Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators, Verfahren zu dessen Herstellung und dessen Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators, der aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, wobei das Mittel bei der Herstellung des Indikators an Antigene gebunden wird.
Das erfindungsgemässe Mittel ist aus Mikrobenzellen aufgebaut, an die eine Verbindung durch eine kovalente chemische Bindung gebunden ist, wobei diese Verbindung noch eine freie reaktive Gruppe aufweist, die chemisch an Antigensubstanzen gebunden werden kann. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieses Mittels und dessen Verwendung zur Herstellung eines Indikators, wobei hiezu an die freie reaktive Gruppe des Mittels eine Antigensubstanz gebunden wird, wodurch ein immunologischer Indikator erhalten wird, der zur visuellen Feststellung von homologen Antigenen oder Antikörpern verwendet werden kann.
Die Möglichkeit, die Anwesenheit von Antigensubstanzen in verschiedenen Flüssigkeiten festzusteller hat sehr grosse Bedeutung. Bei vielen industriellen Verfahren werden proteinartige Materialien, die Antigeneigenschaften besitzen, entweder als Reaktanten verwendet oder diese Materialien werden sonst irgendwie behandelt. Die Möglichkeit, die Änderungen in der Konzentration dieser Materialien festzustellen, um derartige Reaktionen zu verfolgen, ist insbesondere bei der Kontrolle und der Wiederholbarkeit derartiger industrieller Verfahren von Bedeutung. Ein anderes, sehr bedeutendes Anwendungsgebiet besteht in der Feststellung verschiedener Antigene und Antikörper in Körperflüssigkeiten.
Der Spiegel vieler Hormone, Proteine, Lipoproteine, Mucoproteine, Glycoproteine usw. und der Spiegel der Hydrolyseprodukte dieser Materialien, die normalerweise im Körper vorkommen und auch dann, wenn verschiedene pathologische Erscheinungen auftreten, ist für die medizinische Praxis von grosser Bedeutung. Einige dieser Substanzen, die von grossem Interesse sind, können nach bisher bekannten Methoden unter Verwendung von üblichen chemischen Analysenmethoden schwer festgestellt werden. Jedoch unter Anwendung von immuno-chemischen Testverfahren können manche dieser Antigene und Antikörper in Mischungen, die andere grosse Moleküle enthalten, die ähnliche chemische Gruppen aufweisen, jedoch nicht genau die gleiche Konfiguration wie das zu bestimmende Makromolekül besitzen, nachgewiesen werden.
Eine Anzahl von diesen immunologischen Verfahren sind jedoch schwer auszuführen und benötigen oft lange Zeit und spezielle Arbeitstechniken, sie wurden aber dennoch zur Feststellung der Anwesenheit derartiger Substanzen in verschiedenen Körperflüssigkeiten verwendet. Für einige Antigene und Antikörper waren jedoch bisher keine Testverfahren zugänglich.
In neuerer Zeit wurden Hämagglutinationssysteme für die Feststellung von Antigenen oder die Feststellung deren Antikörper ausgearbeitet. Bei diesen Systemen werden rote Blutkörperchen als Indikatorteilchen angewandt, die zu deren Verwendung auf irgend eine Art mit einer Antigensubstanz verbunden werden, so dass ein Indikator erhalten wird, der zur Feststellung des homologen Antikörpers oder zur Feststellung der Antigensubstanz selbst verwendet werden kann. Zur Feststellung der Anwesenheit oder Abwesenheit der Substanz, auf die unter Verwendung derartiger Indikatoren geprüft wird, ist es im allgemeinen notwendig, das Aussehen des Musters der roten Blutkörperchen zu interpretieren um feststellen zu können, ob eine Hämagglutination aufgetreten ist.
Hämagglutination tritt dann auf, wenn der homologe Antikörper in dem Testmedium in einer solchen Form vorliegt, die in der Lage ist, mit der Antigensubstanz zu reagieren, die an die roten Blutkörperchen gebunden ist, um mit derselben einen Immunkomplex zu bilden. Hämagglutination tritt nicht auf, wenn der homologe Antikörper keinen Komplex mit den roten Blutkörperchen bilden kann, an welche die Antigensubstanz gekuppelt ist. Aufgrund vieler Bedingungen, zu denen die Anwesenheit von Puffern und anderen reaktionsfähigen Materialien zählt, ist dieses Testverfahren nur beschränkt anwendbar und es ist nötig, ein geübtes Personal zur Verfü gung zu haben, das in der Lage ist, das Aussehen der erhaltenen Muster zu interpretieren, obwohl gut arbeitende Testsysteme für einige Substanzen bereits angewandt werden.
