JP2002508428A - 硬化トリメチンシアニン色素 - Google Patents
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- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/0075—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain being part of an heterocyclic ring
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- C09B—ORGANIC DYES OR CLOSELY-RELATED COMPOUNDS FOR PRODUCING DYES, e.g. PIGMENTS; MORDANTS; LAKES
- C09B23/00—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes
- C09B23/02—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups
- C09B23/06—Methine or polymethine dyes, e.g. cyanine dyes the polymethine chain containing an odd number of >CH- or >C[alkyl]- groups three >CH- groups, e.g. carbocyanines
Abstract
(57)【要約】
スペクトルの緑色からオレンジ色で強力な蛍光を生産することが可能であり、特に生物学的及び他の標的材料に対する共有結合ラベリングに適した色素にさせる官能基及び／または溶解基をも含む蛍光硬化色素化合物の提供。
Description
【０００１】
本発明は、硬化トリメチンシアニン色素、その調製法、蛍光マーカーとしての
及び蛍光エネルギー転移複合体におけるその使用法、並びにそれらでラベルされ
た物質に関する。
及び蛍光エネルギー転移複合体におけるその使用法、並びにそれらでラベルされ
た物質に関する。
【０００２】
蛍光色素は一般的に周知であり、蛍光顕微鏡、蛍光イムノアッセイ及びフロー
サイトメトリーのような方法によって、各種の生物学的及び非生物学的材料の蛍
光ラベリング及び検出のために使用される。蛍光色素での上記材料のラベリング
の典型的な方法は、該色素分子の適切な基とラベルされる材料の適合的な基の間
の結合による、蛍光複合体を作製することである。この方法において、細胞、組
織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモン、ヌクレオチド、核酸、脂質
及びポリサッカリド等のような材料は、化学的にラベルされ、検出若しくは定量
され得、または標的材料に対して特異的に結合可能な蛍光プローブとして使用さ
れ蛍光検出法によって検出され得る。
サイトメトリーのような方法によって、各種の生物学的及び非生物学的材料の蛍
光ラベリング及び検出のために使用される。蛍光色素での上記材料のラベリング
の典型的な方法は、該色素分子の適切な基とラベルされる材料の適合的な基の間
の結合による、蛍光複合体を作製することである。この方法において、細胞、組
織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモン、ヌクレオチド、核酸、脂質
及びポリサッカリド等のような材料は、化学的にラベルされ、検出若しくは定量
され得、または標的材料に対して特異的に結合可能な蛍光プローブとして使用さ
れ蛍光検出法によって検出され得る。
【０００３】 蛍光色素の４つの一般的に使用されるクラスは、フルオレセイン（緑色蛍光）
、ローダミン（オレンジ色蛍光）、クマリン及びピレン（青色蛍光）クロモホア
に基づくものである。フルオレセイン及びローダミンに基づく色素は、多くの欠
点を有する。フルオレセイン誘導体は、ｐＨ感受性吸収スペクトルを有し、蛍光
はｐＨ８以下で顕著な減少を生ずる。ローダミン誘導体は疎水性であり、水性媒
体で使用することが困難である。それらはしばしばタンパク質に結合した場合に
強力な蛍光クエンチングを示す。
、ローダミン（オレンジ色蛍光）、クマリン及びピレン（青色蛍光）クロモホア
に基づくものである。フルオレセイン及びローダミンに基づく色素は、多くの欠
点を有する。フルオレセイン誘導体は、ｐＨ感受性吸収スペクトルを有し、蛍光
はｐＨ８以下で顕著な減少を生ずる。ローダミン誘導体は疎水性であり、水性媒
体で使用することが困難である。それらはしばしばタンパク質に結合した場合に
強力な蛍光クエンチングを示す。
【０００４】 米国特許第5268486号は、標的材料のアミン、ヒドロキシル、アルデヒド及び スルフヒドリル基に共有結合させることが可能な基を含む、発光モノ及びポリメ
チンシアニン色素、並びにメロシアニン及びスチリル色素のような関連するポリ
メチン色素を開示する。該化合物は、緑色、オレンジ色、赤色及びスペクトルの
赤外線領域で蛍光を発するように開示される。
チンシアニン色素、並びにメロシアニン及びスチリル色素のような関連するポリ
メチン色素を開示する。該化合物は、緑色、オレンジ色、赤色及びスペクトルの
赤外線領域で蛍光を発するように開示される。
【０００５】 米国特許第3679427号は、式（１）に示されるような硬質構造の一部としてト リメチン鎖を含む硬化シアニン色素を記載する：
【化５】 式中、Ｚ及びＺ1のそれぞれは、シアニン色素で使用されるタイプの複素環核を 完成するために必要とされる非金属性原子を表し；Ｒは、ハロゲン原子、アルキ
ル基またはアリール基から選択されたメンバーを表し；Ｒ1は、酸素、硫黄、セ レンまたは窒素から選択されたメンバーを表す。主題となる色素は、強力な蛍光
を示すことが報告され、写真用のハロゲン化銀に対して有用なスペクトル感受性
色素であり、並びに塗料、ラッカー等のような広範囲の組成物に対する着色材料
として有用である。しかしながら、それらは蛍光ラベリング色素としては記載さ
れていない。
ル基またはアリール基から選択されたメンバーを表し；Ｒ1は、酸素、硫黄、セ レンまたは窒素から選択されたメンバーを表す。主題となる色素は、強力な蛍光
を示すことが報告され、写真用のハロゲン化銀に対して有用なスペクトル感受性
色素であり、並びに塗料、ラッカー等のような広範囲の組成物に対する着色材料
として有用である。しかしながら、それらは蛍光ラベリング色素としては記載さ
れていない。
【０００６】 欧州特許出願第747448号は、複素環の窒素原子の間の架橋基によって硬化され
た、ビス−複素環式モノメチンシアニン色素を記載する。上記化合物は、蛍光化
合物に対する所望の溶解性、反応性及び分光学的特性を提供するために選択され
たさらなる基で置換できる。該色素は、標的に対して蛍光特性を与えるために、
標的材料を共有結合的にラベルするために使用できる。モノメチン硬化シアニン
は非常に蛍光性であり、スペクトルの近ＵＶ及び青色（３００−５００ｎｍ）領
域で放射する強力な光吸収色素である。
た、ビス−複素環式モノメチンシアニン色素を記載する。上記化合物は、蛍光化
合物に対する所望の溶解性、反応性及び分光学的特性を提供するために選択され
たさらなる基で置換できる。該色素は、標的に対して蛍光特性を与えるために、
標的材料を共有結合的にラベルするために使用できる。モノメチン硬化シアニン
は非常に蛍光性であり、スペクトルの近ＵＶ及び青色（３００−５００ｎｍ）領
域で放射する強力な光吸収色素である。
【０００７】
スペクトルの緑色からオレンジ色で強力な蛍光を生産することが可能であり、
特に生物学的及び他の標的材料に対する共有結合ラベリングに適した色素にさせ
る官能基及び／または溶解基をも含む蛍光硬化色素化合物は、上述の文献の何れ
にも開示されていない。
特に生物学的及び他の標的材料に対する共有結合ラベリングに適した色素にさせ
る官能基及び／または溶解基をも含む蛍光硬化色素化合物は、上述の文献の何れ
にも開示されていない。
【０００８】
本発明は、スペクトルの４５０−６００ｎｍにおいて吸収及び放射する明るい
非常に蛍光性の色素化合物を提供する。それらは、トリメチンシアニンクロモホ
アに基づき、蛍光の高い量子収率を与える硬質構造を有する。さらにそれらは、
生物学的分子のような標的材料及び他の材料上の適切な基と共有結合的に反応す
るために使用できる官能基または反応基を含み得る。それらはｐＨ非感受性であ
り、それ故それらは蛍光検出応用で使用できる有用な蛍光ラベリング試薬の範囲
を拡張する。
非常に蛍光性の色素化合物を提供する。それらは、トリメチンシアニンクロモホ
アに基づき、蛍光の高い量子収率を与える硬質構造を有する。さらにそれらは、
生物学的分子のような標的材料及び他の材料上の適切な基と共有結合的に反応す
るために使用できる官能基または反応基を含み得る。それらはｐＨ非感受性であ
り、それ故それらは蛍光検出応用で使用できる有用な蛍光ラベリング試薬の範囲
を拡張する。
【０００９】
従って本発明は、Ｒ2−Ｒ9基によって任意に置換された式（２）の化合物を提
供する：
供する：
【化６】 式中、Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ9基は、Ｘ及びＹを含む環に結合し、または任意にＺ a 及びＺb環構造の原子に結合し； Ｒ2からＲ9は同じまたは異なり、−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10を含み、Ｒ10は、水溶性
を減少する中性基、水溶性を増大する極性基、ラベリング反応において使用でき
る官能基、反応基、蛍光分子の吸収及び放射波長をシフトする電子供与及び吸引
基、脂質及び炭化水素溶解性基から選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状
Ｃ1-20アルキル鎖、Ｃ2-20モノエーテルまたはポリエーテル、及び４個までの第
二級アミド結合を含むＣ2-20原子鎖より成る群から選択され； Ｒ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロ ゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アミノ、アセタール、ケタール、ホスホリル
、スルフヒドリル、水溶性基、並びにアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル置換アミノ、第
四級アミノ、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、アセタール、ケタール、
ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スル
ファート、カルボキシラート、アミド、ニトロ、及びアミノ、ヒドロキシル、ア
ルデヒド、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基によって任意に置
換されたアルキル基から選択され； Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ11から選択され、式中Ｒ11は置換されたアミノ基であり；
を減少する中性基、水溶性を増大する極性基、ラベリング反応において使用でき
る官能基、反応基、蛍光分子の吸収及び放射波長をシフトする電子供与及び吸引
基、脂質及び炭化水素溶解性基から選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状
Ｃ1-20アルキル鎖、Ｃ2-20モノエーテルまたはポリエーテル、及び４個までの第
二級アミド結合を含むＣ2-20原子鎖より成る群から選択され； Ｒ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロ ゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アミノ、アセタール、ケタール、ホスホリル
、スルフヒドリル、水溶性基、並びにアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル置換アミノ、第
四級アミノ、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、アセタール、ケタール、
ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スル
ファート、カルボキシラート、アミド、ニトロ、及びアミノ、ヒドロキシル、ア
ルデヒド、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基によって任意に置
換されたアルキル基から選択され； Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ11から選択され、式中Ｒ11は置換されたアミノ基であり；
【化７】 式中、Ｒ’は、水素、Ｃ1-4アルキル及びアリールから選択され、Ｒ”は、Ｃ1-1 8 アルキル、アリール、ヘテロアリール、２−７の炭素原子を有するアシル基、 及びチオカルバモイル基から選択される。
【００１０】 Ｘ及びＹは、同じまたは異なってもよく、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル、並びに炭素
、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗで置換されたＣ4−Ｃ5スピロア
ルキルから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ2）nＲ12基か
ら選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ12は水素、アミノ、アルデ
ヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒド
ロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノ
、第四級アミノ、ニトロ、第一級アミド、置換されたアミド、並びにアミノ、ヒ
ドロキシル、カルボニル、ホスホリル及びスルフヒドリル基と反応性の基から選
択され； Ｚa及びＺbのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環
を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに
任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択された５または６の原子を有し
； Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、標的材料
上の官能基と共有結合反応するための反応基を含み、または標的材料上の反応基
と共有結合反応するための官能基を含み、または Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ1 −Ｒ9は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである。
、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗで置換されたＣ4−Ｃ5スピロア
ルキルから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ2）nＲ12基か
ら選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ12は水素、アミノ、アルデ
ヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒド
ロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノ
、第四級アミノ、ニトロ、第一級アミド、置換されたアミド、並びにアミノ、ヒ
ドロキシル、カルボニル、ホスホリル及びスルフヒドリル基と反応性の基から選
択され； Ｚa及びＺbのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環
を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに
任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択された５または６の原子を有し
； Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、標的材料
上の官能基と共有結合反応するための反応基を含み、または標的材料上の反応基
と共有結合反応するための官能基を含み、または Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ1 −Ｒ9は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである。
【００１１】 好ましいＲ10基は、以下のものから選択される：水素、ハロゲン、アミド、Ｃ 1 −Ｃ6アルコキシ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホナート
、第四級アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホ
ナート、任意に置換されたアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、カ
ルボニル、例えばスクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、アンヒドリ
ド、ハロアセトアミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト
、酸性ハライド、アルキルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドといっ
た反応基；並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフ
ヒドリル基と反応性の基。
、第四級アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホ
ナート、任意に置換されたアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、カ
ルボニル、例えばスクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、アンヒドリ
ド、ハロアセトアミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト
、酸性ハライド、アルキルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドといっ
た反応基；並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフ
ヒドリル基と反応性の基。
【００１２】 好ましくはＲ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ハロゲン、２ ６以下の炭素原子のアルキル基、−（ＣＨ2）nＱから選択され、式中１＜ｎ＜２
６であり、Ｑはアミノ、アルデヒド、スルフヒドリル、ヒドロキシル、及びアミ
ノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル又はスルフヒドリルと反応性の基か
ら選択され、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4及びＲ5は水素である。
６であり、Ｑはアミノ、アルデヒド、スルフヒドリル、ヒドロキシル、及びアミ
ノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル又はスルフヒドリルと反応性の基か
ら選択され、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4及びＲ5は水素である。
【００１３】 適切なＲ12は、水素、アミノ、スルホナート、カルボキシラート、アリール、
ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホスホリル、またはス
ルフヒドリル基と反応性の基から選択される。
ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホスホリル、またはス
ルフヒドリル基と反応性の基から選択される。
【００１４】 ビス−置換炭素は、ビスＣ1−Ｃ4アルキル基及びＣ4−Ｃ5スピロアルキル基を
含む。
含む。
【００１５】 アルキルは、１−２６の炭素原子を含む、適切には１−１２の炭素原子、好ま
しくは１−６の炭素原子を含む直鎖状または分枝状鎖アルキル基である。
しくは１−６の炭素原子を含む直鎖状または分枝状鎖アルキル基である。
【００１６】 アリールは、６−１０の炭素原子を含む一つまたは二つの融合した芳香族環を
含む芳香族置換基であり、例えばフェニルまたはナフチルである。アリールは、
場合により且つ独立して、上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一つ以
上の基によって置換されてもよい。
含む芳香族置換基であり、例えばフェニルまたはナフチルである。アリールは、
場合により且つ独立して、上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一つ以
上の基によって置換されてもよい。
【００１７】 ヘテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択され得る少なくとも１且つ３以下の
ヘテロ原子を含む一または二環式５−１０員環芳香族環系である。ヘテロアリー
ルは、場合により且つ独立して上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一
つ以上の基によって置換されてもよい。
ヘテロ原子を含む一または二環式５−１０員環芳香族環系である。ヘテロアリー
ルは、場合により且つ独立して上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一
つ以上の基によって置換されてもよい。
【００１８】 アラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基によって置換されたＣ1−Ｃ6 アルキル基である。
【００１９】 ハロゲン及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択されたもので
ある。
ある。
【００２０】 Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基、並びにＲ基が反応するであろう基の特異的な例は、表１
に提供される。代わりに、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基は、標的分子の反応基と反応する
であろう表１の官能基であってもよい。 表１：考え得る反応性置換基及びその反応性の部位
に提供される。代わりに、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基は、標的分子の反応基と反応する
であろう表１の官能基であってもよい。 表１：考え得る反応性置換基及びその反応性の部位
【表１】
【００２１】 表１に挙げられた基に加えて、数多くの他の基が、本発明の化合物のＲ1−Ｒ9 及びＲ11部位において反応性の置換基として考慮される。例えば、利用可能なア
ミノ及びヒドロキシ官能基を有する標的構成成分をラベルするために特に有用で
ある反応基は、以下のものを含む：
ミノ及びヒドロキシ官能基を有する標的構成成分をラベルするために特に有用で
ある反応基は、以下のものを含む：
【化８】 式中、ｎ＝０または１−１０の整数であり、Ｒ13またはＲ14の少なくとも一つは
、Ｉ、ＢｒまたはＣｌのような脱離基である。
、Ｉ、ＢｒまたはＣｌのような脱離基である。
【００２２】 利用可能なスルフヒドリル官能基で標的構成要素をラベルするために特に有用
な考え得るＲ1−Ｒ9及びＲ11基の特異的な例は、以下のものを含む：
な考え得るＲ1−Ｒ9及びＲ11基の特異的な例は、以下のものを含む：
【化９】 式中、ｎ＝０または１−１０の整数であり、Ｒ15は、ＩまたはＢｒのような脱離
基である。
基である。
【００２３】 光活性化架橋によって標的構成成分をラベルするために特に有用なＲ1−Ｒ9及
びＲ11官能基の特異的な例は、以下のものを含む：
びＲ11官能基の特異的な例は、以下のものを含む：
【化１０】
【００２４】 水溶性を増大する、またはサンプル中の不適切な構成成分に対する蛍光的にラ
ベルされた構成成分の非所望の非特異的結合を減少する目的のために、または蛍
光のクエンチングを導くであろうラベルされた構成成分上の二つ以上の反応性ク
ロモホアの間の相互作用を減少するために、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11官能基は、周知の
極性及び電気的に荷電した化学基から選択できる。上記基の例は−Ｅ−Ｆ−であ
り、ここでＦは、ヒドロキシ、スルホナート、スルファート、カルボキシラート
、置換されたアミノまたは第四級アミノであり、Ｅは、ｎが０−６である−（Ｃ
Ｈ2）n−のようなスペーサー基である。−Ｅ−Ｆ−基の有用な例は、−（ＣＨ2 ）3ＳＯ3及び−（ＣＨ2）4ＳＯ3のようなＣ1-6アルキルスルホナートを含む。
ベルされた構成成分の非所望の非特異的結合を減少する目的のために、または蛍
光のクエンチングを導くであろうラベルされた構成成分上の二つ以上の反応性ク
ロモホアの間の相互作用を減少するために、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11官能基は、周知の
極性及び電気的に荷電した化学基から選択できる。上記基の例は−Ｅ−Ｆ−であ
り、ここでＦは、ヒドロキシ、スルホナート、スルファート、カルボキシラート
、置換されたアミノまたは第四級アミノであり、Ｅは、ｎが０−６である−（Ｃ
Ｈ2）n−のようなスペーサー基である。−Ｅ−Ｆ−基の有用な例は、−（ＣＨ2 ）3ＳＯ3及び−（ＣＨ2）4ＳＯ3のようなＣ1-6アルキルスルホナートを含む。
【００２５】 蛍光色、水溶性、及び反応基または官能基の位置を調節するための能力を示す
本発明の例示的な化合物は、以下のものである。 i) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチ
ル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジ
ン-5-イウム（化合物Ｉ）； ii) 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-
9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c'
]ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）； iii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c
']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）； iv) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c
']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）； v) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c
']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）； vi) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,
16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2
-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）； vii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-
7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c]ジピリジン-5-
イウム（化合物ＶＩＩ）； viii) 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベ ンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,
2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）； ix) 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニ リノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピ リド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）； x) 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キ ノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イ
ウム（化合物Ｘ）。
本発明の例示的な化合物は、以下のものである。 i) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチ
ル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジ
ン-5-イウム（化合物Ｉ）； ii) 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-
9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c'
]ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）； iii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c
']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）； iv) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c
']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）； v) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c
']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）； vi) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,
16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2
-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）； vii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-
7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c]ジピリジン-5-
