JP2002533329A5 - - Google Patents
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【請求項1】 式(I)
【化1】
[式中、基R1またはR2の1つおよび基R3またはR4の1つは、水素であり、その他は、独立して−COOH、−COOR7、−CONH2、−CONH(CH2)nOH{式中、n=2−8}、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NH2、−NO2、NR10R11、NHCOR12、Cl、Br、F、−CF3、O(C1−C4)−アルキル(所望により任意の炭素C1−C4においてメチルまたはフェニルにより置換されている)、−N=C=O、N=C=S、−SO3H、−SO2NH(CH2)nNH2、(C1−C4)アルキル、末端炭素が−COOH、−COOR7、−CONH2、−CONR8R9、−CONH(CH2)nOH{式中、n=2−8}、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、N=C=S、−SO3H、−SO2NH(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNH2{n=2−8、および当該NH2−基はまた、(C1−C4)アルキルにより、またはtert−ブチルオキシカルボニル、9−フルオレニルメトキシカルボニル、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルのような通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(C 1 −C 16 )−アルキルであり、そして基R 5 またはR 6 の1つは、水素であり、その他のものは水素、ハロゲン、O(C 1 −C 4 )−アルキル(所望により、任意の炭素C 1 −C 4 でメチルまたはフェニルで置換されている)、−NO 2 、NR 10 R 11 、NHCOR 12 、(C 1 −C 4 )アルキル、末端炭素が−COOH、−COOR 7 、−CONH 2 、−CONR 8 R 9 、−CONH(CH 2 ) n OH{式中、n=2−8}、−CH 2 OH、−CH 2 NH 2 、−N=C=O、N=C=S、−SO 3 H、−SO 2 NH(CH 2 ) n NH 2 、−CONH(CH 2 ) n NH 2 {式中、n=2−8、および当該NH 2 −基はまた、(C 1 −C 4 )アルキルにより、または通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(C 1 −C 16 )−アルキルであり、
R7は、通常使用されるカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基、
R8またはR9は、水素であり、他方は、低級アルキル(C1−C4)、フェニル、ベンジルまたはR8およびR9は、5または6員環の一部であり、
R10およびR11は、独立して水素、(C1−C4)アルキルまたはアミノ保護基(適当な保護基は上記の通り)であり、
R12は、何れも(C1−C4)アルキルで置換され得る(C1−C10)アルキル、フェニル、保護アミノ基またはハロゲンである]
により示される、化合物。
【請求項2】 以下の構造により示される、請求項1記載の化合物:
【化2】
【請求項3】 式(II−III)
A−B−D−C−D'−E(式(II))
A−B−D−E−D'−C(式(III))
[式中、Aは、固相および溶液相有機化学に適用される標準的物質から選択される固体支持体であり、
Bは、D−C−D'−EまたはD−E−D'−Cフラグメント、それぞれの遊離のために式(II−III)の蛍光性結合体を切断し得るリンカーであり、
Cは、式(I)から選択された化合物であり、
DおよびD'は、独立した結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサーであり、
Eは、調査される分子である]
により示される、化合物。
【請求項4】 Aが官能化ポリスチレン基礎樹脂、ポリアクリルアミド基礎ポリマー、ポリスチレン/ポリジメチルアクリルアミド組成物、PEGA樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエチレン基礎支持体、Tentagel、PEG−ポリスチレングラフトポリマー性支持体、ガラス表面、官能化表面、官能化表面でグラフトした物質またはポリエチレングリコールから選択され、
Bがベンジル、ベンズヒドリル、ベンズヒドリリデン、トリチル、キサンチエニル、ベンゾイン、シリコンまたはアリル基礎リンカーから選択され、
Cが式(I)の化合物から選択され、
Eが低分子量化合物、ペプチド、タンパク質、炭化水素、核酸、または結合体形成用の官能基を含む脂質から選択される、請求項3記載の化合物。
【請求項5】 以下の構造により示される、請求項3または4記載の化合物:
【化3】
【請求項6】 式(IV)
E−D'−C(式(IV))
