JP4927253B2 - 硬化トリメチンシアニン色素 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、硬化トリメチンシアニン色素、その調製法、蛍光マーカーとしての及び蛍光エネルギー転移複合体におけるその使用法、並びにそれらでラベルされた物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光色素は一般的に周知であり、蛍光顕微鏡、蛍光イムノアッセイ及びフローサイトメトリーのような方法によって、各種の生物学的及び非生物学的材料の蛍光ラベリング及び検出のために使用される。蛍光色素での上記材料のラベリングの典型的な方法は、該色素分子の適切な基とラベルされる材料の適合的な基の間の結合による、蛍光複合体を作製することである。この方法において、細胞、組織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモン、ヌクレオチド、核酸、脂質及びポリサッカリド等のような材料は、化学的にラベルされ、検出若しくは定量され得、または標的材料に対して特異的に結合可能な蛍光プローブとして使用され蛍光検出法によって検出され得る。
【０００３】
蛍光色素の４つの一般的に使用されるクラスは、フルオレセイン（緑色蛍光）、ローダミン（オレンジ色蛍光）、クマリン及びピレン（青色蛍光）クロモホアに基づくものである。フルオレセイン及びローダミンに基づく色素は、多くの欠点を有する。フルオレセイン誘導体は、ｐＨ感受性吸収スペクトルを有し、蛍光はｐＨ８以下で顕著な減少を生ずる。ローダミン誘導体は疎水性であり、水性媒体で使用することが困難である。それらはしばしばタンパク質に結合した場合に強力な蛍光クエンチングを示す。
【０００４】
米国特許第5268486号は、標的材料のアミン、ヒドロキシル、アルデヒド及びスルフヒドリル基に共有結合させることが可能な基を含む、発光モノ及びポリメチンシアニン色素、並びにメロシアニン及びスチリル色素のような関連するポリメチン色素を開示する。該化合物は、緑色、オレンジ色、赤色及びスペクトルの赤外線領域で蛍光を発するように開示される。
【０００５】
米国特許第3679427号は、式（１）に示されるような硬質構造の一部としてトリメチン鎖を含む硬化シアニン色素を記載する：
【化５】
式中、Ｚ及びＺ1のそれぞれは、シアニン色素で使用されるタイプの複素環核を完成するために必要とされる非金属性原子を表し；Ｒは、ハロゲン原子、アルキル基またはアリール基から選択されたメンバーを表し；Ｒ1は、酸素、硫黄、セレンまたは窒素から選択されたメンバーを表す。主題となる色素は、強力な蛍光を示すことが報告され、写真用のハロゲン化銀に対して有用なスペクトル感受性色素であり、並びに塗料、ラッカー等のような広範囲の組成物に対する着色材料として有用である。しかしながら、それらは蛍光ラベリング色素としては記載されていない。
【０００６】
欧州特許出願第747448号は、複素環の窒素原子の間の架橋基によって硬化された、ビス−複素環式モノメチンシアニン色素を記載する。上記化合物は、蛍光化合物に対する所望の溶解性、反応性及び分光学的特性を提供するために選択されたさらなる基で置換できる。該色素は、標的に対して蛍光特性を与えるために、標的材料を共有結合的にラベルするために使用できる。モノメチン硬化シアニンは非常に蛍光性であり、スペクトルの近ＵＶ及び青色（３００−５００ｎｍ）領域で放射する強力な光吸収色素である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
スペクトルの緑色からオレンジ色で強力な蛍光を生産することが可能であり、特に生物学的及び他の標的材料に対する共有結合ラベリングに適した色素にさせる官能基及び／または溶解基をも含む蛍光硬化色素化合物は、上述の文献の何れにも開示されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、スペクトルの４５０−６００ｎｍにおいて吸収及び放射する明るい非常に蛍光性の色素化合物を提供する。それらは、トリメチンシアニンクロモホアに基づき、蛍光の高い量子収率を与える硬質構造を有する。さらにそれらは、生物学的分子のような標的材料及び他の材料上の適切な基と共有結合的に反応するために使用できる官能基または反応基を含み得る。それらはｐＨ非感受性であり、それ故それらは蛍光検出応用で使用できる有用な蛍光ラベリング試薬の範囲を拡張する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
従って本発明は、Ｒ2−Ｒ9基によって任意に置換された式（２）の化合物を提供する：
【化６】
式中、Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ9基は、Ｘ及びＹを含む環に結合し、または任意にＺa及びＺb環構造の原子に結合し；
Ｒ2からＲ9は同じまたは異なり、−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10を含み、Ｒ10は、水溶性を減少する中性基、水溶性を増大する極性基、ラベリング反応において使用できる官能基、反応基、蛍光分子の吸収及び放射波長をシフトする電子供与及び吸引基、脂質及び炭化水素溶解性基から選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状Ｃ1-20アルキル鎖、Ｃ2-20モノエーテルまたはポリエーテル、及び４個までの第二級アミド結合を含むＣ2-20原子鎖より成る群から選択され；
Ｒ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アミノ、アセタール、ケタール、ホスホリル、スルフヒドリル、水溶性基、並びにアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル置換アミノ、第四級アミノ、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、アミド、ニトロ、及びアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基によって任意に置換されたアルキル基から選択され；
Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ11から選択され、式中Ｒ11は置換されたアミノ基であり；
【化７】
式中、Ｒ’は、水素、Ｃ1-4アルキル及びアリールから選択され、Ｒ”は、Ｃ1-18アルキル、アリール、ヘテロアリール、２−７の炭素原子を有するアシル基、及びチオカルバモイル基から選択される。
【００１０】
Ｘ及びＹは、同じまたは異なってもよく、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル、並びに炭素、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗで置換されたＣ4−Ｃ5スピロアルキルから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ2）nＲ12基から選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ12は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノ、第四級アミノ、ニトロ、第一級アミド、置換されたアミド、並びにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホスホリル及びスルフヒドリル基と反応性の基から選択され；
Ｚa及びＺbのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択された５または６の原子を有し；
Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、標的材料上の官能基と共有結合反応するための反応基を含み、または標的材料上の反応基と共有結合反応するための官能基を含み、または
Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである。
【００１１】
好ましいＲ10基は、以下のものから選択される：水素、ハロゲン、アミド、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホナート、第四級アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホナート、任意に置換されたアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、例えばスクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、アンヒドリド、ハロアセトアミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト、酸性ハライド、アルキルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドといった反応基；並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフヒドリル基と反応性の基。
【００１２】
好ましくはＲ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ハロゲン、２６以下の炭素原子のアルキル基、−（ＣＨ2）nＱから選択され、式中１＜ｎ＜２６であり、Ｑはアミノ、アルデヒド、スルフヒドリル、ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル又はスルフヒドリルと反応性の基から選択され、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4及びＲ5は水素である。
【００１３】
適切なＲ12は、水素、アミノ、スルホナート、カルボキシラート、アリール、ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基から選択される。
【００１４】
ビス−置換炭素は、ビスＣ1−Ｃ4アルキル基及びＣ4−Ｃ5スピロアルキル基を含む。
【００１５】
アルキルは、１−２６の炭素原子を含む、適切には１−１２の炭素原子、好ましくは１−６の炭素原子を含む直鎖状または分枝状鎖アルキル基である。
【００１６】
アリールは、６−１０の炭素原子を含む一つまたは二つの融合した芳香族環を含む芳香族置換基であり、例えばフェニルまたはナフチルである。アリールは、場合により且つ独立して、上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一つ以上の基によって置換されてもよい。
【００１７】
ヘテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択され得る少なくとも１且つ３以下のヘテロ原子を含む一または二環式５−１０員環芳香族環系である。ヘテロアリールは、場合により且つ独立して上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一つ以上の基によって置換されてもよい。
【００１８】
アラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基によって置換されたＣ1−Ｃ6アルキル基である。
【００１９】
ハロゲン及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択されたものである。
【００２０】
Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基、並びにＲ基が反応するであろう基の特異的な例は、表１に提供される。代わりに、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基は、標的分子の反応基と反応するであろう表１の官能基であってもよい。
表１：考え得る反応性置換基及びその反応性の部位
【表１】
【００２１】
表１に挙げられた基に加えて、数多くの他の基が、本発明の化合物のＲ1−Ｒ9及びＲ11部位において反応性の置換基として考慮される。例えば、利用可能なアミノ及びヒドロキシ官能基を有する標的構成成分をラベルするために特に有用である反応基は、以下のものを含む：
【化８】
式中、ｎ＝０または１−１０の整数であり、Ｒ13またはＲ14の少なくとも一つは、Ｉ、ＢｒまたはＣｌのような脱離基である。
【００２２】
利用可能なスルフヒドリル官能基で標的構成要素をラベルするために特に有用な考え得るＲ1−Ｒ9及びＲ11基の特異的な例は、以下のものを含む：
【化９】
式中、ｎ＝０または１−１０の整数であり、Ｒ15は、ＩまたはＢｒのような脱離基である。
【００２３】
光活性化架橋によって標的構成成分をラベルするために特に有用なＲ1−Ｒ9及びＲ11官能基の特異的な例は、以下のものを含む：
【化１０】
【００２４】
水溶性を増大する、またはサンプル中の不適切な構成成分に対する蛍光的にラベルされた構成成分の非所望の非特異的結合を減少する目的のために、または蛍光のクエンチングを導くであろうラベルされた構成成分上の二つ以上の反応性クロモホアの間の相互作用を減少するために、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11官能基は、周知の極性及び電気的に荷電した化学基から選択できる。上記基の例は−Ｅ−Ｆ−であり、ここでＦは、ヒドロキシ、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノまたは第四級アミノであり、Ｅは、ｎが０−６である−（ＣＨ2）n−のようなスペーサー基である。−Ｅ−Ｆ−基の有用な例は、−（ＣＨ2）3ＳＯ3及び−（ＣＨ2）4ＳＯ3のようなＣ1-6アルキルスルホナートを含む。
【００２５】
蛍光色、水溶性、及び反応基または官能基の位置を調節するための能力を示す本発明の例示的な化合物は、以下のものである。
i) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｉ）；
ii) 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）；
iii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）；
iv) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）；
v) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）；
vi) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）；
vii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c]ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩ）；
viii) 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）；
ix) 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）；
x) 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｘ）。
【００２６】
ここで提供される基は、本発明の化合物のＲ部位で取り込まれ得る基の全ての包含物を意味しない。本発明の化合物によってラベルされる材料上の基と反応するであろう各種の他の基が存在すると解されよう。Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位での上記他の基の取り込みによって生産される化合物は、本発明によって包含されるものと企図される。
【００２７】
本発明の化合物は、数多くの生物学的及び非生物学的応用で使用され得る。非生物学的応用に関しては、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で一つ以上の非電荷基を有する本発明の化合物、例えばＣ1-26アルキル及びアリール部分が、非極性材料に蛍光特性を提供するために該材料中に溶解され得る。上記非極性材料は、例えば塗料、ポリマー、ワックス、油、インク及び炭化水素溶媒を含む。本発明の別の非生物学的応用は、極性溶媒、または例えば水、エチレングリコール、メチルアルコール、若しくは水とメチルアルコールの混合物のような他の材料中に、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で一つ以上の電荷及び／または極性基を有する本発明の化合物を溶解することである。上記電荷Ｒ基は、例えば−ＮＲ3 +、−ＳＯ3 -、−ＰＯ3 -及び−ＣＯＯ-を含む一方で、上記極性Ｒ基は、例えばヒドロキシル基を含む。生物学的応用に関しては、生物学的分子は、本発明の複合体を使用して非共有結合的にラベルされ得る。例えば、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば第四級アミノといった電荷を含む場合の本発明の複合体は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡのような電荷生物学的分子を非共有結合するために使用され得る。さらに、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば長鎖アルキルといった非電荷基である場合の本発明の化合物は、例えば生物学的脂質のような非電荷生物学的分子を結合するために使用され得る。
【００２８】
別法として、本発明の化合物は、該複合体を含むポリマーの形成に適した重合可能基を含んでもよい。適切な重合可能基は、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、ビニル及びスチリルから選択される。重合は、蛍光化合物を含むコポリマーを形成するために、スチレンまたはビニルトルエンのような第二の重合可能モノマー開始材料で接合されるように使用される本発明の適切な誘導化化合物で実施され得る。別法として、本発明の蛍光化合物は、重合可能基を有する必要がなく、例えば該化合物は、重合または粒子形成の間に取り込まれ、またはポリマー粒子内若しくはその上に吸着されてもよい。
【００２９】
本発明の色素はまた、Boyer及びMorganに対する米国特許第4916711号に示される方法に従ってレーザー色素として使用され得る。レーザー色素は蛍光でなければならず、０．５６または０．５７より大きい量子収率を有さなければならず、且つかなり光安定性でなければならない。本発明の化合物は、これらの必要性のそれぞれを満たす。さらに本発明の色素は、織り込み色素、写真用色素、及び有機伝導体として使用され得る。
【００３０】
本発明の化合物はまた、標的材料に対して蛍光特性を与えるために、標的材料を共有結合ラベルして使用され得る。本発明の化合物を使用する共有結合ラベリングは、生物学的または非生物学的応用の何れにも利用され得る。非生物学的応用においてラベルされ得る標的材料の例は、例えばセルロースベース材料（例えば紙を含む）、織物、石油ベース製品、写真用フィルム、ガラス、ポリマー並びにゲル濾過及びクロマトグラフィー媒体を含む。
【００３１】
本発明の化合物を使用する共有結合ラベリングは、上記定義されたような少なくとも一つの官能基または反応基を有する標的で達成され得る。該標的は、標的材料の官能基または反応基と共有結合できる上述のような反応基または官能基を含む、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11を有するかなりの量の本発明の化合物とインキュベーションされ得る。標的材料及び本発明の化合物は、該標的材料を本発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下で十分な時間インキュベーションされる。
【００３２】
Ｒ1−Ｒ9及びＲ11は、本発明の化合物が異なる標的化合物と反応し、及び／または異なるスペクトル特性を有し、それによって複数の分析で使用できる数多くの関連化合物を提供するように選択され得るが、その場合単一のサンプル中の各種の化合物の存在及び量は、検出された数多くの蛍光放射の波長及び強度に基づいて識別されなければならない。本発明の化合物は、Ｒ基の適切な選択によってラベルされる材料を含む水性、他の極性、または非極性媒体中に可溶性にされ得る。
【００３３】
本発明はまた、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で少なくとも一つの反応基を含む本発明の化合物が、標的材料のアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、カルボキシル、スルフヒドリルまたは他の反応基と反応するラベリング法に関する。上記標的材料は、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭化水素、一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化されたヌクレオチド、並びに一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、毒素、粒子、プラスチックまたはガラス表面及びポリマーよりなる群を制限することなく含む。本発明の化合物はまた、EPA 747700に記載された型の蛍光共鳴エネルギー転移複合体における使用、または蛍光偏光若しくは蛍光クエンチングベース応用のために、さらなる蛍光または非蛍光化合物にカップリングするように使用され得る。
【００３４】
上述の単一工程ラベリング法に加えて、本発明はまた、二工程ラベリング法に関し、そこでは第一の工程において、本発明の化合物は、抗体のような一次構成要素と共有結合で反応し、それによってラベルする。二工程法の第二または染色工程において、蛍光ラベルされた一次構成要素は、抗体が特異的である抗原のような二次構成要素に対するプローブとして使用される。上記ラベルされた抗体の標的が細胞である場合、該方法の第二の工程は、該細胞の蛍光の強度を測定することによってその型の細胞に結合するラベル抗体の量を測定するために使用され得る。この二工程法によって、本発明の蛍光化合物と、第一の工程で共有結合でラベルされたモノクローナル抗体及び他の構成要素が、抗原プローブとして使用できる。
【００３５】
本発明の化合物は、系における特定のタンパク質または他の構成要素の濃度を測定するために使用され得る。もしプローブと反応できるタンパク質の反応基の数が周知であれば、分子当たりの蛍光は周知となり得、系におけるこれらの分子の濃度は、系の全蛍光強度によって測定できる。この特定の方法は、ミクロタイタープレートリーダーまたは他の周知の免疫学的蛍光検出システムを使用して、各種のラベル化分析物の濃度を測定するために使用できる。
【００３６】
本発明の化合物はまた、例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベース法、蛍光存続期間を使用して、または蛍光偏光測定によって、分析物の検出及び測定のための蛍光ラベルを使用するアッセイ方法体系において有用である。
【００３７】
生物学的系における蛍光共鳴エネルギー転移色素ペアの使用は周知であり、それらはＦＲＥＴを使用するアッセイにおける結合現象または切断反応の検出において使用されている。上記アッセイの例は、平衡結合アッセイ（例えばイムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、タンパク質結合アッセイ及びホルモンレセプターアッセイ）、及びタンパク質溶解性切断アッセイ、ヌクレアーゼによるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の切断、若しくはリパーゼによる脂質の切断のような酵素アッセイを含む。
【００３８】
本発明の化合物を利用する結合アッセイは、特異的結合ペアの一つの構成要素を、特異的結合ペアの第二の構成要素と結合させることによって実施でき、第一の構成要素は本発明に従った蛍光ドナー色素でラベルされ、第二の構成要素は蛍光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされ、第一及び第二の構成要素の間のエネルギー転移関係をもたらし、そして放射された蛍光の測定により第一及び第二の構成要素の結合を検出する。特異的結合ペアの例は、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／アビジン（ストレプタビジン）、ホルモン／レセプター、酵素／基質または共因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／ 結合タンパク質を制限することなく含む。本発明において、本発明の色素が特異的な結合ペアの一つの構成要素をラベルするために使用され得、次いで該一つの構成要素が他の構成要素に対する結合の検出において使用され得るように、互いに対して特異的な結合親和性を有するいずれかの分子が使用され得る。
【００３９】
