CN113702342B - 一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法,将探针的溶液与待测溶液混合,或者将所述探针的溶液与发光剂混合,然后再与待测溶液混合,然后用光照射,检测荧光光谱。也可以将试纸浸泡所述探针的溶液后,然后干燥得到检测试纸;将待测溶液滴在所述检测试纸上,根据颜色变化完成待测溶液中汞离子的检测。本发明首次实现三通道荧光检测(Stokes荧光、OPA‑UC荧光和TTA‑UC荧光),结果表明:将上述两种弱光上转换检测方法同时运用在对汞离子的检测,可实现单一化合物分子同时达到高灵敏性(nM级别)和宽检测范围(mM级别)的要求,解决了使用常规的荧光检测方法始终存在着高灵敏性和宽检测范围之间的矛盾,具有鲜明的特色和创新性。
Description
技术领域
本发明属于上转换发光和重金属离子检测技术领域,具体涉及一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法。
背景技术
在各种重金属中,汞离子更是被认为是毒性最强的金属离子之一。汞离子在极低浓度也会导致多种人类健康问题,包括视力丧失、严重的认知运动障碍、产前脑损伤以及对人类心脏、肾脏、胃等的损害,甚至会导致哺乳动物死亡。因此,开发高效灵敏的铜离子和汞离子化合物得到广泛研究。目前,测定汞离子的方法有很多,主要包括:分光光度法、荧光分析法、电化学法和原子吸收光谱法等。其中,荧光分析法具有很高的灵敏度(如可实现单分子检测)和选择性且成本低廉性价比高,同时其操作简易、适用范围广等优点。至今为止,被设计合成出来用于汞的检测的荧光探针已经有上百种,均是采用下转换荧光检测方法,其机理是在短波长光源的激发下,电子从基态的零振动级(S0)跃迁到第一激发态(S1),然后回落至基态并释放出长波长的荧光,可见,下转换荧光的光谱特征是“短波(长)激发,长波(长)发射”。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法;利用的探针分子可通过上/下转换荧光快速增强响应来检测汞离子,且对细胞伤害性小,具有潜在的活体细胞应用价值。
为达上述发明目的,本发明采用的技术方案是:
一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法,包括以下步骤:
(1)以四碘代荧光素、三氯氧磷、硫化钠为原料,反应制备探针;
(2)将所述探针的溶液与待测溶液混合,然后用光照射,检测荧光光谱;根据荧光光谱完成待测溶液中汞离子的检测。
一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法,包括以下步骤:
(1)以四碘代荧光素、三氯氧磷、硫化钠为原料,反应制备探针;
(2)将所述探针的溶液与发光剂混合,然后再与待测溶液混合,然后用光照射,检测荧光光谱;根据荧光光谱完成待测溶液中汞离子的检测。
一种利用荧光转换检测溶液中汞离子的方法,包括以下步骤:
(1)以四碘代荧光素、三氯氧磷、硫化钠为原料,反应制备探针;
(2)将试纸浸泡所述探针的溶液后,干燥得到检测试纸;将待测溶液滴在所述检测试纸上,根据颜色变化完成待测溶液中汞离子的检测。
上述技术方案中,先将四碘代荧光素与三氯氧磷反应,得到四碘代荧光素酰氯;再将四碘代荧光素酰氯与硫化钠反应,得到探针。优选的,四碘代荧光素、三氯氧磷、硫化钠的用量比例为1 mmol∶(0.8~1.2 mL)∶1 0mmol。优选的,四碘代荧光素与三氯氧磷的反应为回流反应6~10小时;四碘代荧光素酰氯与硫化钠的反应为氮气下回流反应20~30小时。优选的,四碘代荧光素与三氯氧磷反应的溶剂为二氯乙烷,反应结束旋蒸,得到的中间产物无需提纯,直接与硫化钠在氮气氛中回流反应,反应结束后,旋转蒸发除去溶剂,通过柱层析和真空干燥,得到探针。
本发明中,发光剂为蒽或者蒽衍生物,比如DPA。