[式中、Eは、調査する分子、
D'は、結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサーであり、
Cは、式(I)から選択される化合物である]
により示される、化合物。
【請求項7】 以下の構造を有する、請求項6記載の化合物:
【化4】
【請求項8】 均一溶液中のAIDA標識分子と結合分子との相互作用の同定のための方法であって、下記ステップ:
ステップ1A:式(IV)から選択されるAIDA標識分子を提供すること、
ステップ1B:式(IV)のAIDA標識分子を結合分子と混合すること、そして、次いで、
ステップ1C:蛍光分光法の方法により、ステップ1Bに述べたAIDA標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること
を含む方法。
【請求項9】 蛍光分光法が、
・連続波=プロンプト=安定状態フルオロメーターのAIDA放射の蛍光非等方性/偏光性の増加、
・時間分解蛍光装置における回転相関時間の増加、
・蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決定される単一分子蛍光実験における移行放散時間の増大、
・300と400nmの範囲の励起波長による350と700nmの範囲の波長のAIDA蛍光放射の増加または減少、
・結合分子中の励起トリプトファン(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、この場合、結合体の分子中のAIDA色素(アクセプター)に対するペプチドまたはタンパク質である、
・結合分子の蛍光標識(アクセプター)に対する結合分子(ドナー)中の励起AIDA色素からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、この場合、任意の化合物クラスを含む、
の測定である、請求項8記載の方法。
【請求項10】 固相有機化学において通常使用される固体支持体上のAIDA標識分子と固体支持体を含む均一溶液中の結合分子との間の相互作用の同定の方法であって、下記ステップ:
ステップ2A:式(IIまたはIII)の結合体としてAIDA標識分子を提供すること、
ステップ2B:式(IIまたはIII)の結合体としてのAIDA標識分子を結合分子と混合すること、そして、次いで、
ステップ2C:結合分子に対する最も高い結合親和性でAIDA連結分子を同定する方法を提供する定量的シグナルを生ずる蛍光分光法で使用する方法により、ステップ2Bに述べたAIDA標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること、
ステップ2D:式(IIまたはIII)により示される同定されたAIDA分子を含む固体支持体の単離、
ステップ2E:方法1A−Cに述べた蛍光分光法を用いる種々の方法により、ステップ2Dで述べたAIDA標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること
を含む、方法。
【請求項11】 ステップ2Cの蛍光分光法が、
・共焦点顕微鏡および分光技術に適用されるAIDA含有固体支持体への蛍光標識巨大分子の結合の直接検出、
・固体支持体上の化合物の合成の間に実施される通常の蛍光分光法に通常使用するための、第2環境的感受性分子へのAIDAの化学的結合による、分子明度の変化の促進の測定、
・蛍光共鳴エネルギー移動の測定:AIDAから適当な長波長色素の蛍光共鳴エネルギー移動であって、それにより、長波長色素の放射波長の分子明度の変化により検出さるAIDA UV−励起を用い増感する蛍光共鳴エネルギー移動、
・蛍光共鳴エネルギー移動の測定:351nm励起および400nm放射波長の、固体支持体に連結する分子上のAIDAの特定明度の減少、
・時間分解単一分子分光法による分子明度の減少または増加を測定することによる量子収量の変化の検出、
である、請求項10記載の方法。
【請求項1】 式(I)
【化1】
[式中、基R1またはR2の1つおよび基R3またはR4の1つは、水素であり、その他は、独立して−COOH、−COOR7、−CONH2、−CONH(CH2)nOH{式中、n=2−8}、−CONR8R9、−CH2OH、−CH2NH2、−NO2、NR10R11、NHCOR12、Cl、Br、F、−CF3、O(C1−C4)−アルキル(所望により任意の炭素C1−C4においてメチルまたはフェニルにより置換されている)、−N=C=O、N=C=S、−SO3H、−SO2NH(CH2)nNH2、(C1−C4)アルキル、末端炭素が−COOH、−COOR7、−CONH2、−CONR8R9、−CONH(CH2)nOH{式中、n=2−8}、−CH2OH、−CH2NH2、−N=C=O、N=C=S、−SO3H、−SO2NH(CH2)nNH2、−CONH(CH2)nNH2{n=2−8、および当該NH2−基はまた、(C1−C4)アルキルにより、またはtert−ブチルオキシカルボニル、9−フルオレニルメトキシカルボニル、フタルイミド、トリフルオロアセトアミド、メトキシカルボニル、エトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、2,2,2−トリクロロエトキシカルボニル、2−(トリメチルシリル)エトキシカルボニルのような通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(C 