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Gebiet der Erfindung
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Die Erfindung betrifft Imidazonaphthyridin-,
Imidazopyridin- und Imidazochinolinverbindungen, die eine immunreaktionsmodulierende
Wirkung haben und die eine Farbstoffeinheit, insbesondere eine fluoreszente
Farbstoffeinheit, enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren
zur Herstellung der Farbstoff-markierten Verbindungen.
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Hintergrund der Erfindung
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Verbindungen, die markiert oder etikettiert
sind, werden in den chemischen und biologischen Wissenschaften bereits
lange verwendet. Solche Verbindungen können auf verschiedene Weise
verwendet werden. Man kann, zum Beispiel, durch Markieren einer
Verbindung, die als biologisch aktiv bekannt ist, leichter Metaboliten
der Verbindung identifizieren, man kann die Bindungs- und/oder Rezeptorseiten
für das
Molekül
bestimmen, man kann bestimmen, wie lange die Verbindung im Körper oder
einem anderen System bleibt und so weiter.
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Ein bekannter Weg zum Markieren von
Verbindungen ist die Anbringung einer Farbstoffinarkierung an die
Verbindung. Das wird typischerweise durch Pfropfen einer Farbstoffeinheit
auf das biologisch wirksame Molekül oder durch Einbringen der
Farbstoffeinheit in das biologisch wirksame Molekül während seiner
Synthese erfolgen. Es ist wichtig, dass die markierte Verbindung
die entscheidenden Eigenschaften der nicht markierten Verbindung,
wie die selektive Bindung an einen Rezeptor oder eine Nucleinsäure, die
Aktivierung oder Hemmung eines besonderen Enzyms oder die Fähigkeit,
sich in eine biologische Membran einzuschließen, behält. Es ist dafür eine breite
Vielfalt von Farbstoffeinheiten, einschließlich, zum Beispiel, Dipyrromethenbordifluoridfarbstoffe,
Fluorescein, Fluoresceinderivate, Rhodamin, Rhodaminderivate und
Texasrot, verfügbar.
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Die Imidazonaphthyridine, Imidazopyridine
und Imidazochinoline sind Teil einer einzigartigen Klasse von immunreaktionsmodifizierenden
Verbindungen, die die Fähigkeit
haben, die Biosynthese von Interferon und anderen Zytokinen auszulösen. Vgl.,
zum Beispiel, Gerster, U.S. Patent Nr. 4,689,338; Gerster et al.,
U.S. Patent Nr. 4,929,624; Gerster, U.S.
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Patent Nr. 5,268,376; Gerster et
al., U.S. Patent Nr. 5,389, 640; Nikolaides et al., U.S. Patent
Nr. 5,352,784; Lindstrom et al:, U.S. Patent Nr. 5,494,916; und
International Publication WO 99/29693. Farbstoffe, besonders fluoreszente
Farbstoffe, sind typischerweise relativ große, sperrige Moleküle und es
ist möglich, dass
ein solcher großer
Substituent die Fähigkeit
der Verbindung zur Bindung oder einer anderen Wechselwirkung mit
den betreffenden Zellen, auf eine Weise beeinträchtigen kann, die eine biologische
Reaktion bewirkt.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Wir haben eine Klasse von Farbstoff-markierten
Imidazonaphthyridin-, Imidazopyridin- oder Imidazochinolinverbindungen
gefunden, die ihre Fähigkeit
behalten, Zytokine zu induzieren.
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Diese Verbindungen verwenden eine
Abstandsgruppe, um die Farbstoffeinheit von dem aktiven Kern der
Verbindung zu trennen, sodass der sperrige Farbstoffrest die biologische
Wirkung des Moleküls
nicht beeinträchtigt.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen
haben die allgemeine Formel I
wobei: R
1 eine
Abstandsgruppe ist; R
2 Wasserstoff, Alkyl,
Hydroxyalkyl, Halogenalkyl, Aminoalkyl. Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl,
Amidoalkyl, Alkylamidoalkyl, Dialkylamidoalkyl, Alkanoylalkyl, Azidoalkyl,
Carbamoylalkyl, gegebenenfalls durch ein Heteroatom unterbrochenes
Alkyl; Alkenyl, Alkenyloxyalkyl; Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl;
Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Heteroarylalkyl, wobei Aryl gegebenenfalls
durch A1ky1 mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Halogen, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert ist; Aroylalkyl
oder Heteroaroylalkyl ist; R
3 und R
4 jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino
sind, oder falls zusammengenommen, R
3 und
R
4 einen kondensierten Aryl- oder Heteroarylrest
bilden, der gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten,
ausgewählt
aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy und Alkoxymethyl,
substituiert ist; oder R
3 und R
4 einen
kondensierten 5- bis 7-gliedrigen gesättigten Ring bilden, welcher
gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch
ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Amino, Halogen oder Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
substituiert ist; und DYE eine Farbstoffeinheit ist, mit der Maßgabe, dass
die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz
davon.
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Die Erfindung stellt außerdem Verfahren
zur Herstellung der Farbstoff-markierten Imidazonaphthyridin-, Imidazopyridin
und Imidazochinolinverbindungen bereit.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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1 ist
ein Histogramm der Fluoreszenzintensität von Zellen, die nur mit einem
fluoreszenten Farbstoff inkubiert sind.
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2 ist
ein Histogramm der Fluoreszenzintensität von Zellen, die mit einer
markierten erfindungsgemäßen Verbindung
inkubiert wurden, wobei die Markierung der bei der Inkubation in 1 verwendete Farbstoff ist.
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Ausführliche Beschreibung der bevorzugten
Ausführungsformen
Wie vorstehend erwähnt,
stellt die Erfindung Farbstoff-markierte immunreaktionsmodifizierende
Verbindungen der Formel (I) bereit:
wobei: R
1 eine
Abstandsgruppe ist; R
2 Wasserstoff, Alkyl,
Hydroxyalkyl, Halogenalkyl, Aminoalkyl. Alkylaminoalkyl, Dialkylaminoalkyl,
Amidoalkyl, Alkylamidoalkyl, Dialkylamidoalkyl, Alkanoylalkyl, Azidoalkyl,
Carbamoylalkyl, gegebenenfalls durch ein Heteroatom unterbrochenes
Alkyl; Alkenyl, Alkenyloxyalkyl; Cycloalkylalkyl, Heterocycloalkyl;
Aryl, Aralkyl, Aralkenyl, Heteroarylalkyl, wobei Aryl gegebenenfalls
durch Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Halogen, Amino, Alkylamino oder Dialkylamino substituiert ist; Aroylalkyl
oder Heteroaroylalkyl ist; R
3 und R
4 jeweils unabhängig Wasserstoff, Alkyl, Alkoxy
mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino
sind, oder falls zusammengenommen, R
3 und
R
4 einen kondensierten Aryl- oder Heteroarylrest
bilden, der gegebenenfalls durch ein oder mehrere Substituenten,
ausgewählt
aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Halogen, Amino, Alkylamino, Dialkylamino, Hydroxy und Alkoxymethyl,
substituiert ist; oder R
3 und R
4 einen
kondensierten 5- bis 7-gliedrigen gesättigten Ring bilden, welcher
gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält und gegebenenfalls durch
ein oder mehrere Substituenten, ausgewählt aus Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,
Amino, Halogen und Halogenalkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, substituiert
ist; und DYE eine Farbstoffeinheit ist, mit der Maßgabe, dass
die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist; oder ein pharmazeutisch verträgliches Additionssalz
davon.