本発明の色素はまた、酵素切断アッセイフォーマットにおいて使用され得、その場合例えばペプチドといった酵素基質は二つの構成要素を含み、その一方は本発明の蛍光ドナー色素でラベルされ、他方は蛍光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされ、切断される基質結合のそれぞれの側のエネルギー転移関係において基質に結合する。周知のまたは推定の酵素インヒビター化合物は、反応混合物において任意に含まれる。酵素による基質の切断は、ドナー及びアクセプター色素の分離を引き起こし、ドナー及びアクセプター種の共鳴エネルギー転移の損失及び蛍光放射の変化を導く。
【００４０】
エネルギー転移色素ペアを形成する本発明の色素と組み合わせ得る適切な蛍光アクセプター色素は、ローダミン及びシアニン色素を含む。特に好ましい色素はシアニン色素であり、Ｃｙ５（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-ジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-4,5,4',5'-(1,3-ジスルホナト)-ジベンゾ-ジカルボシアニン）及びＣｙ７（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-トリカルボシアニン）を含む。適切なクエンチングアクセプター色素は、ＤＡＢＣＹＬ（4-(4-ジメチルアミノフェニル)アゾ安息香酸）である。
【００４１】
本発明の色素はまた、蛍光偏光測定を利用する結合アッセイまたは酵素切断アッセイにおいて使用され得る。結合アッセイフォーマットにおいて、サンプル中の分析物のアッセイは、分析物に対して特異的結合パートナーを提供することによって実施され、該特異的結合パートナーは本発明に従って色素でラベルされ、ラベルされた特異的結合パートナーの蛍光偏光を測定し、分析物−特異的結合パートナー複合体を形成するように分析物を結合するのに適した条件下で、ラベルされた特異的結合パートナーと分析物を接触させ、結合の度合を測定するためにラベルされた分析物−特異的結合パートナー複合体の蛍光偏光を測定する。
【００４２】
第二のフォーマットにおいて、酵素活性の検出のためのアッセイは、以下のように構築され得る。プロテアーゼ酵素及び本発明に従って色素でラベルされた蛍光基質を組み合わせることによって、反応混合物を調製する。周知のまたは推定のインヒビター化合物を、反応混合物に任意に含ませても良い。酵素による基質の切断は、ラベル化断片の生産を導く。反応の進行は、蛍光偏光の変化を観察することによってモニターされる。
【００４３】
本発明の蛍光化合物はまた検出法において使用でき、その場合複数の蛍光化合物が抗体のような複数の異なる一次構成要素に共有結合され、各一次構成要素は、二次構成要素の混合物における複数の二次構成要素のそれぞれを同定するために、抗原のような異なる二次構成要素に特異的である。この方法の使用に従って、一次構成要素のそれぞれは、他の一次構成要素をラベルするために使用される色素分子と比較して、異なる光吸収及び放射波長特性を有する蛍光化合物で別々にラベルされる。一次構成要素と称されるものは、抗原のような二次構成要素を含む調製物に加えられ、一次構成要素は、それらが選択的であるそれぞれの二次構成要素に結合させられる。
【００４４】
いずれかの非反応性のプローブは、分析物との干渉を避けるために、例えば洗浄によって調製物から除去され得る。次いで該調製物は、特定の蛍光化合物の吸収波長を含む一定範囲の励起波長にさらされる。次いで蛍光顕微鏡、またはフィルター若しくはモノクロメーターを励起波長の光線を選択し、且つ蛍光の波長を選択するようにさせたフローサイトメトリー若しくは蛍光分光光度計のような他の蛍光検出システムを、利用される蛍光化合物に相当する放射波長の強度、特定のラベル化一次構成要素と結合している二次構成要素の量を示す蛍光の強度を測定するために使用する。複数のパラメーターの蛍光実験を実施するための周知の方法は、例えば複数パラメーターフローサイトメトリーを含む。
【００４５】
特定の場合において、単一の励起波長が、混合物中の二つ以上の材料から蛍光を励起するために使用でき、その場合それぞれは異なる波長で蛍光を生じ、各ラベル化種の量は、それぞれの放射波長での個々の蛍光強度を検出することによって測定できる。所望であれば、光吸収法もまた使用できる。
【００４６】
本発明の検出法は、蛍光一次構成要素の作成が可能であるいずれかの系に適用できる。例えば、適切な反応性の蛍光化合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片に接合され、次いで生じた接合物はＤＮＡまたはＲＮＡの相補的標的鎖への結合を生ずる。次いで適切な蛍光検出装置が、結合した蛍光接合物の存在を検出するために使用できる。
【００４７】
本発明はまた、本発明の化合物と、例えばタンパク質、ペプチド、炭化水素、核酸、誘導化された核酸、脂質、特定の他の生物学的分子、生物学的細胞、可溶性ポリマー、ポリマー粒子、ポリマー膜、ガラス表面及び他の粒子と表面のような材料のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、ホスホリルまたは他の周知の官能基の間の共有結合反応に関する。蛍光の検出は非常に鋭敏な光学的方法を含むため、これらの色素「ラベル」の存在は、ラベルが非常に少量で存在する場合にさえ検出及び定量できる。それ故、色素ラベリング試薬は、ラベルされている材料の量を測定するために使用できる。
【００４８】
例えばフルオレセインと比較して、本発明の硬化トリエチンシアニンは、特に光安定であり、ｐＨ２からｐＨ１０の間のｐＨ変化に非感受性である。本発明の化合物は、最大４５０から６００ｎｍ（スペクトルの緑からオレンジ領域）の間の波長で光を吸収し且つ放射し、それ故テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、ＢＯＤＩＰＴ及びフルオレセインの代替物となる。
【００４９】
本発明は、任意にＲ2−Ｒ9基によって置換された以下の式（Ａ）の化合物を処理することを含む式（２）の化合物の調製法を提供する：
【化１１】
式中、Ｘ、Ｙ、Ｚa、Ｚb及びＲ1，Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ6，Ｒ7，Ｒ8及びＲ9は上記記載され、Ｒは酢酸のような穏やかな酸性溶液中でメチルまたはエチルである。適切には反応混合物は、還流条件下で加熱され、その際硬化カルボシアニン色素は溶液から沈殿する。別法として該反応は、硫酸のようなより強力な鉱物酸溶液で、例えば環境温度といったより低温で実施され得る。クロロホルムのような溶媒で反応混合物に含まれることが有利であろう。
【００５０】
本発明のアミノ及びヒドラジノ置換カルボシアニン色素の場合、これらは硬化色素を調製するために使用される酸性溶液中に適切なアミンまたはヒドラジノ誘導体を含ませることによって一般式（Ａ）の中間体から調製され得る。
【００５１】
Ｘ及びＹが同一でありＺa及びＺb構造が同一である構造式（Ａ）の対称な化合物は、任意にＲ2、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7基によって置換された構造式（Ｂ）の化合物を反応させることによって調製され得る：
【化１２】
式中、Ｚa及びＸ、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ6及びＲ7は上述のように定義され、Ｒは非硬化トリメチンを調製するために適切な溶媒媒体中でオルトギ酸エチルのような適切なオルトエステルでメチルまたはエチルである。該反応は、還流下での加熱によってピリジンのような溶媒中の溶液で適切に実施される。オルトエステルを適切に置換することによって、接合したトリメチン鎖の中央または中間炭素原子は、Ｒ1基によって表されるような各種の置換基で置換され得る。例えばオルト酢酸エチルでの反応混合物中のオルトギ酸エチルの置換は、トリメチンシアニン色素を生産し、そこで中間水素はメチル基で置換される。
【００５２】
Ｘ及びＹが異なる場合の構造式（Ａ）の非対称化合物は、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6，Ｚa及びＸが上述のように定義されるＲ5及びＲ6基で任意に置換された式（Ｂ）の化合物を、Ｒ8及びＲ9基によって任意に置換された以下の式（Ｃ）の化合物で反応することによって調製できる：
【化１３】
式中、Ｒ1，Ｒ4，Ｒ5，Ｒ8，Ｒ9，Ｙ及びＺbは上述のように定義され、Ｒはメチルまたはエチルのようなアルキル基であり、Ｒaはアセチル、プロピニル及びベンゾイルのようなアシル基であり、Ｒbは水素、メチル若しくはエチルのようなアルキル基、またはフェニルのようなアリール基である。該反応は無水酢酸溶液中で１：１のモル比で適切に実施される。
【００５３】
中間体化合物（Ｂ）は、Ｘ、Ｚa、Ｒ6及びＲ7が上述のように定義される任意にＲ6及びＲ7基によって置換された以下の式（Ｄ）の適切な複素環塩基のヒドロハロゲン化物酸の塩を、Ｒ2及びＲ3が上述のように定義される以下の式（Ｅ）の化合物で反応させることによって調製され得る：
【化１４】
【化１５】
該反応は有利には、過剰な試薬（Ｅ）で、両者の試薬を溶解する穏やかな極性の不活性溶媒中で実施されるが、該溶媒は反応生成物のための溶媒ではない。上記媒体の例は、アセトニトリルのような溶媒である。反応は適切には、７０℃といった上昇した温度で実施される。酢酸のような酸が、反応を容易にするために反応混合物に加えられても良い。特別の例として、Southwick等(Org. Prep. Proceed. Int. 20, 279-84, 1989)の方法によって調製された、(2,3,3-トリメチル-3H-インドール-5-yl)-酢酸のヒドロブロミド塩が、溶媒として酢酸を含むアセトニトリル中のアセロレインジエチルアセタールと反応される。該反応は、適切には７０℃の温度で実施される。
【００５４】
式（Ｃ）の中間体は、以下の式（Ｆ）のホルムアミドで２位にメチル置換基を含む構造式（Ｂ）の化合物の反応によって調製され得る：
【化１６】
式中、Ｒ1及びＲbは上述のように定義され、Ｒcはフェニルまたは置換されたフェニルである。適切には該反応は、例えば無水酢酸、無水プロピオン酸または氷冷酢酸といった酸縮合試薬を使用して、１．５モル過剰のホルムアミジンで構造式（Ｂ）の第四級塩を縮合することによって実施される。無水酢酸は、該反応のための特に好ましい縮合試薬である。別法として縮合反応は、いずれかの添加物なしで実施されても良い；しかしながら酸縮合は、トリメチン鎖の中央または中間炭素原子で置換された硬化トリメチンシアニン色素の生産のために好ましい。例えば英国特許第412309号参照。
【００５５】
（Ｄ）のような式の前駆体化合物は、当業者に周知の方法によって調製され得る。例えば米国特許第4981977号参照で、この特許の全開示は参考として取り込まれる。
【００５６】
式（２）の特定の化合物は、当業者に周知の方法によって式（２）の他の化合物に変換するための中間体として有用であり得る。同様に、特定の中間体は、式（２）の誘導体の合成のために有用であり得る。本発明の化合物は、ここに開示された方法によって合成できる。特定の有用性を有する化合物の誘導体は、適切な前駆体を選択することによって、または各種の位置で官能基を含むように周知の方法によって生じた化合物を修飾することによってのいずれかで調製される。例として、本発明の複合体は、蛍光ラベル化試薬を調製するために特定の反応基を含むように修飾され得、または荷電若しくは極性基が極性または非極性溶媒または材料における該化合物の溶解性を増大するために加えられ得る。変換の例として、エステルがカルボン酸に変換され得、またはアミド誘導体に変換され得る。
【００５７】
以下のものは、本発明の化合物の合成の特異的な実施例、及びそれらの化合物について観察されたスペクトルデータである。
【００５８】
【実施例】
実施例１．6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（R-Cy3.12.OH; 化合物Ｉ）
【化１７】
１．１ 5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドリン
5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドリンを、Southwick等, Org. Prep. Proceed. Int., 20, 274-84, (1989)の方法、または別法として以下に記載の方法のいずれかによって調製した。
【００５９】
＜０℃で３：２の水：濃縮ＨＣｌ（３３ｍｌ）溶媒混合物中の4-アミノフェニル酢酸（５ｇ、３３．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、水（４３ml）中の硝酸ナトリウム（２．７ｇ、３９ｍｍｏｌ）の冷却（＜０℃）溶液を滴定して加えた。次いで反応混合物を、さらに３０分間低温下で維持した。二酸化硫黄の飽和水溶液（１４０ｍｌ）を加え、反応混合物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃で数時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得られた黄色のヒドラジン中間生成物を酢酸（５４ml）中に再溶解し、酢酸カリウム（７．０５ｇ、７１．８ｍｍｏｌ）及びメチル−イソプロピルケトン（６．８４ｇ、７９．４ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過して濃縮した。5-エトキシカルボニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、赤色の固体として得た（４．８ｇ、６７％）。精製は必要ではなかった；ｍ／ｚ(Maldi)：２１７。
【００６０】
１．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル-5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドレイン、エチルエステル
環境温度でエタノール（４０ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドレイン（２ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、臭化水素酸（４８％水溶液の３．１６ｍｌ）を加えた。１時間後反応溶媒を真空下で除去した。ヒドロブロミド塩を、アセトニトリル（４０ｍｌ）及び酢酸（４００ml）中に再溶解し、アクロレインジエチルアセタール（１８．１７ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を７０℃で２０分温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は緑色の油として得られた（１．２４ｇ、３６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：３７６．２。
【００６１】
１．３ 5,5'-ジカルボキシメチル-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン-エチルエステル
１２０℃でピリジン（１０ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル-5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエーテル（３５６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、３０分でオルトギ酸（９８ｍｇ、６６ｍｍｏｌ）を滴定して加えた。２時間後反応混合物を冷却した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（２５１ｍｇ、３５％）；λmax：５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７６１．４。
【００６２】
１．４ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
環境温度でクロロホルム（１０ｍｌ）中の5,5'-カルボキシメチル-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエーテル（１００ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、５０％水性硫酸（２ｍｌ）を加えた。３０分後、反応溶媒をクロロホルム（１０ｍｌ）で希釈し、水（３×１０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過及び濃縮した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（６５ｍｇ、９０％）；λmax：５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５３９．２。
【００６３】
１．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル
環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体への変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
【００６４】
１．６ タンパク質ラベリング法
化合物ＩのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルのストック溶液を、乾燥ＤＭＦ（１ｍｇ活性エステル／１００μｌ）中で調製した。ヒツジＩｇＧ（１ｍｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を２５０μｌ緩衝溶液（ｐＨ９．４）に溶解し、所望の量の色素を強力なボルテックス混合の間に加えた。非接合色素を、溶出液としてｐＨ７の緩衝溶液を使用してゲル浸透クロマトグラフィー（Sephadex G-50の０．７×２０ｃｍカラム）によってラベル化タンパク質から分離した。ラベル化抗体溶液の吸収スペクトルを記録した（図１参照）。サンプルについてのタンパク質に対する色素の割合を、５６０ｎｍでのラベル化色素の吸光度の値と２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度の値を測定して、以下の等式を使用して決定した。
【００６５】
分母の因子Ｘは、最大の吸収（Ａdye）で色素の吸収のａ％である２８０ｎｍでの色素の吸光を説明する。Ｘの値は、硬質色素について０．１７である。
【００６６】
１．７ スペクトル特性の比較：硬化Ｃｙ３（化合物Ｉ）及び開いた鎖のＣｙ３
硬化色素のスペクトル特性を、周知の開いた鎖のＣｙ３．１８ＯＨ及びＣｙ３．１０ＯＨ色素と比較した（図２）。吸収及び放射スペクトルを図３及び４に示す。硬質色素の吸収最大は、メタノール中で１２ｎｍまで赤色にシフトし、と即されたようにそれは非硬質インドシアニンより１０−１２倍明るい。その結果が以下の表２に示される。
【表２】
【００６７】
色素の光ブリーチングを、同一の条件下で実験した。等濃度の色素（水中に１．５×１０-5ｍｍｏｌ溶液の３ｍｌ）のサンプルを、５１４ｎｍのレーザー光線（３０ｍＶ、直径１ｃｍの光線）にさらし、吸収を５０分間で数分間隔で記録した。その結果が図５に示される。硬化色素はより早くブリーチすると予測される。しかしながら、その高い量子収率のため、硬化色素はフローサイトメトリー及びサンプルが短い期間さらされる他のイメージング実験に適するであろう。
【００６８】
実施例２．8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）
【化１８】
２．１ 6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニン
濃縮硫酸（５００ｍｌ）中の2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）-インドレニン（１００ｇ、４７８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を１８０℃で加熱した。２時間後、該溶液を環境温度に冷却し、次いで氷上に注いだ。反応混合物を、５０％水酸化ナトリウム（３０００ｍｌ）を加えることによって塩基性にした。生じた沈殿を濾過し、自ら再結晶化し、乾燥させた。生成物を白色固体として得た（７．２５ｇ、５４％）。
【００６９】
２．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（２ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１６９ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）及び酢酸（１０μｌ）での6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニン（２５ｍｇ、０．００８７ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。分解が観察されたため、該化合物を精製しなかった。生成物はパール上の黄色油として得られた。
【００７０】
２．３ 6,6'-ジスルホナト-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インド-カルボシアニン
6,6'-ジスルホナト-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカルボシアニンを、セクション１．３に記載のものと類似の方法によってピリジン（５ｍｌ）中のオルトギ酸トリエチル（５１．２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）と1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニンの反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク／紫色の固体として得られた；λmax（ＭｅＯＨ）５８０ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：８５２。
【００７１】
２．４ 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム
8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（５ｍｌ）及び５０％硫酸（１ｍｌ）中の6,6'-ジスルホナト-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカルボシアニン（３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、発光性のピンク／紫色の固体として得られた；λmax（ＭｅＯＨ）５９８ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６８４。
【００７２】
実施例３．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）
【化１９】
３．１ 5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン
環境温度で酢酸（２０５ｍｌ）中の4-ヒドラジノベンゼンスルホン酸（６８ｇ、３６１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、3-メチル-2-ブタノン（８８．４４ｇ、１０２７ｍｍｏｌ）を加えた。該反応物を還流下で加熱した。３時間後、該溶液を冷却し、生じたピンク色の沈殿を濾過し、酢酸（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた。生成物をメタノール（８００ｍｌ）中に再溶解し、イソプロパノール（２００ｍｌ）中の水酸化カリウム（２０．４ｇ、３６４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた黄色の固体を濾過し、乾燥させた（４８ｇ、５６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２４０。
【００７３】
３．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-ジエトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法を使用して、アセトニトリル（４０ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（８．５４ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）及び酢酸（１ｍｌ）と、5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンカルシウム塩（１ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、緑色の油として得られた（７４０ｍｇ、５２％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：３７０．１。
【００７４】
３．３ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェノルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン
無水酢酸（２５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン-エチルエステル（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、N,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１１０℃に温めた。３０分後、該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、パール上の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５２１．２。
【００７５】
３．４ 5-カルボキシメチル-5'-スルホナト-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエステル
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の、5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エトキシ-2,3,3-トリメチルインドレニン（９６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)2,3,3-トリメチルインドレニン（６７．７ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ、２４％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７５５．３。
【００７６】
３．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（１０ｍｌ）と５０％硫酸（２ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-5'-スルホナト-1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエステル（３３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ、２４％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５６１。
【００７７】
３．６ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル
環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体への変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
【００７８】
実施例４．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）
【化２０】
環境温度でジメチルホルムアミド（１００ｍｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（１ｍｇ、０．００２４ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（０．８２ｍｇ、０．００３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（１ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、グリシン（０．２ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ）を加え、該溶液をさらに３時間攪拌した。生成物を、４ｍｌ／分で水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（０．２２ｍｇ、３０％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６１８。
【００７９】
実施例５．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）
【化２１】
環境温度でジメチルホルムアミド（５００ｍｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、tert-ブチル-N-(2-アミノエチル)-カルバマート（１．４ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加え、該溶液をさらに２時間攪拌した。溶媒を真空下で除去した。生成物を、９５％水性トリフルオロ酢酸溶液中に溶解し、２時間攪拌した。生成物を、アセトニトリル／水（０．１％ＴＦＡ含有）の勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．６ｍｇ、３０％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６０３．１。
【００８０】
実施例６．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）
【化２２】
６．１ 5-フタルイミドメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
環境温度で濃縮硫酸（１００ｍｌ）中の2,3,3-トリメチルインドレニン（２０ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、部分的にN-ヒドロキシメチルフタルイミド（２０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）を加えた。７０時間後、反応混合物を氷上に注ぎ、濃縮水酸化アンモニウムで塩基性にした。生じた沈殿を濾過し、乾燥した。生成物は、黄色の固体として得られた（３４．８４ｇ、８７％）。
【００８１】
６．２ 5-アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
環境温度でメタノール（５０ｍｌ）中の5-フタルイミドメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（１０ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水和ヒドラジン（１３．１ｇ、４０９ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、沈殿を形成した。反応混合物を、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ１に調節し、溶媒を真空下で除去した。得られた固体を１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、セライトを通じて濾過した。濾過物をジクロロメタンで洗浄し（３×４０ｍｌ）、水相を６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１２に調節し、次いでジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過して、真空下で濃縮し、パール上の黄色固体を得た（４．９８ｇ、８４％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：１８８。
【００８２】
６．３ 5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
ギ酸メチル（３０ｍｌ）中の5-アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（４．９８ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を、２２時間窒素環境の下で還流した。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物は、パール上の茶色の油として得られた（５．４ｇ、９４％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２１７．１。
【００８３】
６．４ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション１．２に記載のものと類似の方法によって、アセトニトリル（４０ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（９ｇ、６９．１ｍｍｏｌ）及び酢酸（１ｍｌ）と、5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（１ｍｇ、２４．８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．２０ｍｇ、６９％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３４７。
【００８４】
６．５ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）（セクション３．２に記載されたように調製された）の反応によって調製した。分解が観察されたため、生成物を精製しなかった。生成物は黄色の油として得られた。
【００８５】
６．６ 1,1-ジ-(3,3'-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'-スルホナト-インドカルボシアニン
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３７ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（２５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時間７０℃に温めた。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（１６ｍｇ、１５％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７２６．１。
【００８６】
６．７ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'-スルホナト-インドカルボシアニン（５ｍｇ、０．００６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（３．３ｍｇ、９０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６４ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５６０。
【００８７】
６．８ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
１：１２の濃縮ＨＣｌ：メタノール（５ｍｌ）中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを１２時間攪拌した。反応溶媒を真空下で除去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．９ｍｇ、５０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６０ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５３２。
【００８８】
実施例７．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩ）
【化２３】
７．１ 5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
＜０℃で３：２の水：濃縮ＨＣｌ（７３ｍｌ）の溶媒混合物中に4-(2-ヒドロキシ）エチル-アニリン（１０ｇ、７３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水（８６ｍｌ）中の冷却（＜０℃）硝酸ナトリウムの溶液（６ｇ、７３ｍｍｏｌ）を滴定して加えた。次いで反応混合物を、さらに３０分低温で維持した。二酸化硫黄の飽和溶液（１５０ｍｌ）を加え、該反応物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃でさらに１時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得られた黄色のヒドラジノ中間生成物を、酢酸（１２０ｍｌ）と酢酸カリウム（１６ｇ、１６３ｍｍｏｌ）中に再溶解し、メチル-イソプロピルケトン（１５．５ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．１８ｇ、８％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２０４．１。
【００８９】
７．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（４ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１．１３ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）、酢酸（１００μｌ）と、5-ヒドロキシ-2,3,3-トリメチルインドレニン（１１８ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、パール状の茶色の油として得られた（２４ｍｇ、１２％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３３１。
【００９０】
７．３ 5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン
5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。分解が観察されたため、生成物は精製しなかった。生成物は黄色の油として得られた。
【００９１】
７．４ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-インドカルボシアニン
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸；無水酢酸（５ｍｌ）中の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3'-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時間７０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（８．６ｍｇ、１０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７１２。
【００９２】
７．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載された方法に従って、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-インドカルボシアニン（４．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（２．８ｍｇ、９０％）；λmax５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５４７。
【００９３】
実施例８．6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）
【化２４】
８．１ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾール
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾールを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（４ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１．６４ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）と酢酸（１００μｌ）と、2-メチルベンゾチアゾール（１２５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は無色の油として得られた（２２０ｍｇ、９５％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２８０。
【００９４】
８．２ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル
5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステルを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はパール状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５２１。
【００９５】
８．３ 14-カルボキシメチル-1,1'-ジ(ジエトキシプロピル)−ベンズチアゾレニン-インドカルボシアニン、エチルエステル
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル（２８ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチル-ベンゾチアゾール（１５．１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１４．３ｍｇ、２０％）；λmax５４９ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６６５．３。
【００９６】
８．４ 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a,3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a,3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の（化合物名）（５ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３．２ｍｇ、９０％）；λmax５６２ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：４７１。
【００９７】
実施例９．6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）
【化２５】
９．１ 1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニン
1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニンを、セクション１．３に記載されたものと類似の方法によって、ピリジン（５ｍｌ）中のオルトギ酸トリエチル（４０．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）と、1-ジエトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン（２５．４ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリルの０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の固体として得られた（６．３ｍｇ、１２％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７５０。
【００９８】
９．２ 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
無水酢酸（２ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニン（２ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、4-ヒドラジノフェニル酢酸（０．８９ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１００℃に温めた。１０分後、該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、８ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク／紫色の固体である、二つのジアステレオマーの化合物として得られた（０．０４ｍｇ、２％、０．０６ｍｇ、３％）λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７１７．２０。
【００９９】
実施例１０．6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｘ）
【化２６】
１０．１ 臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリン
2-メチルキノリン（１．６ｇ、０．０１１ｍｏｌ）及び2-(2-ブロモエチル)-1,3-ジオキソラン（７．７ｇ、０．０４３ｍｏｌ）を、８５℃で１６時間共に熱した。冷却時に、反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、生じた固体を濾過し、エーテルで洗浄して乾燥した。臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリンを、茶色の固体として得た（０．９８ｇ、２７％）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）２４４。
【０１００】
１０．２ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステル
5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステルを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドリンエチルエステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はパール状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５２１。
【０１０１】
１０．３ 14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-1'-(3,3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシアニン、エチルエステル
環境温度でエタノール（０．５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステル（１６．１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、エタノール（０．５ｍｌ）とトリエチルアミン（１２５μｌ、０．９ｍｍｏｌ）中の臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリン（１０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、反応溶媒を真空下で除去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた（１０ｍｇ、５１％）、λmax５６７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６２９。
【０１０２】
１０．４ 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（２ｍｌ）と５０％硫酸（０．４ｍｌ）中の14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-1'-(3,3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシアニン、エチルエステル（５ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた（１．６ｍｇ、４４％）；λmax５８４ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：４６５。
【０１０３】
実施例１１．硬質Ｃｙ−３−Ｃｙ−５接合物の調製（化合物Ｘ）
【化２７】
環境温度でジメチルスルホキシド（１００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス(テトラメチレン)ウロニウム（１ｍｇ、０．００２４ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（０．６８ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-6,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（１ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）を加えた。１時間後、ジイソプロピルエチルアミン（０．２３ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）及びジメチルスルホキシド（１００μｌ）中の5-アミノメチル-5'-スルホナト-1-メチル-1'-エチルインドジカルボシアニン（０．９ｍｇ、０．００１８ｍｍｏｌ）の溶液を、環境温度で加えた。さらに４８時間後、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、青色の固体として得られた；λabs（ＭｅＯＨ）５６１ｎｍ及びλem６４７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：１０５０。