イウム（化合物ＶＩＩ）； viii) 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベ ンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,
2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）； ix) 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニ リノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピ リド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）； x) 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キ ノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イ
ウム（化合物Ｘ）。
【００２６】 ここで提供される基は、本発明の化合物のＲ部位で取り込まれ得る基の全ての
包含物を意味しない。本発明の化合物によってラベルされる材料上の基と反応す
るであろう各種の他の基が存在すると解されよう。Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位での上記
他の基の取り込みによって生産される化合物は、本発明によって包含されるもの
と企図される。
包含物を意味しない。本発明の化合物によってラベルされる材料上の基と反応す
るであろう各種の他の基が存在すると解されよう。Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位での上記
他の基の取り込みによって生産される化合物は、本発明によって包含されるもの
と企図される。
【００２７】 本発明の化合物は、数多くの生物学的及び非生物学的応用で使用され得る。非
生物学的応用に関しては、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で一つ以上の非電荷基を有する本
発明の化合物、例えばＣ1-26アルキル及びアリール部分が、非極性材料に蛍光特
性を提供するために該材料中に溶解され得る。上記非極性材料は、例えば塗料、
ポリマー、ワックス、油、インク及び炭化水素溶媒を含む。本発明の別の非生物
学的応用は、極性溶媒、または例えば水、エチレングリコール、メチルアルコー
ル、若しくは水とメチルアルコールの混合物のような他の材料中に、Ｒ1−Ｒ9及
びＲ11位で一つ以上の電荷及び／または極性基を有する本発明の化合物を溶解す
ることである。上記電荷Ｒ基は、例えば−ＮＲ3 +、−ＳＯ3 -、−ＰＯ3 -及び−Ｃ
ＯＯ-を含む一方で、上記極性Ｒ基は、例えばヒドロキシル基を含む。生物学的 応用に関しては、生物学的分子は、本発明の複合体を使用して非共有結合的にラ
ベルされ得る。例えば、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば第四級ア
ミノといった電荷を含む場合の本発明の複合体は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡのよ
うな電荷生物学的分子を非共有結合するために使用され得る。さらに、少なくと
も一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば長鎖アルキルといった非電荷基である場合
の本発明の化合物は、例えば生物学的脂質のような非電荷生物学的分子を結合す
るために使用され得る。
生物学的応用に関しては、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で一つ以上の非電荷基を有する本
発明の化合物、例えばＣ1-26アルキル及びアリール部分が、非極性材料に蛍光特
性を提供するために該材料中に溶解され得る。上記非極性材料は、例えば塗料、
ポリマー、ワックス、油、インク及び炭化水素溶媒を含む。本発明の別の非生物
学的応用は、極性溶媒、または例えば水、エチレングリコール、メチルアルコー
ル、若しくは水とメチルアルコールの混合物のような他の材料中に、Ｒ1−Ｒ9及
びＲ11位で一つ以上の電荷及び／または極性基を有する本発明の化合物を溶解す
ることである。上記電荷Ｒ基は、例えば−ＮＲ3 +、−ＳＯ3 -、−ＰＯ3 -及び−Ｃ
ＯＯ-を含む一方で、上記極性Ｒ基は、例えばヒドロキシル基を含む。生物学的 応用に関しては、生物学的分子は、本発明の複合体を使用して非共有結合的にラ
ベルされ得る。例えば、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば第四級ア
ミノといった電荷を含む場合の本発明の複合体は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡのよ
うな電荷生物学的分子を非共有結合するために使用され得る。さらに、少なくと
も一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば長鎖アルキルといった非電荷基である場合
の本発明の化合物は、例えば生物学的脂質のような非電荷生物学的分子を結合す
るために使用され得る。
【００２８】 別法として、本発明の化合物は、該複合体を含むポリマーの形成に適した重合
可能基を含んでもよい。適切な重合可能基は、アクリラート、メタクリラート、
アクリルアミド、ビニル及びスチリルから選択される。重合は、蛍光化合物を含
むコポリマーを形成するために、スチレンまたはビニルトルエンのような第二の
重合可能モノマー開始材料で接合されるように使用される本発明の適切な誘導化
化合物で実施され得る。別法として、本発明の蛍光化合物は、重合可能基を有す
る必要がなく、例えば該化合物は、重合または粒子形成の間に取り込まれ、また
はポリマー粒子内若しくはその上に吸着されてもよい。
可能基を含んでもよい。適切な重合可能基は、アクリラート、メタクリラート、
アクリルアミド、ビニル及びスチリルから選択される。重合は、蛍光化合物を含
むコポリマーを形成するために、スチレンまたはビニルトルエンのような第二の
重合可能モノマー開始材料で接合されるように使用される本発明の適切な誘導化
化合物で実施され得る。別法として、本発明の蛍光化合物は、重合可能基を有す
る必要がなく、例えば該化合物は、重合または粒子形成の間に取り込まれ、また
はポリマー粒子内若しくはその上に吸着されてもよい。
【００２９】 本発明の色素はまた、Boyer及びMorganに対する米国特許第4916711号に示され
る方法に従ってレーザー色素として使用され得る。レーザー色素は蛍光でなけれ
ばならず、０．５６または０．５７より大きい量子収率を有さなければならず、
且つかなり光安定性でなければならない。本発明の化合物は、これらの必要性の
それぞれを満たす。さらに本発明の色素は、織り込み色素、写真用色素、及び有
機伝導体として使用され得る。
る方法に従ってレーザー色素として使用され得る。レーザー色素は蛍光でなけれ
ばならず、０．５６または０．５７より大きい量子収率を有さなければならず、
且つかなり光安定性でなければならない。本発明の化合物は、これらの必要性の
それぞれを満たす。さらに本発明の色素は、織り込み色素、写真用色素、及び有
機伝導体として使用され得る。
【００３０】 本発明の化合物はまた、標的材料に対して蛍光特性を与えるために、標的材料
を共有結合ラベルして使用され得る。本発明の化合物を使用する共有結合ラベリ
ングは、生物学的または非生物学的応用の何れにも利用され得る。非生物学的応
用においてラベルされ得る標的材料の例は、例えばセルロースベース材料（例え
ば紙を含む）、織物、石油ベース製品、写真用フィルム、ガラス、ポリマー並び
にゲル濾過及びクロマトグラフィー媒体を含む。
を共有結合ラベルして使用され得る。本発明の化合物を使用する共有結合ラベリ
ングは、生物学的または非生物学的応用の何れにも利用され得る。非生物学的応
用においてラベルされ得る標的材料の例は、例えばセルロースベース材料（例え
ば紙を含む）、織物、石油ベース製品、写真用フィルム、ガラス、ポリマー並び
にゲル濾過及びクロマトグラフィー媒体を含む。
【００３１】 本発明の化合物を使用する共有結合ラベリングは、上記定義されたような少な
くとも一つの官能基または反応基を有する標的で達成され得る。該標的は、標的
材料の官能基または反応基と共有結合できる上述のような反応基または官能基を
含む、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11を有するかなりの量の本発明の化合物
とインキュベーションされ得る。標的材料及び本発明の化合物は、該標的材料を
本発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下で十分な時間インキュベーシ
ョンされる。
くとも一つの官能基または反応基を有する標的で達成され得る。該標的は、標的
材料の官能基または反応基と共有結合できる上述のような反応基または官能基を
含む、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11を有するかなりの量の本発明の化合物
とインキュベーションされ得る。標的材料及び本発明の化合物は、該標的材料を
本発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下で十分な時間インキュベーシ
ョンされる。
【００３２】 Ｒ1−Ｒ9及びＲ11は、本発明の化合物が異なる標的化合物と反応し、及び／ま
たは異なるスペクトル特性を有し、それによって複数の分析で使用できる数多く
の関連化合物を提供するように選択され得るが、その場合単一のサンプル中の各
種の化合物の存在及び量は、検出された数多くの蛍光放射の波長及び強度に基づ
いて識別されなければならない。本発明の化合物は、Ｒ基の適切な選択によって
ラベルされる材料を含む水性、他の極性、または非極性媒体中に可溶性にされ得
る。
たは異なるスペクトル特性を有し、それによって複数の分析で使用できる数多く
の関連化合物を提供するように選択され得るが、その場合単一のサンプル中の各
種の化合物の存在及び量は、検出された数多くの蛍光放射の波長及び強度に基づ
いて識別されなければならない。本発明の化合物は、Ｒ基の適切な選択によって
ラベルされる材料を含む水性、他の極性、または非極性媒体中に可溶性にされ得
る。
【００３３】 本発明はまた、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で少なくとも一つの反応基を含む本発明の
化合物が、標的材料のアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、カルボ
キシル、スルフヒドリルまたは他の反応基と反応するラベリング法に関する。上
記標的材料は、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭化水素、一つ以上のアミ
ノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファー
ト及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化されたヌクレオチド、
並びに一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカル
ボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化
されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、毒素、粒子、プラス
チックまたはガラス表面及びポリマーよりなる群を制限することなく含む。本発
明の化合物はまた、EPA 747700に記載された型の蛍光共鳴エネルギー転移複合体
における使用、または蛍光偏光若しくは蛍光クエンチングベース応用のために、
さらなる蛍光または非蛍光化合物にカップリングするように使用され得る。
化合物が、標的材料のアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、カルボ
キシル、スルフヒドリルまたは他の反応基と反応するラベリング法に関する。上
記標的材料は、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭化水素、一つ以上のアミ
ノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファー
ト及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化されたヌクレオチド、
並びに一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカル
ボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化
されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、毒素、粒子、プラス
チックまたはガラス表面及びポリマーよりなる群を制限することなく含む。本発
明の化合物はまた、EPA 747700に記載された型の蛍光共鳴エネルギー転移複合体
における使用、または蛍光偏光若しくは蛍光クエンチングベース応用のために、
さらなる蛍光または非蛍光化合物にカップリングするように使用され得る。
【００３４】 上述の単一工程ラベリング法に加えて、本発明はまた、二工程ラベリング法に
関し、そこでは第一の工程において、本発明の化合物は、抗体のような一次構成
要素と共有結合で反応し、それによってラベルする。二工程法の第二または染色
工程において、蛍光ラベルされた一次構成要素は、抗体が特異的である抗原のよ
うな二次構成要素に対するプローブとして使用される。上記ラベルされた抗体の
標的が細胞である場合、該方法の第二の工程は、該細胞の蛍光の強度を測定する
ことによってその型の細胞に結合するラベル抗体の量を測定するために使用され
得る。この二工程法によって、本発明の蛍光化合物と、第一の工程で共有結合で
ラベルされたモノクローナル抗体及び他の構成要素が、抗原プローブとして使用
できる。
関し、そこでは第一の工程において、本発明の化合物は、抗体のような一次構成
要素と共有結合で反応し、それによってラベルする。二工程法の第二または染色
工程において、蛍光ラベルされた一次構成要素は、抗体が特異的である抗原のよ
うな二次構成要素に対するプローブとして使用される。上記ラベルされた抗体の
標的が細胞である場合、該方法の第二の工程は、該細胞の蛍光の強度を測定する
ことによってその型の細胞に結合するラベル抗体の量を測定するために使用され
得る。この二工程法によって、本発明の蛍光化合物と、第一の工程で共有結合で
ラベルされたモノクローナル抗体及び他の構成要素が、抗原プローブとして使用
できる。
【００３５】 本発明の化合物は、系における特定のタンパク質または他の構成要素の濃度を
測定するために使用され得る。もしプローブと反応できるタンパク質の反応基の
数が周知であれば、分子当たりの蛍光は周知となり得、系におけるこれらの分子
の濃度は、系の全蛍光強度によって測定できる。この特定の方法は、ミクロタイ
タープレートリーダーまたは他の周知の免疫学的蛍光検出システムを使用して、
各種のラベル化分析物の濃度を測定するために使用できる。
測定するために使用され得る。もしプローブと反応できるタンパク質の反応基の
数が周知であれば、分子当たりの蛍光は周知となり得、系におけるこれらの分子
の濃度は、系の全蛍光強度によって測定できる。この特定の方法は、ミクロタイ
タープレートリーダーまたは他の周知の免疫学的蛍光検出システムを使用して、
各種のラベル化分析物の濃度を測定するために使用できる。
【００３６】 本発明の化合物はまた、例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベース法
、蛍光存続期間を使用して、または蛍光偏光測定によって、分析物の検出及び測
定のための蛍光ラベルを使用するアッセイ方法体系において有用である。
、蛍光存続期間を使用して、または蛍光偏光測定によって、分析物の検出及び測
定のための蛍光ラベルを使用するアッセイ方法体系において有用である。
【００３７】 生物学的系における蛍光共鳴エネルギー転移色素ペアの使用は周知であり、そ
れらはＦＲＥＴを使用するアッセイにおける結合現象または切断反応の検出にお
いて使用されている。上記アッセイの例は、平衡結合アッセイ（例えばイムノア
ッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、タンパク質結合アッセイ及びホ
ルモンレセプターアッセイ）、及びタンパク質溶解性切断アッセイ、ヌクレアー
ゼによるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の切断、若しくはリパーゼによる脂質の切断の
ような酵素アッセイを含む。
れらはＦＲＥＴを使用するアッセイにおける結合現象または切断反応の検出にお
いて使用されている。上記アッセイの例は、平衡結合アッセイ（例えばイムノア
ッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、タンパク質結合アッセイ及びホ
ルモンレセプターアッセイ）、及びタンパク質溶解性切断アッセイ、ヌクレアー
ゼによるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の切断、若しくはリパーゼによる脂質の切断の
ような酵素アッセイを含む。
【００３８】 本発明の化合物を利用する結合アッセイは、特異的結合ペアの一つの構成要素
を、特異的結合ペアの第二の構成要素と結合させることによって実施でき、第一
の構成要素は本発明に従った蛍光ドナー色素でラベルされ、第二の構成要素は蛍
光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされ、第一及び第二の構成
要素の間のエネルギー転移関係をもたらし、そして放射された蛍光の測定により
第一及び第二の構成要素の結合を検出する。特異的結合ペアの例は、抗体／抗原
、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／アビジン（ストレプタビジン）、ホルモ
ン／レセプター、酵素／基質または共因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及
びＤＮＡ／ 結合タンパク質を制限することなく含む。本発明において、本発明 の色素が特異的な結合ペアの一つの構成要素をラベルするために使用され得、次
いで該一つの構成要素が他の構成要素に対する結合の検出において使用され得る
ように、互いに対して特異的な結合親和性を有するいずれかの分子が使用され得
る。
を、特異的結合ペアの第二の構成要素と結合させることによって実施でき、第一
の構成要素は本発明に従った蛍光ドナー色素でラベルされ、第二の構成要素は蛍
光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされ、第一及び第二の構成
要素の間のエネルギー転移関係をもたらし、そして放射された蛍光の測定により
第一及び第二の構成要素の結合を検出する。特異的結合ペアの例は、抗体／抗原
、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／アビジン（ストレプタビジン）、ホルモ
ン／レセプター、酵素／基質または共因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及
びＤＮＡ／ 結合タンパク質を制限することなく含む。本発明において、本発明 の色素が特異的な結合ペアの一つの構成要素をラベルするために使用され得、次
いで該一つの構成要素が他の構成要素に対する結合の検出において使用され得る
ように、互いに対して特異的な結合親和性を有するいずれかの分子が使用され得
る。
【００３９】 本発明の色素はまた、酵素切断アッセイフォーマットにおいて使用され得、そ
の場合例えばペプチドといった酵素基質は二つの構成要素を含み、その一方は本
発明の蛍光ドナー色素でラベルされ、他方は蛍光（またはクエンチング）アクセ
プター色素でラベルされ、切断される基質結合のそれぞれの側のエネルギー転移
関係において基質に結合する。周知のまたは推定の酵素インヒビター化合物は、
反応混合物において任意に含まれる。酵素による基質の切断は、ドナー及びアク
セプター色素の分離を引き起こし、ドナー及びアクセプター種の共鳴エネルギー
転移の損失及び蛍光放射の変化を導く。
の場合例えばペプチドといった酵素基質は二つの構成要素を含み、その一方は本
発明の蛍光ドナー色素でラベルされ、他方は蛍光（またはクエンチング）アクセ
プター色素でラベルされ、切断される基質結合のそれぞれの側のエネルギー転移
関係において基質に結合する。周知のまたは推定の酵素インヒビター化合物は、
反応混合物において任意に含まれる。酵素による基質の切断は、ドナー及びアク
セプター色素の分離を引き起こし、ドナー及びアクセプター種の共鳴エネルギー
転移の損失及び蛍光放射の変化を導く。
【００４０】 エネルギー転移色素ペアを形成する本発明の色素と組み合わせ得る適切な蛍光
アクセプター色素は、ローダミン及びシアニン色素を含む。特に好ましい色素は
シアニン色素であり、Ｃｙ５（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3
'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-ジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５（1-(ε- カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-4,5,4',5'-(1,3-ジス
ルホナト)-ジベンゾ-ジカルボシアニン）及びＣｙ７（1-(ε-カルボキシペンチ ル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-トリカルボシアニ ン）を含む。適切なクエンチングアクセプター色素は、ＤＡＢＣＹＬ（4-(4-ジ メチルアミノフェニル)アゾ安息香酸）である。
アクセプター色素は、ローダミン及びシアニン色素を含む。特に好ましい色素は
シアニン色素であり、Ｃｙ５（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3
'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-ジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５（1-(ε- カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-4,5,4',5'-(1,3-ジス
ルホナト)-ジベンゾ-ジカルボシアニン）及びＣｙ７（1-(ε-カルボキシペンチ ル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-トリカルボシアニ ン）を含む。適切なクエンチングアクセプター色素は、ＤＡＢＣＹＬ（4-(4-ジ メチルアミノフェニル)アゾ安息香酸）である。
【００４１】 本発明の色素はまた、蛍光偏光測定を利用する結合アッセイまたは酵素切断ア
ッセイにおいて使用され得る。結合アッセイフォーマットにおいて、サンプル中
の分析物のアッセイは、分析物に対して特異的結合パートナーを提供することに
よって実施され、該特異的結合パートナーは本発明に従って色素でラベルされ、
ラベルされた特異的結合パートナーの蛍光偏光を測定し、分析物−特異的結合パ
ートナー複合体を形成するように分析物を結合するのに適した条件下で、ラベル
された特異的結合パートナーと分析物を接触させ、結合の度合を測定するために
ラベルされた分析物−特異的結合パートナー複合体の蛍光偏光を測定する。
ッセイにおいて使用され得る。結合アッセイフォーマットにおいて、サンプル中
の分析物のアッセイは、分析物に対して特異的結合パートナーを提供することに
よって実施され、該特異的結合パートナーは本発明に従って色素でラベルされ、
ラベルされた特異的結合パートナーの蛍光偏光を測定し、分析物−特異的結合パ
ートナー複合体を形成するように分析物を結合するのに適した条件下で、ラベル
された特異的結合パートナーと分析物を接触させ、結合の度合を測定するために
ラベルされた分析物−特異的結合パートナー複合体の蛍光偏光を測定する。
【００４２】 第二のフォーマットにおいて、酵素活性の検出のためのアッセイは、以下のよ
うに構築され得る。プロテアーゼ酵素及び本発明に従って色素でラベルされた蛍
光基質を組み合わせることによって、反応混合物を調製する。周知のまたは推定
のインヒビター化合物を、反応混合物に任意に含ませても良い。酵素による基質
の切断は、ラベル化断片の生産を導く。反応の進行は、蛍光偏光の変化を観察す
ることによってモニターされる。
うに構築され得る。プロテアーゼ酵素及び本発明に従って色素でラベルされた蛍
光基質を組み合わせることによって、反応混合物を調製する。周知のまたは推定
のインヒビター化合物を、反応混合物に任意に含ませても良い。酵素による基質
の切断は、ラベル化断片の生産を導く。反応の進行は、蛍光偏光の変化を観察す
ることによってモニターされる。
【００４３】 本発明の蛍光化合物はまた検出法において使用でき、その場合複数の蛍光化合
物が抗体のような複数の異なる一次構成要素に共有結合され、各一次構成要素は
、二次構成要素の混合物における複数の二次構成要素のそれぞれを同定するため
に、抗原のような異なる二次構成要素に特異的である。この方法の使用に従って
、一次構成要素のそれぞれは、他の一次構成要素をラベルするために使用される
色素分子と比較して、異なる光吸収及び放射波長特性を有する蛍光化合物で別々
にラベルされる。一次構成要素と称されるものは、抗原のような二次構成要素を
含む調製物に加えられ、一次構成要素は、それらが選択的であるそれぞれの二次
構成要素に結合させられる。
物が抗体のような複数の異なる一次構成要素に共有結合され、各一次構成要素は
、二次構成要素の混合物における複数の二次構成要素のそれぞれを同定するため
に、抗原のような異なる二次構成要素に特異的である。この方法の使用に従って
、一次構成要素のそれぞれは、他の一次構成要素をラベルするために使用される
色素分子と比較して、異なる光吸収及び放射波長特性を有する蛍光化合物で別々
にラベルされる。一次構成要素と称されるものは、抗原のような二次構成要素を
含む調製物に加えられ、一次構成要素は、それらが選択的であるそれぞれの二次
構成要素に結合させられる。
【００４４】 いずれかの非反応性のプローブは、分析物との干渉を避けるために、例えば洗
浄によって調製物から除去され得る。次いで該調製物は、特定の蛍光化合物の吸
収波長を含む一定範囲の励起波長にさらされる。次いで蛍光顕微鏡、またはフィ
ルター若しくはモノクロメーターを励起波長の光線を選択し、且つ蛍光の波長を
選択するようにさせたフローサイトメトリー若しくは蛍光分光光度計のような他
の蛍光検出システムを、利用される蛍光化合物に相当する放射波長の強度、特定
のラベル化一次構成要素と結合している二次構成要素の量を示す蛍光の強度を測
定するために使用する。複数のパラメーターの蛍光実験を実施するための周知の
方法は、例えば複数パラメーターフローサイトメトリーを含む。
浄によって調製物から除去され得る。次いで該調製物は、特定の蛍光化合物の吸
収波長を含む一定範囲の励起波長にさらされる。次いで蛍光顕微鏡、またはフィ
ルター若しくはモノクロメーターを励起波長の光線を選択し、且つ蛍光の波長を
選択するようにさせたフローサイトメトリー若しくは蛍光分光光度計のような他
の蛍光検出システムを、利用される蛍光化合物に相当する放射波長の強度、特定
のラベル化一次構成要素と結合している二次構成要素の量を示す蛍光の強度を測
定するために使用する。複数のパラメーターの蛍光実験を実施するための周知の
方法は、例えば複数パラメーターフローサイトメトリーを含む。
【００４５】 特定の場合において、単一の励起波長が、混合物中の二つ以上の材料から蛍光
を励起するために使用でき、その場合それぞれは異なる波長で蛍光を生じ、各ラ
ベル化種の量は、それぞれの放射波長での個々の蛍光強度を検出することによっ
て測定できる。所望であれば、光吸収法もまた使用できる。
を励起するために使用でき、その場合それぞれは異なる波長で蛍光を生じ、各ラ
ベル化種の量は、それぞれの放射波長での個々の蛍光強度を検出することによっ
て測定できる。所望であれば、光吸収法もまた使用できる。
【００４６】 本発明の検出法は、蛍光一次構成要素の作成が可能であるいずれかの系に適用
できる。例えば、適切な反応性の蛍光化合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片に接合
され、次いで生じた接合物はＤＮＡまたはＲＮＡの相補的標的鎖への結合を生ず
る。次いで適切な蛍光検出装置が、結合した蛍光接合物の存在を検出するために
使用できる。
できる。例えば、適切な反応性の蛍光化合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片に接合
され、次いで生じた接合物はＤＮＡまたはＲＮＡの相補的標的鎖への結合を生ず
る。次いで適切な蛍光検出装置が、結合した蛍光接合物の存在を検出するために
使用できる。
【００４７】 本発明はまた、本発明の化合物と、例えばタンパク質、ペプチド、炭化水素、
核酸、誘導化された核酸、脂質、特定の他の生物学的分子、生物学的細胞、可溶
性ポリマー、ポリマー粒子、ポリマー膜、ガラス表面及び他の粒子と表面のよう
な材料のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、ホスホリルまたは
他の周知の官能基の間の共有結合反応に関する。蛍光の検出は非常に鋭敏な光学
的方法を含むため、これらの色素「ラベル」の存在は、ラベルが非常に少量で存
在する場合にさえ検出及び定量できる。それ故、色素ラベリング試薬は、ラベル
されている材料の量を測定するために使用できる。
核酸、誘導化された核酸、脂質、特定の他の生物学的分子、生物学的細胞、可溶
性ポリマー、ポリマー粒子、ポリマー膜、ガラス表面及び他の粒子と表面のよう
な材料のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、ホスホリルまたは
他の周知の官能基の間の共有結合反応に関する。蛍光の検出は非常に鋭敏な光学
的方法を含むため、これらの色素「ラベル」の存在は、ラベルが非常に少量で存
在する場合にさえ検出及び定量できる。それ故、色素ラベリング試薬は、ラベル
されている材料の量を測定するために使用できる。
【００４８】 例えばフルオレセインと比較して、本発明の硬化トリエチンシアニンは、特に
光安定であり、ｐＨ２からｐＨ１０の間のｐＨ変化に非感受性である。本発明の
化合物は、最大４５０から６００ｎｍ（スペクトルの緑からオレンジ領域）の間
の波長で光を吸収し且つ放射し、それ故テキサスレッド、ローダミン、テトラメ
チルローダミン、Ｘ−ローダミン、ＢＯＤＩＰＴ及びフルオレセインの代替物と
なる。
光安定であり、ｐＨ２からｐＨ１０の間のｐＨ変化に非感受性である。本発明の
化合物は、最大４５０から６００ｎｍ（スペクトルの緑からオレンジ領域）の間
の波長で光を吸収し且つ放射し、それ故テキサスレッド、ローダミン、テトラメ
チルローダミン、Ｘ−ローダミン、ＢＯＤＩＰＴ及びフルオレセインの代替物と
なる。
【００４９】 本発明は、任意にＲ2−Ｒ9基によって置換された以下の式（Ａ）の化合物を処
理することを含む式（２）の化合物の調製法を提供する：
理することを含む式（２）の化合物の調製法を提供する：
【化１１】 式中、Ｘ、Ｙ、Ｚa、Ｚb及びＲ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ9 は上記記載され、Ｒは酢酸のような穏やかな酸性溶液中でメチルまたはエチルで