本发明使用的是反斯托克斯发射,即“长波长激发,短波长发射”的上转换检测方法。由于以长波长光为激发的光源,可加深激发光源在介质中的穿透力,检测深度广;同时,因其所需激发能量较低,可有效地消除生物体背景荧光从而提高检测分辨率;另外,又因其所需激发能量较低,对生物活体细胞的检测杀伤力小,使其在生物成像和细胞环境检测中具有潜在应用价值。因而,相对于斯托克斯发射的荧光(即下转换荧光)检测技术,上转换检测技术则具有更诱人的应用价值。
本发明中,可以采用荧光光谱检测待测溶液中的汞离子;也可以采用检测试纸肉眼观察,检测待测溶液中的汞离子。
上述技术方案中,采用荧光光谱检测待测溶液中的汞离子时,荧光光谱为下转换荧光光谱或者上转换荧光光谱。优选的,荧光光谱为下转换荧光光谱时,探针的溶液中,探针的浓度为0.05~10mM。荧光光谱为上转换荧光光谱时,上转换为OPA-UC上转换或者TTA-UC上转换。具体的,本发明将所述探针的溶液与待测溶液混合,采用OPA-UC检测,此时探针的溶液中,探针的浓度为50~150μM;将所述探针的溶液与发光剂混合,然后再与待测溶液混合,采用TTA-UC上转换,此时探针的溶液中,探针的浓度为1~50μM,发光剂的浓度为0.1~10 mM,优选0.5~5 mM。进一步的,荧光光谱为下转换荧光光谱时,激发光波长为500 nm;荧光光谱为上转换荧光光谱时,激发光波长为655 nm。
上述技术方案中,采用检测试纸检测待测溶液中的汞离子时,探针的溶液中,探针的浓度为0.1×10-4~5×10-4 M。颜色变化为,肉眼观察下,检测试纸的颜色由白色变为玫瑰红色时,待测溶液中含有汞离子,反之,不含汞离子。
本发明的技术方案具有如下技术效果和优点:
本发明的方法中,探针的检测体系为水/DMSO(1/2, v/v)中性介质,实用性强;首次运用同一化合物实现三通道荧光检测(Stokes荧光、OPA-UC荧光和TTA-UC荧光),对汞离子的传统的的Stokes荧光的检测限和量程分别为8.617×10-9 M和0~10 μM,而TTA-UC荧光检测限在nM级别(1.48×10-9 M),而OPA-UC荧光检测量程在mM级别(0~0.5 mM),结果表明:将上述两种弱光上转换检测方法同时运用在对汞离子的检测,可实现单一化合物分子同时达到高灵敏性(nM级别)和宽检测范围(mM级别)的要求,解决了使用常规的荧光检测方法始终存在着高灵敏性和宽检测范围之间的矛盾,具有鲜明的特色和创新性;探针试纸可用于高浓度的汞离子的裸眼检测,且探针试纸遇汞均可快速变色,方便快捷;OPA-UC检测所用仪器为小型半导体激光器和光纤光谱仪,无需常规的大型荧光光谱仪器,因此,OPA-UC检测显示出更加经济和便携。从而使得上转换检测技术更具实际应用价值。
附图说明
图1 为四碘代荧光素螺环内硫酯的核磁氢谱(氘代DMSO);
图2为四碘代荧光素螺环内硫酯的质谱图;
图3为加入16种金属阳离子后,探针的下转换荧光增强光谱(其中,阳离子浓度100μM,探针浓度10 μM);
图4为加入16种金属阳离子后,探针的荧光响应变化柱状图(纵坐标F/F0为加入Hg2 +前后探针在577 nm荧光强度)(其中,阳离子浓度100 μM,探针浓度10 μM);
图5为加入16种金属阳离子后,探针的上转换荧光增强光谱(其中,阳离子浓度100μM,探针浓度100 μM);
图6为加入16种金属阳离子后,探针的上转换增强响应柱状图(纵坐标UCPL/UCPL0为加入Hg2+前后探针在576 nm上转换荧光强度)(其中,阳离子浓度100 μM,探针浓度100 μM);
图7为加入不同浓度的汞离子(0~10 μM),探针下转换荧光光谱(其中,探针浓度10μM,激发波长500 nm);
图8为加入不同浓度的汞离子(0~10 μM),探针的工作曲线(纵坐标F/F0为加入Hg2+前后探针在575 nm荧光强度)(其中,探针浓度10 μM,激发波长500 nm);
图9为加入不同浓度的汞离子(0~100 μM),探针上转换荧光光谱(纵坐标UCPL/UCPL0为加入Hg2+前后探针在592 nm荧光强度)(其中,探针浓度1mM,激发波长655 nm);
图10为加入不同浓度的汞离子(0~500 μM),探针的工作曲线(纵坐标UCPL/UCPL0为加入Hg2+前后探针在592 nm荧光强度)(其中,探针浓度1m M,激发波长655 nm);
