DE2412137A1

DE2412137A1 - Praeparat zur verwendung bei blutuntersuchungsverfahren

Info

Publication number: DE2412137A1
Application number: DE2412137A
Authority: DE
Inventors: Vito Michael Esposito; Stanley Bruce Weinstein
Original assignee: American Hospital Supply Corp
Current assignee: American Hospital Supply Corp
Priority date: 1973-03-22
Filing date: 1974-03-13
Publication date: 1974-10-03
Also published as: JPS5029735A; CA1033663A; FR2222655A1; GB1421308A; US3970427A; BE812714A; FR2222655B1; IT1005603B; CH586554A5; ES424506A1

Description

4690 Herne, 8000 München 4α,

FrelllgrathstraBe 19 *Mnl inn R H tlflhr Eisenacher Straße 17

Po, fach 140 ^ipi.ing. Μ. Π. Uaiir ΡΛ-Anw. Belzl«

PaL-Änw. Herrmsnn-Tren!epohi DIt)! -PHVS Eduard BetZIer Fernsprecher: 363011

Fernsprecher: 51013 " " * " 36 3012

⁵¹⁰¹⁴ D!p!.-Ing. W. Herrmann-Trentepohl ^³⁰¹³

Telegrammanschrift: Telegrammanschrift:

Bahrpatente Herne PATENTANWÄLTE Babetzpat Mönchen

Telex 08 229 853 . , Telex5215360

r- ~\ Bankkonten:

Bayerische Vereinsbank München 952

2 Δ Ί • 1 3 / Dresdner Bank AG Herne 7-520 499

' Postscheckkonto Dortmund 558 68-467

Ref.: MO 4688 Dr.H/hr

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Zuschrift bitte nach:

München Abholfach 3

American Hospital Supply Corporation

1740 Ridge Avenue
Evanston, 111. 60204 (USA)

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Verdünnungen oder Suspensionen für serologische Bestimmun gen v/erden im allgemeinen mit einer 0,85 %igen (0,.15H) Lösung von Natriumchlorid, gewöhnlich als physiologische

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oder isotonische Kochsalzlösung bezeichnet, durchgeführt. Bei Blutgruppenbestimmungen -werden die Erythrocyten des Spenders (oder Empfängers) erst in einer kleinen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert und dann wird die Suspension mit einem Serum vermischt, des bekannisnieisqBlut eines anderen Types . agglutinierfc Nach der Zentrifugiereng erscheint am Boden des Zentrifugenglases ein kleiner Knopf von sedimentierten Zellen. Leichtes Schütteln des Glases zeigt dann an_fob oder ob nicht Agglutination aufgetreten ist. Wenn die Zellen einheitlich dispergieren und resuspendieren, dann sind die Resultate negativ; wenn hingegen der Knopf sich von der Zentrifugenglaswand löst, aber mehr oder weniger in großen Klumpen verbleibt, die nicht durch das Schütteln zerbrechen, dann trat Agglutination auf und die Ergebnisse sind positiv.

Obwohl abhängig von den einzelnen Bestimmungen, viele verschiedene Variationen des vorstehenden Verfahrens bekannt sind, bleibt im allgemeinen die Stufe der Agitation einer Aggregation von Zellen, um deren Tendenz zur* Wiedersuspension in der Kochsalzlösung zu beobachter, bei den meisten Verfahren die selbe, ob eine solche Stufe in einem Zentrifugenglas oder auf einem Mikroskop-Objektträger stattfindet. Nun tritt häufig ein Problem auf, wenn sich Zellmassen weder dispergieren noch als Aggregat ablösen, aber statt dessen fest an der Glasoberfläche haften. Wenn die Zellen trotz Agitation am Platz verbleiben, dann kann der Serologe nicht- mit Bestimmtheit

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feststellen, ob der Widerstand zur Dispersion durch die Aglutination verursacht ist oder lediglich durch die Neigung der Zellen am Glas zu haften. Auf der anderen Seite, wenn eine Sonde oder eine übermässige Agitation benutzt wurde, um den Knopf von dem Glas zu lösen, so besteht für den Fall, daß sich die Zellen resuspendieren eine Ungewissheit, ob diese Resuspension aufgrund einer wirklichen negativen Reaktion stattfand, oder ob die mechanischen Kräfte, die auf den Knopf ausgeübt wurden, die agiutinierten Zellen eines positiven Testes trennten. Daher hat die Anziehung zwischen den Blutzellen und den Glasoberflächen, ein \vohlbekanntes Phänomen in klinischen Laboratorien, Probleme geschaffen, die dazu neigen Blutuntersuchungsverfahren zu komplizieren und deren Genauigkeit und Verlässlichkeit zu beeinflussen. Obwohl diese Probleme lang bekannt sind, wurde noch keine wirksame Lösung dafür entwickelt.