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In dieser Beschreibung haben die
nachstehenden Ausdrücke
die Bedeutungen, die ihnen nachstehend gegeben werden, wenn es nicht
anders bezeichnet wird: Alkyl- und Alkenylreste enthalten 1 bis
8 (oder 2 bis 8) Kohlenstoffatome und sie können geradkettig oder verzweigt
sein. Cycloalkykeste können
3 bis 8 Ringglieder enthalten und sie können gegebenenfalls durch Alkylreste
substituiert sein. Heterocyclische Reste können 3 bis 8 Ringglieder und
1 bis 3 Heteroatome enthalten, die unabhängig aus O, S und N ausgewählt sind.
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Arylreste sind carbocyclische aromatische
Ringe oder Ringsysteme. Heteroarylreste sind aromatische Ringe oder
Ringsysteme, die 1 bis 6 Heteroatome enthalten, die unabhängig aus
O, S und N ausgewählt
sind. Ein bevorzugter Arylrest ist Benzol. Bevorzugte Heteroarylreste
sind Einzelringe, die 5 oder 6 Glieder und 1 bis 4 Heteroatome,
die unabhängig
aus O, S und N ausgewählt
sind, aufweisen.
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Heteroatome sind O, S oder N.
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Der Ausdruck "oyl" wird
verwendet, um das Vorhandensein einer Carbonylgruppe in dem Rest
anzuzeigen. Zum Beispiel wird "aroyl" verwendet, um auf
einen aromatischen Rest hinzuweisen, der durch eine Carbonylgruppe
an den Rest der Struktur gebunden ist.
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Die Abstandsgruppe ist ein organischer
bindender Rest, der einer Farbstoffeinheit ermöglicht, an eine Imidazonaphthyridin-,
Imidazopyridin- oder Imidazochinolinverbindung gebunden zu werden,
ohne ihre biologische Wirkung im wesentlichen zu vermindern. Obwohl
die Erfindung nicht durch eine Wirkungstheorie gebunden ist, wird
angenommen, dass die Abstandsgruppe eine genügende Distanz zwischen dem
aktiven Kern des Moleküls
und der sperrigen Farbstoffeinheit schafft, sodass die Farbstoffeinheit
nicht auf die Wechselwirkungen zwischen dem aktiven Kern und den
Zellen, die die Zytokininduktion bewirken, störend einwirkt. Die Abstandsgruppe
kann deshalb jeder zweiwertige organische bindende Rest sein, der
nicht selbst die biologische Wirkung des Moleküls beeinträchtigt und der einer Farbstoffeinheit
ermöglicht,
ohne wesentliche Verminderung der biologischen Wirkung der Verbindung
in das Molekül
eingeschlossen zu werden. In diesem Zusammenhang wurde die biologische
Wirkung einer Verbindung nicht wesentlich verschlechtert, wenn die
markierte Verbindung die Interferon- oder die Tumor-Nekrose-Faktor-
Biosynthese induziert, wenn sie bei einer Konzentration von geringer
oder gleich von etwa 50 μg/ml
gemäß dem nachstehend
bereitgestellten Testverfahren 1 geprüft wurde.
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Eine bevorzugte Abstandsgruppe hat
die Strukturformel (II):
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Wenn die Abstandsgruppe die Formel
(II) hat, ist die Methylengruppe, die außerhalb der Klammern ist, vorzugsweise
an die Farbstoffeinheit gebunden.
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Eine andere bevorzugte Abstandsgrppe
hat die Strukturformel (II):
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Die Farbstoffeinheit kann aus jedem
bekannten Farbstoff, besonders fluoreszenten Farbstoffen, stammen,
mit der Maßgabe,
dass die Farbstoffeinheit nicht Dansyl ist. Beispiele für geeignete
Typen von Farbstoffen schließen
Dipyrromethenbordifluoridfarbstoffe, Fluorescein, Fluoresceinderivate,
Rhodamin, Rhodaminderivate und Texasrot ein. Viele Dipyrromethenbordifluorid
(4,4-difluoro-4)-borg-3a,4a-diaza-s-indacen)-Farbstoffe sind bekannt,
vgl. zum Beispiel, Haugland et al., U.S. Patent Nr. 4,774,339; Kang
et al., U.S. Patent Nr. 5,187,288; Haugland et al., U.S. Patent
Nr. 5,248,782; und Kang et al., U.S. Patent Nr. 5,274,113. Viele
Dipyrromethenbordifluorid-Farbstoffe sind von Molecular Probes,
Inc., Eugene, Oregon unter der Marke BODIPY
®-Fluorophore
im Handel erhältlich.
Bevorzugte Farbstoffeinheiten schließen Fluoroscein und 4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-sindacen
ein, das die nachstehende Struktur aufweist:
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Bevorzugte Verbindungen der Formel
(I) schließen N-[2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]-6-[(4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino]hexanoamid,
das die nachstehende Struktur hat:
5-{ [( {4-[4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1
H-imidazo[4,5-c]-chinolin-1-yl]butyl } amino)carbonthioyl]amino}-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure, die
die nachstehende Struktur hat:
und 5-{[({2-[4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]-chinolin-yl]ethyl}amino)carbonthioyl]amino}-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure ein,
die die nachstehende Struktur hat:
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Erfindungsgemäße Verbindungen können nach
dem Verfahren hergestellt werden, das in dem nachstehenden Reaktionsschema
I gezeigt ist. Ein Imidazonaphthyridin, Imidazopyridin oder Imidazochinolin
der Formel IV wird mit einem Farbstoffderivat der Formel V umgesetzt,
wobei eine Verbindung der Formel I bereitgestellt wird. Sowohl RA als auch RB enthalten funktionelle
Gruppen, die ausgewählt
sind, um miteinander zu reagieren. Wenn, zum Beispiel, RA ein primäres Amin enthält, dann
wird ein Farbstoffderivat, in welchem RB ein
Acylazid, Aldehyd, Anhydrid, Carbonylhalogenid, Halogenid, Halogenacetamid,
Imidoester, Isocyanat, Isothiocyanat, Maleinimid, Succinimidylester
oder Sulfonylchlorid ist, ausgewählt.