【０１０４】
実施例１２．タンパク質：ペプチド偏光結合アッセイ
１２．１ ラベル化ペプチドリガンドの合成
配列Ｅ−ｐＹ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｐ−Ｋ（Ｅ９Ｋ）のペプチドを、標準的な方法及び材料を使用して、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機での固相合成によって調製した。過剰な6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、固相に未だ結合されている保護化ペプチドの有利Ｎ末端に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下でＤＭＳＯ中で結合した。２時間後脱保護の後、粗ラベル化ペプチドを、６０分で水／水：アセトニトリル（４０：６０）に対する０．１％ＴＦＡ／０．１％ＴＦＡから得た勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１０５】
１２．２ 結合アッセイ
各種の濃度のＧｒｂ２グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質、及び２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４／１０ｍＭ ＤＴＴ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の化合物ＩＩＩでラベルされたＥ９Ｋを、６０分間黒色９６欠ミクロプレート(Dynatech)中に１５０μｌの最終容量でインキュベーションした。偏光値を、励起のために530DF30フィルターを、放射のために590DF45フィルターを使用して、Fluorolite FPM2TMプレートリーダー(Jolley Reserch and Consulting Inc.)で読み取った。その結果が図６に示され、Ｇｒｂ２タンパク質を有する化合物ＩＩＩラベル化ペプチドの特異的結合（偏光の変化によって測定される）を示す。
【０１０６】
実施例１３．核酸ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイ
１３．１ プローブ調製
非ラベル化標的オリゴヌクレオチド(5' TAC CCA GAC GAG CAA-ビオチン 3')及び相補的非ラベル化プローブオリゴヌクレオチド(5' TTG CTC GTC TGG GTA 3')を、標準的な方法及び材料を使用してApplied Biosystems 391 ＤＮＡ合成機で合成した。該オリゴヌクレオチドを４０℃で１７時間で脱保護し、Ｃ１８カラム及び４０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望のピークを回収し、凍結乾燥し、サンプルを滅菌Ｈ2Ｏに再懸濁した。
【０１０７】
第二のセットの標的及びプローブオリゴヌクレオチドを記載されたように合成したが、アミノ基を5'末端に加えた(5' C7アミノ修飾TAC CCA GAC GAG CAA-ビオチン 3'及び5' C7アミノ修飾TTG CTC GTC TGG GTA 3')。
【０１０８】
アミノ修飾化標的及びプローブオリゴヌクレオチドを、２２℃で一晩、０．１Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の、１０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミド、及びＣｙ５ ＮＨＳ−エステル色素(Amersham Pharmacia Biotech)のそれぞれとインキュベーションした。翌朝、該オリゴヌクレオチドをエタノール沈降し、生じたペレットをＨ2Ｏに再懸濁した。ラベル化オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラム及び６０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製し、所望のピークを回収して凍結乾燥した。残存物をＨ2Ｏ中に再懸濁し、回収された材料の濃度を測定した。
【０１０９】
１３．２ 結合アッセイ
黒色のストレプタビジン皮膜９６穴プレートのウェルを、環境温度で１２０分間、非ラベル化または化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチド（１００μｌＰＢＳ／１ＭｇＣｌ2で希釈された２０ｐｍｏｌ／ウェル）のそれぞれで皮膜した。いずれかの非結合材料を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／０．１％ ＢＳＡ）で強力にウェルを洗浄することによって除去した。非ラベル化またはＣｙ５ラベル化プローブオリゴヌクレオチドを、０．２ｐｍｏｌ／μｌのアッセイ緩衝液に希釈し、プローブハイブリダイゼーションを許容するために、１００μｌを１２０分、環境温度で皮膜ウェルでインキュベーションした。最後に、ウェルをＰＢＳで強力に洗浄し、蛍光強度を５６０ｎｍの励起フィルター及び６７０ｎｍの吸収フィルターを使用して蛍光プレートリーダーで測定した（図７）。
【０１１０】
非ラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、非ラベル化またはＣｙ５ラベル化プローブのいずれかでインキュベーションされたウェルは、残余の背景蛍光シグナルを与えた。同様に、化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、非ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、低い傾向シグナルを与えた。化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、Ｃｙ５ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、強力な蛍光シグナルを与え、ＦＲＥＴが化合物ＩＩＩとＣｙ５の間で生じることを示した。
【０１１１】
実施例１４．タンパク質：ＤＮＡ直接的強度結合アッセイ
１４．１ 試薬の調製
全てのＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを、Genosys Biotechnologies Ltdから得た。ＮＦ−ｋＢに対して特異的な等モル量のビオチン化コード鎖(5' ビオチン-GATCTAGGGACTTT CCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAAGGCGCCTA 3')を、３分沸騰水浴中で共にインキュベーションし、２時間冷却することによってアニールさせた。
【０１１２】
抗ＧＳＴ抗体（３ｍｇ／ｍｌ、Molecular Probes社から得た１．５ｍｇ供給物／バイアル（０．５ｍｌ））を、室温で４時間、０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透析し、透析を０．１５Ｍ塩化ナトリウムの新たな溶液で4℃で一晩継続した。翌朝、抗体を最大４時間、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムの１リットルに対して透析した。
【０１１３】
ＤＭＳＯ中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミドエステルの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１０ｍｇ色素：０．３３ｍｇ抗体の比で抗体を攪拌しながら段階的に加えた。該溶液を、暗所で室温でさらに４５分混合した。遊離色素を、室温で４時間０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透析し、４℃で一晩新鮮な０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透析することによって除去した。最後に抗体を、室温で４時間０．０１Ｍ ＰＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析し、次いで４℃で一晩０．０１Ｍ ＰＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析した。（全ての透析は、ラベリングに引き続き暗所で実施された。）
【０１１４】
１４．２ 結合アッセイ
ビオチンラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的ｄｓＤＮＡ（２．５ｐｍｏｌ、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2中に希釈した）を、９６穴ストレプタビジン皮膜ミクロタイタープレート(Bohringer Mannheim)の各ウェル（最終容量、１００μｌ）に加え、室温で２時間インキュベーションした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）での洗浄に引き続き、５ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５ＧＳＴを、２００ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン（非特異的競合因子）のそれぞれの存在化または不存在下で、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＤＴＴ中に加えた（ブランクはｐ６５ＧＳＴを含まない）。両タンパク質をＨｅｐｅｓ緩衝液中に上述のように希釈した；最終ウェル容量は１００μｌであった。該プレートを室温で３０分浸透し、さらに３０分放置した。上述のＰＢＳ緩衝液での洗浄に引き続き、１００μｌの最終ウェル容量で、上述のＨｅｐｅｓ緩衝液中の５０ｐｍｏｌ／ウェルの化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴ Ａｂで検出を達成した。最後に該プレートを、上述のようにＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌの水を各ウェルに加えた。該プレートを、Biolumin 960蛍光ミクロプレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)においてEx535/Em569及びEx560/595で読み取った。その結果が図８に示されている。
【０１１５】
化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴでの検出は、１０１：１(Ex560/Em595)及び１２３：１(Ex535/Em569)の間の相当するＳ／Ｎ比を有する、約１０，０００ｒｆｕの良好なシグナルを生じた。４０倍モル過剰の特異的競合因子、ｐ６５を使用して特異性が示され、ｐ６５は全シグナルを約９０％まで減少した。非特異的競合因子、カゼインは、全シグナルを２５％のみまで減少した。
【０１１６】
実施例１５．タンパク質：ＤＮＡ ＦＲＥＴ結合アッセイ
１５．１ 試薬の調製
全てのＨＰＬＣ精製ＮＦ−ｋＢ特異的オリゴヌクレオチドを、Genosys Biotechnologies Ltdから得た：コード鎖は、5'末端第一級アミンで修飾され(5' NH2-GATCTAGGGACTTTCCGCG 3')、非コード鎖は修飾されなかった(5' ATCCCTGAAAGGCGCCTAG 3')。１０倍モル過剰のＣｙ−５−ＮＨＳエステル色素(Amersham Pharmacia Biotech)を、２２℃で一晩、０．１Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の、コード鎖とインキュベーションした。翌朝、該オリゴヌクレオチドをエタノール沈降し、次いで水中に再懸濁した。ラベル化コード鎖を、Ｃ１８カラム及び６０％ ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した。ピーク含有ラベル化オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、水中に再懸濁した。
【０１１７】
ＮＦ−ｋＢ特異的二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを、Ｃｙ−５ラベル化コード鎖(5' Cy5-GATCTAGG GACTTTCCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAA GGCGCCTAG 3')の等モル量と共にインキュベーションし、３分間沸騰水浴させ、２時間冷却することによってアニールさせて生産した。
【０１１８】
ＮＦ−ｋＢ ｐ６５タンパク質（２６０ｍｇ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中で１０００μｌに希釈した。２０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍｌの溶液として）を、２時間攪拌しながら２２℃で該タンパク質とインキュベーションした（暗所において）。ラベル化タンパク質を、４℃で０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水／０．５Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ＤＴＴの３回の変化に対して透析した（暗所において、４時間／新鮮な緩衝液）。
【０１１９】
１５．２ 結合アッセイ
黒色のミクロタイタープレート(Dynatech)を、ＦＲＥＴアッセイのために使用した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５（２０ｐｍｏｌ）を、２００ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン（非特異的競合因子）のそれぞれの存在化または不存在下で、１０ｐｍｏｌのＣｙ５ラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを含む、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＤＴＴ中でインキュベーションした。両タンパク質を、１００μｌの最終ウェル容量を与えるように、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に希釈した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５のみを含むウェルが、ブランクとして使用された。該プレートを２２℃で３０分攪拌しながらインキュベーションし（暗所において）、さらに３０分放置した。該プレートを、Biolumin 960蛍光ミクロプレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)において、Ex520/Em670で読み取った。その結果が図９に示されている。
【０１２０】
２０００ｒｆｕのシグナルを、４：１の相当するＳ／Ｎ比を有するＦＲＥＴアッセイにおいて得られた。特異性は、特異的競合因子、ｐ６５の１０倍モル過剰を使用して示され、ｐ６５は４０％まで全体のシグナルを減少した。非特異的競合因子、カゼインは、全体のシグナルに効果を有さなかった。
【０１２１】
実施例１６．蛍光偏光を使用したレセプターリガンド結合アッセイ
１６．１ 試薬の調製
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミドエステル（１ｍｇ）のサンプルを、５％ｖ／ｖトリエチルアミンの存在下で、ジメチルスルホキシド中の１ｍｇのテレンゼピンアミン同類物と反応させた。該反応を、暗所で環境温度で２時間継続させた。化合物ＩＩＩ−テレンゼピン生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で、Ｃ１８カラム及び６０％水／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって開始材料から精製した。精製物のピークを回収し、暗所で凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド中に再懸濁した。これを等分し、暗所で−２０℃で凍結して貯蔵した。
【０１２２】
Ｍ1ムスカリンレセプターを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ Ｍ1細胞）を、１０％胎児ウシ血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミン；５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシン；１２５μｇ／ｍｌゲネチシン(Sigma)を含むＨＡＭＳ Ｆ１２培地(Sigma)中で生育させ、湿気を含むインキュベーター中で５％ＣＯ2と共に３７℃で維持した。細胞をローラーボトルに広げ、５％ＣＯ2で浄化し、ローラーボトルインキュベーター中に４日間３７℃で放置した。
【０１２３】
細胞を冷蔵リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３（ＰＢＳ錠剤；Sigma）中にばらすことによって集め、ＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ３０００ｉ遠心機において４℃で１４００ｒｃｆで遠心分離することによってペレット化した。細胞を冷蔵５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ホモジネーション緩衝液に再懸濁し、２０分間氷上で放置してから、９００ｐｓｉの窒素を使用してＰａｒｒ細胞破壊装置(Parr Cat. N゜. 4639, 45ml)を使用して細胞溶解した。何れかの比破壊細胞を１４００ｒｄｆで遠心分離することによって除去し、懸濁液を取り出しさらに４℃で２０分Beckman J2-21M/E遠心機において１８０００ｒｐｍで遠心分離した。生じたペレットを冷蔵ホモジネーション緩衝液に再懸濁し、上述のように１８０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞膜ペレットを、およそ１５ｍｌのホモジネーション緩衝液に再懸濁し、等分し、−７０℃での貯蔵のため液体窒素で凍結した。
【０１２４】
*テレンゼピンアミン同類物は、Chemical Synthesis Programme of the National Institute of Mental Health, Cobtact NO1MH30003の一部として、Research Biochemicals Internationalによって提供された。
【０１２５】
１６．２ 結合アッセイ
等量のＣＨＯ Ｍ1細胞膜（５０μｇ）を、Ｍ１ムスカリンレセプターアンタゴニストアトロピン及びＴＡＣ（５０００ｎＭ−０．０６４ｎＭ）の一連の希釈を含む黒色のミクロタイタープレートのウェルに加えた。次いで該プレートを、バックグランド偏光値を測定するFluorolite FPM-2TMで測定した（励起フィルター５３０ｎｍ；放射フィルター５９０ｎｍ）。化合物ＩＩＩ−テレンゼピンリガンド（４ｎＭ最終濃度）の添加の後、該プレートを密封し、ミクロタイタープレートシェーカー上で暗所で２２℃でインキュベーションした。得られた偏光データから、非直線回帰及び一部分結合分析を使用して、アトロピン及びＴＡＣの両者について競合曲線を作成した(GraphPad Prism 2.0データ操作パッケージ）。
【０１２６】
図１０における曲線は、ｌｏｇ１０モル濃度非ラベルリガンドに対してプロットされた特異的偏光読み取りを示す。１９０ｍＰの特異的シグナルが得られ、この実験から測定されたＩＣ５０値は、アトロピンについて４．１ｎｍ及び非ラベルＴＡＣについて２８ｎＭであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１．６の色素でラベルされたタンパク質と比較した、実施例１の色素の溶液に対する吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】 図２は、実施例１の色素の硬化色素構造を、二つの開いた鎖の色素の構造と比較する化学式である。
【図３】 図３は、図２の三つのシアニン３色素のスペクトル特性を比較するグラフである。
【図４】 図４は、５１４ｎｍで励起された場合の図２の三つのシアニン色素の放射スペクトルを示すグラフである。
【図５】 図５は、レーザーにさらされた場合の、図２の三つの色素を光ブリーチした結果を示すグラフである。
【図６】 図６は、実施例１２．２に従ったペプチド極性化結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図７】 図７は、実施例１３．３の核酸ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図８】 図８は、実施例１４．２の方法に従ったタンパク質：ＤＮＡ直接的強度結合アッセイを示す棒グラフである。
【図９】 図９は、実施例１５．２のタンパク質：ＤＮＡ ＦＲＥＴ結合アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１０】 図１０は、実施例１６．２に引き続き非ラベル化リガンドの濃度に対する特異的極性読み取りをプロットするグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、硬化トリメチンシアニン色素、その調製法、蛍光マーカーとしての及び蛍光エネルギー転移複合体におけるその使用法、並びにそれらでラベルされた物質に関する。
【０００２】
【従来の技術】
蛍光色素は一般的に周知であり、蛍光顕微鏡、蛍光イムノアッセイ及びフローサイトメトリーのような方法によって、各種の生物学的及び非生物学的材料の蛍光ラベリング及び検出のために使用される。蛍光色素での上記材料のラベリングの典型的な方法は、該色素分子の適切な基とラベルされる材料の適合的な基の間の結合による、蛍光複合体を作製することである。この方法において、細胞、組織、アミノ酸、タンパク質、抗体、薬剤、ホルモン、ヌクレオチド、核酸、脂質及びポリサッカリド等のような材料は、化学的にラベルされ、検出若しくは定量され得、または標的材料に対して特異的に結合可能な蛍光プローブとして使用され蛍光検出法によって検出され得る。
【０００３】
蛍光色素の４つの一般的に使用されるクラスは、フルオレセイン（緑色蛍光）、ローダミン（オレンジ色蛍光）、クマリン及びピレン（青色蛍光）クロモホアに基づくものである。フルオレセイン及びローダミンに基づく色素は、多くの欠点を有する。フルオレセイン誘導体は、ｐＨ感受性吸収スペクトルを有し、蛍光はｐＨ８以下で顕著な減少を生ずる。ローダミン誘導体は疎水性であり、水性媒体で使用することが困難である。それらはしばしばタンパク質に結合した場合に強力な蛍光クエンチングを示す。
【０００４】
米国特許第5268486号は、標的材料のアミン、ヒドロキシル、アルデヒド及びスルフヒドリル基に共有結合させることが可能な基を含む、発光モノ及びポリメチンシアニン色素、並びにメロシアニン及びスチリル色素のような関連するポリメチン色素を開示する。該化合物は、緑色、オレンジ色、赤色及びスペクトルの赤外線領域で蛍光を発するように開示される。
【０００５】
米国特許第3679427号は、式（１）に示されるような硬質構造の一部としてトリメチン鎖を含む硬化シアニン色素を記載する：
【化５】
【０００６】
欧州特許出願第747448号は、複素環の窒素原子の間の架橋基によって硬化された、ビス−複素環式モノメチンシアニン色素を記載する。上記化合物は、蛍光化合物に対する所望の溶解性、反応性及び分光学的特性を提供するために選択されたさらなる基で置換できる。該色素は、標的に対して蛍光特性を与えるために、標的材料を共有結合的にラベルするために使用できる。モノメチン硬化シアニンは非常に蛍光性であり、スペクトルの近ＵＶ及び青色（３００−５００ｎｍ）領域で放射する強力な光吸収色素である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
スペクトルの緑色からオレンジ色で強力な蛍光を生産することが可能であり、特に生物学的及び他の標的材料に対する共有結合ラベリングに適した色素にさせる官能基及び／または溶解基をも含む蛍光硬化色素化合物は、上述の文献の何れにも開示されていない。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、スペクトルの４５０−６００ｎｍにおいて吸収及び放射する明るい非常に蛍光性の色素化合物を提供する。それらは、トリメチンシアニンクロモホアに基づき、蛍光の高い量子収率を与える硬質構造を有する。さらにそれらは、生物学的分子のような標的材料及び他の材料上の適切な基と共有結合的に反応するために使用できる官能基または反応基を含み得る。それらはｐＨ非感受性であり、それ故それらは蛍光検出応用で使用できる有用な蛍光ラベリング試薬の範囲を拡張する。