ある。適切には反応混合物は、還流条件下で加熱され、その際硬化カルボシアニ
ン色素は溶液から沈殿する。別法として該反応は、硫酸のようなより強力な鉱物
酸溶液で、例えば環境温度といったより低温で実施され得る。クロロホルムのよ
うな溶媒で反応混合物に含まれることが有利であろう。
ある。適切には反応混合物は、還流条件下で加熱され、その際硬化カルボシアニ
ン色素は溶液から沈殿する。別法として該反応は、硫酸のようなより強力な鉱物
酸溶液で、例えば環境温度といったより低温で実施され得る。クロロホルムのよ
うな溶媒で反応混合物に含まれることが有利であろう。
【００５０】 本発明のアミノ及びヒドラジノ置換カルボシアニン色素の場合、これらは硬化
色素を調製するために使用される酸性溶液中に適切なアミンまたはヒドラジノ誘
導体を含ませることによって一般式（Ａ）の中間体から調製され得る。
色素を調製するために使用される酸性溶液中に適切なアミンまたはヒドラジノ誘
導体を含ませることによって一般式（Ａ）の中間体から調製され得る。
【００５１】 Ｘ及びＹが同一でありＺa及びＺb構造が同一である構造式（Ａ）の対称な化合
物は、任意にＲ2、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7基によって置換された構造式（Ｂ）の化合物
を反応させることによって調製され得る：
物は、任意にＲ2、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7基によって置換された構造式（Ｂ）の化合物
を反応させることによって調製され得る：
【化１２】 式中、Ｚa及びＸ、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ6及びＲ7は上述のように定義され、Ｒは非硬化 トリメチンを調製するために適切な溶媒媒体中でオルトギ酸エチルのような適切
なオルトエステルでメチルまたはエチルである。該反応は、還流下での加熱によ
ってピリジンのような溶媒中の溶液で適切に実施される。オルトエステルを適切
に置換することによって、接合したトリメチン鎖の中央または中間炭素原子は、
Ｒ1基によって表されるような各種の置換基で置換され得る。例えばオルト酢酸 エチルでの反応混合物中のオルトギ酸エチルの置換は、トリメチンシアニン色素
を生産し、そこで中間水素はメチル基で置換される。
なオルトエステルでメチルまたはエチルである。該反応は、還流下での加熱によ
ってピリジンのような溶媒中の溶液で適切に実施される。オルトエステルを適切
に置換することによって、接合したトリメチン鎖の中央または中間炭素原子は、
Ｒ1基によって表されるような各種の置換基で置換され得る。例えばオルト酢酸 エチルでの反応混合物中のオルトギ酸エチルの置換は、トリメチンシアニン色素
を生産し、そこで中間水素はメチル基で置換される。
【００５２】 Ｘ及びＹが異なる場合の構造式（Ａ）の非対称化合物は、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6 ，Ｚa及びＸが上述のように定義されるＲ5及びＲ6基で任意に置換された式（Ｂ ）の化合物を、Ｒ8及びＲ9基によって任意に置換された以下の式（Ｃ）の化合物
で反応することによって調製できる：
で反応することによって調製できる：
【化１３】 式中、Ｒ1，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ8，Ｒ9，Ｙ及びＺbは上述のように定義され、Ｒはメチ
ルまたはエチルのようなアルキル基であり、Ｒaはアセチル、プロピニル及びベ ンゾイルのようなアシル基であり、Ｒbは水素、メチル若しくはエチルのような アルキル基、またはフェニルのようなアリール基である。該反応は無水酢酸溶液
中で１：１のモル比で適切に実施される。
ルまたはエチルのようなアルキル基であり、Ｒaはアセチル、プロピニル及びベ ンゾイルのようなアシル基であり、Ｒbは水素、メチル若しくはエチルのような アルキル基、またはフェニルのようなアリール基である。該反応は無水酢酸溶液
中で１：１のモル比で適切に実施される。
【００５３】 中間体化合物（Ｂ）は、Ｘ、Ｚa、Ｒ6及びＲ7が上述のように定義される任意 にＲ6及びＲ7基によって置換された以下の式（Ｄ）の適切な複素環塩基のヒドロ
ハロゲン化物酸の塩を、Ｒ2及びＲ3が上述のように定義される以下の式（Ｅ）の
化合物で反応させることによって調製され得る：
ハロゲン化物酸の塩を、Ｒ2及びＲ3が上述のように定義される以下の式（Ｅ）の
化合物で反応させることによって調製され得る：
【化１４】
【化１５】 該反応は有利には、過剰な試薬（Ｅ）で、両者の試薬を溶解する穏やかな極性の
不活性溶媒中で実施されるが、該溶媒は反応生成物のための溶媒ではない。上記
媒体の例は、アセトニトリルのような溶媒である。反応は適切には、７０℃とい
った上昇した温度で実施される。酢酸のような酸が、反応を容易にするために反
応混合物に加えられても良い。特別の例として、Southwick等(Org. Prep. Proce
ed. Int. 20, 279-84, 1989)の方法によって調製された、(2,3,3-トリメチル-3H
-インドール-5-yl)-酢酸のヒドロブロミド塩が、溶媒として酢酸を含むアセトニ
トリル中のアセロレインジエチルアセタールと反応される。該反応は、適切には
７０℃の温度で実施される。
不活性溶媒中で実施されるが、該溶媒は反応生成物のための溶媒ではない。上記
媒体の例は、アセトニトリルのような溶媒である。反応は適切には、７０℃とい
った上昇した温度で実施される。酢酸のような酸が、反応を容易にするために反
応混合物に加えられても良い。特別の例として、Southwick等(Org. Prep. Proce
ed. Int. 20, 279-84, 1989)の方法によって調製された、(2,3,3-トリメチル-3H
-インドール-5-yl)-酢酸のヒドロブロミド塩が、溶媒として酢酸を含むアセトニ
トリル中のアセロレインジエチルアセタールと反応される。該反応は、適切には
７０℃の温度で実施される。
【００５４】 式（Ｃ）の中間体は、以下の式（Ｆ）のホルムアミドで２位にメチル置換基を
含む構造式（Ｂ）の化合物の反応によって調製され得る：
含む構造式（Ｂ）の化合物の反応によって調製され得る：
【化１６】 式中、Ｒ1及びＲbは上述のように定義され、Ｒcはフェニルまたは置換されたフ ェニルである。適切には該反応は、例えば無水酢酸、無水プロピオン酸または氷
冷酢酸といった酸縮合試薬を使用して、１．５モル過剰のホルムアミジンで構造
式（Ｂ）の第四級塩を縮合することによって実施される。無水酢酸は、該反応の
ための特に好ましい縮合試薬である。別法として縮合反応は、いずれかの添加物
なしで実施されても良い；しかしながら酸縮合は、トリメチン鎖の中央または中
間炭素原子で置換された硬化トリメチンシアニン色素の生産のために好ましい。
例えば英国特許第412309号参照。
冷酢酸といった酸縮合試薬を使用して、１．５モル過剰のホルムアミジンで構造
式（Ｂ）の第四級塩を縮合することによって実施される。無水酢酸は、該反応の
ための特に好ましい縮合試薬である。別法として縮合反応は、いずれかの添加物
なしで実施されても良い；しかしながら酸縮合は、トリメチン鎖の中央または中
間炭素原子で置換された硬化トリメチンシアニン色素の生産のために好ましい。
例えば英国特許第412309号参照。
【００５５】 （Ｄ）のような式の前駆体化合物は、当業者に周知の方法によって調製され得
る。例えば米国特許第4981977号参照で、この特許の全開示は参考として取り込 まれる。
る。例えば米国特許第4981977号参照で、この特許の全開示は参考として取り込 まれる。
【００５６】 式（２）の特定の化合物は、当業者に周知の方法によって式（２）の他の化合
物に変換するための中間体として有用であり得る。同様に、特定の中間体は、式
（２）の誘導体の合成のために有用であり得る。本発明の化合物は、ここに開示
された方法によって合成できる。特定の有用性を有する化合物の誘導体は、適切
な前駆体を選択することによって、または各種の位置で官能基を含むように周知
の方法によって生じた化合物を修飾することによってのいずれかで調製される。
例として、本発明の複合体は、蛍光ラベル化試薬を調製するために特定の反応基
を含むように修飾され得、または荷電若しくは極性基が極性または非極性溶媒ま
たは材料における該化合物の溶解性を増大するために加えられ得る。変換の例と
して、エステルがカルボン酸に変換され得、またはアミド誘導体に変換され得る
。
物に変換するための中間体として有用であり得る。同様に、特定の中間体は、式
（２）の誘導体の合成のために有用であり得る。本発明の化合物は、ここに開示
された方法によって合成できる。特定の有用性を有する化合物の誘導体は、適切
な前駆体を選択することによって、または各種の位置で官能基を含むように周知
の方法によって生じた化合物を修飾することによってのいずれかで調製される。
例として、本発明の複合体は、蛍光ラベル化試薬を調製するために特定の反応基
を含むように修飾され得、または荷電若しくは極性基が極性または非極性溶媒ま
たは材料における該化合物の溶解性を増大するために加えられ得る。変換の例と
して、エステルがカルボン酸に変換され得、またはアミド誘導体に変換され得る
。
【００５７】 以下のものは、本発明の化合物の合成の特異的な実施例、及びそれらの化合物
について観察されたスペクトルデータである。
について観察されたスペクトルデータである。
【００５８】
実施例１．6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラ
メチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピ
リジン-5-イウム（R-Cy3.12.OH; 化合物Ｉ）
メチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピ
リジン-5-イウム（R-Cy3.12.OH; 化合物Ｉ）
【化１７】 １．１ 5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドリン 5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドリンを、Southwick等, Org. Pre
p. Proceed. Int., 20, 274-84, (1989)の方法、または別法として以下に記載の
方法のいずれかによって調製した。
p. Proceed. Int., 20, 274-84, (1989)の方法、または別法として以下に記載の
方法のいずれかによって調製した。
【００５９】 ＜０℃で３：２の水：濃縮ＨＣｌ（３３ｍｌ）溶媒混合物中の4-アミノフェニ
ル酢酸（５ｇ、３３．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、水（４３ml）中の硝酸
ナトリウム（２．７ｇ、３９ｍｍｏｌ）の冷却（＜０℃）溶液を滴定して加えた
。次いで反応混合物を、さらに３０分間低温下で維持した。二酸化硫黄の飽和水
溶液（１４０ｍｌ）を加え、反応混合物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃
で数時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得られ
た黄色のヒドラジン中間生成物を酢酸（５４ml）中に再溶解し、酢酸カリウム（
７．０５ｇ、７１．８ｍｍｏｌ）及びメチル−イソプロピルケトン（６．８４ｇ
、７９．４ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温
め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した
。生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗
浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過して濃縮した。5-エトキシ カルボニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、赤色の固体として得た（４．８ ｇ、６７％）。精製は必要ではなかった；ｍ／ｚ(Maldi)：２１７。
ル酢酸（５ｇ、３３．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、水（４３ml）中の硝酸
ナトリウム（２．７ｇ、３９ｍｍｏｌ）の冷却（＜０℃）溶液を滴定して加えた
。次いで反応混合物を、さらに３０分間低温下で維持した。二酸化硫黄の飽和水
溶液（１４０ｍｌ）を加え、反応混合物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃
で数時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得られ
た黄色のヒドラジン中間生成物を酢酸（５４ml）中に再溶解し、酢酸カリウム（
７．０５ｇ、７１．８ｍｍｏｌ）及びメチル−イソプロピルケトン（６．８４ｇ
、７９．４ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温
め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した
。生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗
浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過して濃縮した。5-エトキシ カルボニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、赤色の固体として得た（４．８ ｇ、６７％）。精製は必要ではなかった；ｍ／ｚ(Maldi)：２１７。
【００６０】 １．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル-5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルイ ンドレイン、エチルエステル 環境温度でエタノール（４０ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチ ルインドレイン（２ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、臭化水素酸（４８％水
溶液の３．１６ｍｌ）を加えた。１時間後反応溶媒を真空下で除去した。ヒドロ
ブロミド塩を、アセトニトリル（４０ｍｌ）及び酢酸（４００ml）中に再溶解し
、アクロレインジエチルアセタール（１８．１７ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を加えた
。反応混合物を７０℃で２０分温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除
去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦ
Ａ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍ
カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は緑色の油として得られた（１
．２４ｇ、３６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：３７６．２。
溶液の３．１６ｍｌ）を加えた。１時間後反応溶媒を真空下で除去した。ヒドロ
ブロミド塩を、アセトニトリル（４０ｍｌ）及び酢酸（４００ml）中に再溶解し
、アクロレインジエチルアセタール（１８．１７ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を加えた
。反応混合物を７０℃で２０分温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除
去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦ
Ａ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍ
カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は緑色の油として得られた（１
．２４ｇ、３６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：３７６．２。
【００６１】 １．３ 5,5'-ジカルボキシメチル-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インド カルボシアニン-エチルエステル １２０℃でピリジン（１０ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル-5-カルボキ
シメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエーテル（３５６ｍｇ、０． ９５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、３０分でオルトギ酸（９８ｍｇ、６６ｍｍｏｌ）
を滴定して加えた。２時間後反応混合物を冷却した。生成物を、２０ｍｌ／分で
６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出
液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製
した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（２５１ｍｇ、３５％）；λma x ：５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７６１．４。
シメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエーテル（３５６ｍｇ、０． ９５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、３０分でオルトギ酸（９８ｍｇ、６６ｍｍｏｌ）
を滴定して加えた。２時間後反応混合物を冷却した。生成物を、２０ｍｌ／分で
６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出
液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製
した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（２５１ｍｇ、３５％）；λma x ：５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７６１．４。
【００６２】 １．４ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメ
チル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリ ジン-5-イウム 環境温度でクロロホルム（１０ｍｌ）中の5,5'-カルボキシメチル-1,1-ジ-(3,
3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエーテル（１００ｍｇ、
０．１３２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、５０％水性硫酸（２ｍｌ）を加えた。３０
分後、反応溶媒をクロロホルム（１０ｍｌ）で希釈し、水（３×１０ｍｌ）で洗
浄した。有機相をＮａＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過及び濃縮した。生成物を、 ２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１
００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬ
Ｃによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（６５ｍｇ、９
０％）；λmax：５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５３９．２。
チル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリ ジン-5-イウム 環境温度でクロロホルム（１０ｍｌ）中の5,5'-カルボキシメチル-1,1-ジ-(3,
3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエーテル（１００ｍｇ、
０．１３２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、５０％水性硫酸（２ｍｌ）を加えた。３０
分後、反応溶媒をクロロホルム（１０ｍｌ）で希釈し、水（３×１０ｍｌ）で洗
浄した。有機相をＮａＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過及び濃縮した。生成物を、 ２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１
００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬ
Ｃによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（６５ｍｇ、９
０％）；λmax：５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５３９．２。
【００６３】 １．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメ
チル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリ ジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル 環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、
０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、 ０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラ-2,14-カルボキシメチル-16
,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,
2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。
反応混合物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体へ
の変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラ ムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
チル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリ ジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル 環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、
０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、 ０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラ-2,14-カルボキシメチル-16
,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,
2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。
反応混合物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体へ
の変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラ ムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
【００６４】 １．６ タンパク質ラベリング法 化合物ＩのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルのストック溶液を、乾燥Ｄ
ＭＦ（１ｍｇ活性エステル／１００μｌ）中で調製した。ヒツジＩｇＧ（１ｍｇ
、６．４５ｍｍｏｌ）を２５０μｌ緩衝溶液（ｐＨ９．４）に溶解し、所望の量
の色素を強力なボルテックス混合の間に加えた。非接合色素を、溶出液としてｐ
Ｈ７の緩衝溶液を使用してゲル浸透クロマトグラフィー（Sephadex G-50の０． ７×２０ｃｍカラム）によってラベル化タンパク質から分離した。ラベル化抗体
溶液の吸収スペクトルを記録した（図１参照）。サンプルについてのタンパク質
に対する色素の割合を、５６０ｎｍでのラベル化色素の吸光度の値と２８０ｎｍ
でのタンパク質の吸光度の値を測定して、以下の等式を使用して決定した。 Ｄ Ａdye×Ｅprot ─── ＝ ───────────── Ｐ （Ａ280−ＸＡdye）×Ｅdye
ＭＦ（１ｍｇ活性エステル／１００μｌ）中で調製した。ヒツジＩｇＧ（１ｍｇ
、６．４５ｍｍｏｌ）を２５０μｌ緩衝溶液（ｐＨ９．４）に溶解し、所望の量
の色素を強力なボルテックス混合の間に加えた。非接合色素を、溶出液としてｐ
Ｈ７の緩衝溶液を使用してゲル浸透クロマトグラフィー（Sephadex G-50の０． ７×２０ｃｍカラム）によってラベル化タンパク質から分離した。ラベル化抗体
溶液の吸収スペクトルを記録した（図１参照）。サンプルについてのタンパク質
に対する色素の割合を、５６０ｎｍでのラベル化色素の吸光度の値と２８０ｎｍ
でのタンパク質の吸光度の値を測定して、以下の等式を使用して決定した。 Ｄ Ａdye×Ｅprot ─── ＝ ───────────── Ｐ （Ａ280−ＸＡdye）×Ｅdye
【００６５】 分母の因子Ｘは、最大の吸収（Ａdye）で色素の吸収のａ％である２８０ｎｍ での色素の吸光を説明する。Ｘの値は、硬質色素について０．１７である。
【００６６】 １．７ スペクトル特性の比較：硬化Ｃｙ３（化合物Ｉ）及び開いた鎖のＣｙ３ 硬化色素のスペクトル特性を、周知の開いた鎖のＣｙ３．１８ＯＨ及びＣｙ３
．１０ＯＨ色素と比較した（図２）。吸収及び放射スペクトルを図３及び４に示
す。硬質色素の吸収最大は、メタノール中で１２ｎｍまで赤色にシフトし、と即
されたようにそれは非硬質インドシアニンより１０−１２倍明るい。その結果が
以下の表２に示される。
．１０ＯＨ色素と比較した（図２）。吸収及び放射スペクトルを図３及び４に示
す。硬質色素の吸収最大は、メタノール中で１２ｎｍまで赤色にシフトし、と即
されたようにそれは非硬質インドシアニンより１０−１２倍明るい。その結果が
以下の表２に示される。
【表２】
【００６７】 色素の光ブリーチングを、同一の条件下で実験した。等濃度の色素（水中に１
．５×１０-5ｍｍｏｌ溶液の３ｍｌ）のサンプルを、５１４ｎｍのレーザー光線
（３０ｍＶ、直径１ｃｍの光線）にさらし、吸収を５０分間で数分間隔で記録し
た。その結果が図５に示される。硬化色素はより早くブリーチすると予測される
。しかしながら、その高い量子収率のため、硬化色素はフローサイトメトリー及
びサンプルが短い期間さらされる他のイメージング実験に適するであろう。
．５×１０-5ｍｍｏｌ溶液の３ｍｌ）のサンプルを、５１４ｎｍのレーザー光線
（３０ｍＶ、直径１ｃｍの光線）にさらし、吸収を５０分間で数分間隔で記録し
た。その結果が図５に示される。硬化色素はより早くブリーチすると予測される
。しかしながら、その高い量子収率のため、硬化色素はフローサイトメトリー及
びサンプルが短い期間さらされる他のイメージング実験に適するであろう。
【００６８】 実施例２．8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメ チル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）
,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）
【化１８】 ２．１ 6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニン 濃縮硫酸（５００ｍｌ）中の2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）-インドレニ ン（１００ｇ、４７８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を１８０℃で加熱した。２時間後、
該溶液を環境温度に冷却し、次いで氷上に注いだ。反応混合物を、５０％水酸化
ナトリウム（３０００ｍｌ）を加えることによって塩基性にした。生じた沈殿を
濾過し、自ら再結晶化し、乾燥させた。生成物を白色固体として得た（７．２５
ｇ、５４％）。
該溶液を環境温度に冷却し、次いで氷上に注いだ。反応混合物を、５０％水酸化
ナトリウム（３０００ｍｌ）を加えることによって塩基性にした。生じた沈殿を
濾過し、自ら再結晶化し、乾燥させた。生成物を白色固体として得た（７．２５
ｇ、５４％）。
【００６９】 ２．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベン
ズ（ゾ）インドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ
）インドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、
アセトニトリル（２ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１６９ｍｇ、
１．３ｍｍｏｌ）及び酢酸（１０μｌ）での6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H
-ベンズ（ゾ）インドレニン（２５ｍｇ、０．００８７ｍｍｏｌ）の反応によっ て調製した。分解が観察されたため、該化合物を精製しなかった。生成物はパー
ル上の黄色油として得られた。
ズ（ゾ）インドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ
）インドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、
アセトニトリル（２ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１６９ｍｇ、
１．３ｍｍｏｌ）及び酢酸（１０μｌ）での6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H
-ベンズ（ゾ）インドレニン（２５ｍｇ、０．００８７ｍｍｏｌ）の反応によっ て調製した。分解が観察されたため、該化合物を精製しなかった。生成物はパー
ル上の黄色油として得られた。
【００７０】 ２．３ 6,6'-ジスルホナト-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ） インド-カルボシアニン 6,6'-ジスルホナト-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカ
ルボシアニンを、セクション１．３に記載のものと類似の方法によってピリジン