RA und RB werden
so ausgewählt,
dass sie sich umsetzen, wobei die gewünschte Abstandsgruppe R1 bereitgestellt wird (z. B. wenn RA -CH2CH2NH2 und RB -(CH2)2C(O)NH(CH2)5COOH ist, dann
wird R1 -CH2CH2NHC(O)(CH2)5NHC(O)(CH2)2- sein). Verfahren zur Herstellung von Verbindungen
der Formel IV, in welchen RA eine funktionelle
Gruppe enthält,
sind bekannt. Vgl., zum Beispiel, Gerster, U.S. Patent Nr. 4,689,338;
Gerster et al., U.S. Patent Nr. 4,929,624; Gerster, U.S. Patent
Nr. 5,268,376; Gerster et al., U.S. Patent Nr. 5,389,640; Nikolaides
et al., U.S. Patent Nr. 5,352,784; Lindstrom et al., U.S. Patent
Nr. 5,494,916; Andre et al., U.S. Patent Nr. 4,988,815; Gerster,
U.S. Patent Nr. 5,367,076; Gerster, U.S. Patent Nr. 5,175,296; Nikolaides
et al., U.S. Patent Nr. 5,395,937; Gerster et al., U.S. Patent Nr.
5,741, 908; Lindstrom, U.S. Patent Nr. 5,693,811; Nanba et al.,
U.S. Patent Nr. 6,069,149, deren Offenbarungen als Bezugnahme hierin
aufgenommen sind. Vgl. auch die internationale Veröffentlichung
WO 99/29693. Viele Farbstoffderivate, die eine reaktive funktionelle
Gruppe enthalten, sind im Handel erhältlich (z. B. BODIPY®-Fluorophore,
Fluoresceinisothiocyanat, 5-Carboxyfluorescein) oder können nach
bekannten synthetischen Wegen hergestellt werden. Vgl., zum Beispiel,
Haugland et al., U.S. Patent Nr. 4,774,339; Kang et al., U.S. Patent
Nr. 5,187,288; Haugland et al., U.S. Patent Nr. 5,248,782; und Kang
et al., U.S. Patent Nr. 5,274,113, deren Offenbarungen als Bezugnahme
hierin aufgenommen sind. Die Umsetzung wird im allgemeinen durch
Vereinigen einer Lösung
der Verbindung der Formel IV in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie Pyridin oder Dimethylsulfoxid, mit einer Lösung des Farbstofferivats der
Formel V in einem geeigneten Lösungsmittel,
wie Pyridin oder Dimethylsulfoxid, durchgeführt. Die Umsetzung kann bei
Umgebungstemperatur oder einer erhöhten Temperatur durchgeführt werden.
Das Produkt der Formel I wird dann unter Verwendung üblicher
Verfahren isoliert und gereinigt.
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Reaktionsschema
I
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Die nachstehenden Beispiele werden
bereitgestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen, aber sie sollen
die Erfindung in keiner Weise einschränken.
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Zytokininduktion in menschlichen
Zellen – Testverfahren
1 Ein in vitro menschliches Blutzellensystem wurde verwendet, um
die Zytokininduktion durch erfindungsgemäße Verbindungen zu beurteilen.
Die Aktivität wird
auf die Messung von Interferon und des Tumor-Nekrose-Faktors (α) (IFN beziehungsweise
TNF) gestützt, die
in das Kulturmedium abgeschieden werden, wie von Testerman et al.
in "Cytokine Induction
by the Immunomodulators Imiquimod and S27609", Journal of Leukocyte Biology, 58,
365-372 (September 1995) beschrieben.
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Herstellung der Blutzellen für die Kultur
Reines Blut von gesunden menschlichen Spendern wird durch Venenpunktion
in EDTA-Vakuumröhren gesammelt.
Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) werden durch Histopaque®-1077
(Sigma Chemicals, St. Louis, MO)-Dichtegradientzentrifugieren von
dem reinen Blut getrennt. Die PBMC werden zweimal mit Hank's Balanced Salts
Solution (Sigma) gewaschen und dann bei 2 × 106 Zellen/ml
in RPMI-Medium 1640 suspendiert, das 10 % fetales Rinderserum, 2
mM L-Glutamin und 1 %-ige Penicillin/Streptomycin-Lösung (komplettes
RPMI) enthält.
Zu 12 oder 24 Behälterplättchen mit
flachem Boden mit einer sterilen Gewebekultur werden 1 ml Portionen
der PBMC-Suspension zugegeben.
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Aufbereitung der Verbindung Die Verbindungen
werden in Ethanol, Dimethylsulfoxid oder pyrogenfreiem Wasser solubilisiert,
dann mit Gewebekulturwasser, 0,01 N Natriumhydroxid oder 0,01 N
Salzsäure verdünnt (die
Wahl des Lösungsmittels
hängt von
den chemischen Eigenschaften der geprüften Verbindung ab). Die Ethanol-
oder DMSO-Konzentration sollte eine Endkonzentration von 1 % zur
Zugabe zu den Kulturbehältern
nicht überschreiten.
Die Verbindungen werden im allgemeinen unter Verwendung eines Konzentrationsbereiches
von etwa 0,01 μg/ml
bis etwa 50 μg/ml
geprüft.
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Inkubation
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Die Lösung der Testverbindung wird
zu den Behältern,
die 1 ml PBMC im Medium enthalten, zugegeben. Die Plättchen werden
mit Kunststoffdeckeln bedeckt, vorsichtig gemischt und dann 24 Stunden
bei 37°C in
einer 5%igen Kohlendioxidatmosphäre
inkubiert.
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Trennung
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Nach der Inkubation wird die überstehende
zellfreie Kultur mit einer sterilen Polypropylenpipette entfernt
und in ein 12 × 75
mm Polypropylenrohr übertragen.
Die Röhrchen
werden dann bei 1000 rpm (⁓ 800 xg) bei 4°C 10 bis
15 Minuten zentrifugiert. Die überstehende
Flüssigkeit
wird entfernt und in sterile 2 ml Gefrierfläschchen gebracht. Die Proben
werden bis zur Analyse der Zytokine bei –70°C gehalten.
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Interferonanalyse / Berechnung
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Die Interferonkonzentrationen werden
durch Bioassay unter Verwendung von A549 menschlichen Lungenkarzinomzellen
bestimmt, die mit Enzephalomyocarditis angeregt wurden. Die Einzelheiten
des Bioassay-Verfahrens wurden von G.L Brennan und L.H. Kronenberg
in "Automated Bioassay
of Interferons in Micro-test Plates", Biotechniques, Juni/Juli, 78, 1983
beschrieben, das hier als Bezugnahme aufgenommen ist. Kurz erklärt, wird
das Verfahren wie folgt durchgeführt:
A549-Zellen werden mit Verdünnungen
von IFN-Standard
oder Testproben bei 37°C
24 Stunden inkubiert. Die inkubierten Zellen werden dann mit einem
Inokulum von Enzephalomyocarditis-Virus infiziert. Die infizierten
Zellen werden weitere 24 Stunden bei 37°C inkubiert, bevor sie auf die
virale zytopathische Wirkung quantitativ bestimmt werden. Die virale
zytopathische Wirkung wird durch Färbung der Gefäße mit einem
aktivierenden Farbstoff, wie Kristallviolett, und anschließend durch visuelle
Bewertung der Plättchen
quantifiziert. Die Ergebnisse werden in Alfa-Bezugnahmeeinheiten / ml ausgedrückt, bezogen
auf den Wert, der für
einen NIH menschlichen Leukozyten IFN-Standard erhalten wird.