【０００９】
【発明の実施の形態】
従って本発明は、Ｒ2−Ｒ9基によって任意に置換された式（２）の化合物を提供する：
【化６】
Ｒ2からＲ9は同じまたは異なり、−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10を含み、Ｒ10は、水溶性を減少する中性基、水溶性を増大する極性基、ラベリング反応において使用できる官能基、反応基、蛍光分子の吸収及び放射波長をシフトする電子供与及び吸引基、脂質及び炭化水素溶解性基から選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状Ｃ1-20アルキル鎖、Ｃ2-20モノエーテルまたはポリエーテル、及び４個までの第二級アミド結合を含むＣ2-20原子鎖より成る群から選択され；
Ｒ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アミノ、アセタール、ケタール、ホスホリル、スルフヒドリル、水溶性基、並びにアミノ、Ｃ1−Ｃ4アルキル置換アミノ、第四級アミノ、アルデヒド及びケトンを含むカルボニル、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、アミド、ニトロ、及びアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基によって任意に置換されたアルキル基から選択され；
Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ11から選択され、式中Ｒ11は置換されたアミノ基であり；
【化７】
【００１０】
Ｘ及びＹは、同じまたは異なってもよく、ビス−Ｃ1−Ｃ4アルキル、並びに炭素、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗで置換されたＣ4−Ｃ5スピロアルキルから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ2）nＲ12基から選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ12は水素、アミノ、アルデヒド、アセタール、ケタール、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノ、第四級アミノ、ニトロ、第一級アミド、置換されたアミド、並びにアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホスホリル及びスルフヒドリル基と反応性の基から選択され；
Ｚa及びＺbのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択された５または６の原子を有し；
Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、標的材料上の官能基と共有結合反応するための反応基を含み、または標的材料上の反応基と共有結合反応するための官能基を含み、または
Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである。
【００１１】
好ましいＲ10基は、以下のものから選択される：水素、ハロゲン、アミド、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホナート、第四級アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホナート、任意に置換されたアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、カルボニル、例えばスクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、アンヒドリド、ハロアセトアミド、マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト、酸性ハライド、アルキルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドといった反応基；並びにアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリルまたはスルフヒドリル基と反応性の基。
【００１２】
好ましくはＲ1は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ハロゲン、２６以下の炭素原子のアルキル基、−（ＣＨ2）nＱから選択され、式中１＜ｎ＜２６であり、Ｑはアミノ、アルデヒド、スルフヒドリル、ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル又はスルフヒドリルと反応性の基から選択され、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ4及びＲ5は水素である。
【００１３】
適切なＲ12は、水素、アミノ、スルホナート、カルボキシラート、アリール、ヒドロキシル、及びアミノ、ヒドロキシル、カルボニル、ホスホリル、またはスルフヒドリル基と反応性の基から選択される。
【００１４】
ビス−置換炭素は、ビスＣ1−Ｃ4アルキル基及びＣ4−Ｃ5スピロアルキル基を含む。
【００１５】
アルキルは、１−２６の炭素原子を含む、適切には１−１２の炭素原子、好ましくは１−６の炭素原子を含む直鎖状または分枝状鎖アルキル基である。
【００１６】
アリールは、６−１０の炭素原子を含む一つまたは二つの融合した芳香族環を含む芳香族置換基であり、例えばフェニルまたはナフチルである。アリールは、場合により且つ独立して、上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一つ以上の基によって置換されてもよい。
【００１７】
ヘテロアリールは、Ｎ、Ｏ及びＳから選択され得る少なくとも１且つ３以下のヘテロ原子を含む一または二環式５−１０員環芳香族環系である。ヘテロアリールは、場合により且つ独立して上述の−Ｒ10及び−Ｌ−Ｒ10基から選択された一つ以上の基によって置換されてもよい。
【００１８】
アラルキルは、アリールまたはヘテロアリール基によって置換されたＣ1−Ｃ6アルキル基である。
【００１９】
ハロゲン及びハロ基は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素から選択されたものである。
【００２０】
Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基、並びにＲ基が反応するであろう基の特異的な例は、表１に提供される。代わりに、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11基は、標的分子の反応基と反応するであろう表１の官能基であってもよい。
表１：考え得る反応性置換基及びその反応性の部位
【表１】
表１に挙げられた基に加えて、数多くの他の基が、本発明の化合物のＲ1−Ｒ9及びＲ11部位において反応性の置換基として考慮される。例えば、利用可能なアミノ及びヒドロキシ官能基を有する標的構成成分をラベルするために特に有用である反応基は、以下のものを含む：
【化８】
【００２２】
利用可能なスルフヒドリル官能基で標的構成要素をラベルするために特に有用な考え得るＲ1−Ｒ9及びＲ11基の特異的な例は、以下のものを含む：
【化９】
【００２３】
光活性化架橋によって標的構成成分をラベルするために特に有用なＲ1−Ｒ9及びＲ11官能基の特異的な例は、以下のものを含む：
【化１０】
水溶性を増大する、またはサンプル中の不適切な構成成分に対する蛍光的にラベルされた構成成分の非所望の非特異的結合を減少する目的のために、または蛍光のクエンチングを導くであろうラベルされた構成成分上の二つ以上の反応性クロモホアの間の相互作用を減少するために、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11官能基は、周知の極性及び電気的に荷電した化学基から選択できる。上記基の例は−Ｅ−Ｆ−であり、ここでＦは、ヒドロキシ、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、置換されたアミノまたは第四級アミノであり、Ｅは、ｎが０−６である−（ＣＨ2）n−のようなスペーサー基である。−Ｅ−Ｆ−基の有用な例は、−（ＣＨ2）3ＳＯ3及び−（ＣＨ2）4ＳＯ3のようなＣ1-6アルキルスルホナートを含む。
【００２５】
蛍光色、水溶性、及び反応基または官能基の位置を調節するための能力を示す本発明の例示的な化合物は、以下のものである。
i) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｉ）；
ii) 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）；
iii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）；
iv) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）；
v) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）；
vi) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）；
vii) 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c]ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩ）；
viii) 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）；
ix) 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）；
x) 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｘ）。
【００２６】
ここで提供される基は、本発明の化合物のＲ部位で取り込まれ得る基の全ての包含物を意味しない。本発明の化合物によってラベルされる材料上の基と反応するであろう各種の他の基が存在すると解されよう。Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位での上記他の基の取り込みによって生産される化合物は、本発明によって包含されるものと企図される。
【００２７】
本発明の化合物は、数多くの生物学的及び非生物学的応用で使用され得る。非生物学的応用に関しては、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で一つ以上の非電荷基を有する本発明の化合物、例えばＣ1-26アルキル及びアリール部分が、非極性材料に蛍光特性を提供するために該材料中に溶解され得る。上記非極性材料は、例えば塗料、ポリマー、ワックス、油、インク及び炭化水素溶媒を含む。本発明の別の非生物学的応用は、極性溶媒、または例えば水、エチレングリコール、メチルアルコール、若しくは水とメチルアルコールの混合物のような他の材料中に、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で一つ以上の電荷及び／または極性基を有する本発明の化合物を溶解することである。上記電荷Ｒ基は、例えば−ＮＲ3 +、−ＳＯ3 -、−ＰＯ3 -及び−ＣＯＯ-を含む一方で、上記極性Ｒ基は、例えばヒドロキシル基を含む。生物学的応用に関しては、生物学的分子は、本発明の複合体を使用して非共有結合的にラベルされ得る。例えば、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば第四級アミノといった電荷を含む場合の本発明の複合体は、例えばＤＮＡ及びＲＮＡのような電荷生物学的分子を非共有結合するために使用され得る。さらに、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11が、例えば長鎖アルキルといった非電荷基である場合の本発明の化合物は、例えば生物学的脂質のような非電荷生物学的分子を結合するために使用され得る。
【００２８】
別法として、本発明の化合物は、該複合体を含むポリマーの形成に適した重合可能基を含んでもよい。適切な重合可能基は、アクリラート、メタクリラート、アクリルアミド、ビニル及びスチリルから選択される。重合は、蛍光化合物を含むコポリマーを形成するために、スチレンまたはビニルトルエンのような第二の重合可能モノマー開始材料で接合されるように使用される本発明の適切な誘導化化合物で実施され得る。別法として、本発明の蛍光化合物は、重合可能基を有する必要がなく、例えば該化合物は、重合または粒子形成の間に取り込まれ、またはポリマー粒子内若しくはその上に吸着されてもよい。
【００２９】
本発明の色素はまた、Boyer及びMorganに対する米国特許第4916711号に示される方法に従ってレーザー色素として使用され得る。レーザー色素は蛍光でなければならず、０．５６または０．５７より大きい量子収率を有さなければならず、且つかなり光安定性でなければならない。本発明の化合物は、これらの必要性のそれぞれを満たす。さらに本発明の色素は、織り込み色素、写真用色素、及び有機伝導体として使用され得る。
【００３０】
本発明の化合物はまた、標的材料に対して蛍光特性を与えるために、標的材料を共有結合ラベルして使用され得る。本発明の化合物を使用する共有結合ラベリングは、生物学的または非生物学的応用の何れにも利用され得る。非生物学的応用においてラベルされ得る標的材料の例は、例えばセルロースベース材料（例えば紙を含む）、織物、石油ベース製品、写真用フィルム、ガラス、ポリマー並びにゲル濾過及びクロマトグラフィー媒体を含む。
【００３１】
本発明の化合物を使用する共有結合ラベリングは、上記定義されたような少なくとも一つの官能基または反応基を有する標的で達成され得る。該標的は、標的材料の官能基または反応基と共有結合できる上述のような反応基または官能基を含む、少なくとも一つのＲ1−Ｒ9及びＲ11を有するかなりの量の本発明の化合物とインキュベーションされ得る。標的材料及び本発明の化合物は、該標的材料を本発明の化合物に共有結合させるのに十分な条件下で十分な時間インキュベーションされる。
【００３２】
Ｒ1−Ｒ9及びＲ11は、本発明の化合物が異なる標的化合物と反応し、及び／または異なるスペクトル特性を有し、それによって複数の分析で使用できる数多くの関連化合物を提供するように選択され得るが、その場合単一のサンプル中の各種の化合物の存在及び量は、検出された数多くの蛍光放射の波長及び強度に基づいて識別されなければならない。本発明の化合物は、Ｒ基の適切な選択によってラベルされる材料を含む水性、他の極性、または非極性媒体中に可溶性にされ得る。
【００３３】
本発明はまた、Ｒ1−Ｒ9及びＲ11位で少なくとも一つの反応基を含む本発明の化合物が、標的材料のアミノ、ヒドロキシル、アルデヒド、ホスホリル、カルボキシル、スルフヒドリルまたは他の反応基と反応するラベリング法に関する。上記標的材料は、抗体、脂質、タンパク質、ペプチド、炭化水素、一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化されたヌクレオチド、並びに一つ以上のアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファート基を含むまたは含むように誘導化されたオキシまたはデオキシポリ核酸、微生物材料、薬剤、毒素、粒子、プラスチックまたはガラス表面及びポリマーよりなる群を制限することなく含む。本発明の化合物はまた、EPA 747700に記載された型の蛍光共鳴エネルギー転移複合体における使用、または蛍光偏光若しくは蛍光クエンチングベース応用のために、さらなる蛍光または非蛍光化合物にカップリングするように使用され得る。
【００３４】
上述の単一工程ラベリング法に加えて、本発明はまた、二工程ラベリング法に関し、そこでは第一の工程において、本発明の化合物は、抗体のような一次構成要素と共有結合で反応し、それによってラベルする。二工程法の第二または染色工程において、蛍光ラベルされた一次構成要素は、抗体が特異的である抗原のような二次構成要素に対するプローブとして使用される。上記ラベルされた抗体の標的が細胞である場合、該方法の第二の工程は、該細胞の蛍光の強度を測定することによってその型の細胞に結合するラベル抗体の量を測定するために使用され得る。この二工程法によって、本発明の蛍光化合物と、第一の工程で共有結合でラベルされたモノクローナル抗体及び他の構成要素が、抗原プローブとして使用できる。
【００３５】
本発明の化合物は、系における特定のタンパク質または他の構成要素の濃度を測定するために使用され得る。もしプローブと反応できるタンパク質の反応基の数が周知であれば、分子当たりの蛍光は周知となり得、系におけるこれらの分子の濃度は、系の全蛍光強度によって測定できる。この特定の方法は、ミクロタイタープレートリーダーまたは他の周知の免疫学的蛍光検出システムを使用して、各種のラベル化分析物の濃度を測定するために使用できる。
【００３６】
本発明の化合物はまた、例えば蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）ベース法、蛍光存続期間を使用して、または蛍光偏光測定によって、分析物の検出及び測定のための蛍光ラベルを使用するアッセイ方法体系において有用である。
【００３７】
生物学的系における蛍光共鳴エネルギー転移色素ペアの使用は周知であり、それらはＦＲＥＴを使用するアッセイにおける結合現象または切断反応の検出において使用されている。上記アッセイの例は、平衡結合アッセイ（例えばイムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、タンパク質結合アッセイ及びホルモンレセプターアッセイ）、及びタンパク質溶解性切断アッセイ、ヌクレアーゼによるＤＮＡまたはＲＮＡ分子の切断、若しくはリパーゼによる脂質の切断のような酵素アッセイを含む。
【００３８】
本発明の化合物を利用する結合アッセイは、特異的結合ペアの一つの構成要素を、特異的結合ペアの第二の構成要素と結合させることによって実施でき、第一の構成要素は本発明に従った蛍光ドナー色素でラベルされ、第二の構成要素は蛍光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされ、第一及び第二の構成要素の間のエネルギー転移関係をもたらし、そして放射された蛍光の測定により第一及び第二の構成要素の結合を検出する。特異的結合ペアの例は、抗体／抗原、レクチン／糖タンパク質、ビオチン／アビジン（ストレプタビジン）、ホルモン／レセプター、酵素／基質または共因子、ＤＮＡ／ＤＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡ及びＤＮＡ／ 結合タンパク質を制限することなく含む。本発明において、本発明の色素が特異的な結合ペアの一つの構成要素をラベルするために使用され得、次いで該一つの構成要素が他の構成要素に対する結合の検出において使用され得るように、互いに対して特異的な結合親和性を有するいずれかの分子が使用され得る。
【００３９】
本発明の色素はまた、酵素切断アッセイフォーマットにおいて使用され得、その場合例えばペプチドといった酵素基質は二つの構成要素を含み、その一方は本発明の蛍光ドナー色素でラベルされ、他方は蛍光（またはクエンチング）アクセプター色素でラベルされ、切断される基質結合のそれぞれの側のエネルギー転移関係において基質に結合する。周知のまたは推定の酵素インヒビター化合物は、反応混合物において任意に含まれる。酵素による基質の切断は、ドナー及びアクセプター色素の分離を引き起こし、ドナー及びアクセプター種の共鳴エネルギー転移の損失及び蛍光放射の変化を導く。
【００４０】
エネルギー転移色素ペアを形成する本発明の色素と組み合わせ得る適切な蛍光アクセプター色素は、ローダミン及びシアニン色素を含む。特に好ましい色素はシアニン色素であり、Ｃｙ５（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-ジカルボシアニン）、Ｃｙ５．５（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-4,5,4',5'-(1,3-ジスルホナト)-ジベンゾ-ジカルボシアニン）及びＣｙ７（1-(ε-カルボキシペンチル)-1'-エチル-3,3,3',3'-テトラメチル-5,5'-ジスルホナト-トリカルボシアニン）を含む。適切なクエンチングアクセプター色素は、ＤＡＢＣＹＬ（4-(4-ジメチルアミノフェニル)アゾ安息香酸）である。
【００４１】
本発明の色素はまた、蛍光偏光測定を利用する結合アッセイまたは酵素切断アッセイにおいて使用され得る。結合アッセイフォーマットにおいて、サンプル中の分析物のアッセイは、分析物に対して特異的結合パートナーを提供することによって実施され、該特異的結合パートナーは本発明に従って色素でラベルされ、ラベルされた特異的結合パートナーの蛍光偏光を測定し、分析物−特異的結合パートナー複合体を形成するように分析物を結合するのに適した条件下で、ラベルされた特異的結合パートナーと分析物を接触させ、結合の度合を測定するためにラベルされた分析物−特異的結合パートナー複合体の蛍光偏光を測定する。
【００４２】
第二のフォーマットにおいて、酵素活性の検出のためのアッセイは、以下のように構築され得る。プロテアーゼ酵素及び本発明に従って色素でラベルされた蛍光基質を組み合わせることによって、反応混合物を調製する。周知のまたは推定のインヒビター化合物を、反応混合物に任意に含ませても良い。酵素による基質の切断は、ラベル化断片の生産を導く。反応の進行は、蛍光偏光の変化を観察することによってモニターされる。
【００４３】
本発明の蛍光化合物はまた検出法において使用でき、その場合複数の蛍光化合物が抗体のような複数の異なる一次構成要素に共有結合され、各一次構成要素は、二次構成要素の混合物における複数の二次構成要素のそれぞれを同定するために、抗原のような異なる二次構成要素に特異的である。この方法の使用に従って、一次構成要素のそれぞれは、他の一次構成要素をラベルするために使用される色素分子と比較して、異なる光吸収及び放射波長特性を有する蛍光化合物で別々にラベルされる。一次構成要素と称されるものは、抗原のような二次構成要素を含む調製物に加えられ、一次構成要素は、それらが選択的であるそれぞれの二次構成要素に結合させられる。
【００４４】
いずれかの非反応性のプローブは、分析物との干渉を避けるために、例えば洗浄によって調製物から除去され得る。次いで該調製物は、特定の蛍光化合物の吸収波長を含む一定範囲の励起波長にさらされる。次いで蛍光顕微鏡、またはフィルター若しくはモノクロメーターを励起波長の光線を選択し、且つ蛍光の波長を選択するようにさせたフローサイトメトリー若しくは蛍光分光光度計のような他の蛍光検出システムを、利用される蛍光化合物に相当する放射波長の強度、特定のラベル化一次構成要素と結合している二次構成要素の量を示す蛍光の強度を測定するために使用する。複数のパラメーターの蛍光実験を実施するための周知の方法は、例えば複数パラメーターフローサイトメトリーを含む。
【００４５】
特定の場合において、単一の励起波長が、混合物中の二つ以上の材料から蛍光を励起するために使用でき、その場合それぞれは異なる波長で蛍光を生じ、各ラベル化種の量は、それぞれの放射波長での個々の蛍光強度を検出することによって測定できる。所望であれば、光吸収法もまた使用できる。
【００４６】
本発明の検出法は、蛍光一次構成要素の作成が可能であるいずれかの系に適用できる。例えば、適切な反応性の蛍光化合物は、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片に接合され、次いで生じた接合物はＤＮＡまたはＲＮＡの相補的標的鎖への結合を生ずる。次いで適切な蛍光検出装置が、結合した蛍光接合物の存在を検出するために使用できる。
【００４７】
本発明はまた、本発明の化合物と、例えばタンパク質、ペプチド、炭化水素、核酸、誘導化された核酸、脂質、特定の他の生物学的分子、生物学的細胞、可溶性ポリマー、ポリマー粒子、ポリマー膜、ガラス表面及び他の粒子と表面のような材料のアミン、ヒドロキシ、アルデヒド、スルフヒドリル、ホスホリルまたは他の周知の官能基の間の共有結合反応に関する。蛍光の検出は非常に鋭敏な光学的方法を含むため、これらの色素「ラベル」の存在は、ラベルが非常に少量で存在する場合にさえ検出及び定量できる。それ故、色素ラベリング試薬は、ラベルされている材料の量を測定するために使用できる。
【００４８】
例えばフルオレセインと比較して、本発明の硬化トリエチンシアニンは、特に光安定であり、ｐＨ２からｐＨ１０の間のｐＨ変化に非感受性である。本発明の化合物は、最大４５０から６００ｎｍ（スペクトルの緑からオレンジ領域）の間の波長で光を吸収し且つ放射し、それ故テキサスレッド、ローダミン、テトラメチルローダミン、Ｘ−ローダミン、ＢＯＤＩＰＴ及びフルオレセインの代替物となる。
【００４９】
本発明は、任意にＲ2−Ｒ9基によって置換された以下の式（Ａ）の化合物を処理することを含む式（２）の化合物の調製法を提供する：
【化１１】
【００５０】