Ein wesentliches Merkmal der Erfindung beruht auf der Entdeckung, daß die vorstehend genannten Probleme eliminiert oder reduziert werden^wenn eine physiologische Kochsalzlösung zur Verwendung bei Blutuntersuchungsverfahren so modifiziert wird,daß /geringe Mengen von Gelatine enthalt .-. Aus noch nicht genau bekannten Gründen reduziert die Anwesenheit von Gelatine die Hämolyse von Erythrocyten und eliminiert oder reduziert weitgehend das vorstehend beschriebene Problem des Haftens zwischen den Erythrocyten und den Glasoberflächen. Im allgemeinen wird angenommen, daß die modifizierte Kochsalzpräparation in jedem Falle da vorteilhafter ist, wo bisher physiologische Kochsalzlösungen für in vitro Blutbankverfahren verwendet wurden einschließlich Waschen und Herstellen von Ery-

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throcyten-Suspensionen, direktenAntiglobulinbeStimmungen, indirekte! Antiglobulinbestimmungen, großen und kleinen Kompatibilitätsbestimmungen, Gruppieren und Typieren von Blut, Identifizierung und Screening von Antikörpern und Bestimmungen, die Enzymmethoden verwenden.

Die wässrige Natriumchloridlösung muß steril und isotonisch sein, wie in einer standardphysiologischen Kochsalzlösung. Insbesondere soll die Natriumchloridkonzentration in einem Bereich von 0,80 bis 0,90 %_} am besten 0,85 % (0,15 Molar) sein. Die Gelatinekonzentration soll im allgemeinen sich in dem Bereich von 0,001 bis 2,0 Gew.-% (Gram pro 100 Milliliter) bewegen und soll vorzugsweise in dem Bereich von 0,001 bis 1,0 % sein. Bei geringeren Konzentrationen vermindert sich die Wirksamkeit, während höhere Konzentrationen Reflektionsprobleme bereiten könnten und Mikrobenwachstum unterstützen könnten, ohne den Effekt wesentlich zu erhöhen. Für imun-hämatologisches Testenjs±eint die optimale Konzentration bei etwa 0,1 % zu liegen.

Eine für die Erfindung geeignete Gelatine sollte in fein verteilter """Form vorliegen, um die Lösung in der Kochsalzlösung zu erleichtern und sie sollte zumindest eine Laboratoriumsqualität-Reinheit aufweisen gemäß der "U.S. Pharmacopeia oder National" Formulierung.

Die Herkunft der Gelatine und das Herstellungsverfahren erscheinen nicht kritisch. Somit ist Gelatine hergestellt durch Teilhydrolyse von Collagen aus Kalbshaut, Schweinshaut und aus der Haut und dem damit verbundenen Gewebe und aus den Knochen verschiedener Tiere geeignet. In ähnlicher

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Weise kann die Gelatine von einem säurebehandeltem Vorläufer (Typ A) oder von einem alkalisch behandeltem Vorläufer (Typ B) stammen. Für die erfindungsgemäße Anwendung soll die C-elatine-Kochsalzlösung steril hergestellt und verpackt sein; jedoch können Konservierungsmittel wünschenswert sein, insbesondere wenn das Produkt für längere Zeit in einem Laboratorium aufgehoben v/erden soll, nachdem der Behälter einmal geöffnet wurde. Jedes geeignete Kons'ervierungs- oder antibacterizide Mittel wie Neomycinsulfat und Chloramphenicol kann verwendet v/erden,

Keine speziellen oder ungewöhnlichen Verfahren sind erforderlich für die Herstellung der modifizierten physiologischen Kochsalzlösung, abgesehen davon, daß die letzte Stufe in jeder kommerziellen Herstellung die Sterilisation einschließen muß. Sterile Filtration wurde besonders vorteilhaft befunden. Da Gelatine unlöslich oder nur wenig löslich in kaltem Wasser ist, muß die Wasser- oder Kochsalzlösung zur Herstellung dieser Lösung massig erwärmt werden, um die Gelatineteilchen zu lösen.