1 −C 16 )−アルキルであり、そして基R 5 またはR 6 の1つは、水素であり、その他のものは水素、ハロゲン、O(C 1 −C 4 )−アルキル(所望により、任意の炭素C 1 −C 4 でメチルまたはフェニルで置換されている)、−NO 2 、NR 10 R 11 、NHCOR 12 、(C 1 −C 4 )アルキル、末端炭素が−COOH、−COOR 7 、−CONH 2 、−CONR 8 R 9 、−CONH(CH 2 ) n OH{式中、n=2−8}、−CH 2 OH、−CH 2 NH 2 、−N=C=O、N=C=S、−SO 3 H、−SO 2 NH(CH 2 ) n NH 2 、−CONH(CH 2 ) n NH 2 {式中、n=2−8、および当該NH 2 −基はまた、(C 1 −C 4 )アルキルにより、または通常使用されるアミノ保護基により置換され得る}で置換された(C 1 −C 16 )−アルキルであり、
R7は、通常使用されるカルボキシル保護基またはカルボキシル活性化基、
R8またはR9は、水素であり、他方は、低級アルキル(C1−C4)、フェニル、ベンジルまたはR8およびR9は、5または6員環の一部であり、
R10およびR11は、独立して水素、(C1−C4)アルキルまたはアミノ保護基(適当な保護基は上記の通り)であり、
R12は、何れも(C1−C4)アルキルで置換され得る(C1−C10)アルキル、フェニル、保護アミノ基またはハロゲンである]
により示される、化合物。
【請求項2】 以下の構造により示される、請求項1記載の化合物:
【化2】
【請求項3】 式(II−III)
A−B−D−C−D'−E(式(II))
A−B−D−E−D'−C(式(III))
[式中、Aは、固相および溶液相有機化学に適用される標準的物質から選択される固体支持体であり、
Bは、D−C−D'−EまたはD−E−D'−Cフラグメント、それぞれの遊離のために式(II−III)の蛍光性結合体を切断し得るリンカーであり、
Cは、式(I)から選択された化合物であり、
DおよびD'は、独立した結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサーであり、
Eは、調査される分子である]
により示される、化合物。
【請求項4】 Aが官能化ポリスチレン基礎樹脂、ポリアクリルアミド基礎ポリマー、ポリスチレン/ポリジメチルアクリルアミド組成物、PEGA樹脂、ポリスチレン−ポリオキシエチレン基礎支持体、Tentagel、PEG−ポリスチレングラフトポリマー性支持体、ガラス表面、官能化表面、官能化表面でグラフトした物質またはポリエチレングリコールから選択され、
Bがベンジル、ベンズヒドリル、ベンズヒドリリデン、トリチル、キサンチエニル、ベンゾイン、シリコンまたはアリル基礎リンカーから選択され、
Cが式(I)の化合物から選択され、
Eが低分子量化合物、ペプチド、タンパク質、炭化水素、核酸、または結合体形成用の官能基を含む脂質から選択される、請求項3記載の化合物。
【請求項5】 以下の構造により示される、請求項3または4記載の化合物:
【化3】
【請求項6】 式(IV)
E−D'−C(式(IV))
[式中、Eは、調査する分子、
D'は、結合手であるか、α,ω−ジアミノ−アルカン、ジアミノシクロヘキシル、ビス−(アミノメチル)−置換フェニル、α−アミノ−ω−ヒドロキシル−アルカン、アルキルアミン、環状アルキルアミン、環状アルキルジアミンまたは側鎖に更なる官能基を有するかもしくは有しないアミノ酸から選択されるスペーサーであり、
Cは、式(I)から選択される化合物である]
により示される、化合物。
【請求項7】 以下の構造を有する、請求項6記載の化合物:
【化4】
【請求項8】 均一溶液中のAIDA標識分子と結合分子との相互作用の同定のための方法であって、下記ステップ:
ステップ1A:式(IV)から選択されるAIDA標識分子を提供すること、
ステップ1B:式(IV)のAIDA標識分子を結合分子と混合すること、そして、次いで、
ステップ1C:蛍光分光法の方法により、ステップ1Bに述べたAIDA標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること
を含む方法。
【請求項9】 蛍光分光法が、
・連続波=プロンプト=安定状態フルオロメーターのAIDA放射の蛍光非等方性/偏光性の増加、
・時間分解蛍光装置における回転相関時間の増加、
・蛍光変動の時間追跡における自己相関算出から決定される単一分子蛍光実験における移行放散時間の増大、
・300と400nmの範囲の励起波長による350と700nmの範囲の波長のAIDA蛍光放射の増加または減少、