Eine andere, Schwierigkeiten verursachende Erscheinung, die bei Hämagglutinationssystemen auftritt, ist die Erscheinung, die unter der Bezeichnung heterophiles Antikörperproblem zu verstehen ist, und die von einigen Serumproteinen hervorgerufen wird, die in der Antiserumlösung enthalten sind, die mit den Antigengruppen reagiert, die üblicherweise an der Oberfläche der roten Blutkörperchen auch dann vorkommen, wenn das Antiserum von einer Species genommen wird, die von der Tierspecies verschieden ist, von der die roten Blutkörperchen verwendet werden. Auf diese Weise wurde Ovalbumin bereits früh von Pressmann, D., Campbell, D. H., Pauling, L.: Journal of Immunology 44, Seiten 101-105 (1942) im Serum entdeckt. Ein ähnliches Verfahren wurde angewandt, um Tuberkulin gereinigtes Proteinderivat festzustellen, eine Methode die von Cole, L. R., Farell, V.
R. im Journal of Experimental Medicine 102, Seite 157 (1955) beschrieben ist, und Insulin wurde im Serum von Arquilla, E. R. und Stavitsky, A. B. festgestellt, wie dies im Journal of Clinical Investigation 35.
Seiten 458466 (1956) beschrieben ist. In der USA Patentschrift Nr. 3 236 732 von Edward R. Arquilla ist ein ähnliches System zur Prüfung auf das Hormon Choriongonadotropin beschrieben. Eine pathologische Antigen substanz, nämlich Diphtherietoxin wurde auf diese Weise getestet und dieses Verfahren ist von Butler W.T. im Journal of Immunology 90, Seiten 663-671 (1963) beschrieben.
Es wird angenommen, dass die beschränkte Anwendbarkeit dieser Arten des Hämagglutinationstest zum Teil darauf zurückzuführen ist, dass ein enger Bereich der Grössen und der speziellen Konfigurationen der tierischen roten Blutkörperchen, die im allgemeinen angewandt werden, vorliegt, und dass eine grössere Anwendbarkeit der Agglutination in immun ologischen Indikatoren und Testsystemen dadurch erreicht werden könnte, wenn Indikatorpartikeln gefunden werden könnten,
die die roten Blutkörperchen ersetzen können und die eine stärkere Variation der Grösse erlauben würden. Im allgemeinen ist durch die Verwendung von tierischen roten Blutkörperchen als Indikatorteilchen für verschiedene Antigene sowohl die Anwendung eines chromatographischen als auch die Anwendung eines Plattentyp-Agglutinationsmechanismus ausgeschlossen. Die roten Blutkörperchen sind auch bei ihrer Verwendung teuer, denn es müssen im Laboratorium Tiere gehalten werden und die Abnahmebedingungen müssen sorgsam vorgeschrieben sein, damit eine Hämolyse der Zellen vermieden wird und damit eine Einheitlichkeit erreicht wird, ohne welche der Hämagglutinationstest nicht reproduzierbar ausgeführt werden kann.
Es hat sich nun herausgestellt, dass Mikrobenzellen als immunologische Indikatorpartikeln dienen können und dass hierdurch viele der vorher beschriebenen Schwierigkeiten überwunden werden können. Mikrobenzellen existieren in sehr breiten Grössenbereichen und auch ihre Farben sind stark unterschiedlich und die Grössen liegen in den Bereichen, die sowohl für Röhren-Agglutinationstest als auch für Platten-Agglutinationstest benötigt werden und auch für Tests der chromatographischen Typs zugänglich sind. Daher ist eine Vielzahl von Testmechanismen anwendbar, wenn Mikrobenzellen als Indikatorpartikeln verwendet werden. Die Zellen können leicht unter Laboratoriumsbedingungen gezüchtet werden und können billig hergestellt werden.
Die Mikrobenzellen können entsprechend der benötigten Grösse, entsprechend der Oberflächeneigenschaften, die für den jeweiligen Testmechanismus besonders vorteilhaft sind und nach dem Gesichtspunkt, unter dem die Züchtung der Zellen besonders leicht möglich ist, ausgewählt werden. Deshalb ist eine grössere Variationsmöglichkeit bei der Herstellung des immunologischen Indikators bzw. immunologischen Testsystems möglich, wenn Mikrobenzellen verwendet werden. Durch die Verwendung von Mikrobenzellen kann auch das heterophile Antikörperproblem beseitigt werden.
Unter der Bezeichnung Indikatorteilchen sind hierin Mikrobenzellen zu verstehen, an die keine Verbindung chemisch gebunden ist, die nach der Bindung an die Mikrobenzellen noch eine freie reaktive Gruppe aufweist. Diese Verbindung, die bevor sie an die Mikrobenzellen gebunden wird 2 nichtgebundene reaktive Gruppen aufweist, von denen dann eine mit den Mikrobenzellen unter Ausbildung einer kovalenten chemischen Bindung reagiert, wird in der Folge auch Kupplungsmittel genannt. Unter der Bezeichnung Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators sind Mikrobenzellen zu verstehen, an die das Kupplungsmittel gebunden ist, aber ohne dass eine Antigensubstanz an dieselben gebunden ist. Unter der Bezeichnung immunologischer Indikator ist die Kombination aus Zellen, Kupplungsmittel und Antigensubstanz zu verstehen.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher das Mittel zur Herstllung eines immunologischen Indikators, das zur chemischen Bindung an Antigensubstanzen geeignet ist, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, an die über eine covalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die noch mindestens eine freie reaktive Gruppe aufweist, wobei diese reaktive Gruppe in der Lage ist, mit Antigenen zu reagieren, wenn das Mittel mit diesen zusammengebracht wird.