Die genauen Ursachen warum die Einbeziehung von Gelatine so wesentlich die Wirksamkeit physiologischer Kochsalzlösung im Blutuntersuchungsverfahren erhöht^ sind nicht bekannt, teilweise da der genaue Mechanismus der Erythrocyten-Agglutination nie vollständig bekannt wurde. Es ist möglich, daß Gelatine eine gewisse Wirkung hat auf die Verringerung der Zell-Ladungsunterschiede, oder auf die Reduktion der Oberflächenspannung des Suspensions-' mediums (der modifizierten Salzlösung). Da der Ablauf der Agglutinationsreaktion so wesentlich vorteilhafter ist im Vergleich zur standard (unraodifizierten) physiologischen

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Kochsalzlösung, könnte man vernünftigerweise darauf schließen, daß eine gewisse Verstärkung der Reaktion stattfand; jedoch um eine solche Wirkung ganz zu erklären, müsste eine vollständigere Information betreffend den Mechanismus der Erothrocyten-Agglutination bekannt werden.

Vergleichsstudien von standardphysiologischen Kochsalzlösungen und modifizierten physiologischen Kochsalzlösungen haben gezeigt, daß weniger Hämolyse auftritt, wenn Erothrocyten in modifizierter-Salzlösung gewaschen und suspendiert werden; in einer modifizierten Salzlösung werden Zellknöpfe leichter suspendiert und besser abgegrenzt; das Verhaften der Erothrocyten, insbesondere zu Glasoberflächen ist wesentlich reduziert", wenn modifizierte Salzlösung .verwendet wird; das grobe Aussehen von Zellen unter dem Mikroskop in "Coombs testing" ist eliminiert oder wesentlich reduziert, wenn modifizierte Salzlösung verwendet wird; die Identifizierung und das Screening der Antikörper .wird verbessert, wenn modifizierte Salzlösung verwendet wird, wobei die Reaktionen einfacher lesbar und reproduzierbarer sind.

Die Beispiele erläutern de Erfindung. Beispiel 1

Eine modifizierte physiologische Kochsalzlösung wurde erfindungsgeraäß mit Verwendung der folgenden Reagenzien und der folgenden Konzentrationen hergestellt:

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Reagenzien · . Konzentration

(Gewicht/Volumen)

Natriumchlorid, ρ.A. 0, 85 %

granulierte Gelatine,

Laboratoriumsqualität 0,1 %

Neomycin-Sulfat 0,03 %

Chloramphenicol , 0,02 %

destilliertes Wasser

Von jedem Reagenz wurden Stammlösungen hergestellt. 30 g Natriuinchloridkri stalle wurden in 100 ml destilliertem Wasser gelöst_>um die Natriumchloridstammlösung zu bereiten. Stammlösungen von Neomycinsulfat und Chloramphenicol wurden in ähnlicher Weise hergestellt unter Verwendung von 10 g pro 100 ml für die Neomycinsulfatlösung und 0,44 g pro '100 ml für die Chloramphenicollösung. Ein 10 g percent Konzentrat von Gelatine wurde unter Verwendung von 50° heißem destillierten Wasser vor der Gelatinezugabe hergestellt. Nach Zugabe der Gelatine wurde für 10 Minuten bei 50° gerührt^um vollständige Lösung zu bewirken.

Anschließend wurden die folgenden Volumen der entsprechenden Stammlösurigen miteinander vermischt und destilliertes Wasser wurde hinzugegeben um ein Endvolumen von 1 1 zu erreichen: 28,3 ml Natriumchlorid-Stammlösung; 10,0ml Ge-

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latine-Stammlösung·; 3,0 ml Neomycinsulfat-Stammlösung; 45,5 ml Chloramphenicol-Stammlösung. Das Endprodukt wurde bei 4° aufgehoben bis zur Sterilisationsfiltration, die innerhalb 24 Stunden nach der Herstellung der Lösung durchgeführt wurden.