・結合分子中の励起トリプトファン(ドナー)からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、この場合、結合体の分子中のAIDA色素(アクセプター)に対するペプチドまたはタンパク質である、
・結合分子の蛍光標識(アクセプター)に対する結合分子(ドナー)中の励起AIDA色素からの蛍光共鳴エネルギー移動(ドナー消光またはアクセプター増感)、この場合、任意の化合物クラスを含む、
の測定である、請求項8記載の方法。
【請求項10】 固相有機化学において通常使用される固体支持体上のAIDA標識分子と固体支持体を含む均一溶液中の結合分子との間の相互作用の同定の方法であって、下記ステップ:
ステップ2A:式(IIまたはIII)の結合体としてAIDA標識分子を提供すること、
ステップ2B:式(IIまたはIII)の結合体としてのAIDA標識分子を結合分子と混合すること、そして、次いで、
ステップ2C:結合分子に対する最も高い結合親和性でAIDA連結分子を同定する方法を提供する定量的シグナルを生ずる蛍光分光法で使用する方法により、ステップ2Bに述べたAIDA標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること、
ステップ2D:式(IIまたはIII)により示される同定されたAIDA分子を含む固体支持体の単離、
ステップ2E:方法1A−Cに述べた蛍光分光法を用いる種々の方法により、ステップ2Dで述べたAIDA標識分子および結合分子を用い、結合イベントを選択的に検出すること
を含む、方法。
【請求項11】 ステップ2Cの蛍光分光法が、
・共焦点顕微鏡および分光技術に適用されるAIDA含有固体支持体への蛍光標識巨大分子の結合の直接検出、
・固体支持体上の化合物の合成の間に実施される通常の蛍光分光法に通常使用するための、第2環境的感受性分子へのAIDAの化学的結合による、分子明度の変化の促進の測定、
・蛍光共鳴エネルギー移動の測定:AIDAから適当な長波長色素の蛍光共鳴エネルギー移動であって、それにより、長波長色素の放射波長の分子明度の変化により検出さるAIDA UV−励起を用い増感する蛍光共鳴エネルギー移動、
・蛍光共鳴エネルギー移動の測定:351nm励起および400nm放射波長の、固体支持体に連結する分子上のAIDAの特定明度の減少、
・時間分解単一分子分光法による分子明度の減少または増加を測定することによる量子収量の変化の検出、
である、請求項10記載の方法。
(背景技術)
3つの新しい科学的研究分野は、薬物発見過程における予測性の増加の必要性および全体的損耗率低下の必要性を満たす極めて高い見込みを示す。(1)機能ゲノミクスは、新規な革新的分子標的を生ずることを目的とした。(2)コンビナトリアル化学は、標的を探索する分子多様性を生ずる、ますます効率のよい方法を提供する。(3)高速処理量スクリーニング(HTS)プラットフォームは、可能性あるリード化合物の発見に効率および品質を提供する。殆どの製薬会社における高速処理スクリーニングは、現在、1年あたり数百万アッセイの実施を含む。同時に、HTSは、検出/液体を扱う技術および自動化工程と組合せた、生化学、生物物理学および細胞/分子生物学を吸収した確立された学問分野となった。これら新規の科学的研究分野がもたらしたすべての素晴らしい機会と共に、機能ゲノミクスにおける時間のかかる過程は新規タンパク質の生理的機能の同定であるということが明らかとなった。コンビナトリアル化学が、古典的な合成に必要な時間の間に数倍の化合物の合成を行う一方で、5から10倍のアッセイがスクリーニングからのヒット化合物の同定に必要となることが現在知られている。応用科学の社会が現在直面する挑戦は、合成、タンパク質機能同定およびスクリーニングの過程をスピードアップすることにより時間的に(1)および(2)の利点を十分に利用することである。本発明は、固相上の直接の化合物のスクリーニングに必要な効率を提供することにより、コンビナトリアル化学およびゲノミクスの利点をHTSと統合する新しい可能性を開示する。標的巨大分子は、たとえ機能が知られていなくても、目的化合物に対する直接の結合親和性について試験し得る。以下でAIDA化学として一般的に述べられている、新規蛍光化学はまた、AIDA化学と結合する化合物の直接の適用によるか、または既知の化学的もしくは光物理学的手段による固相からのAIDA結合物の切断によるか、何れかにより、均一溶液中のスクリーニングアッセイに適当である。固相スクリーニング技術において同定されたAIDA結合“バインダー”の解離後、目的の巨大分子への親和性は、マイクロタイタープレートで使用のアッセイ容積における通常の全体平均蛍光分光学的技術により決定され得る。加えて、マイクロタイター容積で実施され、いわゆるナノキャリアーに適用される単一分子分光学的技術が、使用され得る。