本発明のアミノ及びヒドラジノ置換カルボシアニン色素の場合、これらは硬化色素を調製するために使用される酸性溶液中に適切なアミンまたはヒドラジノ誘導体を含ませることによって一般式（Ａ）の中間体から調製され得る。
【００５１】
Ｘ及びＹが同一でありＺa及びＺb構造が同一である構造式（Ａ）の対称な化合物は、任意にＲ2、Ｒ3、Ｒ6及びＲ7基によって置換された構造式（Ｂ）の化合物を反応させることによって調製され得る：
【化１２】
【００５２】
Ｘ及びＹが異なる場合の構造式（Ａ）の非対称化合物は、Ｒ2，Ｒ3，Ｒ5，Ｒ6，Ｚa及びＸが上述のように定義されるＲ5及びＲ6基で任意に置換された式（Ｂ）の化合物を、Ｒ8及びＲ9基によって任意に置換された以下の式（Ｃ）の化合物で反応することによって調製できる：
【化１３】
【００５３】
中間体化合物（Ｂ）は、Ｘ、Ｚa、Ｒ6及びＲ7が上述のように定義される任意にＲ6及びＲ7基によって置換された以下の式（Ｄ）の適切な複素環塩基のヒドロハロゲン化物酸の塩を、Ｒ2及びＲ3が上述のように定義される以下の式（Ｅ）の化合物で反応させることによって調製され得る：
【化１４】
【００５４】
式（Ｃ）の中間体は、以下の式（Ｆ）のホルムアミドで２位にメチル置換基を含む構造式（Ｂ）の化合物の反応によって調製され得る：
【化１６】
【００５５】
（Ｄ）のような式の前駆体化合物は、当業者に周知の方法によって調製され得る。例えば米国特許第4981977号参照で、この特許の全開示は参考として取り込まれる。
【００５６】
式（２）の特定の化合物は、当業者に周知の方法によって式（２）の他の化合物に変換するための中間体として有用であり得る。同様に、特定の中間体は、式（２）の誘導体の合成のために有用であり得る。本発明の化合物は、ここに開示された方法によって合成できる。特定の有用性を有する化合物の誘導体は、適切な前駆体を選択することによって、または各種の位置で官能基を含むように周知の方法によって生じた化合物を修飾することによってのいずれかで調製される。例として、本発明の複合体は、蛍光ラベル化試薬を調製するために特定の反応基を含むように修飾され得、または荷電若しくは極性基が極性または非極性溶媒または材料における該化合物の溶解性を増大するために加えられ得る。変換の例として、エステルがカルボン酸に変換され得、またはアミド誘導体に変換され得る。
【００５７】
以下のものは、本発明の化合物の合成の特異的な実施例、及びそれらの化合物について観察されたスペクトルデータである。
【００５８】
【実施例】
実施例１．6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（R-Cy3.12.OH; 化合物Ｉ）
【化１７】
5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドリンを、Southwick等, Org. Prep. Proceed. Int., 20, 274-84, (1989)の方法、または別法として以下に記載の方法のいずれかによって調製した。
【００５９】
＜０℃で３：２の水：濃縮ＨＣｌ（３３ｍｌ）溶媒混合物中の4-アミノフェニル酢酸（５ｇ、３３．１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に対して、水（４３ml）中の硝酸ナトリウム（２．７ｇ、３９ｍｍｏｌ）の冷却（＜０℃）溶液を滴定して加えた。次いで反応混合物を、さらに３０分間低温下で維持した。二酸化硫黄の飽和水溶液（１４０ｍｌ）を加え、反応混合物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃で数時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得られた黄色のヒドラジン中間生成物を酢酸（５４ml）中に再溶解し、酢酸カリウム（７．０５ｇ、７１．８ｍｍｏｌ）及びメチル−イソプロピルケトン（６．８４ｇ、７９．４ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過して濃縮した。5-エトキシカルボニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、赤色の固体として得た（４．８ｇ、６７％）。精製は必要ではなかった；ｍ／ｚ(Maldi)：２１７。
【００６０】
１．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル-5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドレイン、エチルエステル
環境温度でエタノール（４０ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドレイン（２ｇ、９．３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、臭化水素酸（４８％水溶液の３．１６ｍｌ）を加えた。１時間後反応溶媒を真空下で除去した。ヒドロブロミド塩を、アセトニトリル（４０ｍｌ）及び酢酸（４００ml）中に再溶解し、アクロレインジエチルアセタール（１８．１７ｇ、１４０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を７０℃で２０分温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は緑色の油として得られた（１．２４ｇ、３６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：３７６．２。
【００６１】
１．３ 5,5'-ジカルボキシメチル-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン-エチルエステル
１２０℃でピリジン（１０ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル-5-カルボキシメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエーテル（３５６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、３０分でオルトギ酸（９８ｍｇ、６６ｍｍｏｌ）を滴定して加えた。２時間後反応混合物を冷却した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（２５１ｍｇ、３５％）；λmax：５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７６１．４。
【００６２】
１．４ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
環境温度でクロロホルム（１０ｍｌ）中の5,5'-カルボキシメチル-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエーテル（１００ｍｇ、０．１３２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、５０％水性硫酸（２ｍｌ）を加えた。３０分後、反応溶媒をクロロホルム（１０ｍｌ）で希釈し、水（３×１０ｍｌ）で洗浄した。有機相をＮａＳＯ4で乾燥し、真空下で濾過及び濃縮した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（６５ｍｇ、９０％）；λmax：５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５３９．２。
【００６３】
１．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル
環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体への変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
【００６４】
１．６ タンパク質ラベリング法
化合物ＩのN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルのストック溶液を、乾燥ＤＭＦ（１ｍｇ活性エステル／１００μｌ）中で調製した。ヒツジＩｇＧ（１ｍｇ、６．４５ｍｍｏｌ）を２５０μｌ緩衝溶液（ｐＨ９．４）に溶解し、所望の量の色素を強力なボルテックス混合の間に加えた。非接合色素を、溶出液としてｐＨ７の緩衝溶液を使用してゲル浸透クロマトグラフィー（Sephadex G-50の０．７×２０ｃｍカラム）によってラベル化タンパク質から分離した。ラベル化抗体溶液の吸収スペクトルを記録した（図１参照）。サンプルについてのタンパク質に対する色素の割合を、５６０ｎｍでのラベル化色素の吸光度の値と２８０ｎｍでのタンパク質の吸光度の値を測定して、以下の等式を使用して決定した。
分母の因子Ｘは、最大の吸収（Ａdye）で色素の吸収のａ％である２８０ｎｍでの色素の吸光を説明する。Ｘの値は、硬質色素について０．１７である。
【００６６】
１．７ スペクトル特性の比較：硬化Ｃｙ３（化合物Ｉ）及び開いた鎖のＣｙ３
硬化色素のスペクトル特性を、周知の開いた鎖のＣｙ３．１８ＯＨ及びＣｙ３．１０ＯＨ色素と比較した（図２）。吸収及び放射スペクトルを図３及び４に示す。硬質色素の吸収最大は、メタノール中で１２ｎｍまで赤色にシフトし、と即されたようにそれは非硬質インドシアニンより１０−１２倍明るい。その結果が以下の表２に示される。
【表２】
色素の光ブリーチングを、同一の条件下で実験した。等濃度の色素（水中に１．５×１０-5ｍｍｏｌ溶液の３ｍｌ）のサンプルを、５１４ｎｍのレーザー光線（３０ｍＶ、直径１ｃｍの光線）にさらし、吸収を５０分間で数分間隔で記録した。その結果が図５に示される。硬化色素はより早くブリーチすると予測される。しかしながら、その高い量子収率のため、硬化色素はフローサイトメトリー及びサンプルが短い期間さらされる他のイメージング実験に適するであろう。
【００６８】
実施例２．8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゼ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物ＩＩ）
【化１８】
濃縮硫酸（５００ｍｌ）中の2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）-インドレニン（１００ｇ、４７８ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を１８０℃で加熱した。２時間後、該溶液を環境温度に冷却し、次いで氷上に注いだ。反応混合物を、５０％水酸化ナトリウム（３０００ｍｌ）を加えることによって塩基性にした。生じた沈殿を濾過し、自ら再結晶化し、乾燥させた。生成物を白色固体として得た（７．２５ｇ、５４％）。
【００６９】
２．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（２ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１６９ｍｇ、１．３ｍｍｏｌ）及び酢酸（１０μｌ）での6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニン（２５ｍｇ、０．００８７ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。分解が観察されたため、該化合物を精製しなかった。生成物はパール上の黄色油として得られた。
【００７０】
２．３ 6,6'-ジスルホナト-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インド-カルボシアニン
6,6'-ジスルホナト-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカルボシアニンを、セクション１．３に記載のものと類似の方法によってピリジン（５ｍｌ）中のオルトギ酸トリエチル（５１．２ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）と1-(3,3-ジエトキシプロピル)-6-スルホナト-2,3,3-トリメチル-1H-ベンズ（ゾ）インドレニンの反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク／紫色の固体として得られた；λmax（ＭｅＯＨ）５８０ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：８５２。
【００７１】
２．４ 8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム
8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ（ゾ）インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（５ｍｌ）及び５０％硫酸（１ｍｌ）中の6,6'-ジスルホナト-1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-ベンズ（ゾ）インドカルボシアニン（３ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、発光性のピンク／紫色の固体として得られた；λmax（ＭｅＯＨ）５９８ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：６８４。
【００７２】
実施例３．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）
【化１９】
環境温度で酢酸（２０５ｍｌ）中の4-ヒドラジノベンゼンスルホン酸（６８ｇ、３６１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、3-メチル-2-ブタノン（８８．４４ｇ、１０２７ｍｍｏｌ）を加えた。該反応物を還流下で加熱した。３時間後、該溶液を冷却し、生じたピンク色の沈殿を濾過し、酢酸（５０ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた。生成物をメタノール（８００ｍｌ）中に再溶解し、イソプロパノール（２００ｍｌ）中の水酸化カリウム（２０．４ｇ、３６４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた黄色の固体を濾過し、乾燥させた（４８ｇ、５６％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２４０。
【００７３】
３．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-ジエトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法を使用して、アセトニトリル（４０ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（８．５４ｇ、６５．６ｍｍｏｌ）及び酢酸（１ｍｌ）と、5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンカルシウム塩（１ｇ、３．８８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。該化合物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、緑色の油として得られた（７４０ｍｇ、５２％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：３７０．１。
【００７４】
３．３ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェノルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン
無水酢酸（２５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン-エチルエステル（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、N,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を１１０℃に温めた。３０分後、該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、パール上の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５２１．２。
【００７５】
３．４ 5-カルボキシメチル-5'-スルホナト-1,1'-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエステル
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の、5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エトキシ-2,3,3-トリメチルインドレニン（９６ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)2,3,3-トリメチルインドレニン（６７．７ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ、２４％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７５５．３。
【００７６】
３．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（１０ｍｌ）と５０％硫酸（２ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-5'-スルホナト-1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-インドカルボシアニン、エチルエステル（３３ｍｇ、０．０４４ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３３ｍｇ、２４％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５６１。
【００７７】
３．６ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル
環境温度でジメチルスルホキシド（５００μｌ）中のヘキサフルオロリン酸O-(N-スクシンイミジル-N,N,N',N'-ビス（テトラメチレン）ウロニウム（５ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）及びN,N'-ジイソプロピルエチルアミン（４．０８ｍｇ、０．０３２ｍｍｏｌ）の混合物に、6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（５ｍｇ、０．００８９ｍｍｏｌ）を加えた。反応物を１時間攪拌した。N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル誘導体への変換は、マススペクトロスコピー及びPhenomenex Jupiter C18 １０μｍカラムを使用したＨＰＬＣによって確認された。
【００７８】
実施例４．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物ＩＶ）
【化２０】
【００７９】
実施例５．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物Ｖ）
【化２１】
【００８０】
実施例６．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩ）
【化２２】
環境温度で濃縮硫酸（１００ｍｌ）中の2,3,3-トリメチルインドレニン（２０ｇ、１２６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、部分的にN-ヒドロキシメチルフタルイミド（２０ｇ、１１４ｍｍｏｌ）を加えた。７０時間後、反応混合物を氷上に注ぎ、濃縮水酸化アンモニウムで塩基性にした。生じた沈殿を濾過し、乾燥した。生成物は、黄色の固体として得られた（３４．８４ｇ、８７％）。
【００８１】
６．２ 5-アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
環境温度でメタノール（５０ｍｌ）中の5-フタルイミドメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（１０ｇ、３１．４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水和ヒドラジン（１３．１ｇ、４０９ｍｍｏｌ）を加えた。２０時間後、沈殿を形成した。反応混合物を、６Ｎ ＨＣｌでｐＨ１に調節し、溶媒を真空下で除去した。得られた固体を１Ｎ ＨＣｌに懸濁し、セライトを通じて濾過した。濾過物をジクロロメタンで洗浄し（３×４０ｍｌ）、水相を６Ｎ ＮａＯＨでｐＨ１２に調節し、次いでジクロロメタン（３×４０ｍｌ）で抽出した。有機相をＮａ2ＳＯ4で乾燥し、濾過して、真空下で濃縮し、パール上の黄色固体を得た（４．９８ｇ、８４％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：１８８。
【００８２】
６．３ 5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
ギ酸メチル（３０ｍｌ）中の5-アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（４．９８ｇ、２６．５ｍｍｏｌ）の攪拌溶液を、２２時間窒素環境の下で還流した。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物は、パール上の茶色の油として得られた（５．４ｇ、９４％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２１７．１。
【００８３】
６．４ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション１．２に記載のものと類似の方法によって、アセトニトリル（４０ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（９ｇ、６９．１ｍｍｏｌ）及び酢酸（１ｍｌ）と、5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（１ｍｇ、２４．８ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．２０ｍｇ、６９％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３４７。
【００８４】
６．５ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）（セクション３．２に記載されたように調製された）の反応によって調製した。分解が観察されたため、生成物を精製しなかった。生成物は黄色の油として得られた。
【００８５】
６．６ 1,1-ジ-(3,3'-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'-スルホナト-インドカルボシアニン
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３７ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（２５ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時間７０℃に温めた。該溶液を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（１６ｍｇ、１５％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７２６．１。
【００８６】
６．７ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-(N-ホルミル)アミノメチル-5'-スルホナト-インドカルボシアニン（５ｍｇ、０．００６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の油として得られた（３．３ｍｇ、９０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６４ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５６０。
【００８７】
６．８ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
１：１２の濃縮ＨＣｌ：メタノール（５ｍｌ）中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを１２時間攪拌した。反応溶媒を真空下で除去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１．９ｍｇ、５０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５６０ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５３２。