Die Mikrobenzellen des erfindungsgemässen Mittels zur Herstellung eines Indikators können Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sein. Vorzugsweise haben die Mikrobenzellen gleiche Form und Grösse und besitzen in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron. Die Mikrobenzellen können mit einem Inaktivierungsmittel vorbehandelte Mikrobenzellen und/oder gefärbte Mikrobenzellen sein.
Als Beispiel für die Verbindungen, die beim erfindungsgemässen Mittel über eine freie reaktive Gruppe an die Mikrobenzellen gebunden sind und noch eine freie reaktive Gruppe aufweisen, seien genannt: Bis-diazobenzidin, Bis-di azobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-s-triazin oder N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen Mittels, wobei sich dieses Verfahren dadurch auszeichnent, dass man Mikrobenzellen mit einer Verbindung zusammenbringt, die mindestens 2 nicht gebundene reaktive Gruppen aufweist, und dass man eine dieser reaktiven Gruppen mit den Mikrobenzellen unter Bildung einer kovalenten chemischen Bindung reagieren lässt und die andere der genannten reaktiven Gruppen in dem ungebundenen Zustand belässt.
Bei der Durchführung dieses Verfahrens kann man die Mikrobenzellen suspendieren und diese Suspension mit der Verbindung, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweist, zusammenbringen. Als Beispiel für Verbindungen mit mindestens 2 reaktiven Gruppen seien genannt: Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidindisulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, ein Carbodiimid, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-s-triazin und N-t-Butyl-5-methylisoxazolium-perchlorat.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemässen Mittels zur Herstellung eines Indikators. Diese Verwendung ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Mittel mit einem Antigen umsetzt, wobei das Antigen an die reaktiven Gruppen des Mittels durch kovalente Bindungen gebunden wird.
Ein so erhaltener immunologischer Indikator kann zur Feststellung eines Antigens verwendet werden und kann auch zur Verwendung in Kombination mit den homologen Antikörpern geeignet sein, wobei der Indikator aus Mikrobenzellen zusammengesetzt ist, die an das Antigen mit Hilfe eines chemischen Kupplungsmittels gebunden sind. Bei dieser Verwendung kann der erhaltene Indikator auf ein saugfähiges Material als Abscheidung aufgebracht werden. Man kann das erfindungsgemässe Mittel mit einem Antigen umsetzen, das ein Serumantigen, vorzugsweise y-Globulin, Serumalbumin oder eine Blutgruppensubstanz, oder ein Mikrobenantigen, eine antigene Hormonsubstanz, ein Proteinhydrolyseprodukt oder ein Enzym ist.
Spezielle Beispiele für Antigene mit denen der Indikator umgesetzt werden kann sind: Ovalbumin, ein mit Tuberkulin gereinigtes Proteinderivat, Insulin, das Hormon Choriongonadotropin (CGTH), das sowohl menschlichen als auch tierischen Ursprungs sein kann, sowie menschliches Serumalbumin oder Pferdey-Globulin.
Die Mikrobenzellen des erfindungsgemässen Mittels und der daraus herstellbaren immunologischen Indikators können irgendwelche selbstreproduzierende Mikroorganismen sein, die sich abhängig von oder unabhängig von anderen Organisrnen fortpflanzen. Sowohl grampositive als auch gramnegative Bakterienzellen können verwendet werden, ferner sind auch die Zellen von Pilzen und Protozoen-Zellen anwendbar und auch Virenzellen sind für einige Testsysteme verwendbar. Dies sind im allgemeinen einzellige Organisrnen, die manchmal in Klumpen oder Aggregaten miteinander verbunden sind. Die Zellen können in dieser Form angewandt werden, vorausgesetzt, dass ihre Aggregatgrösse kein Trägerteilchen bildet, das so gross ist, dass das mit diesem gebildete Testsystem in Anwesenheit einer Substanz, die homolog zu der an die aggregierten Zellen zu bindende Antigensubstanz ist, nicht agglutiniert.
Im allgemeinen sind die bevorzugten Mikrobenzellen, Bakterienzellen oder Aggregate derselben, die einheitliche Form und Grösse aufweisen, und maximale Aussenabmessungen im Bereich von etwa 0,2 bis 10 Micron besitzen. Obwohl es nicht vorzuziehen ist, kann auch eine Mischung aus verschiedenen aber einheitlichen Zellen verwendet werden. Bei diesen Bakterien gehören zu den verwendbaren Mikrobenzellen diejenigen der Abteilung I des Pflanzenreiches, zu der die Klassen I, II und III, Ordnung I gehören. Zur Klasse III Ordnung 1 der Mikrobenzellen gehören die intrazellularen Virenorganismen, die Grössen im Be reicll von etwa 0,2 Micron aufweisen.