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Tumor-Nekrose-Faktor (a)-Analyse
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Die Tumor-Nekrose-Faktor (a) (TNF)-Konzentration
wird unter Verwendung eines ELISA-Geräts,
erhältlich
von Genzyme, Cambridge, MA, bestimmt. Die Ergebnisse werden in pg/ml
ausgedrückt.
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Zytokininduktion in menschlichen
Zellen – Testverfahren 2 Um die
Zytokininduktion zu beurteilen, wird ein in vitro menschliches Blutzellensystem
verwendet. Die Aktivität
wird auf die Messung von Interferon und des Tumor-Nekrose-Faktors (α) (IFN beziehungsweise
TNF) gestützt,
die in das Kulturmedium abgeschieden werden, wie von Testerman et
al. in "Cytokine
Induction by the Immunomodulators Imiquimod und 5-27609", Journal of Leukocyte
Biologx, 58, 365-372 (September 1995) beschrieben.
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Herstellung der Blutzellen für die Kultur
Reines Blut von gesunden menschlichen Spendern wird durch Venenpunktion
in EDTA-Vakuumröhrchen gesammelt.
Einkernige periphere Blutzellen (PBMC) werden unter Verwendung von
Histopaque®-1077
durch Dichtegradientzentriguieren getrennt. Die PBMC werden zweimal mit
Hank's Balanced
Salts Solution gewaschen und dann bei 3-4 × 106 Zellen/ml
in komplettem RPMI suspendiert. Die PBMC-Suspension wird zu 48 Gefäßplatten
mit flachem Boden mit steriler Gewebekultur zugegeben (Costar, Cambridge,
MA oder Becton Dickinson Labware, Lincoln Park, NJ), die ein gleiches
Volumen von komplettem, RPMI-Medium enthalten, das die Testverbindung
enthält.
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Aufbereitung der Verbindung
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Die Verbindungen werden in Dimethylsulfoxid
(DMSO) solubilisiert. Die DMSO-Konzentration
sollte eine Endkonzentration von 1 % zur Zugabe zu den Kulturgefäßen nicht überschreiten.
Die Verbindungen werden im allgemeinen bei Konzentrationen im Bereich
von 0,12 bis 30 μM
geprüft.
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Inkubation Die Lösung der Testverbindung wird
mit 60 μM
zu dem ersten Gefäß zugegeben,
das komplettes RPMI enthält,
und es werden Reihen mit 3-fachen Verdünnungen in den Gefäßen durchgeführt. Die PBMC-Suspension
wird dann zu den Gefäßen in einem
gleichen Volumen zugegeben, wobei die Konzentrationen der Testverbindung
in den gewünschten
Bereich (0,12 bis 30 μM)
gebracht werden. Die Endkonzentration der PBMC-Suspension ist 1,5-2
x 106 Zellen/ml. Die Plättchen werden mit sterilen
Kunststoffdeckeln bedeckt, vorsichtig gemischt und dann bei 37°C 18 bis
24 Stunden in einer 5%-igen Kohlendioxidatmosphäre inkubiert.
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Trennung
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Nach der Inkubation werden die Plättchen 5-10
Minuten bei 1000 rpm (200 xg) bei 4°C zentrifugiert. Die überstehende
zellfreie Kultur wird mit einer sterilen Polypropylenpipette entfernt
und in sterile Polypropylenröhrchen übertragen.
Die Proben werden bis zur Analyse bei –30 bis –70°C gehalten. Die Proben werden durch
ELISA auf Interferon (α)
und den Tumor-Nekrose-Faktor (α)
analysiert.
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Interferon (α)- und
Tumor-Nekrose-Faktor (α)-Analyse
durch ELISA Die Interferon (α)-Konzentration wird
durch ELISA unter Verwendung eines Human Multi-Species-Geräts von PBL Biomedical Laboratories, New
Brunswick, NJ bestimmt. Die Ergebnisse sind in pg/ml ausgedrückt.
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Die Tumor-Nekrose-Faktor(α)(TNF)-Konzentration
wird unter Verwendung von ELISA-Geräten, erhältlich von
Genzyme, Cambridge, MA; R&D-Systems,
Minneapolis, MN, oder Pharmingen, San Diego, CA bestimmt. Die Ergebnisse
werden in pg/ml ausgedrückt.
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Herstellung einer nicht markierten
Verbindung der Formel IV 2=(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid
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Teil A
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Zu einer Suspension von 4-Hydroxy-3-nitrochinolin
(75 g, 0,3944 Mol) in Dichlormethan (750 ml) wurden nacheinander
Thionylchlorid (32,3 ml, 0,4338 Mol) und N,N-Dimethylformamid (32 ml, 0,4338 Mol)
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde etwa 2,5 Stunden unter Rückfluss
erwärmt
und dann über
Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde
in einem Eisbad abgekühlt
und dann wurde langsam ein Gemisch von Triethylamin (82,5 ml, 0,5916
Mol) und Ethanolamin (35,7 ml, 0,5916 Mol) in Dichlormethan zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde einige Stunden unter Rückfluss
erwärmt
und dann wurden weitere 0,5 Äquivalente
von sowohl Triethylamin als auch Ethanolamin zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde eine weitere Stunde unter Rückfluss erwärmt und dann über Nacht
bei Umgebungstemperatur gehalten. Der erhaltene Feststoff wurde
durch Filtrieren isoliert, zuerst mit Dichlormethan, dann mit Wasser
gewaschen und getrocknet, wobei 75 g 2-[(3-Nitro-4-chinolinyl)amino]ethanol
bereitgestellt wurden.
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Teil B
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2-[(3-Nitro-4-chinolinyl)amino]ethanol
(6 g) wurde mit Ethanol (200 ml) und einem Platinauf-Kohle-Katalysator
vereinigt. Das Gemisch wurde auf einem Parr-Apparat hydriert. Das
Verfahren wurde fünf
weitere Male unter Verwendung von insgesamt 30 g Ausgangsmaterial
wiederholt. Die Gemische aller fünf
Hydrierungen wurden vereinigt und dann durch eine Schicht von Celite®-Filterhilfe
filtriert, um den Katalysator zu entfernen. Das Filtrat wurde unter
Vakuum konzentriert, wobei rohes 2-[(3-Amino-4-chinolinyl)amino]ethanol
bereitgestellt wurde.
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Teil C
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Das rohe Material des Teils B wurde
mit Ethoxyessigsäure
(13,4 g) vereinigt. Das Gemisch wurde unter Verwendung eines Ölbads erwärmt, bis
die Umsetzung beendet war. Das Gemisch wurde auf Umgebungstemperatur
gekühlt,
dann mit Wasser verdünnt
und mit Natriumhydroxid (6N) basisch gemacht. Das Gemisch wurde
dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt,
mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet und dann filtriert.
Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei 30,8 g rohes 2-Ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol
bereitgestellt wurden.
