して、
８を粘性の油状物質として１Ｈ−ＮＭＲにより示される高い純度で得る。エーテ
ルでトリチュレートして、結晶化を誘発する。ジメチルスルホキシド、メタノー
ル、およびジエチルエーテルの混合物から再結晶化して、８を６０mg(３３％)得
る。 融点 ２２２−２２５℃。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.２５−１.６６(ｍ，６Ｈ，ビオチン)；１.
６７−１.７２(ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ ２ＣＨ２ＮＨ)；２.０９(ｔ，２Ｈ，
ＣＯＣＨ２)；２.５６，２.５８，２.７９，２.８０，２.８１，２.８２(２Ｈ，
ＣＨ ２Ｓ，ＡＢＸのＡＢ部分)；３.０８−３.１０(ｍ，１Ｈ，ＣＨＳ−ビオチン
)；３.１１−３.１５(ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ ２)；３.３０−３.３４(ｍ，２Ｈ，ＮＣ Ｈ ２ )；４.１１−４.１４(ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ビオチン)；４.２８−４.３０(ｍ，
１Ｈ，ＣＨ−ビオチン，ＡＢＸのＸ部分)；６.３４(ｓ，ブロード，１Ｈ，ＮＨ
ＣＯＮＨ)；６.４２(ｓ，ブロード，１Ｈ，ＮＨＣＯＮＨ)；７.４４(ddd，１Ｈ)
；７.４７(ｓ，ブロード，ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；７.６１(ddd，１Ｈ)；７.８４(
ｔ，１Ｈ，ＮＨＣＯ)；７.９７−８.０６(ｍ，５Ｈ)；８.１２(ｓ，ブロード，
ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；８.１３−８.２６(ｍ，５Ｈ)；８.５９(ｔ，１Ｈ，ＮＨＣ
Ｏ)。 ＭＳ ： ｅ／ｍ ６４０ (ＭＨ)＋。 微量分析 ：(Ｃ３４Ｈ３７Ｎ７Ｏ４Ｓ１ｘＨ２Ｏ) 計算値 Ｃ ６２.０８：Ｈ ５.９８；Ｎ １４.９１；Ｓ ４.８７。 実測値 Ｃ ６２.１９：Ｈ ５.８２；Ｎ １４.７８；Ｓ ４.６７。
リジン(２０％)と共に室温で１時間振盪する。最後の濾液試料が切断された保護
基の存在を示さなくなるまで、その樹脂を、ジクロロメタン、メタノール、そし
て最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄する。６(０.５６mmol)、１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール(１.６８mmol)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(
２.２４mmol)およびジメチルホルムアミド(３５ml)から調製した溶液中、その樹
脂を室温で一晩振盪する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、次いでメタノー
ル、そして最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。最後の濾液に蛍光
がなくなるまで、洗浄し続ける。溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。Ｒinkアミ
ド樹脂の脱保護に関して上記した通り、６が結合した樹脂のＦmoc保護基を除去
する。ジメチルホルムアミド(４０ml)中の(＋)−ビオチン(０.８４mmol)および
１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(２.５２mmol)の溶液に、Ｎ,Ｎ'−ジイソプ
ロピルカルボジイミド(５.０４mmol)を加える。その溶液を室温で１時間放置し
た後、樹脂に移す。反応容器を円運動により２４時間穏やかに撹拌する。溶媒を
減圧濾過により除去する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、メタノール、そ
して最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。その樹脂をジクロロメタ
ンとトリフルオロ酢酸との１：１の混合物(１５ml)で２分間処理することにより
、粗製の生成物(８)を固形担体から切断する。その溶液を減圧濾過により集める
。その樹脂をさらにジクロロメタンで３回抽出する。溶媒を減圧下に除去して、
８を粘性の油状物質として１Ｈ−ＮＭＲにより示される高い純度で得る。エーテ
ルでトリチュレートして、結晶化を誘発する。ジメチルスルホキシド、メタノー
ル、およびジエチルエーテルの混合物から再結晶化して、８を６０mg(３３％)得
る。 融点 ２２２−２２５℃。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.２５−１.６６(ｍ，６Ｈ，ビオチン)；１.
６７−１.７２(ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ ２ＣＨ２ＮＨ)；２.０９(ｔ，２Ｈ，
ＣＯＣＨ２)；２.５６，２.５８，２.７９，２.８０，２.８１，２.８２(２Ｈ，
ＣＨ ２Ｓ，ＡＢＸのＡＢ部分)；３.０８−３.１０(ｍ，１Ｈ，ＣＨＳ−ビオチン
)；３.１１−３.１５(ｍ，２Ｈ，ＮＣＨ ２)；３.３０−３.３４(ｍ，２Ｈ，ＮＣ Ｈ ２ )；４.１１−４.１４(ｍ，１Ｈ，ＣＨ−ビオチン)；４.２８−４.３０(ｍ，
１Ｈ，ＣＨ−ビオチン，ＡＢＸのＸ部分)；６.３４(ｓ，ブロード，１Ｈ，ＮＨ
ＣＯＮＨ)；６.４２(ｓ，ブロード，１Ｈ，ＮＨＣＯＮＨ)；７.４４(ddd，１Ｈ)
；７.４７(ｓ，ブロード，ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；７.６１(ddd，１Ｈ)；７.８４(
ｔ，１Ｈ，ＮＨＣＯ)；７.９７−８.０６(ｍ，５Ｈ)；８.１２(ｓ，ブロード，
ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；８.１３−８.２６(ｍ，５Ｈ)；８.５９(ｔ，１Ｈ，ＮＨＣ
Ｏ)。 ＭＳ ： ｅ／ｍ ６４０ (ＭＨ)＋。 微量分析 ：(Ｃ３４Ｈ３７Ｎ７Ｏ４Ｓ１ｘＨ２Ｏ) 計算値 Ｃ ６２.０８：Ｈ ５.９８；Ｎ １４.９１；Ｓ ４.８７。 実測値 Ｃ ６２.１９：Ｈ ５.８２；Ｎ １４.７８；Ｓ ４.６７。
【０１１４】 (ｂ)スキーム３に説明する、４−[３−(４−メトキシカルボニルフェニル)−１
Ｈ−インダゾール−１−イル]安息香酸アミド(７ａ)の合成 先に記載した通り、Ｒinkアミド樹脂(１.７８６ｇ；１.００mmol)を脱保護す
る。４ｄ(７４５mg、２.００mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(８１０
mg、６.００mmol)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.０１０ｇ、８.
００mmol)およびジメチルホルムアミド(１００ml)から調製した溶液中、その脱
保護した樹脂を室温で一晩振盪する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、次い
でメタノール、そして最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。最後の
濾液に蛍光がなくなるまで、洗浄し続ける。溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。
その樹脂をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸との２：１の混合物(１０ml)で１
０分間処理することにより、生成物(７ａ)のアリコートを固形担体(２００mg)か
ら切断する。その溶液を減圧濾過により集める。その樹脂をさらにジクロロメタ
ンで３回抽出し、続いて、ジメチルホルムアミドで２回抽出する。溶媒を減圧下
に除去し、デシケーター中で一晩乾燥させて、７ａを３４.０mg(９８％)得る。
融点 ２６７−２６９℃。 薄層クロマトグラフィーによる同質 ： Ｒｆ＝０.６８；ジクロロメタン：メタ
ノール＝９：１。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： ３.９２(ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ ３)；７.４３(ddd
，１Ｈ)；７.６１(ddd，１Ｈ)；７.９５−８.００(ｍ，３Ｈ)；８.１３−８.１
６(ｍ，４Ｈ)；８.２３−８.２５(ｍ，３Ｈ)；ＣＯＮＨ ２ブロード(指定できな
い)。
Ｈ−インダゾール−１−イル]安息香酸アミド(７ａ)の合成 先に記載した通り、Ｒinkアミド樹脂(１.７８６ｇ；１.００mmol)を脱保護す
る。４ｄ(７４５mg、２.００mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(８１０
mg、６.００mmol)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.０１０ｇ、８.