Bezüglich der kompletten Aufzählung der verwendbaren Bakterienzellen sei auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology von R. S. Breed, E. G. D.
Murray, N. R. Smith., 7. Ausgabe 1947, (Williams und Wilkins Company) verwiesen. Besonders geeignet sind Bakterien der Klasse II Unterordnung II Familie IV (Pseudomonadaceen) und der Klasse II Ordnung IV Familie IV (Enterobacteriaceen). Man nimmt an, dass alle Stämme I bis IV zur Durchführung der vorliegenden Erfindung bevorzugte Zellen darstellen. Auch die Klasse II Ordnung IV Familie V (Brucellaceen), X (Lactobacillaceen) und XIII (Bacillaceen) sind bevorzugte Mikroorganismen. Sowohl die Ordnungen I als auch II der Klasse III der Organismen können angewandt werden, wenn Partikeln einer geringeren Grösse von etwa 0,2 Mikron oder noch kleiner gewünscht sind. Insbesondere die Viralen der Ordnung II sind von sehr geringen Grössenabmessungen, wodurch ihre Verwendbarkeit begrenzt ist.
Besonders bevorzugte Bakterienzellen sind Brucella abortus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi. Die Hefewachstumsphase der Pilzzellen sind auch zur Durchführung der Erfindung bevorzugt. Besonders bevorzugt ist die übliche erhältliche Hefe, nämlich Saccharomyces cerevisiae.
Die Mikrobenzellen können in ihrem natürlichen Zustand verwendet werden, d. h. das Kupplungsmittel kann mit ihnen direkt umgesetzt werden. Wenn jedoch die natürlichen pathogenen Eigenschaften irgendwelcher Mikrobenzellen als gefährlich angesehen werden müssen, dann kann die natürliche Antigenität und damit die pathologischen Eigenschaften dadurch entfernt werden, dass man die Mikrobenzellen mit Inaktivierungsmitteln behandelt oder abtötet. Die gebräuchlichsten Inaktivierungsmittel sind Formaldehyd und Phenol. Es ist bemerkenswert, dass für den Fall, dass Mikrobenzellen mit einem derartigen Inaktivierungsmittel vorbehandelt und dann noch abgewandelt wurden, indem das Kupplungsmittel an sie gebunden wurde, die auf der Zellenoberfläche natürlich vorkommenden Antigengruppen genügend modifiziert wurden, so dass sie inaktiv wurden.
Um irgendwelche Zellen, die natürliche Antigenaktivität aufweisen vollständig auszuschalten, kann das hergestellte Testsystem mit einem Serum enthaltenden Antikörper an das Antigen gebunden werden, das im natürlichen Zustand auf der Zellenoberfläche anwesend ist, wobei hierdurch ein Komplex gebildet wird, der bei weiteren Tests nicht mehr stört.
Wenn z. B. Escherichia coli für die Indikatorpartikeln des Mittels zur Herstellung eines Indikators verwendet werden und die Antikörper für Escherichia coli in der Testprobe anwesend sind, dann kann die Reaktion zwischen dem Indikator und seinem Antikörper durch die Adsorption der Escherichia coli-Zellen des Indika tors mit Antiseren blockiert werden, die den entsprechenden Antikörper enthalten. Deshalb kann man nicht mehr annehmen, dass die Mikrobenzellen, die im erfindungsgemässen Indikator anwesend sind, ihre natürliche Antigenität besitzen.
Falls gewünscht wird, können die Mikrobenzellen gefärbt werden, um die visuelle Unterscheidbarkeit des erhaltenen Indikators von dem umgebenden Hintergrund zu verbessern. Im allgemeinen werden Farbstoffe wie Hematoxylin, Fuchsin und Kristallviolett zu diesem Zweck verwendet. Eine andere, gegebenenfalls vorgenommene Behandlung besteht darin, dass man die Zellen mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B.
Alkoholen, Äthern usw. wäscht, um Polysaccharid- oder Wachsschichten zu entfernen, die anwesend sein können.
Die Verbindungen, die mindestens 2 reaktive Gruppen aufweisen, nämlich die Kupplungsmittel müssen solche reaktiven Gruppen besitzen, die sowohl mit der Mikrobenzelle als auch den Antigensubstanzen reagieren. Die Kupplungsmittel sind im allgemeinen Verbindungen, die zwei oder mehr der folgenden reaktiven Gruppen aufweisen: Azogruppen, Sulfonsäuregruppen, Fluorgruppen die mit Nitrogruppen kombiniert sind, Acide, Imine und reaktive Chlorgruppen, die mit einem Ring verbunden sind, der eine geeignete Resonanzstruktur besitzt.
Diese reaktiven Gruppen sind in der Lage, mit den primären Aminogruppen mit den SH-Gruppen (Mercaptogruppen) und mit den Hydroxylgruppen in den Polymerketten und an der Oberfläche der Mikrobenzellen zu reagieren und bei der Verwendung des Mittels reagieren sie dann mit analogen Gruppen des Antigens unter Ausbildung des immunologischen Indikators.