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Teil D
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Zu einem Gemisch des Materials von
Teil C und Methylacetat (350 ml) wurde Peressigsäure (25 ml, eines 32%-igen
Materials) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde auf 54°C erwärmt, bis
Dünnschichtchromatographie
zeigte, dass das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war. Das Reaktionsgemisch
wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt. Durch Filtrieren wurde
ein Feststoff isoliert, mit Methylacetat gewaschen und dann getrocknet,
wobei 28,5 g 2-Ethoxymethyl-1-(2-hydroxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-S-N-oxid
(Ausbeute 1) bereitgestellt wurden. Das Filtrat wurde unter Vakuum
konzentriert. Der Rückstand
wurde mit wässrigem
Natriumbicarbonat verdünnt
und dann dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die Extrakte wurden
vereinigt, einmal mit wässrigem
Natriumbicarbonat gewaschen, zweimal mit Wasser gewaschen, mit Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und dann unter Vakuum konzentriert, wobei
1,6 g weiteres Produkt (Ausbeute 2) bereitgestellt wurden.
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Teil E
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Die Ausbeuten 1 und 2 von Teil D
wurden vereinigt und mit Dichlormethan (600 ml) gemischt. Es wurde konzentriertes
Ammoniumhydroxid (450 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde
in einem Eisbad gekühlt
und dann wurde zu dem Gemisch langsam p-Toluolsulfonylchlorid (22
g) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur
gerührt.
Die Dünnschichtchromatographie
zeigte das Vorhandensein einer Spur des Ausgangsmaterials an, deshalb
wurde 1 g p-Toluolsulfonylchlorid zugegeben und das Reaktionsgemisch
1 Stunde weiter gerührt.
Durch Filtrieren wurde ein Feststoff isoliert, mit Dichlormethan gewaschen
und dann getrocknet, wobei 20,2 g rohes 4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol
bereitgestellt wurden. Eine 1 g-Portion dieses Materials wurde in
Aceton (etwa 10 ml) gelöst. Chlorwasserstoff/Methanol
(1 g/5 ml) wurden zugegeben bis die Lösung sauer reagierte. Es bildete
sich sofort ein Niederschlag. Das Gemisch wurde 10 Minuten auf einem
Dampfbad erwärmt.
Der Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, mit Aceton gewaschen
und dann aus Methanol/Aceton umkristallisiert, wobei 0,7 g 4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanolhydrochlorid
als schwach weißer
Feststoff bereitgestellt wurden. Analyse: berechnet für C15H19ClN4O:
% C: 55,81; % H: 5,93; % N: 17,36. Gefunden: % C: 55,91; % H: 5,90;
% N: 17,35.
-
Teil F
-
Thionylchlorid (5 ml) und 4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-ethanol
(1 g) wurden vereinigt und auf einem Dampfbad erwärmt bis
die Dünnschichtchromatographie
(20 % Methanol/Ethylacetat) das Verschwinden des Ausgangsmaterials
zeigte. Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur gekühlt und
dann langsam in ein Gemisch von Eis und Wasser gegossen. Das Gemisch
wurde mit Natriumbicarbonat neutralisiert und dann dreimal mit Dichlormethan
extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, dreimal mit wässrigem
Natriumbicarbonat gewaschen, mit Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert
und dann unter Vakuum konzentriert. Zu dem Rückstand wurde Aceton (etwa
10 ml) und anschließend
methanolischer Chlorwasserstoff (etwa 1 ml) zugegeben. Das Gemisch
wurde unter Rückfluss
erwärmt
und es bildete sich ein Niederschlag. Das Reaktionsgemisch wurde
auf Umgebungstemperatur gekühlt.
Der Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und dann mit Aceton
gewaschen. Der Feststoff wurde in heißem Methanol gelöst und dann
durch Zugabe von Aceton ausgefällt.
Der Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert, mit Wasser gewaschen
und dann getrocknet, wobei 1-(2-Chlorethyl)-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-aminhydrochlorid bereitgestellt
wurde. Analyse: berechnet für
C15H18ClN4: % C: 52,80; % H: 5,32; % N: 16,42. Gefunden:
% C: 52,67; % H: 5,21; % N: 16,29.
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Teil G
-
Zu einer Lösung von 1-(2-Chlorethyl)-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin
(22 g, hergestellt nach dem Verfahren des Teils F) in N,N-Dimethylformamid
(75 ml) wurde Natriumazid (14,7 g) zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde mehrere Stunden unter Rückfluss
erwärmt
und dann über
Nacht auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen. Das Reaktionsgemisch
wurde in Wasser (100 ml) gegossen und dann dreimal mit Ethylacetat
extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt, dreimal mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat
getrocknet, filtriert und dann unter Vakuum zur Trockene konzentriert,
wobei rohes 1-(2-Azidoethyl)-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-4-amin
als Öl
bereitgestellt wurde.
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Teil H
-
Zu einer Lösung des rohen Materials aus
Teil G in Ethanol (250 ml) wurde ein Platin-auf-Kohle-Katalysator zugegeben. Das Gemisch
wurde auf einem Parr-Apparat reduziert. Die Flasche wurde mehrere
Male evakuiert, um Stickstoff zu entfernen, und der Fortschritt
der Umsetzung wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht.
Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Schicht von Celite®-Filterhilfe
filtriert, wobei der Katalysator entfernt wurde, und das Filterkissen
wurde mit warmem Ethanol gewaschen. Das Filtrat wurde unter Vakuum
konzentriert, wobei ein Öl
bereitgestellt wurde, das durch Säulenchromatographie (Silikagel,
mit Methanol/Ethylacetat eluiert) gereinigt wurde. Ein Versuch,
das gereinigte Öl
auszukristallisieren, ergab einen Niederschlag, der durch Filtrieren
isoliert wurde. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei
ein Öl
bereitgestellt wurde. Das Öl
wurde in Ethanol gelöst.
Ein Teil wurde zur späteren
Verwendung entfernt. Der Rest wurde mit 10%-igem Chlorwasserstoff
in Ethanol vereinigt und unter Rückfluss
erwärmt.
Das Gemisch wurde in einem Eisbad gekühlt und dann filtriert, wobei
der erhaltene Feststoff isoliert wurde. Der Feststoff wurde aus Ethanol
umkristallisiert, wobei 2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1Himidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid
bereitgestellt wurde. Analyse: berechnet für C15H22Cl3N5O:
% C: 45,64; % H: 5,62; % N: 17,74. Gefunden: % C: 46,14; % H: 5,64;
% N: 17,83.