００mmol)およびジメチルホルムアミド(１００ml)から調製した溶液中、その脱
保護した樹脂を室温で一晩振盪する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、次い
でメタノール、そして最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。最後の
濾液に蛍光がなくなるまで、洗浄し続ける。溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。
その樹脂をジクロロメタンとトリフルオロ酢酸との２：１の混合物(１０ml)で１
０分間処理することにより、生成物(７ａ)のアリコートを固形担体(２００mg)か
ら切断する。その溶液を減圧濾過により集める。その樹脂をさらにジクロロメタ
ンで３回抽出し、続いて、ジメチルホルムアミドで２回抽出する。溶媒を減圧下
に除去し、デシケーター中で一晩乾燥させて、７ａを３４.０mg(９８％)得る。
融点 ２６７−２６９℃。 薄層クロマトグラフィーによる同質 ： Ｒｆ＝０.６８；ジクロロメタン：メタ
ノール＝９：１。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： ３.９２(ｓ，３Ｈ，ＯＣＨ ３)；７.４３(ddd
，１Ｈ)；７.６１(ddd，１Ｈ)；７.９５−８.００(ｍ，３Ｈ)；８.１３−８.１
６(ｍ，４Ｈ)；８.２３−８.２５(ｍ，３Ｈ)；ＣＯＮＨ ２ブロード(指定できな
い)。
【０１１５】 (ｃ)スキーム３に説明する、４−{３−{４−{３−[(９Ｈ−フルオレン−９−イ
ル)メチルオキシカルボニルアミノ]プロピル}アミノカルボニル}フェニル−１Ｈ
−インダゾール−１−イル}安息香酸アミド(７ｂ)の合成 先に記載した通り、Ｒinkアミド樹脂(１.００ｇ；０.５６mmol)を脱保護する
。６(１.１２mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(３.３６mmol)、Ｎ,Ｎ'
−ジイソプロピルカルボジイミド(４.４８mmol)およびジメチルホルムアミド(５
０ml)から調製した溶液中、その脱保護した樹脂を室温で一晩振盪する。その樹
脂を、ジメチルホルムアミド、次いでメタノール、そして最後にジクロロメタン
で数回ずつ完全に洗浄する。最後の濾液に蛍光がなくなるまで、洗浄し続ける。
溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。その樹脂をジクロロメタンとトリフルオロ酢
酸との２：１の混合物(３ml)で１０分間処理することにより、生成物(７ｂ)のア
リコートを固形担体(５１mg)から切断する。その溶液を減圧濾過により集める。
その樹脂をさらにジクロロメタンで３回抽出し、続いて、ジメチルホルムアミド
で２回抽出する。溶媒を減圧下に除去して、４０.５mg(８８％)の７ｂを非晶質
の固体として１Ｈ−ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィー(Ｒｆ＝０.６４；ジク
ロロメタン：メタノール＝９.５：０.５；＋微量の酢酸)により示される高い純
度で得る。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.７１(ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ ２Ｃ
Ｈ２ＮＨＣＯＯ)；３.０９(ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ ２ＮＨＣＯＯ)；３
.３２(ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＯ)；４.２２(歪んだｔ
，１Ｈ，Ｈ−９ フルオレニル)；４.３２(歪んだｄ，２Ｈ，ＣＯＯＣＨ ２−(９
−フルオレニル)；７.３０−７.３５(ｍ，２Ｈ，フルオレニル；１Ｈ，−ＣＯＮ
ＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＯ)；７.４０−７.４４(ｍ，２Ｈ，フルオレニル
；１Ｈ，インダゾール)；７.４７(ｓ，ブロード，−ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；７.６
０−７.６３(ddd，１Ｈ，インダゾール)；７.７０(ｄ，２Ｈ，フルオレニル)；
７.８８(ｄ，２Ｈ，フルオレニル)；７.９７−８.０６(ｍ，５Ｈ，インダゾール
)；８.１２(ｓ，ブロード，−ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；８.１３−８.２５(ｍ，３Ｈ
，インダゾール)；８.５８(ｔ，１Ｈ，ＣＯＮＨ(ＣＨ２)３ＮＨＣＯＯ)。
ル)メチルオキシカルボニルアミノ]プロピル}アミノカルボニル}フェニル−１Ｈ
−インダゾール−１−イル}安息香酸アミド(７ｂ)の合成 先に記載した通り、Ｒinkアミド樹脂(１.００ｇ；０.５６mmol)を脱保護する
。６(１.１２mmol)、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(３.３６mmol)、Ｎ,Ｎ'
−ジイソプロピルカルボジイミド(４.４８mmol)およびジメチルホルムアミド(５
０ml)から調製した溶液中、その脱保護した樹脂を室温で一晩振盪する。その樹
脂を、ジメチルホルムアミド、次いでメタノール、そして最後にジクロロメタン
で数回ずつ完全に洗浄する。最後の濾液に蛍光がなくなるまで、洗浄し続ける。
溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。その樹脂をジクロロメタンとトリフルオロ酢
酸との２：１の混合物(３ml)で１０分間処理することにより、生成物(７ｂ)のア
リコートを固形担体(５１mg)から切断する。その溶液を減圧濾過により集める。
その樹脂をさらにジクロロメタンで３回抽出し、続いて、ジメチルホルムアミド
で２回抽出する。溶媒を減圧下に除去して、４０.５mg(８８％)の７ｂを非晶質
の固体として１Ｈ−ＮＭＲおよび薄層クロマトグラフィー(Ｒｆ＝０.６４；ジク
ロロメタン：メタノール＝９.５：０.５；＋微量の酢酸)により示される高い純
度で得る。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.７１(ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ２ＣＨ ２Ｃ
Ｈ２ＮＨＣＯＯ)；３.０９(ｍ，２Ｈ，ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ ２ＮＨＣＯＯ)；３
.３２(ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨＣＨ ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＯ)；４.２２(歪んだｔ
，１Ｈ，Ｈ−９ フルオレニル)；４.３２(歪んだｄ，２Ｈ，ＣＯＯＣＨ ２−(９
−フルオレニル)；７.３０−７.３５(ｍ，２Ｈ，フルオレニル；１Ｈ，−ＣＯＮ
ＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣＯＯ)；７.４０−７.４４(ｍ，２Ｈ，フルオレニル
；１Ｈ，インダゾール)；７.４７(ｓ，ブロード，−ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；７.６
０−７.６３(ddd，１Ｈ，インダゾール)；７.７０(ｄ，２Ｈ，フルオレニル)；
７.８８(ｄ，２Ｈ，フルオレニル)；７.９７−８.０６(ｍ，５Ｈ，インダゾール
)；８.１２(ｓ，ブロード，−ＣＯＮＨ ２の１Ｈ)；８.１３−８.２５(ｍ，３Ｈ
，インダゾール)；８.５８(ｔ，１Ｈ，ＣＯＮＨ(ＣＨ２)３ＮＨＣＯＯ)。
【０１１６】 実施例４Ｂ： (ａ)スキーム４に説明する、４−[３−(４−アリルオキシカルボニルフェニル)
インダゾール−１−イル]安息香酸 ２,５−ジオキソピロリジン−１−イルエス
テル(１０)の合成
インダゾール−１−イル]安息香酸 ２,５−ジオキソピロリジン−１−イルエス
テル(１０)の合成
【０１１７】 スキーム４：
【化１３】 Ｒ：(＋)−ビオチノイル； 条件：(ａ)(＋)−ビオチン ３−ヒドロキシプロピルアミド、ＢＯＰ、 ＤＩＥＡ、ＤＭＰＵ； (ｂ)Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ＤＩＣ、１,４−ジオキサン； (ｃ)(Ｎ６)−(＋)−ビオチノイル−(Ｌ)−リジン、ＮaＨＣＯ３、水。
【０１１８】 ジオキサン(２０ml)中の４ｅ(３５５mg、０.８９１mmol)およびＮ−ヒドロキ
シスクシンイミド(１０６mg、０.８９１mmol)の撹拌溶液に、ジイソプロピルカ
ルボジイミド(０.１４１ml、０.８９１mmol)をアルゴン雰囲気下にシリンジで少
しずつ加える。その混合物を室温で７２時間撹拌した後、蒸発乾固させる。残留
物を酢酸エチル(６０ml)に再溶解して、ＮＨ４Ｃl(飽和水性)、ＮaＣl(飽和水性
)、および水(各々、１０ml)で連続的に洗浄する。集めた水相を酢酸エチル(１０
ml)で１回抽出する。プールした有機相をＭgＳＯ４で乾燥させて、蒸発乾固させ
る。その結果得られる黄色がかった非晶質の固体をＭＰＬＣ(１回目のクロマト
グラフィーの溶離液：シクロヘキサン：酢酸エチル＝２：１；２回目のクロマト
グラフィーの溶離液：トルエン：酢酸エチル＝１２：１)により２回精製して、
１０を３７０mg(８３％)得る。 融点 １７８℃。 薄層クロマトグラフィーによる同質 ： Ｒｆ＝０.２０(シクロヘキサン：酢酸エ
チル＝２：１)。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： ２.９３(ｓ，４Ｈ)；４.８５−４.８８(ｍ；