Als Kupplungsmittel seien beispielsweise angeführt: Bis-diazobenzidin, Bis-diazobenzidin-disulfonsäure, Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, verschiedene Carbodiimide, Toluoldiisocyanat, Cyanurchlorid, Dichlor-S-triazin und N-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat.
Einige dieser Kupplungsmittel, insbesondere die cyanurierenden Mittel sind in der Lage, die Zellen, zu der Zeit, wo sie mit Gruppen der Oberfläche der Mikrobenzellen kuppeln, so zu schützen, dass bei Verwendung dieser Kupplungsmittel keine getrennte Vorbehandlung zum Schutz der Zellen notwendig ist. Bei Verwendung der zuletzt aufgezählten Verbindung werden die Indikatorteilchen zuerst mit einem succinilierenden Mittel, beispielsweise Bernsteinsäureanhydrid, behandelt.
Zur Bildung des Mittels zur Herstellung des immunologischen Indikators wird das Kupplungsmittel zuerst mit den Mikrobenzellen zur Reaktion gebracht, die zweckmässigerweise in einer Flüssigkeit suspendiert sind, und dann wird daraus der Indikator, wenn er gebraucht wird, hergestellt, indem man das Mittel mit der Antigensubstanz unter Bildung des Indikators mischt.
Das erfindungsgemässe Mittel kann als handelbarer Artikel betrachtet werden, da es hergestellt und verkauft werden kann, so dass es der Verbraucher zur Herstellung eines Indikators für jede beliebige Antigensubstanz verwenden kann.
Im allgemeinen kann jede beliebige Antigensubstanz mit dem erfindungsgemässen Mittel gekuppelt werden. Unter dem Begriff Antigensubstanz ist ein Material zu verstehen, das, wenn es in das Kreislaufsystem eines Tieres eingeführt wird, den entsprechenden Antikörper liefert. Unter diesen breiten Begriff fallen daher Serumantigene, wie z. B. y-Globulin und Serumalbumin und auch die Blutgruppensubstanzen A und B, die zur Testung der verschiedenen Bluttypen dienen.
Mikrobenantigene können an den Indikator gekuppelt werden und es kann dann entweder die Mikrobe selbst oder ihr Antikörper in den Flüssigkeiten festgestellt werden. Antigene Hormonsubstanzen, die in Flüssigkeitssystemen des Organismus anwesend sein können, können auch an den Indikator gekuppelt werden. Auch Proteinhydrolyseprodukte und Enzyme können als Antigensubstanzen verwendet werden. Die Mikrobenantigene oder Antikörper können von bakterieller, pilzlicher, parasitologischer oder virenartiger Natur sein. Die Hauptforderung, die an die Antigensubstanzen gestellt wird, ist die, dass sie mindestens eine Gruppe in ihren Polymerketten aufweisen, die mit der reaktiven Gruppe von mindestens einem der bekannten Kupplungsmittel reagieren kann. Soweit bekannt ist, erfüllen alle Antigensubstanzen diese Forderung.
Die Antigensubstanz kann ein natürlich vorkommendes Material sein oder sie kann ein künstlich hergestelltes Material sein. Einige natürlich vorkommende Substanzen, die mit einem erfindungsgemässen Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators gekuppelt werden können, sind; Ovalbumin, Tuberculin gereinigtes Proteinderivat, Insulin, das Hormon Choriongonadotropin (CGTH), und zwar sowohl dasjenige menschlichen als dasjenige tierischen Ursprungs, menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin.
Es gibt drei allgemeine Methoden zur Durchführung der Tests mit den bei der Verwendung des erfindungsgemässen Mittels erhaltenen immunologischen Indikatoren. Diese Methoden wenden die Prinzipien der Chromatographie, diejenigen der Agglutination in einer Röhre und die der Agglutination in einer Schicht oder auf einer Platte an. Welche Methode nun tatsächlich ausgewählt wird, hängt im wesentlichen von der Grösse der Mikrobenzellen ab, die verwendet werden.
Für den chromatographischen Test werden Mikrobenzellen bevorzugt, die die Form von ellypsoidförmigen Stäben besitzen und etwa 0,3 bis 0,4 Micron lang sind. Für die Platten-Agglutination-Tests können die Mikrobenzellen längere Stäbe sein, die beispielsweise eine Länge im Bereich von 1 bis 3 Mikron und einen Durchmesser im Bereich von 0,5 Mikron besitzen, wobei die Zellen auch Kokkenform aufweisen können.
Ein Röhren-Agglutinations-Test kann für einen weiten Grössenbereich der Mikrobenzellen ausgearbeitet werden, wobei der Grössenbereich zwischen etwa 0,2 bis etwa 10 Mikron in jeder Raumrichtung der Mikroben.
d. h. in Längsrichtung oder in Querrichtung liegen kann.