（５ｍｌ）中のオルトギ酸トリエチル（５１．２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）と
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）
インドレニンの反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３０分間水／
アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、
Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生
成物は、ピンク／紫色の固体として得られた；λmax（ＭｅＯＨ）５８０ｎｍ； ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：８５２。
ルボシアニンを、セクション１．３に記載のものと類似の方法によってピリジン
（５ｍｌ）中のオルトギ酸トリエチル（５１．２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）と
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）
インドレニンの反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３０分間水／
アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、
Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生
成物は、ピンク／紫色の固体として得られた；λmax（ＭｅＯＨ）５８０ｎｍ； ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：８５２。
【００７１】 ２．４ 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチ ル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6
-c']ジピリジン-7-イウム 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,
10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジ ピリジン-7-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によっ て、クロロホルム（５ｍｌ）及び５０％硫酸（１ｍｌ）中の6,6'-ジスルホナト-
1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカルボシアニン（３ｍｇ
、０．０３５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３
０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を
使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精
製した。生成物は、発光性のピンク／紫色の固体として得られた；λmax（Ｍｅ ＯＨ）５９８ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６８４。
-c']ジピリジン-7-イウム 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,
10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジ ピリジン-7-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によっ て、クロロホルム（５ｍｌ）及び５０％硫酸（１ｍｌ）中の6,6'-ジスルホナト-
1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカルボシアニン（３ｍｇ
、０．０３５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３
０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を
使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精
製した。生成物は、発光性のピンク／紫色の固体として得られた；λmax（Ｍｅ ＯＨ）５９８ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６８４。
【００７２】 実施例３．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,1
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5
,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5
,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）
【化１９】 ３．１ 5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン 環境温度で酢酸（２０５ｍｌ）中の4-ヒドラジノベンゼンスルホン酸（６８ｇ
、３６１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、3-メチル-2-ブタノン（８８．４４ｇ、１０ ２７ｍｍｏｌ）を加えた。該反応物を還流下で加熱した。３時間後、該溶液を冷
却し、生じたピンク色の沈殿を濾過し、酢酸（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた
。生成物をメタノール（８００ｍｌ）中に再溶解し、イソプロパノール（２００
ｍｌ）中の水酸化カリウム（２０．４ｇ、３６４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得
られた黄色の固体を濾過し、乾燥させた（４８ｇ、５６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+ ）：２４０。
、３６１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、3-メチル-2-ブタノン（８８．４４ｇ、１０ ２７ｍｍｏｌ）を加えた。該反応物を還流下で加熱した。３時間後、該溶液を冷
却し、生じたピンク色の沈殿を濾過し、酢酸（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた
。生成物をメタノール（８００ｍｌ）中に再溶解し、イソプロパノール（２００
ｍｌ）中の水酸化カリウム（２０．４ｇ、３６４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得
られた黄色の固体を濾過し、乾燥させた（４８ｇ、５６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+ ）：２４０。
【００７３】 ３．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレ
ニン 1-ジエトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セク
ション１．２に記載されたものと類似の方法を使用して、アセトニトリル（４０
ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（８．５４ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）
及び酢酸（１ｍｌ）と、5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンカルシウ ム塩（１ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、２０ｍ
ｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾
配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによっ
て精製した。生成物は、緑色の油として得られた（７４０ｍｇ、５２％）；ｍ／
ｚ（ＦＡＢ+）：３７０．１。
ニン 1-ジエトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セク
ション１．２に記載されたものと類似の方法を使用して、アセトニトリル（４０
ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（８．５４ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）
及び酢酸（１ｍｌ）と、5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンカルシウ ム塩（１ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、２０ｍ
ｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾
配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによっ
て精製した。生成物は、緑色の油として得られた（７４０ｍｇ、５２％）；ｍ／
ｚ（ＦＡＢ+）：３７０．１。
【００７４】 ３．３ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-
フェノルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン 無水酢酸（２５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-
2,3,3-トリメチルインドレニン-エチルエステル（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏ ｌ）の攪拌溶液に、N,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍ ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１１０℃に温めた。３０分後、該溶液を冷却し
、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセト
ニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rain
in Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、パ
ール上の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+） ：５２１．２。
フェノルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン 無水酢酸（２５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-
2,3,3-トリメチルインドレニン-エチルエステル（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏ ｌ）の攪拌溶液に、N,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍ ｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１１０℃に温めた。３０分後、該溶液を冷却し
、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセト
ニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rain
in Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、パ
ール上の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+） ：５２１．２。
【００７５】 ３．４ 5-カルボキシメチル-5'-スルホナト-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル
)-インドカルボシアニン、エチルエステル 環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の、
5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニル
アミノ)エトキシ-2,3,3-トリメチルインドレニン（９６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ
）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中
の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)2,3,3-トリメチルインドレニン（ ６７．７ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７０
℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍ
ｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％
勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによ
って精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ、２４％）
；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７５５．３。
)-インドカルボシアニン、エチルエステル 環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の、
5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニル
アミノ)エトキシ-2,3,3-トリメチルインドレニン（９６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ
）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中
の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)2,3,3-トリメチルインドレニン（ ６７．７ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７０
℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍ
ｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％
勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによ
って精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ、２４％）
；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７５５．３。
【００７６】 ３．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,
18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6
-c']ジピリジン-5-イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テ トラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c'] ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によ って、クロロホルム（１０ｍｌ）と５０％硫酸（２ｍｌ）中の5-カルボキシメチ
ル-5'-スルホナト-1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エ チルエステル（３３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成
物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０
−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨ
ＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ
、２４％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５６１。
18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6
-c']ジピリジン-5-イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テ トラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c'] ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によ って、クロロホルム（１０ｍｌ）と５０％硫酸（２ｍｌ）中の5-カルボキシメチ
ル-5'-スルホナト-1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エ チルエステル（３３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成
物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０
−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨ
ＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ
、２４％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５６１。
【００７７】 ３．６ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,
18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6
-c']ジピリジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル 環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、
０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、 ０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル
-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a
,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍ ｍｏｌ）を加えた。反応物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステル誘導体への変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6
-c']ジピリジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル 環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、
０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、 ０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル
-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a
,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍ ｍｏｌ）を加えた。反応物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエ
ステル誘導体への変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
【００７８】 実施例４．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,1
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）
【化２０】 環境温度でジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（１ｍｇ、
０．００２４ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（０．８２ｍｇ 、０．００３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメ
チル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3
,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（１ｍｇ、０．００１ ８ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、グリシン（０．２ｍｇ、０．００２７ｍｍｏ
ｌ）を加え、該溶液をさらに３時間攪拌した。生成物を、４ｍｌ／分で水／アセ
トニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phen
omenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物
は、ピンク色の固体として得られた（０．２２ｍｇ、３０％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌ
ｄｉ）：６１８。
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（１ｍｇ、
０．００２４ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（０．８２ｍｇ 、０．００３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメ
チル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3
,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（１ｍｇ、０．００１ ８ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、グリシン（０．２ｍｇ、０．００２７ｍｍｏ
ｌ）を加え、該溶液をさらに３時間攪拌した。生成物を、４ｍｌ／分で水／アセ
トニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phen
omenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物
は、ピンク色の固体として得られた（０．２２ｍｇ、３０％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌ
ｄｉ）：６１８。
【００７９】 実施例５．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,1
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ ）
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ ）
【化２１】 環境温度でジメチルホルムアミド（５００ｍｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、
０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、 ０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル
-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a
,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍ ｍｏｌ）を加えた。１時間後、tert-ブチル-N-(2-アミノエチル)-カルバマート （１．４ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加え、該溶液をさらに２時間攪拌した
。溶媒を真空下で除去した。生成物を、９５％水性トリフルオロ酢酸溶液中に溶
解し、２時間攪拌した。生成物を、アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ含有）
の勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰ
ＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．６ｍｇ
、３０％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６０３．１。
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、
０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、 ０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル
-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a
,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍ ｍｏｌ）を加えた。１時間後、tert-ブチル-N-(2-アミノエチル)-カルバマート （１．４ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加え、該溶液をさらに２時間攪拌した
。溶媒を真空下で除去した。生成物を、９５％水性トリフルオロ酢酸溶液中に溶
解し、２時間攪拌した。生成物を、アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ含有）
の勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰ
ＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．６ｍｇ
、３０％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６０３．１。
【００８０】 実施例６．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト
-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ
[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）
-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ
[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）
【化２２】 ６．１ 5-フタルイミドメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン 環境温度で濃縮硫酸（１００ｍｌ）中の2,3,3-トリメチルインドレニン（２０
ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、部分的にN-ヒドロキシメチルフタルイミド
（２０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）を加えた。７０時間後、反応混合物を氷上に注ぎ、
濃縮水酸化アンモニウムで塩基性にした。生じた沈殿を濾過し、乾燥した。生成
物は、黄色の固体として得られた（３４．８４ｇ、８７％）。
ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、部分的にN-ヒドロキシメチルフタルイミド
（２０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）を加えた。７０時間後、反応混合物を氷上に注ぎ、
濃縮水酸化アンモニウムで塩基性にした。生じた沈殿を濾過し、乾燥した。生成
物は、黄色の固体として得られた（３４．８４ｇ、８７％）。
【００８１】 ６．２ 5-アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン 環境温度でメタノール（５０ｍｌ）中の5-フタルイミドメチル-2,3,3-トリメ チルインドレニン（１０ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水和ヒドラジン
（１３．１ｇ、４０９ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、沈殿を形成した。反応
混合物を、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ１に調節し、溶媒を真空下で除去した。得られた 固体を１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、セライトを通じて濾過した。濾過物をジクロロメ タンで洗浄し（３×４０ｍｌ）、水相を６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１２に調節し、次 いでジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し
、濾過して、真空下で濃縮し、パール上の黄色固体を得た（４．９８ｇ、８４％
）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：１８８。
（１３．１ｇ、４０９ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、沈殿を形成した。反応
混合物を、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ１に調節し、溶媒を真空下で除去した。得られた 固体を１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、セライトを通じて濾過した。濾過物をジクロロメ タンで洗浄し（３×４０ｍｌ）、水相を６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１２に調節し、次 いでジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し