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Beispiel 1 – Herstellung
einer markierten Verbindung der Formel I
-
N-[2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]-6-[(4,4-difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino]hexanoamid
Eine Lösung,
enthaltend 6-((4,4-Difluor-5,7-dimethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen-3-propionyl)amino)hexansäure, Succinimidylester
(5 mg, BODIPY®FL-X.SE
von Molekular Probes) gelöst
in Dimethylsulfoxid (1 ml), wurde mit 2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid
(2,5 mg) vereinigt. Pyridin (5 Tropfen) wurde zugegeben und das
Reaktionsgemisch bei Umgebungstemperatur über Nacht geschüttelt. Das
Reaktionsgemisch wurde durch Hochleistungsflüssigchromatographie unter Verwendung
einer Bondapak C18 12,5 nm Umkehrphasensäule (erhältlich von Waters, Milford,
MA) gereinigt, wobei mit einem Verbundgradienten von Acetonitril
in Wasser eluiert wurde. Bei einer typischen Eluierung wurde der
Acetonitrilgehalt während
der ersten 15 Minuten von 5 % auf 30 % erhöht, anschließend 10
Minuten isokratisch bei 30 % Acetronitril eluiert, ein 5 Minuten
Gradient auf 50 % Acetonitril, dann eine 5 Minuten lange isokratische
Elution bei 50 % Acetonitril durchgeführt. Alle Lösungsmittel enthielten 0,1
% Trifluoressigsäure.
Die Fraktionen, die die markierte Verbindung enthielten, wurden
zuerst durch einen Vergleich der Chromatogramme des freien Fluorophors
und der nicht markierten Verbindung mit der des Reaktionsgemisches
identifiziert. Die Fraktionen, die die markierte Verbindung enthielten,
wurden dann gesammelt, vereinigt und gefriergetrocknet. Die markierte
Verbindung hatte ein durch Elektrospraymassenspektroskopie bestimmtes
Molekulargewicht von 672,08. Das berechnete Gewicht ist 672,35,
bezogen auf die vorgeschlagene empirische Formel C35H45N8BF2.
Das UV-sichtbare Absorptionsspektrum zeigte Absorptionsbanden bei
505 nm und 325 nm, die für
die Fluoreszenzmarkierung beziehungsweise für die nicht markierte Verbindung
charakteristisch sind.
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Die markierte Verbindung des Beispiels
1 und das nicht markierte Zwischenprodukt (2-(4-Amino-2-ethoxymethyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamintrihydrochlorid)
wurden Seite an Seite auf ihre Fähigkeit
geprüft,
die Zytokinbiosynthese zu induzieren, wobei das vorstehend verwendete
Testverfahren I verwendet wurde. Die Verbindung des Beispiels 1
wurde in Ethanol solubilisiert. Das nicht markierte Zwischenprodukt
wurde in Gewebekulturwasser solubilisiert. Die Ergebnisse sind in
der nachstehenden Tabelle gezeigt.
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-
Fließzytometrieanalyse
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Reines Blut wurde durch Venenpunktion
von gesunden menschlichen Spendern in EDTA-Vakuumröhrchen gesammelt. PBMC wurden
von dem reinen Blut durch Ficoll-Hypaque (Sigma Chemicals, St. Louis, Mo)
Dichtegradientzentrifugieren, wie von Testerman beschrieben, abgetrennt.
Die PBMC wurden bei 2 × 106 Zellen/ml in RPMI 1640 Medium suspendiert,
das 10 % fetales Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Penicillin/Streptomycin-Lösung (komplettes RPMI) enthielt.
Die Zellen wurden dann in 12 × 75
mm Polypropylenröhrchen
1 Stunde bei 37°C
mit entweder der markierten Verbindung des Beispiels 1 oder dem
BODIPY-Fluorophor, der zur Herstellung der markierten Verbindung
verwendet wurde, inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen
zweimal mit färbendem
Puffer (Dulbecco's
Phosphate Buffered Saline ohne Calcium und Magnesium, 1 % wärmeinaktiviertem
fetalen Rinderserum und 0,1 % Natriumazid) gewaschen. Die Zellen
wurden in färbendem
Puffer suspendiert und in 12 x 75 mm Polystyrolröhrchen zur Analyse durch Fließzytometrie übertragen.
Die Bindung an einkernige Zellen wurde durch Fluoreszenz unter Verwendung
eines FACScan Fließzytometers
(von Becton Dickinson gekauft) bestimmt.
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Die Histogramme der 1 und 2 stellen
die Fluoreszenzintensität
dar, wobei die stärker
fluoreszierenden Zellpopulationen weiter rechts zu sehen sind. Der
Peakbereich, der in den Histogrammen als M3 markiert ist, zeigt
die Fluoreszenzbindung zu der Monozytenpopulation in den peripheren,
einkernigen Blutzellen. Diese Monozyten haben sich als Hauptzellen
erwiesen, die Zytokine als Reaktion zu den Imidazochinolinen produzieren
(Gibson et al. in "Cellular
Requirements for Cytokine Production in Response to the Immunomodulators
Imiquimod and S-27609",
Journal of Interferon and Cytokine Research, 15, 537-545 (1995)).
Das Histogramm der 1 wurde
von Zellen erhalten, die mit dem BODIPY-Fluorophor inkubiert waren.
Das Histogramm der 2 wurde
von Zellen erhalten, die mit der durch BODIPY markierten Verbindung
des Beispiels 1 inkubiert waren. Diese Histogramme zeigen, dass
die markierte Verbindung des Beispiels 1 sich an einkernige periphere
menschliche Blutzellen bindet, während
das BODIPY-Fluorophor selbst sich nicht daran bindet und dass Monozyten
wirksamer binden als andere PBMC.
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Die markierte Verbindung des Beispiels
1 zeigte keine bedeutende Bindung an Monozyten, wenn sie 1 Stunde
bei 4°C
mit menschlichen PBMC inkubiert war. Es wurde ein dem in 1 ähnliches Histogramm erhalten,
was zeigt, dass die Bindung wahrscheinlich intrazellulär ist.
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Herstellung einer nicht markierten
Verbindung der Formel IV 4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butanamin
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Teil A
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Zu einer Lösung von 3-Nitrochinolin-4-ol
(50 g, 0,26 Mol) in N,N-Dimethylformamid (150 ml) wurde langsam
innerhalb 1 Stunde Phosphoroxychlorid (30 ml, 0,32 Mol) zugegeben.
Das Reaktionsgemisch wurde eine halbe Stunde auf einem Dampfbad
erwärmt
und dann über
ein Gemisch von Eis und Wasser gegossen. Der erhaltene Feststoff
wurde durch Filtrieren isoliert und dann in Chloroform (750 ml)
suspendiert. Die Suspension wurde auf einem Dampfbad erwärmt und
dann filtriert, während
sie noch warm war. Das Filtrat wurde in einen Scheidetrichter gegossen
und die Chloroformschicht von dem Wasser getrennt. Zu der Chloroformschicht
wurde Triethylamin (29 ml) und anschließend langsam tert-Butyl-N-(4-aminobutyl)carbamat
zugegeben. Die Umsetzung wurde durch Dünnschichtchromatographie überwacht.
Als das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war, wurde das Reaktionsgemisch
mit Wasser gewaschen, über
Magneisumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei
66 g 1,1-Dimethylethyl N-{4-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]butyl}carbamat als gelber Feststoff
bereitgestellt wurden.
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Teil B
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Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl
N-{4-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]butyl}carbamat (36,1 g, 100 mMol)
in Toluol (1,5 1) wurde Platin-auf-Kohle (3,6 g 5%-iges Material)
zugegeben. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 50 psi (3,5 kg/cm2) hydriert.