Die Platten- oder Röhren-Agglutinations-Tests beruhen auf der Fähigkeit des immunologischen Indikators, der aus dem erfindungsgemässen Mittel erzeugt wurde, zu agglutinieren, wobei sich bei der Agglutination ein erkennbarer Unterschied im Muster zu dem Muster bildet, das das System bei Nichtvorhandensein einer Agglutination zeigt. Diese Art der Testung kann in zwei grundlegend verschiedenen Weisen durchgeführt werden, wobei im ersten Fall eine Agglutination und im zweiten Fall eine Hemmung der Agglutination auftritt. Im Fall der Agglutination wird ein Antigen an die Mikrobenzellen gekuppelt, wobei sich ein Indikator bildet, und dieser wird verwendet, um die Anwesenheit des entsprechenden Antikörpers in der Probe festzustellen.
Wenn die Probe den Antikörper enthält, dann agglutiniert der Indikator mit dem Antikörper und dieser Umstand kann durch das Muster festgestellt werden, das der Indikator zeigt. Bei der Hemmung der Agglutination wird das Antigen an die Mikrobenzellen gekuppelt, wobei sich ein immunologischer Indikator bildet, der dann mit dem homogenen Antikörper zur Testung auf die Anwesenheit von Antigen in der Probe herangezogen wird. Wenn die Probe das Antigen enthält, wird der homologe Antikörper von dem Antigen gehemmt oder neutralisiert und das Indikatorsystem wird nicht agglutiniert. Unter der Bedingung der Nicht Agglutination wird sich der Indikator, der aus unlöslichen Mikrobenzellen und dem gebundenen Antigen besteht, aus der Testflüssigkeit abscheiden, wobei sich ein erkennbarer Unterschied im Muster im Vergleich zu dem Muster bildet, das der agglutinierte Indikator zeigt.
Die Agglutinierung zeigt sich im Fall des Platten Tests durch die Bildung eines körnigen Musters, während im Fall des Röhren-Tests die Agglutinierung durch eine gleichmässige einheitliche Suspension der Zellen angezeigt wird. Wenn beim Platten-Test eine Nicht-Agglutinierung auftritt, so zeigt sich dies in Form eines glatten Musters und im Fall des Röhren Tests zeigt sich die Nicht-Agglutinierung durch die Sedimentation des Indikators am Boden der Röhre, wobei diese Sedimentation entweder die Form eines Ringes oder eines Fleckes annehmen kann.
Die gleiche Art der Agglutinierung oder Hemmung der Agglntininierung ist für den Typus der chromatographischen Testung verantwortlich, wobei für den Fall, dass die getestete Probe ein spezielles Antigen oder einen Antikörper enthält, dann von der chromatographischen Lösung eine spezielle Wanderungseigenschaft gezeigt wird. Für den Fall, dass Agglutinierung auftritt, wird beim chromatographischen Test ein Fleck des Indikators auf einen geeigneten chromatographischen Träger, beispielsweise ein Filterpapier, aufgetragen und dann wird ein Tropfen der auf die Aussenseite des Antikörpers zu testenden Flüssigkeit an der gleichen Stelle aufgetragen und der Rand des Trägers wird mit der Entwicklerflüssigkeit, beispielsweise einer Salzlösung in Berührung gebracht.
Wenn die Probe den Antikörper enthält, dann agglutiniert der Indikator und bildet mit dem Antikörper ein Immunaggregat. Dieses Aggregat wandert nicht weiter, wenn die Entwicklerflüssigkeit vordringt und es wird nur eine geringe Ver änderung des Flecks auftreten. Wenn jedoch die Probe keinen Antikörper enthält, dann bildet sich kein Immunaggregat und der Indikator wandert dann weiter, sobald die Lösungsmittelfront fortschreitet, wobei sich ein Streifenmuster bildet. Bei der Ausführung eines Tests auf die Hemmung der Agglutinierung wird nach dem chromatographischen Testverfahren ein Fleck des Immunaggregates gebildet, indem man einen Tropfen einer Antikörper enthaltenden Lösung auf einen Tropfen der auf die Anwesenheit des Antigens zu testenden Probe wird dann auf den Fleck des Immunaggregats aufgetragen und man lässt eine Lösung im Trägermaterial aufsteigen.
Es ist auch möglich, den Rand des Trägermaterials direkt mit der Probe zusammenzubringen so dass das Antigen, falls es anwesend ist, mit dem Tropfen des Immunaggregats in Kontakt kommt. Falls die Probe das Antigen enthält, wird das Immunaggregat aufgrund der bevorzugten Reaktion zwischen Antikörper und Antigen zur Dissoziation gebracht und der Indikator wandert dann und bildet ein Streifenmuster.
Für den Fall, dass kein Antigen in der Probe anwesend ist, tritt natürlich keine Wanderung des Fleckes, der das Immunaggregat enthält, auf.
Die Erfindung soll anhand der Beispiele näher er iäutert werden. In den Beispielen werden die Teile als Gewichtsteile pro Volumen angegeben und die Pufferkonzentrationen werden in Molaritäten M angegeben, falls nicht ausdrücklich angeführt wird, dass andere Bezeichnungsweisen vorliegen.