２Ｈ)；５.３０−５.３３(ｍ，１Ｈ)；５.４２−５.４７(ｍ，１Ｈ)；６.０５−
６.１３(ｍ，１Ｈ)；７.４５−７.４９(ｔ，１Ｈ)；７.６４−７.６８(ｔ，１Ｈ
)；８.１１−８.３２(ｍ，１０Ｈ)。 ＭＳ ： ｍ／ｅ ４９６ (ＭＨ＋)。 微量分析 ：(Ｃ２８Ｈ２１Ｎ３Ｏ６) 計算値 Ｃ ６７.８７：Ｈ ４.２７；Ｎ ８.４８。 実測値 Ｃ ６７.９９：Ｈ ４.３４；Ｎ ８.７０。
シスクシンイミド(１０６mg、０.８９１mmol)の撹拌溶液に、ジイソプロピルカ
ルボジイミド(０.１４１ml、０.８９１mmol)をアルゴン雰囲気下にシリンジで少
しずつ加える。その混合物を室温で７２時間撹拌した後、蒸発乾固させる。残留
物を酢酸エチル(６０ml)に再溶解して、ＮＨ４Ｃl(飽和水性)、ＮaＣl(飽和水性
)、および水(各々、１０ml)で連続的に洗浄する。集めた水相を酢酸エチル(１０
ml)で１回抽出する。プールした有機相をＭgＳＯ４で乾燥させて、蒸発乾固させ
る。その結果得られる黄色がかった非晶質の固体をＭＰＬＣ(１回目のクロマト
グラフィーの溶離液：シクロヘキサン：酢酸エチル＝２：１；２回目のクロマト
グラフィーの溶離液：トルエン：酢酸エチル＝１２：１)により２回精製して、
１０を３７０mg(８３％)得る。 融点 １７８℃。 薄層クロマトグラフィーによる同質 ： Ｒｆ＝０.２０(シクロヘキサン：酢酸エ
チル＝２：１)。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： ２.９３(ｓ，４Ｈ)；４.８５−４.８８(ｍ；
２Ｈ)；５.３０−５.３３(ｍ，１Ｈ)；５.４２−５.４７(ｍ，１Ｈ)；６.０５−
６.１３(ｍ，１Ｈ)；７.４５−７.４９(ｔ，１Ｈ)；７.６４−７.６８(ｔ，１Ｈ
)；８.１１−８.３２(ｍ，１０Ｈ)。 ＭＳ ： ｍ／ｅ ４９６ (ＭＨ＋)。 微量分析 ：(Ｃ２８Ｈ２１Ｎ３Ｏ６) 計算値 Ｃ ６７.８７：Ｈ ４.２７；Ｎ ８.４８。 実測値 Ｃ ６７.９９：Ｈ ４.３４；Ｎ ８.７０。
【０１１９】 (ｂ)スキーム４に説明する、(５Ｓ)−４−{１−[４−(５−カルボキシ−５−(ビ
オチノイルアミノ)ペンチルカルバモイル)フェニル]−１Ｈ−インダゾール−３
−イル}安息香酸 アリルエステル トリエチルアンモニウム塩(１１) 水(２ml)中のω−(＋)−ビオチノイル−(Ｌ)−リジン(５０mg、０.１３４mmol
)およびＮaＨＣＯ３(２３mg、０.２６８mmol)の撹拌溶液に、１０(１００mg、０
.２０１mmol)を加える。その懸濁液をジオキサン／ジメチルホルムアミド(１／
１、４ml)で希釈し、アルゴン雰囲気下に室温で６日間撹拌して、僅かに濁った
溶液とし、これをさらに水(１０ml)で希釈し、凍結乾燥させて、黄色がかった粉
末を得る。原料を、０.１Ｍ ＴＥＡＡ(pＨ ７.０)／ＣＨ３ＣＮのリニアグラジ
エント(９０：１０−１０：９０)を使用する分取ＲＰ１８−ＨＰＬＣで精製する
。生成物を含む画分をプールし、水で希釈し、凍結乾燥させて、９９mg(８６％)
の１１を白色の粉末として得る(分析用ＲＰ１８−ＨＰＬＣ；ＵＶ／蛍光検出に
より測定すると、この純度は、９８％以上である)。 融点 ４５℃。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.００(ｔ，９Ｈ，(ＣＨ ３ＣＨ２)３ＮＨ＋)
；１.２２−１.６３(ｍ，１１Ｈ)；１.７２−１.８８(ｍ，２Ｈ)；２.０３(ｔ，
２Ｈ)；２.５５(ｄ，１Ｈ)；２.６２(ｑ，６Ｈ，(ＣＨ３ＣＨ ２)３ＮＨ＋)；２.
７７(dxd，１Ｈ)；３.００−３.０７(ｍ，２Ｈ)；４.０７−４.１０(ｍ，１Ｈ)
；４.２５−４.３０(ｍ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ ２−ＣＨ＝ＣＨ２)；５.３０−５.３
３(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；５.４３−５.４７(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；６.０６−
６.１３(ｍ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ２)；６.３２(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；６
.４０(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；７.４５(dxd，Ｊ１＝Ｊ２，１Ｈ)；７.６３
(dxd，Ｊ１＝Ｊ２，１Ｈ)；７.７６(ｔ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−(ＣＨ２)４−，リ
ジン)；７.９９，８.００および８.１３，８.１４(ＡＡ'ＢＢ'，４Ｈ)；８.０２
(ｄ，Ｊ＝５.５，１Ｈ)；８.１７，８.１９および８.２６，８.２８(ＡＡ'ＢＢ'
，４Ｈ)；８.２７(ｄ，Ｊ＝６.６，１Ｈ)；８.４４(ｄ，Ｊ＝７.４，１Ｈ，−Ｎ Ｈ −)。 ＭＳ ： ｍ／ｅ ７５３ (ＭＨ＋)，７７５ [Ｍ＋Ｎa]＋。 微量分析 ：(Ｃ４６Ｈ５９Ｎ７Ｏ７Ｓｘ２.５Ｈ２Ｏ) 計算値 Ｃ ６１.４５：Ｈ ７.１８；Ｎ １０.９０；Ｓ ３.５６。 実測値 Ｃ ６１.６４：Ｈ ６.３５；Ｎ １０.７６；Ｓ ３.１４。
オチノイルアミノ)ペンチルカルバモイル)フェニル]−１Ｈ−インダゾール−３
−イル}安息香酸 アリルエステル トリエチルアンモニウム塩(１１) 水(２ml)中のω−(＋)−ビオチノイル−(Ｌ)−リジン(５０mg、０.１３４mmol
)およびＮaＨＣＯ３(２３mg、０.２６８mmol)の撹拌溶液に、１０(１００mg、０
.２０１mmol)を加える。その懸濁液をジオキサン／ジメチルホルムアミド(１／
１、４ml)で希釈し、アルゴン雰囲気下に室温で６日間撹拌して、僅かに濁った
溶液とし、これをさらに水(１０ml)で希釈し、凍結乾燥させて、黄色がかった粉
末を得る。原料を、０.１Ｍ ＴＥＡＡ(pＨ ７.０)／ＣＨ３ＣＮのリニアグラジ
エント(９０：１０−１０：９０)を使用する分取ＲＰ１８−ＨＰＬＣで精製する
。生成物を含む画分をプールし、水で希釈し、凍結乾燥させて、９９mg(８６％)
の１１を白色の粉末として得る(分析用ＲＰ１８−ＨＰＬＣ；ＵＶ／蛍光検出に
より測定すると、この純度は、９８％以上である)。 融点 ４５℃。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.００(ｔ，９Ｈ，(ＣＨ ３ＣＨ２)３ＮＨ＋)
；１.２２−１.６３(ｍ，１１Ｈ)；１.７２−１.８８(ｍ，２Ｈ)；２.０３(ｔ，
２Ｈ)；２.５５(ｄ，１Ｈ)；２.６２(ｑ，６Ｈ，(ＣＨ３ＣＨ ２)３ＮＨ＋)；２.
７７(dxd，１Ｈ)；３.００−３.０７(ｍ，２Ｈ)；４.０７−４.１０(ｍ，１Ｈ)
；４.２５−４.３０(ｍ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ ２−ＣＨ＝ＣＨ２)；５.３０−５.３
３(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；５.４３−５.４７(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；６.０６−
６.１３(ｍ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ２)；６.３２(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；６
.４０(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；７.４５(dxd，Ｊ１＝Ｊ２，１Ｈ)；７.６３
(dxd，Ｊ１＝Ｊ２，１Ｈ)；７.７６(ｔ，１Ｈ，−ＣＯＮＨ−(ＣＨ２)４−，リ
ジン)；７.９９，８.００および８.１３，８.１４(ＡＡ'ＢＢ'，４Ｈ)；８.０２
(ｄ，Ｊ＝５.５，１Ｈ)；８.１７，８.１９および８.２６，８.２８(ＡＡ'ＢＢ'
，４Ｈ)；８.２７(ｄ，Ｊ＝６.６，１Ｈ)；８.４４(ｄ，Ｊ＝７.４，１Ｈ，−Ｎ Ｈ −)。 ＭＳ ： ｍ／ｅ ７５３ (ＭＨ＋)，７７５ [Ｍ＋Ｎa]＋。 微量分析 ：(Ｃ４６Ｈ５９Ｎ７Ｏ７Ｓｘ２.５Ｈ２Ｏ) 計算値 Ｃ ６１.４５：Ｈ ７.１８；Ｎ １０.９０；Ｓ ３.５６。 実測値 Ｃ ６１.６４：Ｈ ６.３５；Ｎ １０.７６；Ｓ ３.１４。
【０１２０】 (ｃ)スキーム４に説明する、４−[３−(４−アリルオキシカルボニルフェニル)
−１Ｈ−インダゾール−１−イル]安息香酸 (５Ｓ) ３−(ビオチノイルアミノ)
プロピルエステル(９) ＤＭＰＵ(１５ml)中の４ｅ(１０７０mg、２.６７７mmol)、ＢＯＰ(１３０３mg
、２.９４５mmol)およびＤＩＥＡ(６８８μl、４.０１６mmol)の撹拌溶液に、Ｄ
ＭＰＵ(１０ml)中の(＋)−ビオチン ３−ヒドロキシプロピルアミド(８０７mg、
２.６７７mmol)および１,２,４−トリアゾール(２０３mg、２.９４５mmol)の溶
液をアルゴン雰囲気下に室温で膜を通して少しずつ注入する。その結果得られる
黄色の溶液をさらにアルゴン下に６日間撹拌して、蒸発乾固させる(ＨＶ、浴温
度：７５℃)。その結果得られる黄色の油状物質をＭＰＬＣ(ジクロロメタン：メ
タノール＝２０：１)により精製して、黄色がかった固体(１.２５８ｇ、６９％)
を得、これをさらにアセトニトリル−水(１：１)からの再結晶化により精製して
、９を８２０mg(４５％)得る。 融点 １５４−１５７℃(アセトニトリル／水)。 薄層クロマトグラフィーにより示される同質 ： Ｒｆ＝０.２４；ジクロロメタ
ン：メタノール＝１５：１。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.２５−１.３８(ｍ，２Ｈ，ビオチン)；１.