Das Reaktionsgemisch wurde durch eine Schicht von Celite®-Filterhilfe
filtriert, wobei der Katalysator entfernt wurde. Das Filtrat wurde
unter Vakuum konzentriert, wobei 30,1 g rohes 1,1-Dimethylethyl
N-{4-[(3-Aminochinolin-4-yl)amino]butyl}carbamat als klebriger organefarbener
Sirup bereitgestellt wurden.
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Teil C Unter einer Stickstoffatmosphäre wurde
eine Lösung
des Materials aus Teil B in Dichlormethan (1l) auf 0°C gekühlt. Triethylamin
(13 ml, 93,3 mMol) wurde zugegeben. Innerhalb von 10 Minuten wurde
Methoxypropionylchlorid (11,5 g, 91,2 mMol) zugegeben. Das Eisbad
wurde entfernt. Nach 1 Stunde wurde das Reaktionsgemisch konzentriert,
wobei ein blassorangefarbener Feststoff bereitgestellt wurde. Das
Material wurde mit Ethanol (1l) und Triethylamin (39 ml) vereinigt.
Das Gemisch wurde über
Nacht bei etwa 75°C
erwärmt.
Das Reaktionsgemisch wurde auf Umgebungstemperatur abkühlen gelassen
und dann unter Vakuum konzentriert, wobei ein Öl bereitgestellt wurde. Das Öl wurde
mit Diethylether (750 ml) vereinigt, etwa 15 Minuten gerührt und
dann filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei
34,5 g rohes 1,1-Dimethylethyl N-[4-(2-(2-Methoxyethyl)-1Himidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butyl]carbamat
als brauner Sirup bereitgestellt wurden.
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Teil D
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Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl
N-[4-(2-(2-Methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butyl]carbamat (21,3
g, 53,5 mMol) in Dichlormethan (200 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre 3-Chlorperbenzoesäure (12,86
g, eines >77%-igen
Materials) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei
Umgebungstemperatur gerührt.
Weitere 3-Chlorperbenzoesäure
(200 mg, eines >77%-igen
Materials) wurde zugegeben. Nach etwa 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch
mit Wasser, wässrigem
Natriumbicarbonat, Wasser und zuletzt mit Salzlösung gewaschen. Die organische
Schicht wurde über
Natriumsulfat getrocknet und dann unter Stickstoff konzentriert,
wobei 22 g rohes 1-{4-[(1,1-Dimethylethylcarbonyl)amino]butyl }-2-(2-methoxyethyl)-1
H-imidazo[4,5-c]chinolin-5N-oxid als klebriger Sirup bereitgestellt
wurden.
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Teil E
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Zu einer Lösung des Materials aus Teil
D in Dichlormethan (200 ml) wurde konzentriertes Ammoniumhydroxid
(⁓ 50 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter einer
Stickstoffatmosphäre
auf 0°C
gekühlt.
Während
10 Minuten wurde unter kräftigem
Rühren
Tosylchlorid (10,2 g, 53,5 mMol) zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt
und das Reaktionsgemisch bei Umgebungstemperatur gerührt. Die
Schichten wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit 1 %-igem
Natriumcarbonat (3X), Wasser und Salzlösung gewaschen, über Natriumsulfat
getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei 20,0 g rohes
1,1-Dimethylethyl N-[4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-lyl)butyl]caxbamat
als senfgelber Feststoff bereitgestellt wurden.
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Teil F
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Ein Gemisch von 1,1-Dimethylethyl
N-[4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butyl]carbamat (18,0
g) und Chlorwasserstoff/Ethanol (40 ml von 2M) wurde auf etwa 70°C erwärmt. Nach
90 Minuten wurden weitere 40 ml Chlorwasserstoff/Ethanol zugegeben.
Nach etwa einer weiteren Stunde wurde das Reaktionsgemisch abkühlen gelassen,
wobei es mit Stickstoff gespült
wurde, um überschüssigen Chlorwasserstoff
zu entfernen. Das Reaktionsgemisch wurde fast zur Trockene . konzentriert.
Der Rückstand
wurde mit Diethylether verrieben. Der erhaltene Feststoff wurde
durch Filtrieren isoliert und dann unter Hochvakuum getrocknet,
wobei 15,8 g des Dihydrochloridsalzes als hellbrauner Feststoff
bereitgestellt wurden.
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Ein Teil des Salzes (10 g) wurde
in Wasser gelöst.
Die Lösung
wurde durch Zugabe von Ammoniumhydroxid auf pH 11 eingestellt und
dann mehrere Male mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden
vereinigt und unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wurde mit Toluol aufgeschlämmt und
dann zur Trockene (3x) konzentriert, wobei 6,6 g 4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butanamin
als braungelber Feststoff bereitgestellt wurden.
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Beispiel 2 – Herstellung
einer markierten Verbindung der Formel I
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5- { [( {4-[4-Amino-2-(2-methoxyethyl)1-H-imidazo
[4,5-c]chinolin-1-yl]butyl } amino)-carbonthioyl]amino}-2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure Eine
Lösung
von 4-(4-Amino-2-(2-methoxyethyl)-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)butanamin
(0,11 g, 0,35 mMol) in warmem Pyridin (2 ml) wurde langsam zu einer
Lösung
von Fluorescein-5-isothiocyanat (0,138 g, 0,35 mMol) in warmem Pyridin
(2 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur
gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit Methanol (15 ml) gequencht
und dann 1 Stunde gerührt.
Der erhaltene Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, mit siedendem
Methanol aufgeschlämmt
und dann getrocknet, wobei 0,12 g des gewünschten Produkts als organgefarbener
Feststoff, Schmp.: >245°C, bereitgestellt
wurde. Die Analyse sowohl durch Dünnschichtchromatographie als
auch durch Hochleistungsflüssigchromatographie
zeigte das reine Produkt. Analyse: berechnet für C38H34N6O6S:
% C: 64,94; % H: 4,88; % N: 11,96. Gefunden: % C: 61,33; % H: 5,09;
% N: 11,39. Hochauflösungsmassenspektroskopie:
TM = 703,2339 Da., MM = 703,2315 Da.
-
Herstellung einer nicht
markierten Verbindung der Formel IV
-
2-(4-Amino-2-buty1-1 H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethanamin
-
Teil A
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Zu einer Lösung von tert-Butyl(N-2-aminoethyl)carbamat
(55,0 g, 0,34 mMol) in wasserfreiem Dichlormethan (500 ml) wurde
Triethylamin (66,8 g, 0,66 mMol) zugegeben. 4-Chlor-3-nitrochinolin (68,2 g, 0,33 mMol)
wurde langsam zugegeben. Das Reaktionsgemisch zeigte eine exotherme
Reaktion. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht gerührt. Der
erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und mit Wasser abgespült, wobei
ein gelber Feststoff bereitgestellt wurde. Das Filtrat wurde mit
Wasser gewaschen, über
Magnesiumsulfat getrocknet und dann konzentriert, wobei ein gelber
Feststoff bereitgestellt wurde. Die beiden Feststoffmengen wurden
vereinigt, mit Hexan aufgeschlämmt,
filtriert und dann getrocknet, wobei 101 g 1,1-Dimethylethyl N-{2-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]ethyl)carbamat
als gelber Feststoff bereitgestellt wurden.