图11为探针加入Hg2+后随时间变化荧光图(其中,探针浓度为10 μM,Hg2+浓度=100μM,激发波长500 nm);
图12为探针加入Hg2+后在575 nm处荧光强度的工作曲线(其中,探针浓度为10 μM,Hg2+浓度=100 μM,激发波长500 nm);
图13为探针加入Hg2+后随时间变化荧光图(其中,探针浓度为100 μM,Hg2+浓度=100 μM,激发波长655 nm);
图14为探针加入Hg2+后在584 nm处荧光强度的工作曲线(其中,探针浓度为100 μM,Hg2+浓度=100 μM,激发波长655 nm);
图15为探针试纸条检测Hg2+的颜色变化(Hg2+浓度从左到右依次为:0,0.1,0.5,1,10,单位:mM);
图16为Luc-1对金属离子的下转换荧光增强响应图;
图17为Luc-5对金属离子的下转换荧光增强响应图;
图18为 Luc-7对阳离子的的TTA-UC荧光选择性(Luc-7/DPA:10 μM/1 mM,离子:10μM);
图19为加入不同浓度汞离子后的Luc-7的TTA-UC荧光光谱及其工作曲线(Luc-7/DPA:10 μM/1 mM,DMSO)。
具体实施方式
本发明公开的四碘代荧光素螺环内硫酯类荧光探针分子,对汞离子具有“上/下转换荧光”快速增强响应特性,对水环境或生物体中汞离子检测具有应用价值。
实验仪器及试剂
以上试剂除非另外说明,否则原料或中间体均不经任何中间处理使用。
下转换测试:用爱丁堡荧光光谱仪器测试,激发波长为500 nm。
上转换测试,选用655 nm半导体激光器作为激发光源,光纤光谱仪作为信号接收和处理设备。
合成以及测试过程中所用到的各类仪器仪表都为常规产品,以二氯化汞水溶液为汞离子溶液。
制备例四碘荧光素螺环内硫酯的制备
在50 mL的三口烧瓶中加入四碘荧光素(1 mmol)、三氯氧磷(1 mL)和10 mL二氯乙烷,常规超声将其溶解;90℃回流反应8h,反应过程点板跟踪,展开剂为二氯甲烷:石油醚(1/1,v/v),停止反应,冷却至室温;减压蒸馏除去二氯乙烷和三氯氧磷,得到土黄色固体中间产物(四碘荧光素酰氯)。在不提纯的情况下,直接将上述中间产物溶于无水四氢呋喃中,加入无水硫化钠(10 mM, 0.78 g),常规超声使其溶解;在氮气氛下,70℃回流反应24h;反应过程点板跟踪,展开剂为二氯甲烷:石油醚(1/1,v/v)。停止反应,冷却至室温;加圧蒸留除去四氢呋喃得到固体混合物,通过柱层析方法提纯产物,展开剂为乙酸乙酯/二氯甲烷(8/1,v/v)。得到0.09g淡粉色的探针(产率:10 %)。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6):δ 10.04(s, 2H,Ar-OH),7.89 (d, J = 7.6 Hz, 1H,Ar-H), 7.78 (t, J = 7.5 Hz, 1H,Ar-H),7.70 (t, J = 7.4 Hz, 1H,Ar-H), 7.37 (d, J = 7.8 Hz, 1H,Ar-H), 7.09 (s, 2H,Ar-H);13C NMR (101 MHz, DMSO-d 6) δ 207.25, 170.01, 157.58, 151.71, 148.28,137.81, 136.36, 134.84, 130.35, 128.06, 123.72, 121.68, 117.43, 99.33 (d, J =23.7 Hz), 84.07, 81.89, 78.10。MS,计算值:[M+H+] =852.63948,测试值:[M+Na+] =852.64029;见附图1、附图2。
实施例一 汞离子检测
取0.0426 g(0.001 mol)四碘荧光素螺环内硫酯于容量瓶中,加入5 mL DMSO,超声振荡使其溶解,配制得到浓度为10 mM的母液,避光保存。
下转换荧光检测溶液配制:
取3 mL缓冲液/DMSO(1/2,v/v)于石英比色皿中,再取出3 μL 上述母液加入石英比色皿中,超声溶解,即配得10 μM的下转换探针检测液。
上转换荧光检测溶液配制:
取3 mL缓冲液/DMSO(1/3,v/v)于石英比色皿中,再取出30 μL 上述母液加入石英比色皿中,超声溶解,即配得100 μM的上转换探针检测液。
上述缓冲液(pH=7)的配制如下:称取1.2114 g(0.01 mol)的三羟甲基氨基甲烷(Tris)于100 mL去离子水中,溶解后得到三羟甲基氨基甲烷(Tris)水溶液(0.1 M);再取出8.3 mL的浓盐酸(HCl,36%)稀释至1000 mL,配得HCl稀溶液(0.1 M);然后,分别取出50 mL的Tris溶液和45.7 mL HCl稀溶液,用pH计微调至pH=7,定容至100 mL,即配得0.05 M的三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(Tris-HCl,pH=7)。
探针对Hg2+的下转换荧光增强响应:在17个盛有下转换探针检测液(10 μM)的比色皿中,分别加入16种金属阳离子水溶液(浓度为100 mM),它们分别是:Hg2+、Cu2+、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Fe2+和Fe3+。然后测定下转换荧光光谱(激发波长500 nm),见附图3、附图4所示。可见,Hg2+的加入使探针的荧光强度增强了160倍,其余金属阳离子几乎不变化。显示出探针对Hg2+具有高度的选择性荧光响应。
探针对Hg2+的上转换荧光响应:在17个盛有上转换探针检测液(100 μM)的比色皿中,分别加入16种金属阳离子水溶液(100 mM),它们是:Hg2+、Cu2+、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Fe2+和Fe3+。然后测定上转换荧光光谱(激发波长:655 nm),见附图5、附图6所示。可见,除了Hg2+外,加入其他15种金属阳离子后,探针溶液在短波长处并不出现上转换荧光峰形;而Hg2+的加入使得探针溶液的上转换荧光强度增强到原来的5倍,而加入其余15种金属阳离子,探针溶液并不出现上转换荧光峰形。值得注意的是:在下转换荧光检测中起干扰作用的Cu2+,在上转换荧光检测中不再发生干扰。这说明,探针只对Hg2+具有高度的选择性上转换荧光增强响应。
探针对Hg2+浓度的下转换荧光响应:在下转换探针检测液(10 μM)中加入不同浓度的Hg2+,观察探针的下转换荧光光谱的变化(激发波长500 nm),见附图7所示。可见,未加入汞离子之前,探针的荧光很弱;分别加入3 mL~30 mL Hg2+水溶液(1 mM)于上述探针溶液中(Hg2+浓度折合为1~10 μM),时,探针荧光强度不断地增强(见附图8)。由附图可见,在Hg2+浓度0~10 μM范围内,其荧光强度与Hg2+浓度呈现出很好的线性关系,相关系数R2=0.99001。根据公式“检测限=3δ/k”可计算出利用荧光光谱检测Hg2+的检测限为8.617×10-9 M。
探针对Hg2+浓度的上转换荧光响应:在上转换探针检测液(1mM)溶液中加入不同浓度的Hg2+,观察探针上转换荧光光谱的变化(激发波长655 nm),见附图9所示。可见,未加入汞离子之前,探针的上转换荧光很弱,分别加入3 μL~30 μL Hg2+水溶液(50mM)于上述探针溶液中(Hg2+浓度折合为50~500 μM,探针荧光强度不断地增强(见附图10)。由附图可见,在Hg2+浓度0~500 μM范围内,其上转换荧光强度与Hg2+浓度呈现出很好的线性关系,相关系数R2=0.99540。根据公式“检测限=3δ/k”可计算出利用上转换荧光光谱检测Hg2+的检测限为1.10×10-5 M。
探针对Hg2+的下转换荧光响应时间:由附图11可见,下转换探针检测液(10 μM)的荧光很弱,当加入30 mL Hg2+水溶液(10 mM)于上述探针溶液中(Hg2+浓度折合为100 μM)时,探针的荧光强度急剧增强,荧光峰位位于560 nm,其变化几乎是瞬时(10秒以内)的,附图12可以更为直观的看出其随时间的变化。
探针对Hg2+的上转换荧光响应时间:与下转换荧光情况类似,探针对于Hg2+的响应也几乎是瞬时(10秒以内)完成的(见附图13和附图14)。
实施例二 探针试纸检测Hg2+