、濾過して、真空下で濃縮し、パール上の黄色固体を得た（４．９８ｇ、８４％
）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：１８８。
【００８２】 ６．３ 5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン ギ酸メチル（３０ｍｌ）中の5-アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン （４．９８ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を、２２時間窒素環境の下で還流
した。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物は、パール上の茶色の
油として得られた（５．４ｇ、９４％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２１７．１。
した。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物は、パール上の茶色の
油として得られた（５．４ｇ、９４％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２１７．１。
【００８３】 ６．４ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリ
メチルインドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチル
インドレニンを、セクション１．２に記載のものと類似の方法によって、アセト
ニトリル（４０ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（９ｇ、６９．１ｍ
ｍｏｌ）及び酢酸（１ｍｌ）と、5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチ ルインドレニン（１ｍｇ、２４．８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物
を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−
１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰ
ＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．２０ｍｇ、６９
％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３４７。
メチルインドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチル
インドレニンを、セクション１．２に記載のものと類似の方法によって、アセト
ニトリル（４０ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（９ｇ、６９．１ｍ
ｍｏｌ）及び酢酸（１ｍｌ）と、5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチ ルインドレニン（１ｍｇ、２４．８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物
を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−
１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰ
ＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．２０ｍｇ、６９
％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３４７。
【００８４】 ６．５ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテ
ニル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-5
-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載された
ものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルム アミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエト キシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ
）（セクション３．２に記載されたように調製された）の反応によって調製した
。分解が観察されたため、生成物を精製しなかった。生成物は黄色の油として得
られた。
ニル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-5
-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載された
ものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルム アミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエト キシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ
）（セクション３．２に記載されたように調製された）の反応によって調製した
。分解が観察されたため、生成物を精製しなかった。生成物は黄色の油として得
られた。
【００８５】 ６．６ 1,1-ジ-(3,3'-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'- スルホナト-インドカルボシアニン 環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-
スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ) エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３７ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の 攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-
(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルイン
ドレニン（２５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時
間７０℃に温めた。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０
ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００
％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣに
よって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（１６ｍｇ、１５％）；
λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７２６．１。
スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ) エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３７ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の 攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-
(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルイン
ドレニン（２５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時
間７０℃に温めた。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０
ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００
％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣに
よって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（１６ｍｇ、１５％）；
λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７２６．１。
【００８６】 ６．７ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-1
6,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3
,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,1
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方 法によって、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-
ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'-スルホナト-インドカル ボシアニン（５ｍｇ、０．００６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物
を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−
１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰ
ＬＣによって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（３．３ｍｇ、９
０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６４ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５６０。
6,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3
,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,1
8,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5
,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方 法によって、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-
ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'-スルホナト-インドカル ボシアニン（５ｍｇ、０．００６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物
を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−
１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰ
ＬＣによって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（３．３ｍｇ、９
０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６４ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５６０。
【００８７】 ６．８ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18- テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c'
]ジピリジン-5-イウム １：１２の濃縮ＨＣｌ：メタノール（５ｍｌ）中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-
(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-
ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム を１２時間攪拌した。反応溶媒を真空下で除去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０
分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使
用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製
した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．９ｍｇ、５０％）；λma x （ＭｅＯＨ）５６０ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５３２。
]ジピリジン-5-イウム １：１２の濃縮ＨＣｌ：メタノール（５ｍｌ）中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-
(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-
ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム を１２時間攪拌した。反応溶媒を真空下で除去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０
分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使
用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製
した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．９ｍｇ、５０％）；λma x （ＭｅＯＨ）５６０ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５３２。
【００８８】 実施例７．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメ チル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリ ジン-5-イウム（化合物ＶＩＩ）
【化２３】 ７．１ 5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン ＜０℃で３：２の水：濃縮ＨＣｌ（７３ｍｌ）の溶媒混合物中に4-(2-ヒドロ キシ）エチル-アニリン（１０ｇ、７３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水（８６ｍｌ ）中の冷却（＜０℃）硝酸ナトリウムの溶液（６ｇ、７３ｍｍｏｌ）を滴定して
加えた。次いで反応混合物を、さらに３０分低温で維持した。二酸化硫黄の飽和
溶液（１５０ｍｌ）を加え、該反応物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃で
さらに１時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得
られた黄色のヒドラジノ中間生成物を、酢酸（１２０ｍｌ）と酢酸カリウム（１
６ｇ、１６３ｍｍｏｌ）中に再溶解し、メチル-イソプロピルケトン（１５．５ ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温
め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生
成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄し
た。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含
有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム
上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．１８
ｇ、８％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２０４．１。
加えた。次いで反応混合物を、さらに３０分低温で維持した。二酸化硫黄の飽和
溶液（１５０ｍｌ）を加え、該反応物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃で
さらに１時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得
られた黄色のヒドラジノ中間生成物を、酢酸（１２０ｍｌ）と酢酸カリウム（１
６ｇ、１６３ｍｍｏｌ）中に再溶解し、メチル-イソプロピルケトン（１５．５ ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温
め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生
成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄し
た。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含
有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム
上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．１８
ｇ、８％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２０４．１。
【００８９】 ７．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルイ
ンドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレ
ニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニト
リル（４ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１．１３ｇ、８．６８ｍ
ｍｏｌ）、酢酸（１００μｌ）と、5-ヒドロキシ-2,3,3-トリメチルインドレニ ン（１１８ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４
ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％
勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬ
Ｃによって精製した。生成物は、パール状の茶色の油として得られた（２４ｍｇ
、１２％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３３１。
ンドレニン 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレ
ニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニト
リル（４ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１．１３ｇ、８．６８ｍ
ｍｏｌ）、酢酸（１００μｌ）と、5-ヒドロキシ-2,3,3-トリメチルインドレニ ン（１１８ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４
ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％
勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬ
Ｃによって精製した。生成物は、パール状の茶色の油として得られた（２４ｍｇ
、１２％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３３１。
【００９０】 ７．３ 5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニ
ルアミノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン 5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミ
ノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載された
ものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルム アミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエト キシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ
）の反応によって調製した。分解が観察されたため、生成物は精製しなかった。
生成物は黄色の油として得られた。
ルアミノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン 5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミ
ノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載された
ものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルム アミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエト キシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ
）の反応によって調製した。分解が観察されたため、生成物は精製しなかった。
生成物は黄色の油として得られた。
【００９１】 ７．４ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-インドカルボシアニ
ン 環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸；無水酢酸（５ｍｌ）中の5-
スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ) エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の攪 拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3
,3'-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン （２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時間７０℃で
温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍｌ／分
で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出
液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによっ
て精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（８．６ｍｇ、１０％）
；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７１２。
ン 環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸；無水酢酸（５ｍｌ）中の5-
スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ) エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の攪 拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3
,3'-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン （２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時間７０℃で
温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍｌ／分
で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出
液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによっ
て精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（８．６ｍｇ、１０％）
；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７１２。
【００９２】 ７．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチ ル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジ ン-5-イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,
8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イ ウムを、セクション１．４に記載された方法に従って、クロロホルム（５ｍｌ）
と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエ
チル-インドカルボシアニン（４．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の反応によって 調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦ
Ａ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０
μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として
得られた（２．８ｍｇ、９０％）；λmax５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）： ５４７。
8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イ ウムを、セクション１．４に記載された方法に従って、クロロホルム（５ｍｌ）
と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエ
チル-インドカルボシアニン（４．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の反応によって 調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦ
Ａ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０
μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として
得られた（２．８ｍｇ、９０％）；λmax５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）： ５４７。
【００９３】 実施例８．6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a
-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ
[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）
-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ
[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）
【化２４】 ８．１ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾール 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾールを、セクション１． ２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（４ｍｌ）中のアク
ロレインジエチルアセタール（１．６４ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）と酢酸（１００
μｌ）と、2-メチルベンゾチアゾール（１２５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の反応
によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０
．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18
、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は無色の油として得ら
れた（２２０ｍｇ、９５％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２８０。
ロレインジエチルアセタール（１．６４ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）と酢酸（１００
μｌ）と、2-メチルベンゾチアゾール（１２５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の反応
によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０
．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18
、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は無色の油として得ら
れた（２２０ｍｇ、９５％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２８０。
【００９４】 ８．２ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-
フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニ
ルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステルを、セクシ