Beispiel 1
Ein Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde erzeugt, indem man als Mikrobenzellen, Zellen der Brucella abortus verwendete und es wurde Bis-diazobenzidin (BDB) als Kupplungsmittel angewandt. Das erhaltene Mittel wurde dann mit menschlichem Choriongonadotropin (CGTH) das als Antigen diente, zu einem speziellen Indikator umgesetzt und dieser wurde dann auf ein aufsaugendes Trägermaterial in Verbindung mit dem Antikörper des CGTH aufgetragen und Harnproben wurden dann mit der so erhaltenen Testvorrichtung auf die Anwesenheit von CGTH geprüft. Dieser Indikator funktionierte nach dem in der Folge beschriebenen chromatographischen Mechanismus.
Herstellung des Reagens
Isotone Salzlösung:
Eine 0,850/oige Salzlösung wurde hergestellt, indem man 8,5 g Natriumchlorid in einem Liter destilliertem Wasser löste.
Phosphatpuffer: Eine 0,15-molare Pufferlösung eines pH-Wertes von 7 wurde hergestellt, indem man eine trockene Mischung aus 81 /o sekundärem Natriumphosphat (Na2HPO4) und 19 /o primärem Natriumphosphat (NaH2PO+) in destilliertem Wasser auflöste, bis der gewünschte pH-Wert erreicht war.
Bis-diazobenzidinlösung:
Zu 0,92 g Benzidin wurden 100 ml destilliertes Wasser und 6 ml 6-normale Salzsäure gegeben. Es wurden zusätzlich 100 ml destilliertes Wasser der Mi Mischung zugesetzt. Nach der Auflösung des Benzidins wurde die Lösung in einem Eis-Salzkühlbad auf 0 C abgekühlt. Sobald sich in der Lösung Eiskristalle zu bilden begannen, wurden 6,5 ml einer 100/oigen Lösung aus Natriumnitrit rasch unter Rühren zugesetzt. Das Rühren wurde so lange fortgesetzt, bis die Lösung gegenüber Stärkejodidpapier negativ reagierte. Während des Rührens wurde dafür Sorge getragen, dass die Temperatur niemals auf über etwa 10 C anstieg.
Dieses Material wies eine schwache Gelbfärbung auf. Bei der Zugabe des Phosphatpuffers veränderte sich die Farbe in rotbraun. Die blassgelbe Lösung war bei Zimmertemperatur zwischen 5 und 7 Stunden beständig, bei 40 C war sie etwa 7 Tage lang stabil.
Wenn diese Lösung gefroren wurde und bei -200 C aufbewahrt wurde, dann war sie 60 Tage hindurch beständig. Bei einer Lagerung bei -35" C war sie mindestens 6 Monate lang beständig.
Formalinisierung der Mikrobenzellen: Zellen der Brucella abortus wurden 72 Stunden lang bei 37 C auf Tryptose agar gezüchtet und dann wurde der Agar mit einer 0,050/oigen Salzlösung die 10/0 Formaldehyd enthielt, weggewaschen. Die Zellen wurden sofort mit Formaldehyd behandelt, indem man sie in einer Kochsalz-Formaldehyd-Lösung 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur (250 C) beliess. Die Zellen wurden dann gründlich gewaschen, um den Rest des Schutzmittels (Formaldehyd) zu entfernen. Das Waschen der Zellen der Brucella abortus wurde durchgeführt, indem man die Zellen in destilliertem Wasser suspendierte.
Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und erneut in destilliertem Wasser suspendiert, wobei diese Verfah rensschritte mehrmals wiederholt wurden. Die konservierten Zellen wurden dann gefärbt.
Färbung der formalinisierten Mikrobenzellen: 2 g der nass zusammengepackten formalinisierten Zellen der Brucella abortus, 1 ml 20/obiges Ferrosulfat und 5ml 10/obiges wässriges Hematoxylin, wurden 100 ml destilliertem Wasser zugesetzt und die Mischung wurde 24 Stunden lang ständig gerührt. Die Zellen wurden dauerhaft gefärbt und die Farbe laugte sich nicht aus.
Erzeugung des Mittels zur Herstellung des Indikators: (Formalinisierte Mikrobenzellen-BDB-CGTH) Zellen der Brucella abortus, die mit Hematoxilin wie oben beschrieben, gefärbt waren, wurden als Indikatorpartikeln herangezogen. Ein Volumen, das 0,5 g zusammengepackter gefärbter Zellen enthielt, wurde zu 10 ml einer Salzlösung gegeben, und dann wurden 12 ml Phosphatpuffer und 40 ml einer verdünnten BDB-Lösung, die durch Mischen von 8 ml der oben beschriebenen BDB-Lösung mit 32 mol Phosphatpuffer hergestellt wurde, zugegeben. Man liess die Kupplnngsreaktion unter ständigem Rühren 20 Minuten lang bei Zimmertemperatur (250 C) ablaufen.