【００８８】
実施例７．6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩ）
【化２３】
＜０℃で３：２の水：濃縮ＨＣｌ（７３ｍｌ）の溶媒混合物中に4-(2-ヒドロキシ）エチル-アニリン（１０ｇ、７３ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、水（８６ｍｌ）中の冷却（＜０℃）硝酸ナトリウムの溶液（６ｇ、７３ｍｍｏｌ）を滴定して加えた。次いで反応混合物を、さらに３０分低温で維持した。二酸化硫黄の飽和溶液（１５０ｍｌ）を加え、該反応物を１時間環境温度で温め、次いで７０℃でさらに１時間温めた。反応混合物を急速に冷却し、溶媒を真空下で除去した。得られた黄色のヒドラジノ中間生成物を、酢酸（１２０ｍｌ）と酢酸カリウム（１６ｇ、１６３ｍｍｏｌ）中に再溶解し、メチル-イソプロピルケトン（１５．５ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を環境温度で加えた。３０分後、反応混合物を９０℃に温め、さらに２時間攪拌した。反応混合物を冷却し、溶媒を真空下で除去した。生成物をジクロロメタン（１００ｍｌ）中に溶解し、水（２×５０ｍｌ）で洗浄した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は黄色の油として得られた（１．１８ｇ、８％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２０４．１。
【００８９】
７．２ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（４ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１．１３ｇ、８．６８ｍｍｏｌ）、酢酸（１００μｌ）と、5-ヒドロキシ-2,3,3-トリメチルインドレニン（１１８ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、パール状の茶色の油として得られた（２４ｍｇ、１２％）；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：３３１。
【００９０】
７．３ 5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン
5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)アテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２０ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（７９ｍｇ、０．４０５ｍｍｏｌ）と、5-スルホナト-1-(3,3'-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン（１００ｍｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。分解が観察されたため、生成物は精製しなかった。生成物は黄色の油として得られた。
【００９１】
７．４ 1-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-インドカルボシアニン
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸；無水酢酸（５ｍｌ）中の5-スルホナト-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン（３０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3'-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-2,3,3-トリメチルインドレニン（２０ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を５時間７０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（８．６ｍｇ、１０％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７１２。
【００９２】
７．５ 6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載された方法に従って、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5-ヒドロキシエチル-インドカルボシアニン（４．３ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（２．８ｍｇ、９０％）；λmax５６５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：５４７。
【００９３】
実施例８．6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＶＩＩＩ）
【化２４】
1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチルベンゾチアゾールを、セクション１．２に記載されたものと類似の方法によって、アセトニトリル（４ｍｌ）中のアクロレインジエチルアセタール（１．６４ｇ、１２．６ｍｍｏｌ）と酢酸（１００μｌ）と、2-メチルベンゾチアゾール（１２５ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は無色の油として得られた（２２０ｍｇ、９５％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：２８０。
【００９４】
８．２ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル
5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステルを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はパール状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５２１。
【００９５】
８．３ 14-カルボキシメチル-1,1'-ジ(ジエトキシプロピル)−ベンズチアゾレニン-インドカルボシアニン、エチルエステル
環境温度で４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニン、エチルエステル（２８ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、４．５：４．５：１のピリジン：酢酸：無水酢酸（５ｍｌ）中の1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-メチル-ベンゾチアゾール（１５．１ｍｇ、０．０５４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。反応混合物を、５時間７０℃で温めた。該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（１４．３ｍｇ、２０％）；λmax５４９ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６６５．３。
【００９６】
８．４ 6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a,3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a,3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（５ｍｌ）と５０％硫酸（１ｍｌ）中の（化合物名）（５ｍｇ、０．００７５ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク色の固体として得られた（３．２ｍｇ、９０％）；λmax５６２ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：４７１。
【００９７】
実施例９．6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＸ）
【化２５】
1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニンを、セクション１．３に記載されたものと類似の方法によって、ピリジン（５ｍｌ）中のオルトギ酸トリエチル（４０．７ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）と、1-ジエトキシプロピル-5-スルホナト-2,3,3-トリメチルインドレニン（２５．４ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリルの０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18、８μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はピンク色の固体として得られた（６．３ｍｇ、１２％）；λmax（ＭｅＯＨ）５５５ｎｍ；ｍ／ｚ（Ｍａｌｄｉ）：７５０。
【００９８】
９．２ 6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
無水酢酸（２ｍｌ）中の1,1-ジ-(3,3-ジエトキシプロピル)-5,5'-ジスルホナト-インドカルボシアニン（２ｍｇ、０．００２７ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、4-ヒドラジノフェニル酢酸（０．８９ｍｇ、０．００５４ｍｍｏｌ）を加え、反応物を１００℃に温めた。１０分後、該溶液を冷却し、反応溶媒を真空下で除去した。生成物を、８ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０μｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、ピンク／紫色の固体である、二つのジアステレオマーの化合物として得られた（０．０４ｍｇ、２％、０．０６ｍｇ、３％）λmax（ＭｅＯＨ）５６３ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：７１７．２０。
【００９９】
実施例１０．6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物Ｘ）
【化２６】
2-メチルキノリン（１．６ｇ、０．０１１ｍｏｌ）及び2-(2-ブロモエチル)-1,3-ジオキソラン（７．７ｇ、０．０４３ｍｏｌ）を、８５℃で１６時間共に熱した。冷却時に、反応混合物をジエチルエーテルで希釈し、生じた固体を濾過し、エーテルで洗浄して乾燥した。臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリンを、茶色の固体として得た（０．９８ｇ、２７％）。ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）２４４。
【０１００】
１０．２ 5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステル
5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステルを、セクション３．３に記載されたものと類似の方法によって、無水酢酸（２５ｍｌ）中のN,N'-ジフェニルホルムアミジン（９０８ｍｇ、４．６３ｍｍｏｌ）と、5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2,3,3-トリメチルインドリンエチルエステル（セクション１．２に記載されたように調製された）（１．１６ｇ、３．０９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、２０ｍｌ／分で６０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の１０−１００％勾配溶出液を使用して、Rainin Dynamax C18カラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物はパール状の茶色の油として得られた（６３４ｍｇ、４０％）；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：５２１。
【０１０１】
１０．３ 14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-1'-(3,3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシアニン、エチルエステル
環境温度でエタノール（０．５ｍｌ）中の5-カルボキシメチル-1-(3,3-ジエトキシプロピル)-2-(2-N-アセチル-N-フェニルアミノ)エテニル-2,3,3-トリメチルインドレニンエチルエステル（１６．１ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の攪拌溶液に、エタノール（０．５ｍｌ）とトリエチルアミン（１２５μｌ、０．９ｍｍｏｌ）中の臭化1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-2-メチル-キノリン（１０ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１時間後、反応溶媒を真空下で除去し、生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた（１０ｍｇ、５１％）、λmax５６７ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：６２９。
【０１０２】
１０．４ 6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム
6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニン-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウムを、セクション１．４に記載されたものと類似の方法によって、クロロホルム（２ｍｌ）と５０％硫酸（０．４ｍｌ）中の14-カルボキシメチル-1-[2-(1,3-ジオキサラン-2-yl)エチル]-1'-(3,3-ジエトキシプロピル)-キノリノ−インドカルボシアニン、エチルエステル（５ｍｇ、０．００７９ｍｍｏｌ）の反応によって調製した。生成物を、４ｍｌ／分で３０分間水／アセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）の０−１００％勾配溶出液を使用して、Phenomenex Jupiter C18、１０ｍｍカラム上でのＨＰＬＣによって精製した。生成物は、紫色の固体として得られた（１．６ｍｇ、４４％）；λmax５８４ｎｍ；ｍ／ｚ（ＦＡＢ+）：４６５。
【０１０３】
実施例１１．硬質Ｃｙ−３−Ｃｙ−５接合物の調製（化合物Ｘ）
【化２７】
【０１０４】
実施例１２．タンパク質：ペプチド偏光結合アッセイ
１２．１ ラベル化ペプチドリガンドの合成
配列Ｅ−ｐＹ−Ｉ−Ｎ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｐ−Ｋ（Ｅ９Ｋ）のペプチドを、標準的な方法及び材料を使用して、Applied Biosystems 431Aペプチド合成機での固相合成によって調製した。過剰な6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルを、固相に未だ結合されている保護化ペプチドの有利Ｎ末端に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下でＤＭＳＯ中で結合した。２時間後脱保護の後、粗ラベル化ペプチドを、６０分で水／水：アセトニトリル（４０：６０）に対する０．１％ＴＦＡ／０．１％ＴＦＡから得た勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した。
【０１０５】
１２．２ 結合アッセイ
各種の濃度のＧｒｂ２グルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質、及び２０ｍＭ ＭＯＰＳ ｐＨ７．４／１０ｍＭ ＤＴＴ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０中の化合物ＩＩＩでラベルされたＥ９Ｋを、６０分間黒色９６欠ミクロプレート(Dynatech)中に１５０μｌの最終容量でインキュベーションした。偏光値を、励起のために530DF30フィルターを、放射のために590DF45フィルターを使用して、Fluorolite FPM2TMプレートリーダー(Jolley Reserch and Consulting Inc.)で読み取った。その結果が図６に示され、Ｇｒｂ２タンパク質を有する化合物ＩＩＩラベル化ペプチドの特異的結合（偏光の変化によって測定される）を示す。
【０１０６】
実施例１３．核酸ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイ
１３．１ プローブ調製
非ラベル化標的オリゴヌクレオチド(5' TAC CCA GAC GAG CAA-ビオチン 3')及び相補的非ラベル化プローブオリゴヌクレオチド(5' TTG CTC GTC TGG GTA 3')を、標準的な方法及び材料を使用してApplied Biosystems 391 ＤＮＡ合成機で合成した。該オリゴヌクレオチドを４０℃で１７時間で脱保護し、Ｃ１８カラム及び４０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製した。所望のピークを回収し、凍結乾燥し、サンプルを滅菌Ｈ2Ｏに再懸濁した。
【０１０７】
第二のセットの標的及びプローブオリゴヌクレオチドを記載されたように合成したが、アミノ基を5'末端に加えた(5' C7アミノ修飾TAC CCA GAC GAG CAA-ビオチン 3'及び5' C7アミノ修飾TTG CTC GTC TGG GTA 3')。
【０１０８】
アミノ修飾化標的及びプローブオリゴヌクレオチドを、２２℃で一晩、０．１Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の、１０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミド、及びＣｙ５ ＮＨＳ−エステル色素(Amersham Pharmacia Biotech)のそれぞれとインキュベーションした。翌朝、該オリゴヌクレオチドをエタノール沈降し、生じたペレットをＨ2Ｏに再懸濁した。ラベル化オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラム及び６０％ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって精製し、所望のピークを回収して凍結乾燥した。残存物をＨ2Ｏ中に再懸濁し、回収された材料の濃度を測定した。
【０１０９】
１３．２ 結合アッセイ
黒色のストレプタビジン皮膜９６穴プレートのウェルを、環境温度で１２０分間、非ラベル化または化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチド（１００μｌＰＢＳ／１ＭｇＣｌ2で希釈された２０ｐｍｏｌ／ウェル）のそれぞれで皮膜した。いずれかの非結合材料を、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ／１ｍＭ ＭｇＣｌ2／０．１％ ＢＳＡ）で強力にウェルを洗浄することによって除去した。非ラベル化またはＣｙ５ラベル化プローブオリゴヌクレオチドを、０．２ｐｍｏｌ／μｌのアッセイ緩衝液に希釈し、プローブハイブリダイゼーションを許容するために、１００μｌを１２０分、環境温度で皮膜ウェルでインキュベーションした。最後に、ウェルをＰＢＳで強力に洗浄し、蛍光強度を５６０ｎｍの励起フィルター及び６７０ｎｍの吸収フィルターを使用して蛍光プレートリーダーで測定した（図７）。
【０１１０】
非ラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、非ラベル化またはＣｙ５ラベル化プローブのいずれかでインキュベーションされたウェルは、残余の背景蛍光シグナルを与えた。同様に、化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、非ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、低い傾向シグナルを与えた。化合物ＩＩＩラベル化標的オリゴヌクレオチドで皮膜され、Ｃｙ５ラベル化プローブでインキュベーションされたウェルは、強力な蛍光シグナルを与え、ＦＲＥＴが化合物ＩＩＩとＣｙ５の間で生じることを示した。
【０１１１】
実施例１４．タンパク質：ＤＮＡ直接的強度結合アッセイ
１４．１ 試薬の調製
全てのＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドを、Genosys Biotechnologies Ltdから得た。ＮＦ−ｋＢに対して特異的な等モル量のビオチン化コード鎖(5' ビオチン-GATCTAGGGACTTT CCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAAGGCGCCTA 3')を、３分沸騰水浴中で共にインキュベーションし、２時間冷却することによってアニールさせた。
【０１１２】
抗ＧＳＴ抗体（３ｍｇ／ｍｌ、Molecular Probes社から得た１．５ｍｇ供給物／バイアル（０．５ｍｌ））を、室温で４時間、０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透析し、透析を０．１５Ｍ塩化ナトリウムの新たな溶液で4℃で一晩継続した。翌朝、抗体を最大４時間、０．１Ｍ炭酸水素ナトリウムの１リットルに対して透析した。
【０１１３】
ＤＭＳＯ中の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミドエステルの１ｍｇ／ｍｌ溶液を、０．１０ｍｇ色素：０．３３ｍｇ抗体の比で抗体を攪拌しながら段階的に加えた。該溶液を、暗所で室温でさらに４５分混合した。遊離色素を、室温で４時間０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透析し、４℃で一晩新鮮な０．１５Ｍ塩化ナトリウムの１リットルに対して透析することによって除去した。最後に抗体を、室温で４時間０．０１Ｍ ＰＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析し、次いで４℃で一晩０．０１Ｍ ＰＢＳ／０．０１％アジ化ナトリウムの１リットルに対して透析した。（全ての透析は、ラベリングに引き続き暗所で実施された。）
【０１１４】
１４．２ 結合アッセイ
ビオチンラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的ｄｓＤＮＡ（２．５ｐｍｏｌ、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2中に希釈した）を、９６穴ストレプタビジン皮膜ミクロタイタープレート(Bohringer Mannheim)の各ウェル（最終容量、１００μｌ）に加え、室温で２時間インキュベーションした。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）での洗浄に引き続き、５ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５ＧＳＴを、２００ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン（非特異的競合因子）のそれぞれの存在化または不存在下で、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＤＴＴ中に加えた（ブランクはｐ６５ＧＳＴを含まない）。両タンパク質をＨｅｐｅｓ緩衝液中に上述のように希釈した；最終ウェル容量は１００μｌであった。該プレートを室温で３０分浸透し、さらに３０分放置した。上述のＰＢＳ緩衝液での洗浄に引き続き、１００μｌの最終ウェル容量で、上述のＨｅｐｅｓ緩衝液中の５０ｐｍｏｌ／ウェルの化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴ Ａｂで検出を達成した。最後に該プレートを、上述のようにＰＢＳ緩衝液で洗浄し、１００μｌの水を各ウェルに加えた。該プレートを、Biolumin 960蛍光ミクロプレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)においてEx535/Em569及びEx560/595で読み取った。その結果が図８に示されている。
【０１１５】