４２−１.５７(ｍ，３Ｈ，ビオチン)；１.５８−１.６３(ｍ，１Ｈ，ビオチン)
；１.８８(txt，Ｊ＝５.６，２Ｈ，−ＯＣＨ２−ＣＨ ２−ＣＨ２ＮＨ−)；２.０
８(ｔ，２Ｈ，−ＣＯ−ＣＨ ２−)；２.５６(ｄ，１Ｈ，ビオチン)；２.７９(dxd
，１Ｈ，ビオチン)；３.０５−３.１０(ｍ，１Ｈ，ビオチン)；３.２２−３.２
６(ｍ，２Ｈ，−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ ２−ＮＨ−)；４.１０−４.１３(ｍ，１
Ｈ，ビオチン)；４.２７−４.３０(ｍ，１Ｈ，ビオチン)；４.３２(ｔ，２Ｈ，
−Ｏ−ＣＨ ２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−)；４.８６−４.８８(ｍ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ＝ＣＨ２)；５.３０−５.３３(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；５.４２−５.４
７(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；６.０５−６.１３(ｍ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ２)；６.
３４(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；６.４１(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；７.４
４(ｔ，１Ｈ)；７.６４(ｔ，１Ｈ)；７.９０(ｔ，１Ｈ，ＮＨ−(ＣＨ２)３−Ｏ
−)；８.０３−８.０８(ｍ，３Ｈ)；８.１７−８.２１(ｍ，４Ｈ)；８.２４−８
.２７(ｍ，３Ｈ)。 ＭＳ ： ｍ／ｅ ６８２ (ＭＨ＋)。 微量分析 ：(Ｃ３７Ｈ３９Ｎ５Ｏ６ＳｘＨ２Ｏ) 計算値 Ｃ ６３.５０：Ｈ ５.９０；Ｎ １０.０１；Ｓ ４.５７。 実測値 Ｃ ６４.００：Ｈ ５.７３；Ｎ １０.４２；Ｓ ４.２４。
−１Ｈ−インダゾール−１−イル]安息香酸 (５Ｓ) ３−(ビオチノイルアミノ)
プロピルエステル(９) ＤＭＰＵ(１５ml)中の４ｅ(１０７０mg、２.６７７mmol)、ＢＯＰ(１３０３mg
、２.９４５mmol)およびＤＩＥＡ(６８８μl、４.０１６mmol)の撹拌溶液に、Ｄ
ＭＰＵ(１０ml)中の(＋)−ビオチン ３−ヒドロキシプロピルアミド(８０７mg、
２.６７７mmol)および１,２,４−トリアゾール(２０３mg、２.９４５mmol)の溶
液をアルゴン雰囲気下に室温で膜を通して少しずつ注入する。その結果得られる
黄色の溶液をさらにアルゴン下に６日間撹拌して、蒸発乾固させる(ＨＶ、浴温
度：７５℃)。その結果得られる黄色の油状物質をＭＰＬＣ(ジクロロメタン：メ
タノール＝２０：１)により精製して、黄色がかった固体(１.２５８ｇ、６９％)
を得、これをさらにアセトニトリル−水(１：１)からの再結晶化により精製して
、９を８２０mg(４５％)得る。 融点 １５４−１５７℃(アセトニトリル／水)。 薄層クロマトグラフィーにより示される同質 ： Ｒｆ＝０.２４；ジクロロメタ
ン：メタノール＝１５：１。１ Ｈ−ＮＭＲ(ＤＭＳＯ−ｄ６)： １.２５−１.３８(ｍ，２Ｈ，ビオチン)；１.
４２−１.５７(ｍ，３Ｈ，ビオチン)；１.５８−１.６３(ｍ，１Ｈ，ビオチン)
；１.８８(txt，Ｊ＝５.６，２Ｈ，−ＯＣＨ２−ＣＨ ２−ＣＨ２ＮＨ−)；２.０
８(ｔ，２Ｈ，−ＣＯ−ＣＨ ２−)；２.５６(ｄ，１Ｈ，ビオチン)；２.７９(dxd
，１Ｈ，ビオチン)；３.０５−３.１０(ｍ，１Ｈ，ビオチン)；３.２２−３.２
６(ｍ，２Ｈ，−ＯＣＨ２ＣＨ２−ＣＨ ２−ＮＨ−)；４.１０−４.１３(ｍ，１
Ｈ，ビオチン)；４.２７−４.３０(ｍ，１Ｈ，ビオチン)；４.３２(ｔ，２Ｈ，
−Ｏ−ＣＨ ２−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−)；４.８６−４.８８(ｍ，２Ｈ，−Ｏ−ＣＨ ２ −ＣＨ＝ＣＨ２)；５.３０−５.３３(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；５.４２−５.４
７(ｍ，１Ｈ，＝ＣＨ ２)；６.０５−６.１３(ｍ，１Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ２)；６.
３４(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；６.４１(ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ビオチン)；７.４
４(ｔ，１Ｈ)；７.６４(ｔ，１Ｈ)；７.９０(ｔ，１Ｈ，ＮＨ−(ＣＨ２)３−Ｏ
−)；８.０３−８.０８(ｍ，３Ｈ)；８.１７−８.２１(ｍ，４Ｈ)；８.２４−８
.２７(ｍ，３Ｈ)。 ＭＳ ： ｍ／ｅ ６８２ (ＭＨ＋)。 微量分析 ：(Ｃ３７Ｈ３９Ｎ５Ｏ６ＳｘＨ２Ｏ) 計算値 Ｃ ６３.５０：Ｈ ５.９０；Ｎ １０.０１；Ｓ ４.５７。 実測値 Ｃ ６４.００：Ｈ ５.７３；Ｎ １０.４２；Ｓ ４.２４。
【０１２１】 実施例５Ｂ： (ａ)スキーム５に説明する、４−[３−(４−アミノカルボニルフェニル)−１Ｈ
−インダゾール−１−イル]安息香酸アミド(１２ａ−ｊ)の合成
−インダゾール−１−イル]安息香酸アミド(１２ａ−ｊ)の合成
【０１２２】 スキーム５：
【化１４】 条件：(ａ)アミン(ＲＮＨ２)、ＴＨＦ、２４時間、室温； (ｂ)４ｃ、ＨＯＢＴ、ＤＩＣ、ＤＭＦ、２４時間、室温； (ｃ)ＤＣＭ／ＭeＯＨ、照射、２４時間(３６６nm)。
【０１２３】 標準的な手順により、アミノエチル−Ｔentagel樹脂(容積 ０.２９mmol／ｇ)
に光不安定な４−ブロモメチル−３−ニトロ安息香酸リンカーを充填する。その
樹脂部分(２００mg；充填：０.２７mmol／ｇ)を様々な第一級アミン(ａ−ｊ)(テ
トラヒドロフラン５ml中の１.０８mmol)と室温で２４時間反応させる。その樹脂
を、テトラヒドロフラン、メタノール、最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄し
て、デシケーター中で減圧下に乾燥させる。ジメチルホルムアミド(３０ml)中の
４ｃ(５７９mg、１.６２mmol)および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(６５７
mg、４.８６mmol)の溶液に、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.２３ｇ
、９.７２mmol)を加える。その反応混合物を室温で３０分間撹拌する。保存溶液
を１０のアリコート(３ml)に分けて、これを調製した樹脂に加える。その樹脂を
室温で２４時間振盪する。試薬を含む溶液を減圧濾過により除去する。その樹脂
を、ジメチルホルムアミド、メタノール、そして最後にジクロロメタンで数回ず
つ洗浄する。その樹脂をガラスバイアルに移して、ジクロロメタン(５ml)で覆う
。メタノールを加えて、等濃度の溶液とする。そのバイアルをＵＶランプ(３６
６nm)での照射下に２４時間振盪する。この後、その樹脂を減圧濾過により除去
して、溶媒を蒸発乾固させる。生成物(１２ａ−ｊ)の純度をＲＰ−ＨＰＬＣによ
り分析して、化合物１２ａ−ｊの存在を質量分析により確認する。
に光不安定な４−ブロモメチル−３−ニトロ安息香酸リンカーを充填する。その
樹脂部分(２００mg；充填：０.２７mmol／ｇ)を様々な第一級アミン(ａ−ｊ)(テ
トラヒドロフラン５ml中の１.０８mmol)と室温で２４時間反応させる。その樹脂
を、テトラヒドロフラン、メタノール、最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄し
て、デシケーター中で減圧下に乾燥させる。ジメチルホルムアミド(３０ml)中の
４ｃ(５７９mg、１.６２mmol)および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール(６５７