ョン３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中の
N,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カル ボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン、エ
チルエステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ
、３．０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０
分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を
使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した
。生成物はパール状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ
（ＦＡＢ+）：５２１。
フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニ
ルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステルを、セクシ
ョン３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中の
N,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カル ボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン、エ
チルエステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ
、３．０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０
分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を
使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した
。生成物はパール状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ
（ＦＡＢ+）：５２１。
【００９５】 ８．３ 14-カルボキシメチル-1,1'-ジ(ジエトキシプロピル)−ベンズチアゾレ ニン-インドカルボシアニン、エチルエステル 環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-
カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルア
ミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル（２８ｍｇ、０
．０５４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水
酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチル-ベンゾチアゾール（
１５．１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７
０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍ
ｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾
配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣ
によって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１４．３ｍｇ、
２０％）；λmax５４９ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６６５．３。
カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルア
ミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル（２８ｍｇ、０
．０５４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水
酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチル-ベンゾチアゾール（
１５．１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７
０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍ
ｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾
配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣ
によって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１４．３ｍｇ、
２０％）；λmax５４９ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６６５．３。
【００９６】 ８．４ 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a- ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a,3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピ リジン-5-イウム 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾ チアゾレニン-インドレニン-[3,2-a,3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-
5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロ
ホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の（化合物名）（５ｍｇ、０．００
７５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／
アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、
Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生
成物は、ピンク色の固体として得られた（３．２ｍｇ、９０％）；λmax５６２ ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：４７１。
5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロ
ホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の（化合物名）（５ｍｇ、０．００
７５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／
アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、
Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生
成物は、ピンク色の固体として得られた（３．２ｍｇ、９０％）；λmax５６２ ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：４７１。
【００９７】 実施例９．6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ- アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a'
]ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）
]ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）
【化２５】 ９．１ 1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシ
アニン 1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニン
を、セクション１．３に記載されたものと類似の方法によって、ピリジン（５ｍ
ｌ）中のオルトギ酸トリエチル（４０．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）と、1-ジ
エトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン（２５．４ｍｇ
、０．０６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６
０分間水／アセトニトリルの０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynam
ax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の固
体として得られた（６．３ｍｇ、１２％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７５０。
アニン 1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニン
を、セクション１．３に記載されたものと類似の方法によって、ピリジン（５ｍ
ｌ）中のオルトギ酸トリエチル（４０．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）と、1-ジ
エトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン（２５．４ｍｇ
、０．０６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６
０分間水／アセトニトリルの０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynam
ax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の固
体として得られた（６．３ｍｇ、１２％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７５０。
【００９８】 ９．２ 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-ア ニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a'] ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム 無水酢酸（２ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナ ト-インドカルボシアニン（２ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、4- ヒドラジノフェニル酢酸（０．８９ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）を加え、反応
物を１００℃に温めた。１０分後、該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去し
た。生成物を、８ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有
）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカ
ラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク／紫色の固体である、
二つのジアステレオマーの化合物として得られた（０．０４ｍｇ、２％、０．０
６ｍｇ、３％）λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７１７．２
０。
物を１００℃に温めた。１０分後、該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去し
た。生成物を、８ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有
）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカ
ラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク／紫色の固体である、
二つのジアステレオマーの化合物として得られた（０．０４ｍｇ、２％、０．０
６ｍｇ、３％）λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７１７．２
０。
【００９９】 実施例１０．6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-
8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン
-5-イウム（化合物Ｘ）
8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン
-5-イウム（化合物Ｘ）
【化２６】 １０．１ 臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリン 2-メチルキノリン（１．６ｇ、０．０１１ｍｏｌ）及び2-(2-ブロモエチル)-1
,3-ジオキソラン（７．７ｇ、０．０４３ｍｏｌ）を、８５℃で１６時間共に熱 した。冷却時に、反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、生じた固体を濾過し
、エーテルで洗浄して乾燥した。臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-
メチル-キノリンを、茶色の固体として得た（０．９８ｇ、２７％）。ｍ／ｚ（ ＦＡＢ+）２４４。
,3-ジオキソラン（７．７ｇ、０．０４３ｍｏｌ）を、８５℃で１６時間共に熱 した。冷却時に、反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、生じた固体を濾過し
、エーテルで洗浄して乾燥した。臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-
メチル-キノリンを、茶色の固体として得た（０．９８ｇ、２７％）。ｍ／ｚ（ ＦＡＢ+）２４４。
【０１００】 １０．２ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-
N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステル 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニ
ルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステルを、セクショ
ン３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中のN,
N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カルボ キシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドリンエチルエ
ステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ、３．
０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水
／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用し
て、Rainin Dynamax C18カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はパー
ル状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）： ５２１。
N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステル 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニ
ルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステルを、セクショ
ン３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中のN,
N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カルボ キシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドリンエチルエ
ステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ、３．
０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水
／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用し
て、Rainin Dynamax C18カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はパー
ル状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）： ５２１。
【０１０１】 １０．３ 14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-1'-(3,
3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシアニン、エチルエステル 環境温度でエタノール（０．５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエト
キシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチル
インドレニンエチルエステル（１６．１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液
に、エタノール（０．５ｍｌ）とトリエチルアミン（１２５μｌ、０．９ｍｍｏ
ｌ）中の臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリン（１０ ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、反応溶媒を真空下で除
去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含
有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍ
カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた
（１０ｍｇ、５１％）、λmax５６７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６２９。
3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシアニン、エチルエステル 環境温度でエタノール（０．５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエト
キシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチル
インドレニンエチルエステル（１６．１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液
に、エタノール（０．５ｍｌ）とトリエチルアミン（１２５μｌ、０．９ｍｍｏ
ｌ）中の臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリン（１０ ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、反応溶媒を真空下で除
去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含
有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍ
カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた
（１０ｍｇ、５１％）、λmax５６７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６２９。
【０１０２】 １０．４ 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a
-キノリノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5- イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリ ノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを
、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（２
ｍｌ）と５０％硫酸（０．４ｍｌ）中の14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキ
サラン-2-yl)エチル]-1'-(3,3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシ
アニン、エチルエステル（５ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ）の反応によって調製
した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含
有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍ
カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた
（１．６ｍｇ、４４％）；λmax５８４ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：４６５。
-キノリノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5- イウム 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリ ノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを
、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（２
ｍｌ）と５０％硫酸（０．４ｍｌ）中の14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキ
サラン-2-yl)エチル]-1'-(3,3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシ
アニン、エチルエステル（５ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ）の反応によって調製
した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含
有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍ
カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた
（１．６ｍｇ、４４％）；λmax５８４ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：４６５。
【０１０３】 実施例１１．硬質Ｃｙ−３−Ｃｙ−５接合物の調製（化合物Ｘ）
【化２７】 環境温度でジメチルスルホキシド（１００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス(テトラメチレン)ウロニウム（１ｍｇ、０
．００２４ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（０．６８ｍｇ、 ０．００７ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル
-14-スルホナト-6,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,
3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（１ｍｇ、０．００１８ｍｍ
ｏｌ）を加えた。１時間後、ジイソプロピルエチルアミン（０．２３ｍｇ、０．
００１８ｍｍｏｌ）及びジメチルスルホキシド（１００μｌ）中の5-アミノメチ
ル-5'-スルホナト-1-メチル-1'-エチルインドジカルボシアニン（０．９ｍｇ、 ０．００１８ｍｍｏｌ）の溶液を、環境温度で加えた。さらに４８時間後、生成
物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−
１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上で
のＨＰＬＣによって精製した。生成物は、青色の固体として得られた；λabs（ ＭｅＯＨ）５６１ｎｍ及びλem６４７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：１０５０。
(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス(テトラメチレン)ウロニウム（１ｍｇ、０
．００２４ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（０．６８ｍｇ、 ０．００７ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル
-14-スルホナト-6,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,
3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（１ｍｇ、０．００１８ｍｍ
ｏｌ）を加えた。１時間後、ジイソプロピルエチルアミン（０．２３ｍｇ、０．
００１８ｍｍｏｌ）及びジメチルスルホキシド（１００μｌ）中の5-アミノメチ
ル-5'-スルホナト-1-メチル-1'-エチルインドジカルボシアニン（０．９ｍｇ、 ０．００１８ｍｍｏｌ）の溶液を、環境温度で加えた。さらに４８時間後、生成
物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−
１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上で
のＨＰＬＣによって精製した。生成物は、青色の固体として得られた；λabs（ ＭｅＯＨ）５６１ｎｍ及びλem６４７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：１０５０。
【０１０４】 実施例１２．タンパク質：ペプチド偏光結合アッセイ １２．１ ラベル化ペプチドリガンドの合成 配列Ｅ−ｐＹ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｐ−Ｋ（Ｅ９Ｋ）のペプチドを、標準的
な方法及び材料を使用して、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機での固相 合成によって調製した。過剰な6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-
スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2
'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキ シスクシンイミドエステルを、固相に未だ結合されている保護化ペプチドの有利
Ｎ末端に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下でＤＭＳＯ中で結合した。２時
間後脱保護の後、粗ラベル化ペプチドを、６０分で水／水：アセトニトリル（４
０：６０）に対する０．１％ＴＦＡ／０．１％ＴＦＡから得た勾配を使用して、
逆相ＨＰＬＣによって精製した。
な方法及び材料を使用して、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機での固相 合成によって調製した。過剰な6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-
スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2
'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキ シスクシンイミドエステルを、固相に未だ結合されている保護化ペプチドの有利
Ｎ末端に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下でＤＭＳＯ中で結合した。２時
間後脱保護の後、粗ラベル化ペプチドを、６０分で水／水：アセトニトリル（４
０：６０）に対する０．１％ＴＦＡ／０．１％ＴＦＡから得た勾配を使用して、
逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１０５】 １２．２ 結合アッセイ 各種の濃度のＧｒｂ２グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質、 及び２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４／１０ｍＭ ＤＴＴ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０中の化合物ＩＩＩでラベルされたＥ９Ｋを、６０分間黒色９６欠ミクロプレ
ート(Dynatech)中に１５０μｌの最終容量でインキュベーションした。偏光値を
、励起のために530DF30フィルターを、放射のために590DF45フィルターを使用し
て、Fluorolite FPM2TMプレートリーダー(Jolley Reserch and Consulting Inc.
)で読み取った。その結果が図６に示され、Ｇｒｂ２タンパク質を有する化合物 ＩＩＩラベル化ペプチドの特異的結合（偏光の変化によって測定される）を示す
。
ート(Dynatech)中に１５０μｌの最終容量でインキュベーションした。偏光値を
、励起のために530DF30フィルターを、放射のために590DF45フィルターを使用し
て、Fluorolite FPM2TMプレートリーダー(Jolley Reserch and Consulting Inc.