化合物ＩＩＩラベル化抗ＧＳＴでの検出は、１０１：１(Ex560/Em595)及び１２３：１(Ex535/Em569)の間の相当するＳ／Ｎ比を有する、約１０，０００ｒｆｕの良好なシグナルを生じた。４０倍モル過剰の特異的競合因子、ｐ６５を使用して特異性が示され、ｐ６５は全シグナルを約９０％まで減少した。非特異的競合因子、カゼインは、全シグナルを２５％のみまで減少した。
【０１１６】
実施例１５．タンパク質：ＤＮＡ ＦＲＥＴ結合アッセイ
１５．１ 試薬の調製
全てのＨＰＬＣ精製ＮＦ−ｋＢ特異的オリゴヌクレオチドを、Genosys Biotechnologies Ltdから得た：コード鎖は、5'末端第一級アミンで修飾され(5' NH2-GATCTAGGGACTTTCCGCG 3')、非コード鎖は修飾されなかった(5' ATCCCTGAAAGGCGCCTAG 3')。１０倍モル過剰のＣｙ−５−ＮＨＳエステル色素(Amersham Pharmacia Biotech)を、２２℃で一晩、０．１Ｍ二炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９）中の、コード鎖とインキュベーションした。翌朝、該オリゴヌクレオチドをエタノール沈降し、次いで水中に再懸濁した。ラベル化コード鎖を、Ｃ１８カラム及び６０％ ＴＥＡＡ／アセトニトリル勾配を使用して、逆相ＨＰＬＣによって精製した。ピーク含有ラベル化オリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、水中に再懸濁した。
【０１１７】
ＮＦ−ｋＢ特異的二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを、Ｃｙ−５ラベル化コード鎖(5' Cy5-GATCTAGG GACTTTCCGCG 3')及び非修飾非コード鎖(5' ATCCCTGAAA GGCGCCTAG 3')の等モル量と共にインキュベーションし、３分間沸騰水浴させ、２時間冷却することによってアニールさせて生産した。
【０１１８】
ＮＦ−ｋＢ ｐ６５タンパク質（２６０ｍｇ）を、０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中で１０００μｌに希釈した。２０倍モル過剰の6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭＳＯ中で１ｍｇ／ｍｌの溶液として）を、２時間攪拌しながら２２℃で該タンパク質とインキュベーションした（暗所において）。ラベル化タンパク質を、４℃で０．０１Ｍリン酸緩衝生理食塩水／０．５Ｍ ＮａＣｌ／３ｍＭ ＥＤＴＡ／２ｍＭ ＤＴＴの３回の変化に対して透析した（暗所において、４時間／新鮮な緩衝液）。
【０１１９】
１５．２ 結合アッセイ
黒色のミクロタイタープレート(Dynatech)を、ＦＲＥＴアッセイのために使用した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５（２０ｐｍｏｌ）を、２００ｐｍｏｌ／ウェルのｐ６５（特異的競合因子）またはカゼイン（非特異的競合因子）のそれぞれの存在化または不存在下で、１０ｐｍｏｌのＣｙ５ラベル化ＮＦ−ｋＢ特異的二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡを含む、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．２ｍＭ酢酸ナトリウム、０．０５％ ＮＰ４０、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ及び５ｍＭ ＤＴＴ中でインキュベーションした。両タンパク質を、１００μｌの最終ウェル容量を与えるように、Ｈｅｐｅｓ緩衝液中に希釈した。化合物ＩＩＩラベル化ｐ６５のみを含むウェルが、ブランクとして使用された。該プレートを２２℃で３０分攪拌しながらインキュベーションし（暗所において）、さらに３０分放置した。該プレートを、Biolumin 960蛍光ミクロプレートリーダー(Molecular Dynamics Inc.)において、Ex520/Em670で読み取った。その結果が図９に示されている。
【０１２０】
２０００ｒｆｕのシグナルを、４：１の相当するＳ／Ｎ比を有するＦＲＥＴアッセイにおいて得られた。特異性は、特異的競合因子、ｐ６５の１０倍モル過剰を使用して示され、ｐ６５は４０％まで全体のシグナルを減少した。非特異的競合因子、カゼインは、全体のシグナルに効果を有さなかった。
【０１２１】
実施例１６．蛍光偏光を使用したレセプターリガンド結合アッセイ
１６．１ 試薬の調製
6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a,3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物ＩＩＩ）、N-ヒドロキススクシンイミドエステル（１ｍｇ）のサンプルを、５％ｖ／ｖトリエチルアミンの存在下で、ジメチルスルホキシド中の１ｍｇのテレンゼピンアミン同類物と反応させた。該反応を、暗所で環境温度で２時間継続させた。化合物ＩＩＩ−テレンゼピン生成物を、０．１％トリフルオロ酢酸の存在下で、Ｃ１８カラム及び６０％水／アセトニトリル勾配を使用して逆相ＨＰＬＣによって開始材料から精製した。精製物のピークを回収し、暗所で凍結乾燥し、ジメチルスルホキシド中に再懸濁した。これを等分し、暗所で−２０℃で凍結して貯蔵した。
【０１２２】
Ｍ1ムスカリンレセプターを安定に発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ Ｍ1細胞）を、１０％胎児ウシ血清（ＢＲＬ）；２ｍＭグルタミン；５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、ストレプトマイシン；１２５μｇ／ｍｌゲネチシン(Sigma)を含むＨＡＭＳ Ｆ１２培地(Sigma)中で生育させ、湿気を含むインキュベーター中で５％ＣＯ2と共に３７℃で維持した。細胞をローラーボトルに広げ、５％ＣＯ2で浄化し、ローラーボトルインキュベーター中に４日間３７℃で放置した。
【０１２３】
細胞を冷蔵リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．３（ＰＢＳ錠剤；Sigma）中にばらすことによって集め、ＭＳＥ Ｍｉｓｔｒａｌ３０００ｉ遠心機において４℃で１４００ｒｃｆで遠心分離することによってペレット化した。細胞を冷蔵５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５ホモジネーション緩衝液に再懸濁し、２０分間氷上で放置してから、９００ｐｓｉの窒素を使用してＰａｒｒ細胞破壊装置(Parr Cat. N゜. 4639, 45ml)を使用して細胞溶解した。何れかの比破壊細胞を１４００ｒｄｆで遠心分離することによって除去し、懸濁液を取り出しさらに４℃で２０分Beckman J2-21M/E遠心機において１８０００ｒｐｍで遠心分離した。生じたペレットを冷蔵ホモジネーション緩衝液に再懸濁し、上述のように１８０００ｒｐｍで遠心分離した。細胞膜ペレットを、およそ１５ｍｌのホモジネーション緩衝液に再懸濁し、等分し、−７０℃での貯蔵のため液体窒素で凍結した。
【０１２４】
*テレンゼピンアミン同類物は、Chemical Synthesis Programme of the National Institute of Mental Health, Cobtact NO1MH30003の一部として、Research Biochemicals Internationalによって提供された。
【０１２５】
１６．２ 結合アッセイ
等量のＣＨＯ Ｍ1細胞膜（５０μｇ）を、Ｍ１ムスカリンレセプターアンタゴニストアトロピン及びＴＡＣ（５０００ｎＭ−０．０６４ｎＭ）の一連の希釈を含む黒色のミクロタイタープレートのウェルに加えた。次いで該プレートを、バックグランド偏光値を測定するFluorolite FPM-2TMで測定した（励起フィルター５３０ｎｍ；放射フィルター５９０ｎｍ）。化合物ＩＩＩ−テレンゼピンリガンド（４ｎＭ最終濃度）の添加の後、該プレートを密封し、ミクロタイタープレートシェーカー上で暗所で２２℃でインキュベーションした。得られた偏光データから、非直線回帰及び一部分結合分析を使用して、アトロピン及びＴＡＣの両者について競合曲線を作成した(GraphPad Prism 2.0データ操作パッケージ）。
【０１２６】
図１０における曲線は、ｌｏｇ１０モル濃度非ラベルリガンドに対してプロットされた特異的偏光読み取りを示す。１９０ｍＰの特異的シグナルが得られ、この実験から測定されたＩＣ５０値は、アトロピンについて４．１ｎｍ及び非ラベルＴＡＣについて２８ｎＭであった。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、実施例１．６の色素でラベルされたタンパク質と比較した、実施例１の色素の溶液に対する吸収スペクトルを示すグラフである。
【図２】 図２は、実施例１の色素の硬化色素構造を、二つの開いた鎖の色素の構造と比較する化学式である。
【図３】 図３は、図２の三つのシアニン３色素のスペクトル特性を比較するグラフである。
【図４】 図４は、５１４ｎｍで励起された場合の図２の三つのシアニン色素の放射スペクトルを示すグラフである。
【図５】 図５は、レーザーにさらされた場合の、図２の三つの色素を光ブリーチした結果を示すグラフである。
【図６】 図６は、実施例１２．２に従ったペプチド極性化結合アッセイの結果を示すグラフである。
【図７】 図７は、実施例１３．３の核酸ＦＲＥＴハイブリダイゼーションアッセイの結果を示す棒グラフである。
【図８】 図８は、実施例１４．２の方法に従ったタンパク質：ＤＮＡ直接的強度結合アッセイを示す棒グラフである。
【図９】 図９は、実施例１５．２のタンパク質：ＤＮＡ ＦＲＥＴ結合アッセイの結果を示す棒グラフである。
【図１０】 図１０は、実施例１６．２に引き続き非ラベル化リガンドの濃度に対する特異的極性読み取りをプロットするグラフである。
Claims (16)
- Ｒ２−Ｒ９基によって任意に置換された以下の式：
Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９基は、それぞれ、Ｘ又はＹを含む環に結合し、または任意にＺａ 又はＺｂ環構造の原子に結合し；
Ｒ２からＲ９は同じまたは異なり、それぞれ、−Ｒ１０ 又は−Ｌ−Ｒ１０を含み、Ｒ１０は、水素、ハロゲン、カルボキサミド、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホナート、第四級アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホナート、ホルミルアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、アルデヒド、スクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、−ＮＨＣＯＣＨ ２ Ｒ １５ （式中、Ｒ １５ は、Ｉ又はＢｒである）、Ｎ−マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト、酸ハライド、アルキルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドから選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状Ｃ１−２０アルキル鎖、及び４個までの−ＣＯＮＨ−結合および２〜２０個の−（ＣＨ ２ ）−単位からなる鎖より成る群から選択され；
Ｒ１は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アンモニウム、ホスホリル、スルフヒドリル、及びアルキルから選択され、アミノ、Ｃ１−Ｃ４アルキル置換アミノ、第四級アンモニウム、アルデヒド、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、アミド、及びニトロから選択される基で置換されていてもよく；
Ａは、Ｏ、Ｓ及びＮＲ１１から選択され、式中Ｒ１１は置換されたアミノ基であり；
Ｘ及びＹは、同じまたは異なってもよく、ビス−Ｃ１−Ｃ４アルキル置換炭素、Ｃ ４ −Ｃ ５ スピロアルキル置換炭素、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ２）ｎＲ１２基から選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ１２は水素、アミノ、アルデヒド、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、ホルミルアミノ、第四級アンモニウム、及びニトロから選択され；
Ｚａ及びＺｂのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択される５または６の原子を有し；
Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ１−Ｒ９は、アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、アルデヒド、カルボキシル及びスルフヒドリルより成る群から選択される官能基であるか、もしくは前記官能基と共有結合できる反応基であり、または
Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ１−Ｒ９は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである］
の化合物。 - Ｒ１が、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、及びハロゲンから選択され、Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４及びＲ５は水素である、請求項１記載の化合物。
- i）6,7,9,10-テトラヒドロ-2,14-カルボキシメチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物I）；
ii）8,9,11,12-テトラヒドロ-3,17-ジスルホナト-20,20,22,22-テトラメチル-9aH,10aH-ビスベンズ [e]インドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-7-イウム（化合物II）；
iii）6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c:5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物III）；
iv）6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、グリシンアミド（化合物IV）；
v）6,7,9,10-テトラヒドロ-2-カルボキシメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム、N-(2-アミノエチルカルボキシアミド)（化合物V）；
vi）6,7,9,10-テトラヒドロ-2-(N-ホルミル)アミノメチル-14-スルホナト-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物VI）；
vii）6,7,9,10-テトラヒドロ-2-ヒドロキシエチル-16,16,18,18-テトラメチル-7aH,8aH-ビスインドリニウム[3,2-a;3'2'-a]ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物VII）；
viii）6,7,8,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a,8a-ベンゾチアゾレニン-インドレニン-[3,2-a]-ベンゾチアゾリル[3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物VIII）；
ix）6,7,8,8a,9,10-ヘキサヒドロ-2,14-ジスルホナト-8-(4-カルボキシ-アニリノ)-16,16,18,18-テトラメチル-7aH-ビス-インドリニウム[3,2-a;3'2'-a']ピリド[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物IX）；
x）6,7,9,10-テトラヒドロ-14-カルボキシメチル-16,16-ジメチル-7a-8a-キノリノ-インドレニウム-[3,2-a;3'2'-a]-ピラノ[3,2-c;5,6-c']ジピリジン-5-イウム（化合物X）；
から選択される、請求項１記載の化合物。 - 任意にＲ２−Ｒ９基によって置換された以下の式（Ａ）：
Ｘ、Ｙ、Ｚａ、Ｚｂ及びＲ１，Ｒ２，Ｒ３，Ｒ４，Ｒ５，Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９は請求項１に定義したとおりであり、Ｒは連結基Ａの形成に適した条件下でメチルまたはエチルであり、Ａは請求項１に定義したとおりである］
の化合物を、酸性溶液中で縮合環化反応させることを含む、請求項１記載の化合物の製造法。 - 任意にＲ２−Ｒ９基によって置換された以下の式：
Ｒ６，Ｒ７，Ｒ８及びＲ９基は、それぞれ、Ｘ又はＹを含む環に結合し、または任意にＺａ 又はＺｂ環構造の原子に結合し；
Ｒ２からＲ９は同じまたは異なり、それぞれ、−Ｒ１０ 又は−Ｌ−Ｒ１０を含み、Ｒ１０は、水素、ハロゲン、カルボキサミド、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、ニトロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、スルホナート、第四級アンモニウム、グアニジニウム、ヒドロキシル、ホスファート、ホスホナート、ホルミルアミノ、アジド、スルフヒドリル、カルボキシル、アルデヒド、スクシンイミジルエステル、イソチオシアナート、−ＮＨＣＯＣＨ ２ Ｒ １５ （式中、Ｒ １５ は、Ｉ又はＢｒである）、Ｎ−マレイミド、スルホニルハライド、ホスホルアミダイト、酸ハライド、アルキルイミダート、ヒドラジド、及びカルボジイミドから選択され、並びにＬは、直鎖状または分枝状Ｃ１−２０アルキル鎖、及び４個までの−ＣＯＮＨ−結合および２〜２０個の−（ＣＨ ２ ）−単位からなる鎖より成る群から選択され；
Ｒ１は、水素、アリール、ヘテロアリール、シアノ、ニトロ、アルデヒド、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、第四級アンモニウム、ホスホリル、スルフヒドリル、及びアルキルから選択され、アミノ、Ｃ１−Ｃ４アルキル置換アミノ、第四級アンモニウム、アルデヒド、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、アミド、及びニトロから選択される基で置換されていてもよく；
Ｘ及びＹは、同じまたは異なってもよく、ビス−Ｃ１−Ｃ４アルキル置換炭素、Ｃ ４ −Ｃ ５ スピロアルキル置換炭素、酸素、硫黄、セレン、ＣＨ＝ＣＨ、及びＮ−Ｗから選択され、ここでＮは窒素であり、Ｗは水素、−（ＣＨ２）ｎＲ１２基から選択され、ここでｎは１から２６の整数であり、Ｒ１２は水素、アミノ、アルデヒド、ハロ、シアノ、アリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、ホルミルアミノ、第四級アンモニウム、及びニトロから選択され；
Ｚａ及びＺｂのそれぞれは、一つ、二つの融合したまたは三つの融合した芳香族環を完成するために必要とされる結合または原子を表し、各環は、炭素原子並びに任意に２以下の酸素、窒素及び硫黄原子から選択される５または６の原子を有し；
Ｒは連結基Ａの形成に適した条件下でメチルまたはエチルであり、Ａは請求項１に定義したとおりであり；
Ｘ及びＹが炭素以外のものである場合、少なくとも一つのＲ１−Ｒ９は、アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、アルデヒド、カルボキシル及びスルフヒドリルより成る群から選択される官能基であるか、もしくは前記官能基と共有結合できる反応基であり、または
Ｘ及びＹが異なり、且つＯ及びＳｅから選択される場合、少なくとも一つのＲ１−Ｒ９は、水素、メチル、フェニル若しくはナフチル以外のものである］
の化合物。 - 非極性材料に、少なくとも一つのＲ１からＲ９及びＲ１１基が、Ｃ １−２６ のアルキル及びアリールから選択される非電荷基である請求項１記載の化合物を混合する工程を含む、非極性材料に蛍光特性を与える方法。
- 極性材料に、少なくとも一つのＲ１からＲ９及びＲ１１基が、−Ｅ−Ｆ−（式中、Ｆは、ヒドロキシ、スルホナート、スルファート、カルボキシラート、または第四級アンモニウムであり、Ｅは、ｎが０〜６である−（ＣＨ ２ ） ｎ −のスペーサー基である）で表される電荷基及び極性基より成る群から選択される請求項１記載の化合物を混合する工程を含む、極性材料に蛍光特性を与える方法。
- i）アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、アルデヒド、カルボキシル、及びスルフヒドリル基より成る群から選択される少なくとも一つの官能基を有する；または前記少なくとも一つの官能基と共有結合できる少なくとも一つの反応基を有する、標的材料、及び；
ii）少なくとも一つのＲ１からＲ９及びＲ１１基が、アミノ、ヒドロキシル、ホスホリル、アルデヒド、カルボキシル、及びスルフヒドリルより成る群から選択される官能基である；または少なくとも一つのＲ１からＲ９及びＲ１１基が、前記少なくとも一つの官能基と共有結合できる反応基である、請求項１記載の蛍光化合物；
を共に、
前記蛍光化合物の前記少なくとも一つの官能基または反応基を、前記標的材料の前記少なくとも一つの反応基または官能基に共有結合させるのに十分な時間、
反応させる工程を含む、標的材料に蛍光特性を与えるための方法。 - アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファートから選択される基を一つ以上含むまたは含むように誘導化された、抗体、脂質、タンパク質、炭化水素、およびヌクレオチド；アミノ、スルフヒドリル、カルボニル、ヒドロキシル及びカルボキシル、ホスファート及びチオホスファートから選択される基を一つ以上含むまたは含むように誘導化されたオキシ若しくはデオキシポリ核酸；微生物；薬物；毒素；ガラス；及びポリマーより成る群から選択される標的材料であって、請求項１記載の化合物に共有結合されたものを含む、蛍光ラベル化された標的材料。
- i）特異的結合ペアの一つの構成要素を、前記ペアの第二の構成要素と結合する工程であって、前記第一の構成要素が、ドナー蛍光色素でラベルされており、前記第二の構成要素が、アクセプター蛍光色素（またはクエンチング色素）でラベルされていて、前記第一及び第二の構成要素の間のエネルギー移動関係がもたらされる、工程；及び
ii）放射された蛍光を測定することによって第一及び第二の構成要素の結合を検出する工程；
を含み、ドナー蛍光色素が請求項１記載の化合物である、アッセイ方法。 - 前記結合アッセイが、イムノアッセイ、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、ＤＮＡ−タンパク質結合アッセイ、ホルモンレセプター結合アッセイ、及び酵素アッセイより成る群から選択される、請求項１０記載の方法。
- i）エネルギー移動関係にある二つの構成要素を分離する工程であって、前記第一の構成要素が、ドナー蛍光色素でラベルされており、前記第二の構成要素が、アクセプター蛍光色素（またはクエンチング色素）でラベルされている、工程；及び
ii）放射された蛍光を測定することによって分離した第一又は第二の構成要素の存在を検出する工程；
を含み、蛍光ドナー色素が請求項１記載の化合物である、アッセイ方法。 - 該アッセイが、タンパク質溶解性酵素切断アッセイ、ヌクレアーゼ切断アッセイ、及びリパーゼ切断アッセイから選択される請求項１２記載の方法。
- i）分析物に対する特異的結合パートナーを準備する工程であって、特異的結合パートナーを請求項１記載の化合物でラベルする、工程；
ii）測定すべき分析物と、前記特異的結合パートナーとを、分析物が結合して分析物−特異的結合パートナー複合体を形成するのに適した条件下で接触させる工程；及び
iii）結合の度合を測定するために、色素でラベルされた分析物−特異的結合パートナー複合体の蛍光偏光を測定する工程；
を含む、サンプル中の分析物の測定方法。 - i）酵素に対して基質を準備する工程であって、前記基質が請求項１記載の化合物でラベルされている工程；
ii）酵素反応を開始するのに適した条件下で、酵素と、前記ラベル化基質とを接触させる工程；及び
iii）反応の度合を測定するためにサンプルの蛍光偏光を測定する工程；
を含む、サンプル中の酵素の測定のためのアッセイ方法。 - i）配列決定すべき核酸のサンプル、前記配列決定すべき核酸の少なくとも一部に相補的であるプライマー核酸配列、デオキシヌクレオチド調製品、配列決定反応を終結させるための少なくとも一種のジデオキシヌクレオチド、及びポリメラーゼを準備する工程；
ii）核酸鎖伸長及び鎖終結反応を実施する工程；
iii）サイズに従ってオリゴヌクレオチド断片を分離する工程；
を含み、前記ジデオキシヌクレオチドの一種以上または前記プライマー核酸配列が、請求項１記載の化合物でラベルされていることを特徴とする、核酸の配列の決定方法。
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