mg、４.８６mmol)の溶液に、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(１.２３ｇ
、９.７２mmol)を加える。その反応混合物を室温で３０分間撹拌する。保存溶液
を１０のアリコート(３ml)に分けて、これを調製した樹脂に加える。その樹脂を
室温で２４時間振盪する。試薬を含む溶液を減圧濾過により除去する。その樹脂
を、ジメチルホルムアミド、メタノール、そして最後にジクロロメタンで数回ず
つ洗浄する。その樹脂をガラスバイアルに移して、ジクロロメタン(５ml)で覆う
。メタノールを加えて、等濃度の溶液とする。そのバイアルをＵＶランプ(３６
６nm)での照射下に２４時間振盪する。この後、その樹脂を減圧濾過により除去
して、溶媒を蒸発乾固させる。生成物(１２ａ−ｊ)の純度をＲＰ−ＨＰＬＣによ
り分析して、化合物１２ａ−ｊの存在を質量分析により確認する。
【０１２４】 実施例６Ｂ： スキーム６に説明する、４−(３−{４−[３−(アリールスルホニルアミノ)プロ
ピルカルバモイル]フェニル}インダゾール−１−イル)安息香酸アミド(１３ａ−
ｄ)の合成
ピルカルバモイル]フェニル}インダゾール−１−イル)安息香酸アミド(１３ａ−
ｄ)の合成
【０１２５】 スキーム６：
【化１５】 条件：(ａ)ＤＣＭ／ピペリジン； (ｂ)６、ＤＩＣ、ＨＯＢt、ＤＭＦ、室温、７時間； (ｃ)ＤＣＭ／ＴＥＡ、ＡrＳＯ２Ｃl、室温、３時間； (ｄ)ＤＣＭ／ＴＦＡ、室温、２０分間。
【０１２６】 Ｒinkアミド樹脂(５００mg；０.２８mmol)をジクロロメタン(１０ml)中のピペ
リジン(２０％)と共に室温で１時間振盪する。最後の濾液試料が切断された保護
基の存在を示さなくなるまで、その樹脂を、ジクロロメタン、メタノール、そし
て最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄する。６(０.５６mmol)、１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール(１.６８mmol)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(
２.２４mmol)およびジメチルホルムアミド(３５ml)から調製した溶液中、その樹
脂を室温で一晩振盪する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、次いでメタノー
ル、そして最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。最後の濾液に蛍光
がなくなるまで、洗浄し続ける。溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。Ｒinkアミ
ド樹脂の脱保護に関して上記した通り、６が結合した樹脂のＦmoc保護基を除去
する。その樹脂を減圧下に３０分間乾燥させる。トリエチルアミン(１０％ ｖ／
ｖ)を含むジクロロメタン(５ml)中、樹脂部分(各々、８０mg)を僅かに撹拌する
。様々なアリールスルホニルクロリド(ａ−ｄ；各々、０.１６mmol)を室温で加
える。３時間後、試薬を濾過して除き、その樹脂を、ジクロロメタン、メタノー
ル、最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄する。デシケーター中で減圧下に乾燥
させた後、生成物の切断のために、各々の樹脂をジクロロメタン／トリフルオロ
酢酸(４／１)３mlで処理する。その切断溶液を濾過により集めて、その樹脂をジ
クロロメタン(各々、２ml)で３回洗浄する。水酸化ナトリウムを含むデシケータ
ー中、溶媒を減圧下に除去する。生成物(１３ａ−ｄ)の純度をＲＰ−ＨＰＬＣに
より分析して、化合物１３ａ−ｄの存在を質量分析により確認する。 １３ａ ： Ｒ＝４−メチルフェニル； 収率 ： ３１％； ＨＰＬＣ ： ９２％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ５６８ (Ｍ＋Ｈ)＋。 １３ｂ ： Ｒ＝５−ジメチルアミノ−１−ナフチル； 収率 ： ５７％； ＨＰＬＣ ： ８５％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ６４７ (Ｍ＋Ｈ)＋。 １３ｃ ： Ｒ＝３−ニトロフェニル； 収率 ： ５７％； ＨＰＬＣ ： ８５％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ５９９ (Ｍ＋Ｈ)＋。 １３ｄ ： Ｒ＝４−メトキシフェニル； 収率 ： ７９％； ＨＰＬＣ ： ８７％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ５８４ (Ｍ＋Ｈ)＋。 (ＨＰＬＣ：２５４nm；ピーク下の％領域)。
リジン(２０％)と共に室温で１時間振盪する。最後の濾液試料が切断された保護
基の存在を示さなくなるまで、その樹脂を、ジクロロメタン、メタノール、そし
て最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄する。６(０.５６mmol)、１−ヒドロキ
シベンゾトリアゾール(１.６８mmol)、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(
２.２４mmol)およびジメチルホルムアミド(３５ml)から調製した溶液中、その樹
脂を室温で一晩振盪する。その樹脂を、ジメチルホルムアミド、次いでメタノー
ル、そして最後にジクロロメタンで数回ずつ完全に洗浄する。最後の濾液に蛍光
がなくなるまで、洗浄し続ける。溶媒を減圧下に室温で蒸発させる。Ｒinkアミ
ド樹脂の脱保護に関して上記した通り、６が結合した樹脂のＦmoc保護基を除去
する。その樹脂を減圧下に３０分間乾燥させる。トリエチルアミン(１０％ ｖ／
ｖ)を含むジクロロメタン(５ml)中、樹脂部分(各々、８０mg)を僅かに撹拌する
。様々なアリールスルホニルクロリド(ａ−ｄ；各々、０.１６mmol)を室温で加
える。３時間後、試薬を濾過して除き、その樹脂を、ジクロロメタン、メタノー
ル、最後にジクロロメタンで数回ずつ洗浄する。デシケーター中で減圧下に乾燥
させた後、生成物の切断のために、各々の樹脂をジクロロメタン／トリフルオロ
酢酸(４／１)３mlで処理する。その切断溶液を濾過により集めて、その樹脂をジ
クロロメタン(各々、２ml)で３回洗浄する。水酸化ナトリウムを含むデシケータ
ー中、溶媒を減圧下に除去する。生成物(１３ａ−ｄ)の純度をＲＰ−ＨＰＬＣに
より分析して、化合物１３ａ−ｄの存在を質量分析により確認する。 １３ａ ： Ｒ＝４−メチルフェニル； 収率 ： ３１％； ＨＰＬＣ ： ９２％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ５６８ (Ｍ＋Ｈ)＋。 １３ｂ ： Ｒ＝５−ジメチルアミノ−１−ナフチル； 収率 ： ５７％； ＨＰＬＣ ： ８５％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ６４７ (Ｍ＋Ｈ)＋。 １３ｃ ： Ｒ＝３−ニトロフェニル； 収率 ： ５７％； ＨＰＬＣ ： ８５％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ５９９ (Ｍ＋Ｈ)＋。 １３ｄ ： Ｒ＝４−メトキシフェニル； 収率 ： ７９％； ＨＰＬＣ ： ８７％； ＭＳ(ＥＳＩ＋)： ５８４ (Ｍ＋Ｈ)＋。 (ＨＰＬＣ：２５４nm；ピーク下の％領域)。
【０１２７】 実施例７Ｂ： スキーム７に説明する、４−[３−(４−カルバモイルフェニル)インダゾール−
１−イル]−Ｎ−[２−(シクロプロピルメチルカルバモイル)エチル]ベンズアミ
ド(１４)
１−イル]−Ｎ−[２−(シクロプロピルメチルカルバモイル)エチル]ベンズアミ
ド(１４)
【０１２８】 スキーム７：
【化１６】 条件：(ａ)Ｆmoc−β−アラニン、ＨＯＢt、ＤＩＣ、ＤＭＦ； (ｂ)ＤＣＭ／ピペリジン； (ｃ)４ｃ、ＨＯＢt、ＤＩＣ、ＤＭＦ； (ｄ)ＤＣＭ／ＭeＯＨ、照射、２４時間(３６６nm)。