)で読み取った。その結果が図６に示され、Ｇｒｂ２タンパク質を有する化合物 ＩＩＩラベル化ペプチドの特異的結合（偏光の変化によって測定される）を示す
。
【０１０６】 実施例１３．核酸ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイ １３．１ プローブ調製 非ラベル化標的オリゴヌクレオチド(5' TAC CCA GAC GAG CAA-ビオチン 3')及
び相補的非ラベル化プローブオリゴヌクレオチド(5' TTG CTC GTC TGG GTA 3') を、標準的な方法及び材料を使用してApplied Biosystems 391 ＤＮＡ合成機で 合成した。該オリゴヌクレオチドを４０℃で１７時間で脱保護し、Ｃ１８カラム
及び４０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製
した。所望のピークを回収し、凍結乾燥し、サンプルを滅菌Ｈ2Ｏに再懸濁した 。
び相補的非ラベル化プローブオリゴヌクレオチド(5' TTG CTC GTC TGG GTA 3') を、標準的な方法及び材料を使用してApplied Biosystems 391 ＤＮＡ合成機で 合成した。該オリゴヌクレオチドを４０℃で１７時間で脱保護し、Ｃ１８カラム
及び４０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製
した。所望のピークを回収し、凍結乾燥し、サンプルを滅菌Ｈ2Ｏに再懸濁した 。
【０１０７】 第二のセットの標的及びプローブオリゴヌクレオチドを記載されたように合成
したが、アミノ基を5'末端に加えた(5' C7アミノ修飾TAC CCA GAC GAG CAA-ビオ
チン 3'及び5' C7アミノ修飾TTG CTC GTC TGG GTA 3')。
したが、アミノ基を5'末端に加えた(5' C7アミノ修飾TAC CCA GAC GAG CAA-ビオ
チン 3'及び5' C7アミノ修飾TTG CTC GTC TGG GTA 3')。
【０１０８】 アミノ修飾化標的及びプローブオリゴヌクレオチドを、２２℃で一晩、０．１
Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の、１０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラ ヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH
-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミド、及びＣｙ５ ＮＨＳ−エステ ル色素(Amersham Pharmacia Biotech)のそれぞれとインキュベーションした。翌
朝、該オリゴヌクレオチドをエタノール沈降し、生じたペレットをＨ2Ｏに再懸 濁した。ラベル化オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラム及び６０％ＴＥＡＡ／ア
セトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製し、所望のピークを回収
して凍結乾燥した。残存物をＨ2Ｏ中に再懸濁し、回収された材料の濃度を測定 した。
Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の、１０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラ ヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH
-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミド、及びＣｙ５ ＮＨＳ−エステ ル色素(Amersham Pharmacia Biotech)のそれぞれとインキュベーションした。翌
朝、該オリゴヌクレオチドをエタノール沈降し、生じたペレットをＨ2Ｏに再懸 濁した。ラベル化オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラム及び６０％ＴＥＡＡ／ア
セトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製し、所望のピークを回収
して凍結乾燥した。残存物をＨ2Ｏ中に再懸濁し、回収された材料の濃度を測定 した。
【０１０９】 １３．２ 結合アッセイ 黒色のストレプタビジン皮膜９６穴プレートのウェルを、環境温度で１２０分
間、非ラベル化または化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチド（１００μ
ｌＰＢＳ／１ＭｇＣｌ2で希釈された２０ｐｍｏｌ／ウェル）のそれぞれで皮膜 した。いずれかの非結合材料を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／
０．１％ ＢＳＡ）で強力にウェルを洗浄することによって除去した。非ラベル 化またはＣｙ５ラベル化プローブオリゴヌクレオチドを、０．２ｐｍｏｌ／μｌ
のアッセイ緩衝液に希釈し、プローブハイブリダイゼーションを許容するために
、１００μｌを１２０分、環境温度で皮膜ウェルでインキュベーションした。最
後に、ウェルをＰＢＳで強力に洗浄し、蛍光強度を５６０ｎｍの励起フィルター
及び６７０ｎｍの吸収フィルターを使用して蛍光プレートリーダーで測定した（
図７）。
間、非ラベル化または化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチド（１００μ
ｌＰＢＳ／１ＭｇＣｌ2で希釈された２０ｐｍｏｌ／ウェル）のそれぞれで皮膜 した。いずれかの非結合材料を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／
０．１％ ＢＳＡ）で強力にウェルを洗浄することによって除去した。非ラベル 化またはＣｙ５ラベル化プローブオリゴヌクレオチドを、０．２ｐｍｏｌ／μｌ
のアッセイ緩衝液に希釈し、プローブハイブリダイゼーションを許容するために
、１００μｌを１２０分、環境温度で皮膜ウェルでインキュベーションした。最
後に、ウェルをＰＢＳで強力に洗浄し、蛍光強度を５６０ｎｍの励起フィルター
及び６７０ｎｍの吸収フィルターを使用して蛍光プレートリーダーで測定した（
図７）。
【０１１０】 非ラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、非ラベル化またはＣｙ５ラベ
ル化プローブのいずれかでインキュベーションされたウェルは、残余の背景蛍光
シグナルを与えた。同様に、化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮
膜され、非ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、低い傾向シ
グナルを与えた。化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、Ｃ
ｙ５ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、強力な蛍光シグナ
ルを与え、ＦＲＥＴが化合物ＩＩＩとＣｙ５の間で生じることを示した。
ル化プローブのいずれかでインキュベーションされたウェルは、残余の背景蛍光
シグナルを与えた。同様に、化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮
膜され、非ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、低い傾向シ
グナルを与えた。化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、Ｃ
ｙ５ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、強力な蛍光シグナ
ルを与え、ＦＲＥＴが化合物ＩＩＩとＣｙ５の間で生じることを示した。
【０１１１】 実施例１４．タンパク質：ＤＮＡ直接的強度結合アッセイ １４．１ 試薬の調製 全てのＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを、Genosys Biotechnologies Ltdか ら得た。ＮＦ−ｋＢに対して特異的な等モル量のビオチン化コード鎖(5' ビオチ
ン-GATCTAGGGACTTT CCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAAGGCGCCTA 3'
)を、３分沸騰水浴中で共にインキュベーションし、２時間冷却することによっ てアニールさせた。
ン-GATCTAGGGACTTT CCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAAGGCGCCTA 3'
)を、３分沸騰水浴中で共にインキュベーションし、２時間冷却することによっ てアニールさせた。
【０１１２】 抗ＧＳＴ抗体（３ｍｇ／ｍｌ、Molecular Probes社から得た１．５ｍｇ供給物
／バイアル（０．５ｍｌ））を、室温で４時間、０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１
リットルに対して透析し、透析を０．１５Ｍ塩化ナトリウムの新たな溶液で4℃ で一晩継続した。翌朝、抗体を最大４時間、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムの１リ
ットルに対して透析した。
／バイアル（０．５ｍｌ））を、室温で４時間、０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１
リットルに対して透析し、透析を０．１５Ｍ塩化ナトリウムの新たな溶液で4℃ で一晩継続した。翌朝、抗体を最大４時間、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムの１リ
ットルに対して透析した。
【０１１３】 ＤＭＳＯ中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,
16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2
-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミ ドエステルの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１０ｍｇ色素：０．３３ｍｇ抗体の比で
抗体を攪拌しながら段階的に加えた。該溶液を、暗所で室温でさらに４５分混合
した。遊離色素を、室温で４時間０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対し
て透析し、４℃で一晩新鮮な０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透
析することによって除去した。最後に抗体を、室温で４時間０．０１Ｍ ＰＢＳ ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析し、次いで４℃で一晩
０．０１Ｍ ＰＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析し た。（全ての透析は、ラベリングに引き続き暗所で実施された。）
16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2
-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミ ドエステルの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１０ｍｇ色素：０．３３ｍｇ抗体の比で
抗体を攪拌しながら段階的に加えた。該溶液を、暗所で室温でさらに４５分混合
した。遊離色素を、室温で４時間０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対し
て透析し、４℃で一晩新鮮な０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透
析することによって除去した。最後に抗体を、室温で４時間０．０１Ｍ ＰＢＳ ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析し、次いで４℃で一晩
０．０１Ｍ ＰＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析し た。（全ての透析は、ラベリングに引き続き暗所で実施された。）
【０１１４】 １４．２ 結合アッセイ ビオチンラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的ｄｓＤＮＡ（２．５ｐｍｏｌ、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2中に希釈した）を、９６穴ストレプタビジン皮膜ミクロタイタープレ
ート(Bohringer Mannheim)の各ウェル（最終容量、１００μｌ）に加え、室温で
２時間インキュベーションした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）での洗浄に引き続き、５ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５
ＧＳＴを、２００ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン
（非特異的競合因子）のそれぞれの存在化または不存在下で、１０ｍＭ Ｈｅｐ ｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
及び５ｍＭ ＤＴＴ中に加えた（ブランクはｐ６５ＧＳＴを含まない）。両タン パク質をＨｅｐｅｓ緩衝液中に上述のように希釈した；最終ウェル容量は１００
μｌであった。該プレートを室温で３０分浸透し、さらに３０分放置した。上述
のＰＢＳ緩衝液での洗浄に引き続き、１００μｌの最終ウェル容量で、上述のＨ
ｅｐｅｓ緩衝液中の５０ｐｍｏｌ／ウェルの化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴ Ａ ｂで検出を達成した。最後に該プレートを、上述のようにＰＢＳ緩衝液で洗浄し
、１００μｌの水を各ウェルに加えた。該プレートを、Biolumin 960蛍光ミクロ
プレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)においてEx535/Em569及びEx560/59
5で読み取った。その結果が図８に示されている。
ート(Bohringer Mannheim)の各ウェル（最終容量、１００μｌ）に加え、室温で
２時間インキュベーションした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍ リン酸緩衝液（ｐＨ７．５）での洗浄に引き続き、５ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５
ＧＳＴを、２００ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン
（非特異的競合因子）のそれぞれの存在化または不存在下で、１０ｍＭ Ｈｅｐ ｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ
及び５ｍＭ ＤＴＴ中に加えた（ブランクはｐ６５ＧＳＴを含まない）。両タン パク質をＨｅｐｅｓ緩衝液中に上述のように希釈した；最終ウェル容量は１００
μｌであった。該プレートを室温で３０分浸透し、さらに３０分放置した。上述
のＰＢＳ緩衝液での洗浄に引き続き、１００μｌの最終ウェル容量で、上述のＨ
ｅｐｅｓ緩衝液中の５０ｐｍｏｌ／ウェルの化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴ Ａ ｂで検出を達成した。最後に該プレートを、上述のようにＰＢＳ緩衝液で洗浄し
、１００μｌの水を各ウェルに加えた。該プレートを、Biolumin 960蛍光ミクロ
プレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)においてEx535/Em569及びEx560/59
5で読み取った。その結果が図８に示されている。
【０１１５】 化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴでの検出は、１０１：１(Ex560/Em595)及び１ ２３：１(Ex535/Em569)の間の相当するＳ／Ｎ比を有する、約１０，０００ｒｆ ｕの良好なシグナルを生じた。４０倍モル過剰の特異的競合因子、ｐ６５を使用
して特異性が示され、ｐ６５は全シグナルを約９０％まで減少した。非特異的競
合因子、カゼインは、全シグナルを２５％のみまで減少した。
して特異性が示され、ｐ６５は全シグナルを約９０％まで減少した。非特異的競
合因子、カゼインは、全シグナルを２５％のみまで減少した。
【０１１６】 実施例１５．タンパク質：ＤＮＡ ＦＲＥＴ結合アッセイ １５．１ 試薬の調製 全てのＨＰＬＣ精製ＮＦ−ｋＢ特異的オリゴヌクレオチドを、Genosys Biotec
hnologies Ltdから得た：コード鎖は、5'末端第一級アミンで修飾され(5' NH2-G
ATCTAGGGACTTTCCGCG 3')、非コード鎖は修飾されなかった(5' ATCCCTGAAAGGCGCC
TAG 3')。１０倍モル過剰のＣｙ−５−ＮＨＳエステル色素(Amersham Pharmacia Biotech)を、２２℃で一晩、０．１Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の 、コード鎖とインキュベーションした。翌朝、該オリゴヌクレオチドをエタノー
ル沈降し、次いで水中に再懸濁した。ラベル化コード鎖を、Ｃ１８カラム及び６
０％ ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製し た。ピーク含有ラベル化オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、水中に再懸濁した。
hnologies Ltdから得た：コード鎖は、5'末端第一級アミンで修飾され(5' NH2-G
ATCTAGGGACTTTCCGCG 3')、非コード鎖は修飾されなかった(5' ATCCCTGAAAGGCGCC
TAG 3')。１０倍モル過剰のＣｙ−５−ＮＨＳエステル色素(Amersham Pharmacia Biotech)を、２２℃で一晩、０．１Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の 、コード鎖とインキュベーションした。翌朝、該オリゴヌクレオチドをエタノー
ル沈降し、次いで水中に再懸濁した。ラベル化コード鎖を、Ｃ１８カラム及び６
０％ ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製し た。ピーク含有ラベル化オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、水中に再懸濁した。
【０１１７】 ＮＦ−ｋＢ特異的二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを、Ｃｙ−５ラベル化コード鎖(5' Cy
5-GATCTAGG GACTTTCCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAA GGCGCCTAG 3
')の等モル量と共にインキュベーションし、３分間沸騰水浴させ、２時間冷却す
ることによってアニールさせて生産した。
5-GATCTAGG GACTTTCCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAA GGCGCCTAG 3
')の等モル量と共にインキュベーションし、３分間沸騰水浴させ、２時間冷却す
ることによってアニールさせて生産した。
【０１１８】 ＮＦ−ｋＢ ｐ６５タンパク質（２６０ｍｇ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝生理 食塩水中で１０００μｌに希釈した。２０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラヒドロ-
2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスイ
ンドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合 物ＩＩＩ）、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍｌ
の溶液として）を、２時間攪拌しながら２２℃で該タンパク質とインキュベーシ
ョンした（暗所において）。ラベル化タンパク質を、４℃で０．０１Ｍリン酸緩
衝生理食塩水／０．５Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ＤＴＴの３回の 変化に対して透析した（暗所において、４時間／新鮮な緩衝液）。
2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスイ
ンドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合 物ＩＩＩ）、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍｌ
の溶液として）を、２時間攪拌しながら２２℃で該タンパク質とインキュベーシ
ョンした（暗所において）。ラベル化タンパク質を、４℃で０．０１Ｍリン酸緩
衝生理食塩水／０．５Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ＤＴＴの３回の 変化に対して透析した（暗所において、４時間／新鮮な緩衝液）。
【０１１９】 １５．２ 結合アッセイ 黒色のミクロタイタープレート(Dynatech)を、ＦＲＥＴアッセイのために使用
した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５（２０ｐｍｏｌ）を、２００ｐｍｏｌ／ウェ
ルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン（非特異的競合因子）のそれぞれ
の存在化または不存在下で、１０ｐｍｏｌのＣｙ５ラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的二
本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを含む、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム 、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＤＴＴ中でインキュ ベーションした。両タンパク質を、１００μｌの最終ウェル容量を与えるように
、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に希釈した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５のみを含むウェ
ルが、ブランクとして使用された。該プレートを２２℃で３０分攪拌しながらイ
ンキュベーションし（暗所において）、さらに３０分放置した。該プレートを、
Biolumin 960蛍光ミクロプレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)において 、Ex520/Em670で読み取った。その結果が図９に示されている。
した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５（２０ｐｍｏｌ）を、２００ｐｍｏｌ／ウェ
ルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン（非特異的競合因子）のそれぞれ
の存在化または不存在下で、１０ｐｍｏｌのＣｙ５ラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的二
本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを含む、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム 、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＤＴＴ中でインキュ ベーションした。両タンパク質を、１００μｌの最終ウェル容量を与えるように
、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に希釈した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５のみを含むウェ
ルが、ブランクとして使用された。該プレートを２２℃で３０分攪拌しながらイ
ンキュベーションし（暗所において）、さらに３０分放置した。該プレートを、
Biolumin 960蛍光ミクロプレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)において 、Ex520/Em670で読み取った。その結果が図９に示されている。
【０１２０】 ２０００ｒｆｕのシグナルを、４：１の相当するＳ／Ｎ比を有するＦＲＥＴア
ッセイにおいて得られた。特異性は、特異的競合因子、ｐ６５の１０倍モル過剰
を使用して示され、ｐ６５は４０％まで全体のシグナルを減少した。非特異的競
合因子、カゼインは、全体のシグナルに効果を有さなかった。
ッセイにおいて得られた。特異性は、特異的競合因子、ｐ６５の１０倍モル過剰
を使用して示され、ｐ６５は４０％まで全体のシグナルを減少した。非特異的競
合因子、カゼインは、全体のシグナルに効果を有さなかった。
【０１２１】 実施例１６．蛍光偏光を使用したレセプターリガンド結合アッセイ １６．１ 試薬の調製 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テ トラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c'] ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミドエステル （１ｍｇ）のサンプルを、５％ｖ／ｖトリエチルアミンの存在下で、ジメチルス