3つの新しい科学的研究分野は、薬物発見過程における予測性の増加の必要性および全体的損耗率低下の必要性を満たす極めて高い見込みを示す。(1)機能ゲノミクスは、新規な革新的分子標的を生ずることを目的とした。(2)コンビナトリアル化学は、標的を探索する分子多様性を生ずる、ますます効率のよい方法を提供する。(3)高速処理量スクリーニング(HTS)プラットフォームは、可能性あるリード化合物の発見に効率および品質を提供する。殆どの製薬会社における高速処理スクリーニングは、現在、1年あたり数百万アッセイの実施を含む。同時に、HTSは、検出/液体を扱う技術および自動化工程と組合せた、生化学、生物物理学および細胞/分子生物学を吸収した確立された学問分野となった。これら新規の科学的研究分野がもたらしたすべての素晴らしい機会と共に、機能ゲノミクスにおける時間のかかる過程は新規タンパク質の生理的機能の同定であるということが明らかとなった。コンビナトリアル化学が、古典的な合成に必要な時間の間に数倍の化合物の合成を行う一方で、5から10倍のアッセイがスクリーニングからのヒット化合物の同定に必要となることが現在知られている。応用科学の社会が現在直面する挑戦は、合成、タンパク質機能同定およびスクリーニングの過程をスピードアップすることにより時間的に(1)および(2)の利点を十分に利用することである。本発明は、固相上の直接の化合物のスクリーニングに必要な効率を提供することにより、コンビナトリアル化学およびゲノミクスの利点をHTSと統合する新しい可能性を開示する。標的巨大分子は、たとえ機能が知られていなくても、目的化合物に対する直接の結合親和性について試験し得る。以下でAIDA化学として一般的に述べられている、新規蛍光化学はまた、AIDA化学と結合する化合物の直接の適用によるか、または既知の化学的もしくは光物理学的手段による固相からのAIDA結合物の切断によるか、何れかにより、均一溶液中のスクリーニングアッセイに適当である。固相スクリーニング技術において同定されたAIDA結合“バインダー”の解離後、目的の巨大分子への親和性は、マイクロタイタープレートで使用のアッセイ容積における通常の全体平均蛍光分光学的技術により決定され得る。加えて、マイクロタイター容積で実施され、いわゆるナノキャリアーに適用される単一分子分光学的技術が、使用され得る。
4eの量子収率決定[Demans & Cosby, 1971; Chen et al., 1972]:
4eの量子収率を、標準としてキニンスルフェートを使用して決定する[Melhuish, 1961]。
4eのUVスペクトルとキニンスルフェート(CS)の間の交差をCary 1Eスペクトロフォトメーターでの二つの物質の溶液の測定により決定する。濃度は4eに関してはTHF中25μMおよびCSに関しては1N H2SO4中50mMであった。スペクトルを260nmから380nm、光学的通過長10mmの石英キュベットを使用して記録し、ブランクを溶媒吸光を引くことにより補正する。二つの得られるUVスペクトルの交差の点は348.3nmと決定され、モノクロメーターシフトのために、SLM-8000Cフルオロメーターで352.8nmに対応する。4eおよびCSの蛍光放出スペクトルを、1光子計数モードでのUV測定と同じ溶液を使用して記録する。ランプ強度補正を対照チャンネルにおける量子カウンターを使用して補正する。ゲインは×100に設定し、適用した高ボルト数は830Vである。集積時間は0.5秒である。スリット幅は各々励起に関して1nmおよび放出に関して2nmおよび4nmである。放出スペクトルの記録のため、励起を352.8に設定し、放出を、IAEに関しては360から550nm、CSに関しては360から650nmでモニターする。
4eの量子収率を、標準としてキニンスルフェートを使用して決定する[Melhuish, 1961]。
4eのUVスペクトルとキニンスルフェート(CS)の間の交差をCary 1Eスペクトロフォトメーターでの二つの物質の溶液の測定により決定する。濃度は4eに関してはTHF中25μMおよびCSに関しては1N H2SO4中50mMであった。スペクトルを260nmから380nm、光学的通過長10mmの石英キュベットを使用して記録し、ブランクを溶媒吸光を引くことにより補正する。二つの得られるUVスペクトルの交差の点は348.3nmと決定され、モノクロメーターシフトのために、SLM-8000Cフルオロメーターで352.8nmに対応する。4eおよびCSの蛍光放出スペクトルを、1光子計数モードでのUV測定と同じ溶液を使用して記録する。ランプ強度補正を対照チャンネルにおける量子カウンターを使用して補正する。ゲインは×100に設定し、適用した高ボルト数は830Vである。集積時間は0.5秒である。スリット幅は各々励起に関して1nmおよび放出に関して2nmおよび4nmである。放出スペクトルの記録のため、励起を352.8に設定し、放出を、IAEに関しては360から550nm、CSに関しては360から650nmでモニターする。
実施例1A
選択実施例4−[3−(4−アリルオキシカルボニル−フェニル)−1H−インダゾル−1−イル]安息香酸(4e)の詳細な分光学特徴付:
AIDA誘導体4eは、342nmで吸収最大を、および403nmで最大放出強度を示す。本化合物は、約60nmの大ストークシフトを有し、殆どの巨大分子環境下でトリプトファン類の放出と商品として入手可能な多くのフルオロフォアの間に位置し、生化学でトレーサーとして使用される(図1−2)。吸収と蛍光励起スペクトルの間の殆ど完全な重複は、励起状態における光化学および光物理作用の可能性が低いことを示す。337nmでの吸収係数εは39926M−1cm−1であり、これはフルオレッシンまたはローダミン誘導体から既知の値の約50%であるが、ナノモル濃度範囲におけるFRET測定においてアクセプターとして働くには十分高い。4eの量子収率、Q4eは0.591である。トリプトファン(≒0.1)またはフルオレッシン(有機溶媒中、≒0.9、タンパク質またはRNAに結合≒0.2−0.4)と比較して、4eのような小化合物で、これは良好な蛍光ドナー特性を示す驚くべき高い量子収率である。
選択実施例4−[3−(4−アリルオキシカルボニル−フェニル)−1H−インダゾル−1−イル]安息香酸(4e)の詳細な分光学特徴付:
AIDA誘導体4eは、342nmで吸収最大を、および403nmで最大放出強度を示す。本化合物は、約60nmの大ストークシフトを有し、殆どの巨大分子環境下でトリプトファン類の放出と商品として入手可能な多くのフルオロフォアの間に位置し、生化学でトレーサーとして使用される(図1−2)。吸収と蛍光励起スペクトルの間の殆ど完全な重複は、励起状態における光化学および光物理作用の可能性が低いことを示す。337nmでの吸収係数εは39926M−1cm−1であり、これはフルオレッシンまたはローダミン誘導体から既知の値の約50%であるが、ナノモル濃度範囲におけるFRET測定においてアクセプターとして働くには十分高い。4eの量子収率、Q4eは0.591である。トリプトファン(≒0.1)またはフルオレッシン(有機溶媒中、≒0.9、タンパク質またはRNAに結合≒0.2−0.4)と比較して、4eのような小化合物で、これは良好な蛍光ドナー特性を示す驚くべき高い量子収率である。
(b)ドナーまたはアクセプターとしての11での共鳴エネルギー伝達試験。
アクセプターとしてのAIDA結合体8:(図3b)
差異スペクトル[I(8 (遊離) )+I(アビジン (遊離) )]−I(8−アビジン 複合体 )(図3b、曲線5)。
8のインダゾール分子における3位(11における1位から)へのビオチンの結合は、蛍光スペクトルを変えるだけでなく、トリプトファンからインダゾールFRET特徴も変える:インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の26%増加により示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(120%)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
アクセプターとしてのAIDA結合体8:(図3b)
差異スペクトル[I(8 (遊離) )+I(アビジン (遊離) )]−I(8−アビジン 複合体 )(図3b、曲線5)。
8のインダゾール分子における3位(11における1位から)へのビオチンの結合は、蛍光スペクトルを変えるだけでなく、トリプトファンからインダゾールFRET特徴も変える:インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の26%増加により示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(120%)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
ドナーとしてのAIDA結合体8:(図3d)
インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分が11よりも8で小さいが、アクセプターのより大きな増感が、8−アビジン−BODIPY複合体で起こり、48%蛍光エネルギー伝達および93.5%インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、高ドナー量子収率により、または8におけるドナー放出とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらされることができる。
インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分が11よりも8で小さいが、アクセプターのより大きな増感が、8−アビジン−BODIPY複合体で起こり、48%蛍光エネルギー伝達および93.5%インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、高ドナー量子収率により、または8におけるドナー放出とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらされることができる。
スキーム1に説明するような、ジアリールケトン(1a−j)からのアリールヒドラゾン(2a−j)の合成。ジアリールケトン(1a−j;10mmol)とアリールヒドラジン(11mmol)のメタノール(50mL)中の懸濁液を、50時間還流する。加熱すると、透明溶液が得られる。一連の反応の間に結晶性沈殿が形成される。氷浴で冷却後、結晶性生産物(2a−j)を濾過して回収し、2回冷メタノールで、数回ジエチルエーテルで洗浄する。2a−jの結晶を、一晩70℃の乾燥オーブンに保つ。非対称的に置換されたジアリールケトン(1b−f、1i−j)がE/Z−異性体混合物として産生され(2b−f;2i−j)それを更に分割することなく次段階に挿入する。