【０１２９】 標準的な手順により、アミノエチル−Ｔentagel樹脂(容積 ０.２９mmol／ｇ)
に光不安定な４−ブロモメチル−３−ニトロ安息香酸リンカーを充填した後、実
施例５Ｂに記載した通り、シクロプロピルメチルアミンと反応させる。ＤＭＦ(
５ml)中のＦmoc−β−アラニン(１８１mg、０.５８mmol)および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(２３５mg、１.７４mmol)の溶液に、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピ
ルカルボジイミド(２９３mg、２.３２mmol)を加える。その溶液を室温で１時間
放置する。シクロプロピルメチルアミンを充填した樹脂(５００ｇ)を加えて、１
２時間僅かに撹拌した。その樹脂を濾過して除き、ＤＭＦ、ＭeＯＨ、およびＤ
ＣＭで洗浄する。その樹脂を実施例５Ｂに記載した通り製造した４ｃの活性エス
テルの溶液(５ml)に加える。その反応混合物を室温で一晩振盪する。試薬を濾過
により除去する。その樹脂を、ＤＭＦ、ＭeＯＨ、そして最後にＤＣＭで数回ず
つ洗浄する。その樹脂をガラスバイアルに移して、ＤＣＭ(５ml)で覆う。ＭeＯ
Ｈを加えて、等濃度の溶液とする。そのバイアルをＵＶランプ(３６６nm)での照
射下に２４時間振盪する。この後、その樹脂を減圧濾過により除去して、溶媒を
蒸発乾固させる。生成物(１４)の純度をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析して、化合物
１４の存在を質量分析により確認する。 ｍ／ｅ＝４８２ (ＭＨ＋)。
に光不安定な４−ブロモメチル−３−ニトロ安息香酸リンカーを充填した後、実
施例５Ｂに記載した通り、シクロプロピルメチルアミンと反応させる。ＤＭＦ(
５ml)中のＦmoc−β−アラニン(１８１mg、０.５８mmol)および１−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール(２３５mg、１.７４mmol)の溶液に、Ｎ,Ｎ'−ジイソプロピ
ルカルボジイミド(２９３mg、２.３２mmol)を加える。その溶液を室温で１時間
放置する。シクロプロピルメチルアミンを充填した樹脂(５００ｇ)を加えて、１
２時間僅かに撹拌した。その樹脂を濾過して除き、ＤＭＦ、ＭeＯＨ、およびＤ
ＣＭで洗浄する。その樹脂を実施例５Ｂに記載した通り製造した４ｃの活性エス
テルの溶液(５ml)に加える。その反応混合物を室温で一晩振盪する。試薬を濾過
により除去する。その樹脂を、ＤＭＦ、ＭeＯＨ、そして最後にＤＣＭで数回ず
つ洗浄する。その樹脂をガラスバイアルに移して、ＤＣＭ(５ml)で覆う。ＭeＯ
Ｈを加えて、等濃度の溶液とする。そのバイアルをＵＶランプ(３６６nm)での照
射下に２４時間振盪する。この後、その樹脂を減圧濾過により除去して、溶媒を
蒸発乾固させる。生成物(１４)の純度をＲＰ−ＨＰＬＣにより分析して、化合物
１４の存在を質量分析により確認する。 ｍ／ｅ＝４８２ (ＭＨ＋)。
【０１３０】
【表４】 溶媒 ： アセトニトリル／２％ ＤＭＳＯ；()内の範囲。
【０１３１】
【表５】 溶媒 ： アセトニトリル／２％ ＤＭＳＯ；()内の範囲。
【０１３２】 参考文献： １,３−ジアリールインダゾールの合成に関する文献 「Ｈeterocyclic Ｃompounds」(１９５７)でのＥlderfield，Ｒ. Ｃ.，Ｅlder
field，Ｒ. Ｃ.編，第５巻，Ｊohn Ｗiley & Ｓons，Ｉnc.，Ｎew Ｙork，１６
２頁。 Ｄalla Ｃroce，Ｐiero；Ｌa Ｒosa，Ｃoncetta. Ｓynthesis(１９８４)，１
１，９８２−３。 Ｙan，Ｂ.；Ｇstach，Ｈ. Ｔetrahedron Ｌett.(１９９６)，３７(４６)，８
３２５−８。 Ｗang，Ｑ.；Ｊochims，Ｊ.；Ｋoehlbrandt，Ｓ.；Ｄahlenburg，Ｌ.；Ａl−
Ｔalib，Ｍ.；Ｈamed，Ａ.，Ｉsmail，Ａbd ＥＩ Ｈamid. Ｓynthesis(１９９２
)，７，７１０−８。 Ｋrishnan，Ｒ.；Ｌang，Ｓ. Ａ.，Ｊr.；Ｌin，Ｙang Ｉ；Ｗilkinson，Ｒ.
Ｇ. Ｊ. Ｈeterocycl. Ｃhem.(１９８８)，２５(２)，４４７−５２。 Ｍatsugo，Ｓeiichi；Ｓaito，Ｍitsuo；Ｋato，Ｙohko；Ｔakamizawa，Ａkir
a. Ｃhem. Ｐharm. Ｂu11.(１９８４)，３２(６)，２１４６−５３。 Ｍatsugo，Ｓeiichi；Ｔakamizawa，Ａkira. Ｓynthesis(１９８３)，１０，
８５２。 Ｔheilacker，Ｗ.；Ｒaabe，Ｃ. Ｔetrahedron Ｌett.(１９６６)，９１−９
２。 Ｇladstone，Ｗ. Ａ. Ｆ.；Ｎorman，Ｒ. Ｏ. Ｃ. Ｊ. Ｃhem. Ｓoc.(１９６
５)，３０４８−５２。 Ｆries，Ｋ.；Ｆabel，Ｋ.；Ｅckhardt，Ｈ. Ｊustus Ｌiebigs Ａnn. Ｃhem.
(１９４２)，５５０，３１−４９。 Ｂorsche，Ｗ.；Ｓcriba，Ｗ. Ｊustus Ｌiebigs Ａnn. Ｃhem.(１９３９)，
５４０，８３−９８。 Ｈuisgen，Ｒ.；Ｓeidel，Ｍ.；Ｗallbillich，Ｇ.；Ｋnupfer，Ｈ. Ｔetrahe
dron(１９６２)，１７，３−２９。 Ｇladstone，Ｗ. Ａ. Ｆ.；Ｎorman，Ｒ. Ｏ. Ｃ. Ｊ. Ｃhem. Ｓoc.(１９６
５)，５１７７−８２。 Ｈuisgen，Ｒ.；Ｋnupfer，Ｈ.；Ｓustmann，Ｒ.；Ｗallbillich，Ｇ.；Ｗebe
rndoerfer，Ｖ. Ｃhem. Ｂer.(１９６７)，１００，１５８０−９２。 Ｆries，Ｋ.；Ｔampke，Ｈ. Ｊustus Ｌiebigs Ａnn. Ｃhem.(１９２７)，４
５４，３０３−２４。 Ｐummerer，Ｒ.；Ｂuchta，Ｅ.；Ｄeimler，Ｅ. Ｃhem. Ｂer.(１９５１)，８
４(７)，５８３−９０。 Ｄennler，Ｅ. Ｂ.；Ｆrasca，Ａ. Ｒ. Ｔetrahedron(１９６６)，２２，３１
３１−４１。 Ｇladstone，Ｗ. Ａ. Ｆ.；Ｈarrison，Ｍ. Ｊ.；Ｎorman，Ｒ. Ｏ. Ｃ. Ｊ.
Ｃhem. Ｓoc.(１９６６)，１７８１。
field，Ｒ. Ｃ.編，第５巻，Ｊohn Ｗiley & Ｓons，Ｉnc.，Ｎew Ｙork，１６
２頁。 Ｄalla Ｃroce，Ｐiero；Ｌa Ｒosa，Ｃoncetta. Ｓynthesis(１９８４)，１
１，９８２−３。 Ｙan，Ｂ.；Ｇstach，Ｈ. Ｔetrahedron Ｌett.(１９９６)，３７(４６)，８
３２５−８。 Ｗang，Ｑ.；Ｊochims，Ｊ.；Ｋoehlbrandt，Ｓ.；Ｄahlenburg，Ｌ.；Ａl−
Ｔalib，Ｍ.；Ｈamed，Ａ.，Ｉsmail，Ａbd ＥＩ Ｈamid. Ｓynthesis(１９９２
)，７，７１０−８。 Ｋrishnan，Ｒ.；Ｌang，Ｓ. Ａ.，Ｊr.；Ｌin，Ｙang Ｉ；Ｗilkinson，Ｒ.
Ｇ. Ｊ. Ｈeterocycl. Ｃhem.(１９８８)，２５(２)，４４７−５２。 Ｍatsugo，Ｓeiichi；Ｓaito，Ｍitsuo；Ｋato，Ｙohko；Ｔakamizawa，Ａkir
a. Ｃhem. Ｐharm. Ｂu11.(１９８４)，３２(６)，２１４６−５３。 Ｍatsugo，Ｓeiichi；Ｔakamizawa，Ａkira. Ｓynthesis(１９８３)，１０，
８５２。 Ｔheilacker，Ｗ.；Ｒaabe，Ｃ. Ｔetrahedron Ｌett.(１９６６)，９１−９
２。 Ｇladstone，Ｗ. Ａ. Ｆ.；Ｎorman，Ｒ. Ｏ. Ｃ. Ｊ. Ｃhem. Ｓoc.(１９６
５)，３０４８−５２。 Ｆries，Ｋ.；Ｆabel，Ｋ.；Ｅckhardt，Ｈ. Ｊustus Ｌiebigs Ａnn. Ｃhem.