制备了Hg2+检测试纸。具体操作为:将2cm×1cm 的试纸置于探针的溶液(探针的浓度为 1×10-4 M,溶剂:乙醇)中浸泡30 min,取出自然晾干备用。然后,用玻璃棒蘸取不同浓度的Hg2+水溶液滴在试纸上,如附图15所示。随着Hg2+浓度的增加,试纸由无色(白色)变成玫瑰红色,且颜色依次加深,最低响应浓度为0.01 mM,且效果较四溴代荧光素螺环内硫酯所制试纸更好。因此,该试纸可以对溶液中高浓度的Hg2+实现快速裸眼检测。
迄今为止,报道的有机上转换发光(upconversion, UC)主要有双光子吸收机制(TPA-UC)和三线态-三线态湮灭(TTA-UC)机制来实现的,具有单光子吸收机制的上转换(OPA-UC)则是另一种独特的发光机制,鲜见报道。本发明使用的是单光子上转换(OPA-UC)荧光探测技术。单光子吸收上转换(OPA-UC)机理是电子从基态的热活化振动-转动能级(St)跃迁到第一激发态(S1), 然后回落至基态并发出荧光。与上述的两种上转换(即TPA-UC和TTA-UC)相比,OPA-UC的优势在于,除了具有穿透深度大和对活体伤害小等优势外;OPA上转换所需的激发光源强度较小,所需上转换检测设备价格低廉便携;所需探针的浓度较小,无需隔绝氧气,空气中即可检测,因而实用性更强。
对比例
称取2.5 mmol的荧光素、3.5mmol水合肼加入100 mL三口烧瓶中,加入30 mL乙醇加热回流24小时后,旋蒸除去溶剂,加入去离子水进行重沉淀得到粗产物,分别通过水/乙醇加热挥发结晶法得到最终产物化合物Luc-1:MS,计算值:347.102633,测量值:347.102992;1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.05 – 9.49 (m, 2H), 7.86 – 7.73 (m,1H), 7.49 (dd, J = 6.3, 2.9 Hz, 2H), 7.07 – 6.93 (m, 1H), 6.60 (d, J = 2.3Hz, 2H), 6.53 – 6.32 (m, 4H), 4.40 (s, 2H);
称取2.5 mmol四碘荧光素、3.5mmol水合肼加入100 mL三口烧瓶中,加入30 mL乙醇加热回流24小时后,旋蒸除去溶剂,加入去离子水进行重沉淀得到粗产物,分别通过水/乙醇加热挥发结晶法得到最终产物化合物Luc-5:MS,计算值:849.68193,测量值:850.69090;1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6) δ 10.34 (d, J = 393.8 Hz, 2H), 7.82 (d, J= 8.6 Hz, 1H), 7.54 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.03 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 6.78 (dd,J = 20.3, 13.2 Hz, 2H), 6.63 – 6.34 (m, 1H), 4.63 (s, 2H);13C NMR (101 MHz,DMSO-d 6) δ 165.92, 158.77, 152.79, 136.70, 129.73, 129.46, 129.16, 128.38,123.05 (d, J = 14.8 Hz), 79.41, 79.05, 78.16。
上述对比例合成路线以及产物结构如下:
探针(Luc-1)对金属离子的下转换荧光增强响应:在17个盛有探针溶液(10 μM,DMF/缓冲液,pH=7.0, v/v,1/2)的比色皿中,分别加入16种金属阳离子水溶液(浓度为100mM),它们分别是:Hg2+、Cu2+、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Fe2+和Fe3+。然后测定下转换荧光光谱(激发波长500 nm),见附图16,加入一定量的不同阳离子后,化合物Luc-1仅对Mg2+有微弱的响应且干扰离子较多。