Ähnliche Lösungen von modifizierten physiologischen Kochsalzlösungen wurden hergestellt unter Verwendung von Gelatine anderer Qualität und anderer Quellen wie z.B. Gelatine 1099 (gereinigte Kalbshaut), Gelatine 5247 (gereinigte Schweinshaut), Gelatine G-8 (granulierte Laboratoriumsqualität, 270 bloom), von Fisher Scientific Company, New Jersey, und Gelatine G-2500 (Schweinehaut, Typ 1 etwa 300 bloom), bezogen von Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri. Alle Materialien ergeben im wesentlichen die selben Resultate wobei Laboratoriumsqualität-Gelatine im allgemeinen so wirksam ist wie mehr gereinigte Materialien. Auch hatte die Eliminierung von Preservationsmitteln (Neomycinsulfat und Chloramphenicol) keine nachteilige Wirkungauf die Resultate, wenn die modifizierte physidbgische Kochsalzlösung alsbald nach der Herstellung oder kurz nach der Öffnung einer sterilen Verpackung verwendet wurde.

Beispiel 2

Über 100 Probesuspensionen von 3 bis 5 Prozent- (V/V) von Menschenerothrocyten wurden hergestellt unter Verwendung der modifizierten physiologischen Kochsalzlösung gemäß Beispiel 1 und wurden visuell verglichen mit einer gleichen Zahl von Probesuspensione^ bei denen eine konventionelle physiologische Kochsalzlösung verwendet wurde, Die Suspensionen wurden über verschiedene Zeiträume bis

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zu 21 Tagen aufbewahrt und für Hämolyse und allgemeines Aussehen der Erothrocyten beobachtet. Freies Hämoglobin und eine massige Aggregation von Erothrocyten wurde in den Suspensionen der konventionellen physiologischen Kochsalzlösung beobachtet, in einem bedeutenden Gegensatz dazu waren die modifizierten physiologischen Kochsalzlösungen frei von Hämoglobin und die Erothrocyten verblieben in einem nicht-aggregierten Zustand.

Beispiel 5

ABO-Gruppierung und Rh-Hr Typierung von Erothrocyten wurde durchgeführt, um die Begrenzung von Zellknöpfen und die Leichtigkeit der Suspendierung von Zellen in konventioneller und in modifizierter physiologischer Kochsalzlösung zu vergleichen. Eine Vielzahl von Erothroeyten-Suspensionen wurden in beiden Lösungen hergestellt und die Untersuchungen wurden gemäß den Instruktionen der Antiserumhersteller durchgeführt. Ein übliches Verfahren schloß die Herstellung einer 2 folgen (V/V) Suspension von gewaschenen roten Blutzellen in der Saline ein (entweder normale physiologische Salzlösung oder modifizierte physiologische Salzlösung) und Zugabe eines Tropfens der Zellsuspension in ein kleines Zentrifugenglas zu dem ein Tropfen Antiserum hinzugefügt wurde. Die Inhalte des Röhrchens wurden durch Rühren' * vermischt und dann zentrifugiert, üblicherweise 1 Minute bei 1000 Umdrehungen pro Minute (RCF 125 g) oder für 20 Sekunden bei 3400 Umdrehungen pro Minute (RCF 1,000 g). Das Glas wurde aus der Zentrifuge genommen und leicht geschüttelt; anschließend wurden die Inhalte makroskopisch auf Agglutinierung geprüft. Eine mikroskopische Untersuchung wurde ebenfalls unternommen.