ルホキシド中の１ｍｇのテレンゼピンアミン同類物と反応させた。該反応を、暗
所で環境温度で２時間継続させた。化合物ＩＩＩ−テレンゼピン生成物を、０．
１％トリフルオロ酢酸の存在下で、Ｃ１８カラム及び６０％水／アセトニトリル
勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって開始材料から精製した。精製物のピークを
回収し、暗所で凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド中に再懸濁した。これを等分
し、暗所で−２０℃で凍結して貯蔵した。
ルホキシド中の１ｍｇのテレンゼピンアミン同類物と反応させた。該反応を、暗
所で環境温度で２時間継続させた。化合物ＩＩＩ−テレンゼピン生成物を、０．
１％トリフルオロ酢酸の存在下で、Ｃ１８カラム及び６０％水／アセトニトリル
勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって開始材料から精製した。精製物のピークを
回収し、暗所で凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド中に再懸濁した。これを等分
し、暗所で−２０℃で凍結して貯蔵した。
【０１２２】 Ｍ1ムスカリンレセプターを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞 （ＣＨＯ Ｍ1細胞）を、１０％胎児ウシ血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミン；５
０ＩＵ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシン；１２５μｇ／ｍｌゲネチシン(S
igma)を含むＨＡＭＳ Ｆ１２培地(Sigma)中で生育させ、湿気を含むインキュベ ーター中で５％ＣＯ2と共に３７℃で維持した。細胞をローラーボトルに広げ、 ５％ＣＯ2で浄化し、ローラーボトルインキュベーター中に４日間３７℃で放置 した。
０ＩＵ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシン；１２５μｇ／ｍｌゲネチシン(S
igma)を含むＨＡＭＳ Ｆ１２培地(Sigma)中で生育させ、湿気を含むインキュベ ーター中で５％ＣＯ2と共に３７℃で維持した。細胞をローラーボトルに広げ、 ５％ＣＯ2で浄化し、ローラーボトルインキュベーター中に４日間３７℃で放置 した。
【０１２３】 細胞を冷蔵リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３（ＰＢＳ錠剤；Sigma）中にばら すことによって集め、ＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ３０００ｉ遠心機において４℃で １４００ｒｃｆで遠心分離することによってペレット化した。細胞を冷蔵５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ホモジネーション緩衝液に再懸濁 し、２０分間氷上で放置してから、９００ｐｓｉの窒素を使用してＰａｒｒ細胞
破壊装置(Parr Cat. N゜. 4639, 45ml)を使用して細胞溶解した。何れかの比破壊
細胞を１４００ｒｄｆで遠心分離することによって除去し、懸濁液を取り出しさ
らに４℃で２０分Beckman J2-21M/E遠心機において１８０００ｒｐｍで遠心分離
した。生じたペレットを冷蔵ホモジネーション緩衝液に再懸濁し、上述のように
１８０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞膜ペレットを、およそ１５ｍｌのホモジ
ネーション緩衝液に再懸濁し、等分し、−７０℃での貯蔵のため液体窒素で凍結
した。
破壊装置(Parr Cat. N゜. 4639, 45ml)を使用して細胞溶解した。何れかの比破壊
細胞を１４００ｒｄｆで遠心分離することによって除去し、懸濁液を取り出しさ
らに４℃で２０分Beckman J2-21M/E遠心機において１８０００ｒｐｍで遠心分離
した。生じたペレットを冷蔵ホモジネーション緩衝液に再懸濁し、上述のように
１８０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞膜ペレットを、およそ１５ｍｌのホモジ
ネーション緩衝液に再懸濁し、等分し、−７０℃での貯蔵のため液体窒素で凍結
した。
【０１２４】* テレンゼピンアミン同類物は、Chemical Synthesis Programme of the Nationa
l Institute of Mental Health, Cobtact NO1MH30003の一部として、Research B
iochemicals Internationalによって提供された。
l Institute of Mental Health, Cobtact NO1MH30003の一部として、Research B
iochemicals Internationalによって提供された。
【０１２５】 １６．２ 結合アッセイ 等量のＣＨＯ Ｍ1細胞膜（５０μｇ）を、Ｍ１ムスカリンレセプターアンタゴ
ニストアトロピン及びＴＡＣ（５０００ｎＭ−０．０６４ｎＭ）の一連の希釈を
含む黒色のミクロタイタープレートのウェルに加えた。次いで該プレートを、バ
ックグランド偏光値を測定するFluorolite FPM-2TMで測定した（励起フィルター
５３０ｎｍ；放射フィルター５９０ｎｍ）。化合物ＩＩＩ−テレンゼピンリガン
ド（４ｎＭ最終濃度）の添加の後、該プレートを密封し、ミクロタイタープレー
トシェーカー上で暗所で２２℃でインキュベーションした。得られた偏光データ
から、非直線回帰及び一部分結合分析を使用して、アトロピン及びＴＡＣの両者
について競合曲線を作成した(GraphPad Prism 2.0データ操作パッケージ）。
ニストアトロピン及びＴＡＣ（５０００ｎＭ−０．０６４ｎＭ）の一連の希釈を
含む黒色のミクロタイタープレートのウェルに加えた。次いで該プレートを、バ
ックグランド偏光値を測定するFluorolite FPM-2TMで測定した（励起フィルター
５３０ｎｍ；放射フィルター５９０ｎｍ）。化合物ＩＩＩ−テレンゼピンリガン
ド（４ｎＭ最終濃度）の添加の後、該プレートを密封し、ミクロタイタープレー
トシェーカー上で暗所で２２℃でインキュベーションした。得られた偏光データ
から、非直線回帰及び一部分結合分析を使用して、アトロピン及びＴＡＣの両者
について競合曲線を作成した(GraphPad Prism 2.0データ操作パッケージ）。
【０１２６】 図１０における曲線は、ｌｏｇ１０モル濃度非ラベルリガンドに対してプロッ
トされた特異的偏光読み取りを示す。１９０ｍＰの特異的シグナルが得られ、こ
の実験から測定されたＩＣ５０値は、アトロピンについて４．１ｎｍ及び非ラベ
ルＴＡＣについて２８ｎＭであった。
トされた特異的偏光読み取りを示す。１９０ｍＰの特異的シグナルが得られ、こ
の実験から測定されたＩＣ５０値は、アトロピンについて４．１ｎｍ及び非ラベ
ルＴＡＣについて２８ｎＭであった。
【図１】 図１は、実施例１．６の色素でラベルされたタンパク質と比較
した、実施例１の色素の溶液に対する吸収スペクトルを示すグラフである。
した、実施例１の色素の溶液に対する吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】 図２は、実施例１の色素の硬化色素構造を、二つの開いた鎖の
色素の構造と比較する化学式である。
色素の構造と比較する化学式である。
【図３】 図３は、図２の三つのシアニン３色素のスペクトル特性を比較
するグラフである。
するグラフである。
【図４】 図４は、５１４ｎｍで励起された場合の図２の三つのシアニン
色素の放射スペクトルを示すグラフである。
色素の放射スペクトルを示すグラフである。
【図５】 図５は、レーザーにさらされた場合の、図２の三つの色素を光
ブリーチした結果を示すグラフである。
ブリーチした結果を示すグラフである。
【図６】 図６は、実施例１２．２に従ったペプチド極性化結合アッセイ
の結果を示すグラフである。
の結果を示すグラフである。
【図７】 図７は、実施例１３．３の核酸ＦＲＥＴハイブリダイゼーショ
ンアッセイの結果を示す棒グラフである。
ンアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図８】 図８は、実施例１４．２の方法に従ったタンパク質：ＤＮＡ直
接的強度結合アッセイを示す棒グラフである。
接的強度結合アッセイを示す棒グラフである。
【図９】 図９は、実施例１５．２のタンパク質：ＤＮＡ ＦＲＥＴ結合 アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１０】 図１０は、実施例１６．２に引き続き非ラベル化リガンドの
濃度に対する特異的極性読み取りをプロットするグラフである。
濃度に対する特異的極性読み取りをプロットするグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/58 Ｇ０１Ｎ 33/58 Ａ // Ｈ０１Ｓ 3/213 Ｈ０１Ｓ 3/20 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｓ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB01 BB05 BB20 BB46 BB48 BB51 CB01 FB01 FB02 FB03 FB06 4B063 QA01 QA13 QA18 QA20 QQ01 QQ05 QQ21 QQ42 QQ79 QQ96 QR01 QR08 QR12 QR14 QR16 QR42 QR48 QR62 QS03 QS25 QS28 QS33 QS34 QX02 4C057 MM04 4H056 CA01 CC02 CC08 CE03 CE06 DD03 FA08 5F072 AC02 FF09
Claims (17)
- 【請求項１】 Ｒ2−Ｒ9基によって任意に置換された以下の式： 【化１】 ［式中、Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ9基は、Ｘ及びＹを含む環に結合し、または任意に
Ｚa及びＺb環構造の原子に結合し； Ｒ2からＲ9は同じまたは異なり、−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10を含み、Ｒ10は、水溶性
を減少する中性基、水溶性を増大する極性基、ラベリング反応において使用でき
る官能基、反応基、蛍光分子の吸収及び放射波長をシフトする電子供与及び吸引
基、脂質及び炭化水素溶解性基から選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状
Ｃ1-20アルキル鎖、Ｃ2-20モノエーテルまたはポリエーテル、及び４個までの第
二級アミド結合を含むＣ2-20原子鎖より成る群から選択され； Ｒ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロ ゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アミノ、アセタール、ケタール、ホスホリル
、スルフヒドリル、水溶性基、並びにアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル置換アミノ、第
四級アミノ、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、アセタール、ケタール、
ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スル
ファート、カルボキシラート、アミド、ニトロ、及びアミノ、ヒドロキシル、ア
ルデヒド、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基によって任意に置
換されたアルキル基から選択され； Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ11から選択され、式中Ｒ11は置換されたアミノ基であり； 【化２】 ｛式中、Ｒ’は、水素、Ｃ1-4アルキル及びアリールから選択され、Ｒ”は、Ｃ1 -18 アルキル、アリール、ヘテロアリール、２−７の炭素原子を有するアシル基 、及びチオカルバモイル基から選択され｝； Ｘ及びＹは、同じまたは異なってもよく、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル、並びに炭素
、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗで置換されたＣ4−Ｃ5スピロア
ルキルから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ2）nＲ12基か
ら選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ12は水素、アミノ、アルデ
ヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒド
ロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノ
、第四級アミノ、ニトロ、第一級アミド、置換されたアミド、並びにアミノ、ヒ
ドロキシル、カルボニル、ホスホリル及びスルフヒドリル基と反応性の基から選
択され； Ｚa及びＺbのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環
を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに
任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択された５または６の原子を有し
； Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、標的材料
上の官能基と共有結合反応するための反応基を含み、または標的材料上の反応基
と共有結合反応するための官能基を含み、または Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ1 −Ｒ9は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである］ の化合物。 - 【請求項２】 Ｒ10が、水素、ハロゲン、アミド、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ニ
トロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホナート、第四級アンモニウム
、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホナート、任意に置換さ
れたアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、例えばスク
シンイミジルエステル、イソチオシアナート、アンヒドリド、ハロアセトアミド
、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト、酸性ハライド、アル
キルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドといった反応基；並びにアミ
ノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフヒドリル基と反応性の
基から選択される、請求項１記載の化合物。 - 【請求項３】 Ｒ1が、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ハロゲ ン、２６以下の炭素原子のアルキル基、−（ＣＨ2）nＱから選択され、式中１＜
ｎ＜２６であり、Ｑはアミノ、アルデヒド、ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロ
キシル、アルデヒド、ホスホリル又はスルフヒドリル基と反応性の基から選択さ
れ、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4及びＲ5は水素である、請求項１記載の化合物。 - 【請求項４】 i) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,1
6,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2
-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｉ）； ii) 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-
9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c'
]ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）； iii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c
']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）； iv) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c
']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）； v) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18
-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c
']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）； vi) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,
16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2
-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）； vii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-
7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5
-イウム（化合物ＶＩＩ）； viii) 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベ ンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,
2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）； ix) 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニ リノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピ リド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）； x) 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キ ノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イ
ウム（化合物Ｘ）； から選択される、請求項１記載の化合物。 - 【請求項５】 任意にＲ2−Ｒ9基によって置換された以下の式（Ａ）： 【化３】 ［式中、Ｘ、Ｙ、Ｚa、Ｚb及びＲ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ 9 は上記記載され、Ｒは結合Ａの形成に適した条件下でメチルまたはエチルであ り、Ａは上述のように定義される］ の化合物を反応させることを含む、請求項１記載の化合物の製造法。
- 【請求項６】 任意にＲ2−Ｒ9基によって置換された以下の式： 【化４】 ［式中、Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ9はＸ及びＹを含む環に結合し、または任意にＺa 及びＺb環構造の原子に結合し、Ｒ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6−Ｒ9、Ｘ、Ｙ、
Ｚa、Ｚb及びＲは上記定義され； Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、標的材料
上の官能基と共有結合反応するための反応基を含み、または標的材料上の反応基
と共有結合反応するための官能基を含み、または Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ1 −Ｒ9は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである］ の化合物。 - 【請求項７】 非極性材料に、少なくとも一つのＲ1からＲ9及びＲ11基が非
電荷基である請求項１記載の化合物を混合する工程を含む、非極性材料に蛍光特
性を与える方法。 - 【請求項８】 極性材料に、少なくとも一つのＲ1からＲ9及びＲ11基が電荷
基及び極性基より成る群から選択される請求項１記載の化合物を混合する工程を
含む、極性材料に蛍光特性を与える方法。 - 【請求項９】 ｉ）アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、カルボニル及びス
ルフヒドリル基より成る群から選択された少なくとも一つの官能基を有する；ま
たは上記少なくとも一つの官能基と共有結合できる少なくとも一つの反応基を有
する、標的材料、及び； ｉｉ）少なくとも一つのＲ1からＲ9及びＲ11基が、アミノ、ヒドロキシル、ホス
ホリル、カルボニル及びスルフヒドリルより成る群から選択された官能基である
；または少なくとも一つのＲ1からＲ9及びＲ11基が、上記少なくとも一つの官能
基と共有結合できる反応基である、請求項１記載の蛍光化合物； を共に、 上記蛍光化合物の上記少なくとも一つの官能基または反応基を、上記標的材料の
上記少なくとも一つの反応または官能基に共有結合させるのに十分な時間、 反応させる工程を含む、標的材料に蛍光特性を与えるための方法。 - 【請求項１０】 請求項１記載の化合物に共有結合された、抗体、脂質、
タンパク質、炭化水素、一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒド
ロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは
含むように誘導化されたヌクレオチド、並びに一つ以上のアミノ、スルフヒドリ
ル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスフ
ァート基を含むまたは含むように誘導化されたオキシ若しくはデオキシポリ核酸
、微生物材料、薬剤、毒素、粒子、プラスチックまたはガラス表面及びポリマー
より成る群から選択された標的材料を含む蛍光ラベル化標的材料。 - 【請求項１１】 ｉ）特異的結合ペアの一つの構成要素を、上記ペアの第二
の構成要素と結合すること、上記第一及び第二の構成要素の間のエネルギー転移
関係をもたらすように、上記第一の構成要素は、蛍光ドナー色素でラベルされ、
上記第二の構成要素は、蛍光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベル
される；及び ｉｉ）放射された蛍光を測定することによって第一及び第二の構成要素の結合を
検出すること； を含み、蛍光ドナー色素が請求項１記載の化合物である、アッセイ方法。 - 【請求項１２】 上記結合アッセイが、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイ
ゼーションアッセイ、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイ、ホルモンレセプター結
合アッセイ、及び酵素アッセイより成る群から選択される、請求項１１記載の方
法。 - 【請求項１３】 ｉ）エネルギー転移関係にある二つの構成要素を分離する
こと、上記第一の構成要素は、蛍光ドナー色素でラベルされ、上記第二の構成要
素は、蛍光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされる；及び ｉｉ）放射された蛍光を測定することによって第一及び第二の構成要素の存在を
検出すること； を含み、蛍光ドナー色素が請求項１記載の化合物である、アッセイ方法。 - 【請求項１４】 該アッセイが、タンパク質溶解性酵素切断アッセイ、ヌク
レアーゼ切断アッセイ、及びリパーゼ切断アッセイから選択される請求項１３記
載の方法。 - 【請求項１５】 ｉ）特異的結合パートナーが請求項１記載の化合物でラベ
ルされる、分析物に対して特異的結合パートナーを提供すること； ｉｉ）分析物−特異的結合パートナー複合体を形成するように分析物を結合する
のに適した条件下で、特異的結合パートナーと、測定される分析物を接触させる
こと；及び ｉｉｉ）結合の度合を測定するために、色素でラベルされた分析物−特異的結合
パートナー複合体の蛍光偏光を測定すること； を含む、サンプル中の分析物の測定方法。 - 【請求項１６】 ｉ）酵素に対して基質を提供すること、上記基質は請求項
１記載の化合物でラベルされる； ｉｉ）酵素反応を開始するのに適した条件下で、酵素とラベル化基質を接触させ
ること；及び ｉｉｉ）反応の度合を測定するためにサンプルの蛍光偏光を測定すること； を含む、サンプル中の酵素の測定のためのアッセイ方法。 - 【請求項１７】 ｉ）配列決定される核酸のサンプル、上記配列決定される
核酸の少なくとも一部に相補的であるプライマー核酸配列、デオキシヌクレオチ
ドと配列決定反応を終結するための少なくとも一つのジデオキシヌクレオチドの
供給、及びポリメラーゼを提供すること； ｉｉ）核酸鎖伸長及び鎖終結反応を実施すること； ｉｉｉ）サイズに従ってオリゴヌクレオチド断片を分離すること； の工程を含み、一つ以上の上記ジデオキシヌクレオチドまたは上記プライマー核
酸配列が、請求項１記載の化合物でラベルされることを特徴とする、核酸の配列
の決定方法。
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