2a−jの収率および分析的データ
*:E/Z−異性体の比率(指定していない);1H/13C−NMRスペクトル:2a−jの構造に一致して。
2a−jの収率および分析的データ
(f)4−[3−(4−カルボキシフェニル)−1H−インダゾール−1−イル]−安息香酸のクロロスルホニル化
(4b)。インダゾール誘導体4b(21mg、0.06mmol)をクロロ硫酸(1mL)で120℃で10分処理する。反応混合物を氷浴で冷却し、水に滴下する(0℃、4mL)。沈殿を濾過し、水で洗浄し、80℃で減圧下乾燥させる:19mgの4−[3−(4−カルボキシフェニル)5−クロロスルホニル−1H−インダゾール−1−イル]−安息香酸(4q)(69%)。MS(ESI):457(100%)(MH)+。
(4b)。インダゾール誘導体4b(21mg、0.06mmol)をクロロ硫酸(1mL)で120℃で10分処理する。反応混合物を氷浴で冷却し、水に滴下する(0℃、4mL)。沈殿を濾過し、水で洗浄し、80℃で減圧下乾燥させる:19mgの4−[3−(4−カルボキシフェニル)5−クロロスルホニル−1H−インダゾール−1−イル]−安息香酸(4q)(69%)。MS(ESI):457(100%)(MH)+。
1,3−ジアミノ−プロパン(80mL)を、4d(10.0g、26.85mmol)に添加する。異成分から成る反応混合物を、90℃に撹拌下加熱する。4dを一度溶媒に反応温度で溶解し、次いで溶液を4時間放置して反応させる。1,3−ジアミノ−プロパンを減圧下蒸留し、粘性油状物を後に残す。粗生産物をメタノール(200mL)で希釈し、加熱還流する。メタノールが沸騰温度に到達する前に、結晶性生産物は沈殿を始める。懸濁液を10分還流させ、次いで室温に冷却する。結晶を減圧濾過により集める。無色結晶を氷状メタノールで1回、次いでジエチルエーテルで数回洗浄する。生産物を乾燥オーブン中、減圧下、120℃で乾燥させ、9.86g(89%)の5を得る:mp 285−288℃(加熱速度に依存;分解);1H−NMR(DMSO−d6):1.85−2.05(m, 2H);2.90−3.05(m, 2H);3.35−3.55(m, 2H);7.32(t,1H);7.51(t,1H);7.75−8.30(m, 10H);9.20(ブロード, t, 1H, CONH);MS:e/m 415(MH+)。
(c)4−{3−{4−[(3−メチルアミノプロピル)−アミノカルボニル]−フェニル}−1H−インダゾール−1−イル}−安息香酸(5a)の合成。インダゾール4d(186mg、0.5mmol)に、3−メチルアミノ−プロピルアミン(5mL)を添加する。溶液を還流温度に8時間保つ。反応混合物を室温に冷却し、水(20mL)で希釈し、濃塩酸で酸性化する。無色沈殿が形成される。懸濁液を遠心(4500rpm)する。水性層を廃棄する。残りのゲルを塩酸(0.1N、30mL、5回)で洗浄し、真空で70℃で8時間乾燥させる。粗材料を温DMF(2mL)に溶解させる。溶液を室温に冷却し、エーテル(20mL)で希釈する。白色懸濁液が形成され、茶色沈殿がフラスコの底に分離する。懸濁液を分離し、遠心(4500rpm)する。有機層を除去する。残りの無色固体をエーテル(2mL、2回)で洗浄し、真空で2時間乾燥させる:93mg(43%)の5a:mp 186−190℃;MS(ESI)m/z=429(100%)(M+H)+;1H−NMR(DMSO−d6):1.85−1.89(m, 2H, CH2CH 2CH2);2.56(s, OH, NHCH 3);2.96(t, ブロード, 2H, CH 2NH);3.33−3.45(m, 2H, CONHCH 2);7.45(t, 1H, インダゾール−H);7.64(t, 1H, インダゾール−H);7.95−8.28(m, 10H);8.89(t, 1H, CONHCH2)。
【図面の簡単な説明】
【図1】
(a)25μM 4eのTHF溶液の吸収スペクトルおよび蛍光励起スペクトル(---)。蛍光励起スペクトルの小さな赤シフトは、UVと蛍光装置の間の単色光分光器のずれによる。
(b)1μMのTHF溶液の蛍光放出、342nmで励起。
【図2】
(a) −(i)AIDA−結合体11、9および8(グラフでは各々BLI、BPIおよびIPBと示している)、およびアビジン−トリプトファン、アビジンLucifer Yellowおよびアビジン−BODIPY-FLの励起および放出スペクトルは、トリプトファン、BODIPY-FLおよびLucifer Yellow放出および励起の間の各々の重複を示す。
【図3】
上部パネル:
11(BLI)(a)および8(IPB)(b)トリプトファンアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号1−5で示す。差異スペクトル[(I(11または8(遊離))+I(アビジン(遊離))]−I(11−または8−アビジン複合体)を曲線5に示す。11蛍光は、アビジン結合部位における複合体形成により、約25.5%まで消光する。約62%のこの総消光効果は、蛍光共鳴エネルギー伝達である。250から305nmで、トリプトファンとチロシン蛍光強度の促進は、11とアビジンの合計を基本にして72%である。ビオチンのインダゾール分子の3位への結合(11では1位)は、蛍光スペクトルだけでなく、トリプトファン→インダゾールFRET特性も変える:インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の26%増加により示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(120%)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
下部パネル:
11(c)および8(d)BODIPY-FLアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号1−5で示す。両方の分子両方の分子幾何学で、1位(11)および3位(8)を介して結合したインダゾールトレーサー、BODIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の70−90%消光をもたらす。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるインダゾールまたはFRETのBODIPY標識に対する基底状態消光により、励起状態の同時非放射デポピュレーションと共にもたらされることができる。インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分は11よりも8で小さいが、アクセプター蛍光のより大きな増感が8−アビジンBODIPY複合体でもたらされ、48%エネルギー伝達および93.5%インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、8における高いドナー量子収率、またはドナー放出とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらすことができる。
【図1】
(a)25μM 4eのTHF溶液の吸収スペクトルおよび蛍光励起スペクトル(---)。蛍光励起スペクトルの小さな赤シフトは、UVと蛍光装置の間の単色光分光器のずれによる。
(b)1μMのTHF溶液の蛍光放出、342nmで励起。
【図2】
(a) −(i)AIDA−結合体11、9および8(グラフでは各々BLI、BPIおよびIPBと示している)、およびアビジン−トリプトファン、アビジンLucifer Yellowおよびアビジン−BODIPY-FLの励起および放出スペクトルは、トリプトファン、BODIPY-FLおよびLucifer Yellow放出および励起の間の各々の重複を示す。
【図3】
上部パネル:
11(BLI)(a)および8(IPB)(b)トリプトファンアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号1−5で示す。差異スペクトル[(I(11または8(遊離))+I(アビジン(遊離))]−I(11−または8−アビジン複合体)を曲線5に示す。11蛍光は、アビジン結合部位における複合体形成により、約25.5%まで消光する。約62%のこの総消光効果は、蛍光共鳴エネルギー伝達である。250から305nmで、トリプトファンとチロシン蛍光強度の促進は、11とアビジンの合計を基本にして72%である。ビオチンのインダゾール分子の3位への結合(11では1位)は、蛍光スペクトルだけでなく、トリプトファン→インダゾールFRET特性も変える:インダゾール蛍光放出(消光の変わりに)の26%増加により示される、トリプトファンへの増加したエネルギー伝達(120%)は、アビジン環境におけるインダゾール量子収率の非常な増加により重ね合わせられる。
下部パネル:
11(c)および8(d)BODIPY-FLアビジン複合体における蛍光共鳴エネルギー伝達および基底状態消光。曲線は番号1−5で示す。両方の分子両方の分子幾何学で、1位(11)および3位(8)を介して結合したインダゾールトレーサー、BODIPY-FL標識アビジンの結合は、インダゾール放出の70−90%消光をもたらす。シグナル強度におけるこの減少は、アビジンにおけるインダゾールまたはFRETのBODIPY標識に対する基底状態消光により、励起状態の同時非放射デポピュレーションと共にもたらされることができる。インダゾール放出とBODIPY-FL吸収スペクトルの間の重複積分は11よりも8で小さいが、アクセプター蛍光のより大きな増感が8−アビジンBODIPY複合体でもたらされ、48%エネルギー伝達および93.5%インダゾールドナー消光をもたらす。この効果は、8における高いドナー量子収率、またはドナー放出とアクセプター吸収双極子の好ましい相対的配向によりもたらすことができる。
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