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In den Versuchen, in denen die Zellen in konventioneller physiologischer Kochsalzlösung suspendiert waren, erschienen die Zellknöpfe öJffus und körnig und waren charakteristisch begleitet von einem scheinartigen Kranz oder einem schwach angedeuteten Ring an der Innenseite des Zentrifugenglases. -Bei positiven Ergebnissen lösten sich die Knöpfe nicht leicht j in den meisten Fällen, wenn die Resuspendierung stattfand verblieben an der Innenseite der Glasoberfläche der Ring oder der Schein. Im Gegensatz dazu, erschien in den Versuchen, in denen modifizierte physiologische Kochsalzlösung verwendet wurde (gemäß Beispiel 1) ein kompakter, ebenförmiger und wohl definierter Zellknopf. Sogar bei positiven Proben löste sich dieser Knopf leicht; in den meisten Fällen löste sich der Knopf von dem Boden des Zentrifugenglases zur selben Zeit, zu der das Glas von der Zentrifuge genommen wurde. Der Ring oder der Schein der in Verbindung mit den Proben, die normale physiologische Kochsalzlösung verwendete, beobachtet wurde, wurde bei den Versuchen,die modifizierte physiologische Kochsalzlösung gemäß Beispiel 1 verwendeten nicht beobachtet . .

Beispiel 4

Zusätzlich zur Zentrifugenglasmethode für die Blutgruppierung und Typierung können in manchen Fällen die Reaktionen auch auf Objektträgern durchgeführt werden. Die Haftung von Erothrocyten auf Glas kann, demoniriert werden, indem für einige Sekunden die Zellen auf den Glasobjektträger gegeben werden und dann der" Träger so geneigt wird, daß die Zellen von der Glasoberfläche ablaufen.

Unter Verwendung des genannten Verfahrens wurden (5 % V/V)

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Erothrocytensuspensxonen rait konventioneller physiologischer Kochsalzlösung hergestellt und dann auf die Objektträger wie beschrieben aufgebracht-. Nachdem die Zellen von dem geneigten Träger abgelaufen waren, verblieb ein trüber oder durchscheinender Rückstand, wodurch die Anwesenheit einer wesentlichen Zahl von Zellen, die dem Glas anhaften, angezeigt wurde. Bei der Wiederholung des selben Versuches unter Verwendung einer modifizierten physiologischen Kochsalzlösung, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurde, zeigte die makroskopische Beobachtung, daß der Rückstand wesentlich weniger trüb (also durchsichtiger) war. Mikroskopische Untersuchungen bestätigte, daß verhältnismässig wenig Zellen auf der Glasoberfläche verblieben, wenn modifizierte physiologische Kochsalzlösung verwendet wurde im Vergleich mit den zurückgehaltenen Zellen bei Vervrendung von konventioneller physiologischer Kochsalzlösung.

Beispiel 5

Versuche zeigten, daß die Antigen-Antikörper Reaktionen bei Verwendung von modifizierter physiologischer Kochsalzlösung, gemäß Beispiel 1 reproduzierbarer sind, als bei Verwendung von konventioneller physiologischer Kochsalzlösung. In einer Serie von identischen Antigen-Antikörper-Versuchen, die in einer modifizierten.und einer normalen Saline durchgeführt wurden, wurden im allgemeinen in den modifizierten Kochsalzlösungsversuchen stärkere Reaktionen beobachtet. Unter Verwendung des Einteilungsschemas für die Stärke der Agglutinierungsreaktionen, veröffentlicht in "Technical Methods and Procedures of the American Association of Blood Banks, Seite 47, 5th Edition. 1970" wurde ein wesentlicher Bestandteil der Versuche die

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als 1+ Reaktionen mit normaler Kochsalzlösung "berichtet wurden, als 2+ oder stärkere Reaktionen berichtet bei
Verwendung der erfindungsgemäßen modifizierten Kochsalzlösung« Die erhöhte Reaktivität ergab reproduzierbarere Versuche, insbesondere bei schwachen oder geringen Antikörperkonzentrationen. Mikroskopische Ablesungen bestätigten die makroskopischen Beobachtungen.

- Patentansprüche -13 -

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Claims

Patentansprüche

1J Präparat zur Verwendung bei Blutuntersuchungsverfahren, dadurch gekennzeichnet , daß es aus einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung besteht, die Gelatine in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,001 bis 2,0 % enthält.
2. Präparat zur Verwendung bei Blutuntersuchungsverfahren, dadurch gekennzeichnet , daß es aus einer sterilen physiologischen Kochsalzlösung besteht, die Gelatine in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,001 bis 1 % enthält.
3. Präparat nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß seine Gelatinekonzentration etwa 0,1 % beträgt.

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