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Teil B
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Zu einer Aufschlämmung von 1,1-Dimethylethyl
N-{2-[(3-Nitrochinolin-4-yl)amino]ethyl}carbamat (100 g, 0,30 Mol)
in Toluol (500 ml) wurden Platin-auf-Kohle (1,0 g eines 10%-igen
Materials) und Natriumsulfat (2 g) zugegeben. Das Reaktionsgefäß wurde über Nacht
bei Umgebungstemperatur auf einen Parr-Apparat unter 50 psi (3,5
kg/cm²)
Wasserstoffdruck gebracht. Das Reaktionsgemisch wurde durch eine
Schicht von Celite = Filterhilfe filtriert, wobei der Katalysator
entfernt wurde. Das Filtrat wurde unter Vakuum konzentriert, wobei
73 g 1,1-Dimethylethyl N-{2-[(3-Aminochinolin-4-yl)amino]ethyl}carbamat als dunkelgoldfarbenes Öl bereitgestellt wurden.
Die Dünnschichtchromatographie
(Silikagel; 10 % Methanol in Dichlormethan)-Analyse zeigte, dass das
Material rein war.
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Teil C Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl
N-{2-[(3-Aminochinolin-4-yl)amino]ethyl}carbamat (10,0 g, 33,1 mMol)
in wasserfreiem Toluol (100 ml) wurde unter Rühren Trimethylorthovalerat
(5,9 g, 36,4 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter Rückfluss
erwärmt.
Eine 10 ml Portion von Toluol wurde unter Verwendung eines Dean
Stark-Abscheiders entfernt und das Reaktionsgemisch 36 Stunden bei
der Temperatur gehalten. Es wurden weitere 40 ml Toluol entfernt
und die Umsetzung wurde dann unter kontinuierlichem Rühren auf
Umgebungstemperatur abkühlen
gelassen. Der erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert
und getrocknet, wobei 6,2 g 1,1-Dimethylethyl N[2-(2-Butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-l-yl)ethyl]carbamat als
gelbbrauner Feststoff bereitgestellt wurden. Die Dünnschichtchromatographie
(Silikagel; 10 % Methanol in Dichlormethan)-Analyse zeigte, dass
das Material rein war.
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Teil D
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Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl
N-[2-(2-Butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-lyl)ethyl]carbamat (6,0 g,
16,3 mMol) in Chloroform (60 ml) wurde langsam unter kräftigem Rühren 3-Chlorperbenzoesäure (5,15
g 60%-iges Material, 17,9 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde über
Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten und dann mit wässrigem
Natriumcarbonat (250 ml eines 1 %-igen Materials) gequencht. Die Schichten
wurden getrennt. Die organische Schicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet
und dann unter Vakuum konzentriert, wobei ⁓ 6,3 g 1-{2-[(1,1-Dimethylethylcarbonyl)amino]ethyl}-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-5-N-oxid
als gelbbrauner Schaum bereitgestellt wurden.
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Teil E
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Eine Lösung von 1-{2-[(1,1-Dimethylethylcarbonyl)amino]ethyl}-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-5-N-oxid
(39 g, 101 mMol) in Chloroform (300 ml) wurde in einem Eisbad gekühlt. Unter
Rühren
wurde Trichloracetylisocyanat (21 g, 112 mMol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch
wurde über
Nacht bei Umgebungstemperatur gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde
mit konzentriertem Ammoniumhydroxid (40 ml) abgeschreckt und dann
4 Stunden bei Umgebungstemperatur gerüht. Zu dem Reaktionsgemisch
wurde Wasser zugegeben. Die Schichten wurden getrennt. Die organische
Schicht wurde über
Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter Vakuum konzentriert, wobei
ein goldfarbenes Öl
bereitgestellt wurde. Das Material wurde aus 90%-igem Isopropanol
auskristallisiert, wobei 30,2 g 1,1-Dimethylethyl N-[2-(4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]carbamat
erhalten wurden.
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Teil F
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Zu einer Lösung von 1,1-Dimethylethyl
N-[2-(4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-1-yl)ethyl]carbamat
(30,0 g, 78,2 mMol) in Acetonitril (100 ml) wurde unter Rühren Trifluoressigsäure (100
ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 24 Stunden bei Umgebungstemperatur
gehalten und dann unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand
wurde in einer ganz kleinen Menge Wasser gelöst und der pH der Lösung unter
Verwendung von 10%-igem Natriumhydroxid auf pH 13 eingestellt. Der
erhaltene Niederschlag wurde durch Filtrieren isoliert und unter
Hochvakuum getrocknet, wobei 18,1 g 2-(4-Amino-2-butyl-1Himidazo[4,5-c]chinolin-l-yl)ethanamin
als schwachweißer
Feststoff, Schmp.: 196-199°C,
bereitgestellt wurden.
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Beispiel 3 – Herstellung
einer markierten Verbindung der Formel I 5-
{ [({2-[4-Amino-2-butyl-1 H-inudazo[4,5-c]chinolin-l-yl]ethyl }
amino)carbonthioyl]amino } -2-(6-hydroxy-3-oxo-3H-xanthen-9-yl)benzoesäure Zu einer
Lösung
von 2-(4-Amino-2-butyl-1H-imidazo[4,5-c]chinolin-l-yl)ethanamin
(566 mg, 2,0 mMol) in Pyridin (5 ml) wurde eine Lösung von
Fluorescein-5-isothiocyanat (778 mg, 2,0 mMol) in Pyridin (5 ml)
zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten unter Rückfluss
erwärmt
und dann in Wasser (50 ml) gegossen. Der erhaltene orangefarbene
Feststoff wurde durch Filtrieren isoliert, unter Hochvakuum getrocknet
und dann aus Pyridin umkristallisiert, wobei 0,76 g des gewünschten
Produkts als orangefarbener Feststoff, Schmp.: >245°C,
bereitgestellt wurden. Die Analyse durch Hochleistungsflüssigchromatographie
zeigte, dass das Produkt rein war. Analyse: berechnet für C37H32N6O5S: % C: 66,06; % H: 4,79; % N: 12,49. Gefunden:
% C: 63,03; % H: 4,89; % N: 12,59. Hochauflösungsmassenspektroskopie: TM
= 673,2233 Da., MM = 673,2251 Da.
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Die markierten Verbindungen der Beispiele
2 und 3 wurden auf ihre Fähigkeit
geprüft,
die Zytokinbiosynthese zu induzieren, wobei das vorstehend beschriebene
Testverfahren 2 verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle gezeigt, wobei ein "+" zeigt, dass die
Verbindung das bezeichnete Zytokin bei der bestimmten Konzentration
induzierte und ein "-" zeigt, dass die
Verbindung das bezeichnete Zytokin bei der bestimmten Konzentration
nicht induzierte.
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