(１９４２)，５５０，３１−４９。 Ｂorsche，Ｗ.；Ｓcriba，Ｗ. Ｊustus Ｌiebigs Ａnn. Ｃhem.(１９３９)，
５４０，８３−９８。 Ｈuisgen，Ｒ.；Ｓeidel，Ｍ.；Ｗallbillich，Ｇ.；Ｋnupfer，Ｈ. Ｔetrahe
dron(１９６２)，１７，３−２９。 Ｇladstone，Ｗ. Ａ. Ｆ.；Ｎorman，Ｒ. Ｏ. Ｃ. Ｊ. Ｃhem. Ｓoc.(１９６
５)，５１７７−８２。 Ｈuisgen，Ｒ.；Ｋnupfer，Ｈ.；Ｓustmann，Ｒ.；Ｗallbillich，Ｇ.；Ｗebe
rndoerfer，Ｖ. Ｃhem. Ｂer.(１９６７)，１００，１５８０−９２。 Ｆries，Ｋ.；Ｔampke，Ｈ. Ｊustus Ｌiebigs Ａnn. Ｃhem.(１９２７)，４
５４，３０３−２４。 Ｐummerer，Ｒ.；Ｂuchta，Ｅ.；Ｄeimler，Ｅ. Ｃhem. Ｂer.(１９５１)，８
４(７)，５８３−９０。 Ｄennler，Ｅ. Ｂ.；Ｆrasca，Ａ. Ｒ. Ｔetrahedron(１９６６)，２２，３１
３１−４１。 Ｇladstone，Ｗ. Ａ. Ｆ.；Ｈarrison，Ｍ. Ｊ.；Ｎorman，Ｒ. Ｏ. Ｃ. Ｊ.
Ｃhem. Ｓoc.(１９６６)，１７８１。
【０１３３】 インダゾールに関する光学分光学の文献 Ｓaha，Ｓubit Ｋ.；Ｄogra，Ｓneh Ｋ. Ｊ. Ｐhotochem. Ｐhotobiol.，Ａ(
１９９７)，１１０(３)，２５７−２６６。 Ｐhaniraj，Ｐ.；Ｍishra，Ａshok Ｋ.；Ｄogra，Ｓ. Ｋ. Ｉndian Ｊ. Ｃhem
.，第Ａ節(１９８５)，２４Ａ(１１)，９１３−１７。 Ｍishra，Ａ. Ｋ.；Ｓwaminathan，Ｍ.；Ｄogra，Ｓ. Ｋ. Ｊ. Ｐhotochem.(
１９８４)，２６(１)，４９−５６。
１９９７)，１１０(３)，２５７−２６６。 Ｐhaniraj，Ｐ.；Ｍishra，Ａshok Ｋ.；Ｄogra，Ｓ. Ｋ. Ｉndian Ｊ. Ｃhem
.，第Ａ節(１９８５)，２４Ａ(１１)，９１３−１７。 Ｍishra，Ａ. Ｋ.；Ｓwaminathan，Ｍ.；Ｄogra，Ｓ. Ｋ. Ｊ. Ｐhotochem.(
１９８４)，２６(１)，４９−５６。
【０１３４】 実験部分で使用する蛍光およびＵＶ分光法の具体的な文献 Ｍelhuish，Ｗ. Ｈ.(１９６１)Ｊ. Ｐhys. Ｃhem. ６５，２２９。 Ｄemas，Ｊ. Ｎ. & Ｃrosby，Ｇ. Ａ.(１９７１)Ｊ. Ｐhys. Ｃhem. ７５，９
９１−１０２４。 Ｃhen，Ｒ. Ｆ.(１９７２)Ｊ. of Ｒesearch of the Ｉnternational Ｂureau
of Ｓtandards 第７６Ａ巻 Ｎo. ６，５９３−６０６。 Ｌakowicz，Ｊ. Ｒ.(１９８３，５２−９３頁，１１２−１５３頁，１５６−
１８５頁)Ｐrinciples of Ｆluorescence Ｓpectroscopy，Ｐlenum Ｐress，Ｎe
w ＹorkおよびＬondon。 Ｓavage，Ｍ. Ｄ.ら，Ａvidin−Ｂiotin Ｃhemistry，Ｐierce Ｃhemical Ｃo
mpany，(１９９２)。 Ｐetrich，Ｊ. Ｗ.，Ｃhang，Ｍ. Ｃ.，ＭcＤonald，Ｄ. Ｂ.，Ｆleming，Ｇ.
Ｒ.(１９８３)Ｊ. Ａm. Ｃhem. Ｓoc. １０５，３８２４−３８３２。 Ｓzabo，Ａ. Ｇ.，Ｒayner，Ｄ. Ｍ.(１９８０)Ｊ. Ａm. Ｃhem. Ｓoc. １０
２，５５４−５６３。 Ｐugliese，Ｌ.，Ｃoda，Ａ.，Ｍalcovati，Ｍ.，Ｂolognesi，Ｍ.(１９９３)
Ｊ. Ｍol. Ｂiol. ２３１，６９８。
９１−１０２４。 Ｃhen，Ｒ. Ｆ.(１９７２)Ｊ. of Ｒesearch of the Ｉnternational Ｂureau
of Ｓtandards 第７６Ａ巻 Ｎo. ６，５９３−６０６。 Ｌakowicz，Ｊ. Ｒ.(１９８３，５２−９３頁，１１２−１５３頁，１５６−
１８５頁)Ｐrinciples of Ｆluorescence Ｓpectroscopy，Ｐlenum Ｐress，Ｎe
w ＹorkおよびＬondon。 Ｓavage，Ｍ. Ｄ.ら，Ａvidin−Ｂiotin Ｃhemistry，Ｐierce Ｃhemical Ｃo
mpany，(１９９２)。 Ｐetrich，Ｊ. Ｗ.，Ｃhang，Ｍ. Ｃ.，ＭcＤonald，Ｄ. Ｂ.，Ｆleming，Ｇ.
Ｒ.(１９８３)Ｊ. Ａm. Ｃhem. Ｓoc. １０５，３８２４−３８３２。 Ｓzabo，Ａ. Ｇ.，Ｒayner，Ｄ. Ｍ.(１９８０)Ｊ. Ａm. Ｃhem. Ｓoc. １０
２，５５４−５６３。 Ｐugliese，Ｌ.，Ｃoda，Ａ.，Ｍalcovati，Ｍ.，Ｂolognesi，Ｍ.(１９９３)
Ｊ. Ｍol. Ｂiol. ２３１，６９８。
【図１】 (ａ)２５μM ４ｅのＴＨＦ溶液の吸収スペクトルおよび蛍光励起スペクトル(--
-)。蛍光励起スペクトルの小さな赤シフトは、ＵＶと蛍光装置の間の単色光分光
器のずれによる。 (ｂ)１μMのＴＨＦ溶液の蛍光放出、３４２nmで励起。
-)。蛍光励起スペクトルの小さな赤シフトは、ＵＶと蛍光装置の間の単色光分光
器のずれによる。 (ｂ)１μMのＴＨＦ溶液の蛍光放出、３４２nmで励起。
【図２】 (ａ) −(ｉ)ＡＩＤＡ−結合体１１、９および８(グラフでは各々ＢＬＩ、ＢＰ
ＩおよびＩＰＢと示している)、およびアビジン−トリプトファン、アビジンLuc
ifer Yellowおよびアビジン−BODIPY-FLの励起および放出スペクトルは、トリプ
トファン、BODIPY-FLおよびLucifer Yellow放出および励起の間の各々の重複を
示す。
ＩおよびＩＰＢと示している)、およびアビジン−トリプトファン、アビジンLuc
ifer Yellowおよびアビジン−BODIPY-FLの励起および放出スペクトルは、トリプ
トファン、BODIPY-FLおよびLucifer Yellow放出および励起の間の各々の重複を
示す。
【図３】 上部パネル： １１(ＢＬＩ)(ａ)および８(ＩＰＢ)(ｂ)トリプトファンアビジン複合体におけ
る蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号１−５で示す。差異
スペクトル[(Ｉ(１１または８(遊離))＋Ｉ(アビジン(遊離))]−Ｉ(１１−または
８−アビジン複合体)を曲線５に示す。１１経口は、アビジン結合部位における
複合体形成により、訳２５.５％まで消光する。約６２％のこの総消光効果は、
蛍光共鳴エネルギー伝達である。２５０から３０５nmで、トリプトファンとチロ
シン蛍光強度の促進は、１１とアビジンの合計を基本にして７２％である。ビオ
チンのインダゾール分子の３位への結合(１１では１位)は、蛍光スペクトルだけ
でなく、トリプトファン→インダゾールＦＲＥＴ特性も変える：インダゾール蛍
光放出(消光の変わりに)の２６％増加により示される、トリプトファンへの増加
したエネルギー伝達(１２０％)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率
の非常な増加により重ね合わせられる。 下部パネル： １１(ｃ)および８(ｄ)BODIPY-FLアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー
伝達および基底状態消光。曲線は番号１−５で示す。両方の分子両方の分子幾何
学で、１位(１１)および３位(８)を介して結合したインダゾールトレーサー、BO
DIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の７０−９０％消光をもたら
す。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるインダゾールまたはＦ
ＲＥＴのＢＯＤＩＰＹ標識に対する基底状態消光により、励起状態の同時非放射
デポピュレーションと共にもたらされることができる。インダゾール放出とBODI
PY-FL吸収スペクトルの間の重複積分は１１よりも８で小さいが、アクセプター
蛍光のより大きな増感が８−アビジンBODIPY複合体でもたらされ、４８％エネル
ギー伝達および９３.５％インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、８
における高いドナー量子収率、またはドナー放出とアクセプター吸収双極子の好
ましい相対的配向によりもたらすことができる。
る蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号１−５で示す。差異
スペクトル[(Ｉ(１１または８(遊離))＋Ｉ(アビジン(遊離))]−Ｉ(１１−または
８−アビジン複合体)を曲線５に示す。１１経口は、アビジン結合部位における
複合体形成により、訳２５.５％まで消光する。約６２％のこの総消光効果は、
蛍光共鳴エネルギー伝達である。２５０から３０５nmで、トリプトファンとチロ
シン蛍光強度の促進は、１１とアビジンの合計を基本にして７２％である。ビオ
チンのインダゾール分子の３位への結合(１１では１位)は、蛍光スペクトルだけ
でなく、トリプトファン→インダゾールＦＲＥＴ特性も変える：インダゾール蛍
光放出(消光の変わりに)の２６％増加により示される、トリプトファンへの増加
したエネルギー伝達(１２０％)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率
の非常な増加により重ね合わせられる。 下部パネル： １１(ｃ)および８(ｄ)BODIPY-FLアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー
伝達および基底状態消光。曲線は番号１−５で示す。両方の分子両方の分子幾何
学で、１位(１１)および３位(８)を介して結合したインダゾールトレーサー、BO
DIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の７０−９０％消光をもたら
す。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるインダゾールまたはＦ
ＲＥＴのＢＯＤＩＰＹ標識に対する基底状態消光により、励起状態の同時非放射
デポピュレーションと共にもたらされることができる。インダゾール放出とBODI