探针(Luc-5)对金属离子的下转换荧光增强响应:在17个盛有探针溶液(10 μM,DMF/缓冲液,pH=7.0, v/v,1/2)的比色皿中,分别加入16种金属阳离子水溶液(浓度为100mM),它们分别是:Hg2+、Cu2+、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2+、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Fe2+和Fe3+。然后测定下转换荧光光谱(激发波长500 nm),见附图17,加入一定量的不同阳离子后,化合物Luc-5对汞离子无响应。
而在OPA-UC(激发波长655 nm)荧光中,对比例化合物对金属离子都未有选择性OPA-UC荧光增强现象。
实施例三 四碘代荧光素螺环内硫酯(Luc-7)在TTA-UC的离子探测性能
以四碘代荧光素螺环内硫酯作为敏化剂与发光剂DPA(9,10-二苯基蒽)在溶液中组成双组份,产生TTA-UC,TTA-UC探测性能研究中均采用纯溶剂DMSO。
在17个盛有双组份溶液(Luc-7/DPA:10 μM/1 mM,DMSO)的比色皿中,分别加入16种金属阳离子水溶液(浓度为10 mM),它们分别是:Hg2+、Cu2+、Mn2+、NH4 +、Zn2+、Mg2+、Cd2+、Pb2 +、Li+、Na+、K+、Ca2+、Ni2+、Co2+、Fe2+和Fe3+,除氧后,测试其TTA-UC荧光光谱(激发波长655nm)。见图18,发现在加入Hg2+后,溶液的上转换荧光明显增强,而加入其它金属离子则无明显的TTA-UC荧光增强,说明在TTA-UC光谱检测中,化合物Luc-7也能选择性的识别Hg2+。
作为对比,将Luc-7更换为四溴代荧光素螺环内硫酯、Luc-1或者Luc-5,采用同样的双组份以及测试方法,对所有离子都没有TTA-UC响应。
TTA-UC的灵敏度测试采用滴定法。向10 μM/1 mM的Luc-7/DPA的DMSO溶液依次滴加1 μL的0.3 mM的汞离子水溶液,除氧后,依次测试其TTA-UC的荧光强度变化(见图19a)。发现依次滴加定量的汞离子后其荧光强度依次增强,由于TTA-UC发光过程对水及其敏感,在汞离子的浓度0~0.8 μM时,荧光强度的增加具有良好的相关性,R2为0.993332,斜率k为11.13683(见图19b),通过公式“检测限=3δ/k”可算得Luc-7在TTA-UC荧光检测通道中对Hg2+的检测限为1.48×10-9 M,其中δ=4.53×10-1。可以看出,Luc-7对汞离子的TTA-UC的检测限极高,极为灵敏。
Claims (9)
4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法,其特征在于,先将四碘代荧光素与三氯氧磷反应,反应结束旋蒸,得到的中间产物无需提纯,直接与硫化钠在氮气氛中回流反应,得到探针。
5.根据权利要求1~2任意一项所述的方法,其特征在于,采用荧光光谱检测待测溶液中的汞离子时,荧光光谱为下转换荧光光谱或者上转换荧光光谱。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,荧光光谱为下转换荧光光谱时,探针的溶液中,探针的浓度为1~50 μM。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,荧光光谱为上转换荧光光谱时,上转换为OPA-UC上转换或者TTA-UC上转换。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,上转换为OPA-UC上转换时,探针的溶液中,探针的浓度为50~150μM;上转换为TTA-UC上转换时,探针的溶液中,探针的浓度为1~20μM,发光剂的浓度为0.1~10 mM。
9.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,探针的溶液中,探针的浓度为0.1×10-4~5×10-4 M。
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