PY-FL吸収スペクトルの間の重複積分は１１よりも８で小さいが、アクセプター
蛍光のより大きな増感が８−アビジンBODIPY複合体でもたらされ、４８％エネル
ギー伝達および９３.５％インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、８
における高いドナー量子収率、またはドナー放出とアクセプター吸収双極子の好
ましい相対的配向によりもたらすことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ 【要約の続き】 する。
Claims (11)
- 【請求項１】 式(Ｉ) 【化１】 [式中、基Ｒ１またはＲ２の１つおよび基Ｒ３またはＲ４の１つは、水素であり
、その他は、独立して−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ(
ＣＨ２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ
２ＮＨ２、−ＮＯ２、ＮＲ１０Ｒ１１、ＮＨＣＯＲ１２、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、−Ｃ
Ｆ３、Ｏ(Ｃ１−Ｃ４)−アルキル(所望により任意の炭素Ｃ１−Ｃ４においてメ
チルまたはフェニルにより置換されている)、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−Ｓ
Ｏ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、末端炭素が−
ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲ７、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＲ８Ｒ９、−ＣＯＮＨ(ＣＨ
２)ｎＯＨ{式中、ｎ＝２−８}、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＮＨ２、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ
、Ｎ＝Ｃ＝Ｓ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ(ＣＨ２)ｎＮＨ２、−ＣＯＮＨ(ＣＨ
２)ｎＮＨ２{ｎ＝２−８、および当該ＮＨ２−基はまた、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル
により、または通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(
Ｃ１−Ｃ１６)−アルキルであり、 Ｒ７は、通常使用されるカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基、 Ｒ８またはＲ９は、水素であり、他方は、低級アルキル(Ｃ１−Ｃ４)、フェニル
、ベンジルまたはＲ８およびＲ９は、ピペラジンのような５または６員環の一部
であり、 Ｒ１０およびＲ１１は、独立して水素、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはアミノ保護
基(適当な保護基は上記の通り)であり、 Ｒ１２は、何れも(Ｃ１−Ｃ４)アルキルで置換され得る(Ｃ１−Ｃ１０)アルキル
、フェニル、保護(適当な保護基は上記の通り)アミノ基またはハロゲンである]
により示される、化合物。 - 【請求項２】 以下の構造により示される、請求項１記載の化合物： 【化２】
- 【請求項３】 式(II−III) Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｃ−Ｄ'−Ｅ(式(II)) Ａ−Ｂ−Ｄ−Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(III)) [式中、Ａは、固相および溶液相有機化学に適用される標準的物質から選択され
る固体支持体であり、 Ｂは、Ｄ−Ｃ−Ｄ'−ＥまたはＤ−Ｅ−Ｄ'−Ｃフラグメント、それぞれの遊離の
ために式(II−III)の蛍光性結合体を切断し得るリンカーであり、 Ｃは、式(Ｉ)から選択された化合物であり、 ＤおよびＤ'は、独立した結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミ
ノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒ
ドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジ
アミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択
されるスペーサーであり、 Ｅは、調査される分子である] により示される、化合物。 - 【請求項４】 Ａが官能化ポリスチレン基礎樹脂、ポリアクリルアミド基礎
ポリマー、ポリスチレン／ポリジメチルアクリルアミド組成物、ＰＥＧＡ樹脂、
ポリスチレン−ポリオキシエチレン基礎支持体、Tentagel、ＰＥＧ−ポリスチレ
ングラフトポリマー性支持体、ガラス表面、官能化表面、官能化表面でグラフト
した物質またはポリエチレングリコールから選択され、 Ｂがベンジル、ベンズヒドリル、ベンズヒドリリデン、トリチル、キサンチエニ
ル、ベンゾイン、シリコンまたはアリル基礎リンカーから選択され、 Ｃが式(Ｉ)の化合物から選択され、 Ｅが低分子量化合物、ペプチド、タンパク質、炭化水素、核酸、または結合体形
成用の官能基を含む脂質から選択される、請求項３記載の化合物。 - 【請求項５】 以下の構造により示される、請求項３または４記載の化合物
： 【化３】 - 【請求項６】 式(IV) Ｅ−Ｄ'−Ｃ(式(IV)) [式中、Ｅは、調査する分子、 Ｄ'は、結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル
、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アル
カン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖
に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサー
であり、 Ｃは、式(Ｉ)から選択される化合物である] により示される、化合物。 - 【請求項７】 以下の構造を有する、請求項６記載の化合物： 【化４】
- 【請求項８】 均一溶液中のＡＩＤＡ標識分子と結合分子との相互作用の同
定のための方法であって、下記ステップ： ステップ１Ａ：式(IV)から選択されるＡＩＤＡ標識分子を提供すること、 ステップ１Ｂ：式(IV)のＡＩＤＡ標識分子を結合分子と混合すること、そして、
次いで、 ステップ１Ｃ：蛍光分光法の方法により、ステップ１Ｂに述べたＡＩＤＡ標識分
子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること を含む方法。 - 【請求項９】 蛍光分光法が、 ・連続波＝プロンプト＝安定状態フルオロメーターのＡＩＤＡ放射の蛍光非等方
性／偏光性の増加、 ・時間分解蛍光装置における回転相関時間の増加、 ・蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決定される単一分子蛍光実験に
おける移行放散時間の増大、 ・３００と４００nmの範囲の励起波長による３５０と７００nmの範囲の波長のＡ
ＩＤＡ蛍光放射の増加または減少、 ・結合分子中の励起トリプトファン(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(ド
ナー消光またはアクセプター増感)、この場合、結合体の分子中のＡＩＤＡ色素(
アクセプター)に対するペプチドまたはタンパク質である、 ・結合分子の蛍光標識(アクセプター)に対する結合分子(ドナー)中の励起ＡＩＤ
Ａ色素からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、こ
の場合、任意の化合物クラスを含む、 の測定である、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 固相有機化学において通常使用される固体支持体上のＡＩ
ＤＡ標識分子と固体支持体を含む均一溶液中の結合分子との間の相互作用の同定
の方法であって、下記ステップ： ステップ２Ａ：式(IIまたはIII)の結合体としてＡＩＤＡ標識分子を提供するこ
と、 ステップ２Ｂ：式(IIまたはIII)の結合体としてのＡＩＤＡ標識分子を結合分子
と混合すること、そして、次いで、 ステップ２Ｃ：結合分子に対する最も高い結合親和性でＡＩＤＡ連結分子を同定
する方法を提供する定量的シグナルを生ずる蛍光分光法で使用する方法により、
ステップ２Ｂに述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを
選択的に検出すること、 ステップ２Ｄ：式(IIまたはIII)により示される同定されたＡＩＤＡ分子を含む
固体支持体の単離、 ステップ２Ｅ：方法１Ａ−Ｃに述べた蛍光分光法を用いる種々の方法により、ス
テップ２Ｄで述べたＡＩＤＡ標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選
択的に検出すること を含む、方法。 - 【請求項１１】 ステップ２Ｃの蛍光分光法が、 ・共焦点顕微鏡および分光技術に適用されるＡＩＤＡ含有固体支持体への蛍光標
識巨大分子の結合の直接検出、 ・固体支持体上の化合物の合成の間に実施される通常の蛍光分光法に通常使用す
るための、第２環境的感受性分子へのＡＩＤＡの化学的結合による、分子明度の
変化の促進の測定、 ・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：ＡＩＤＡから適当な長波長色素の蛍光共鳴エ
ネルギー移動であって、それにより、長波長色素の放射波長の分子明度の変化に
より検出さるＡＩＤＡ ＵＶ−励起を用い増感する蛍光共鳴エネルギー移動、 ・蛍光共鳴エネルギー移動の測定：３５１nm励起および４００nm放射波長の、固
体支持体に連結する分子上のＡＩＤＡの特定明度の減少、 ・時間分解単一分子分光法による分子明度の減少または増加を測定することによ
る量子収量の変化の検出、 である、請求項１０記載の方法。
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