Das so erhaltene Mittel wurde zur Herstellung eines Indikators verwendet, indem man es mit menschlichem CGTH, das von der Vitamerican Corp. Little Falls, New Jersey, erhalten wurde, in einer Menge von 20 mg CGTH pro 0,9 g der Zellen (bezogen auf deren Gewicht vor der Kupplung) umsetzte. Der erhaltene Indikator war ein brauner Komplex, der abzentrifugiert wurde. Da der Indikator auf einen saugfähigen Träger aufgetragen werden sollte, wurde ein Anteil von 0,1 g dieses Indikators in einem Mörser homogenisiert. Es wurde eine kräftige Mischung mit einem Tropfen 10/obigem Methiolat vorgenommen und 1 g Saccharosesirup (25 Gew.-O/o pro Volumen) wurde langsam zugegeben.
Herstellung des Antikörpers für das CGTH: Laboratoriumskaninchen wurden mit Injektionen aus menschlichem CGTH in Freund's komplettem Hilfsstoff in einer Reihe von Impfungen behandelt. Nach einem vorgegebenen Zeitraum wurde den Kaninchen Blut abgenommen und das Serum, das den Antikörper enthielt, wurde vom Gesamtblut abgetrennt. Das angewandte CGTlR kann irgendeines der käuflich erwobenen Präparate sein. Beonders nützlich ist dasjenige, das von der Vitamerican Corp. vertrieben wird, und das eine Aktivität von etwa 2000 bis 2500 internationalen Einheiten (I. U) pro mg aufweist.
Ein typisches Schema für die Injektionsbehandlung und die Abtrennung des Antikörpers ist das folgende: Eine Lösung, die 10 mg CGTH pro ml Salzlösung enthält, wurde mit gleichen Teilen Freund's komplettem Hilfsstoff gemischt, 1/10 (0,1 ml) der Mischung wurde in jeden Zehenballen eines Kaninchens injiziert, das 3 t/2 kg wog.
Am Ende eines Zeitraumes von 2 Wochen wurde eine erste Injektion von 0,5 ml einer Lösung verabreicht, die 5 mg CGTH pro ml Salzlösung enthielt. Die Injektion wurde intravenös gegeben. Zwei Tage nach der ersten Injektion wurde eine zweite verabreicht. Sieben Tage nach der letzten Injektion wurden dem Kaninchen Blutproben abgenommen. Das Antiserum wies einen Titer von 1:2560, bestimmt durch Hämagglutination, auf.
Testverfahren (chromatographisches Testverfahren): Ein Fleck des oben hergestellten Indikators wurde etwa in einer Entfernung von 19 mm vom Rand eines Stücks Filterpapier aufgetragen und ein Tropfen des obigen Antiserum wurde sodann aufgetragen, wo- bei sich ein Immunaggregat bildete. Der Rand des Papiers wurde dann mit einer normalen Harnprobe einer Nichtschwangeren in Kontakt gebracht. Als der Harn im Papier hochstieg, blieb der Fleck des Tmmunaggregats fest am Papier. Dies zeigte, dass das gebildete Im munaggregat durch die üblichen Harnbestandteile nicht zur Dissoziation gebracht wurde.
Ein anderer Streifen des Filterpapiers wurde wie oben beschrieben mit einem Fleck aus Immunaggregat versehen und der Rand des Papiers wurde in eine Harnprobe einer schwangeren Frau eingebracht, der Harn stieg im Papier hoch, ein Teil des Immunaggregats dissoziierte und bewirkte eine Streifenbildung oder eine Aufwärtswanderung des gefärbten Indikators aus dem Aggregatfleck, der entsprechenderweise an Farbintensität verlor.
Bei einem anderen Test wurden die Flecke des Immunaggregats auf verschiedenen Papierstreifen aufgetragen und dann wurden die Harnproben auf diese Streifen aufgetropft. Die Ränder der Streifen wurden dann in eine physiologische Salzlösung eingetaucht. Sobald die Salzlösung über die Flecken hinaus aufstieg, die mit dem Harn einer schwangeren Frau behandelt wurden, wanderte ein Teil des gefärbten Indikators mit, wobei sich ein Streifenmuster bildete. Eine relativ geringe Streifenbildung zeigte sich, wenn die Salzlösung über Flecken wanderte, die mit dem normalen Harn einer Nichtschwangeren behandelt wurden.
Testvorrichtungen wurden zum Testen des Vorhandenseins des Antikörpers für menschliches CGTH hergestellt, indem man Flecken des oben beschriebenen Indikators etwa 1,9 cm vom Rand eines Stückes Filterpapier auftrug. Ein Tropfen Kaninchenserum, das den Antikörper enthielt, wurde auf den Fleck des Indikators auf einen der Streifen aufgetragen und der Rand des Filterpapiers wurde in eine physiologische Salzlösung eingetaucht. Die Salzlösung wanderte über den Fleck, ohne dass eine Streifenbildung des Indikators auftrat, wodurch gezeigt wurde, dass sich ein unlösliches Immunaggregat gebildet hatte. Ein Tropfen normalen I(aninchenserums wurde in gleicher Weise mit dem Indikator getestet und es stellte sich heraus, dass ein Abwandern vom FIeck auftrat, wodurch gezeigt war, dass sich kein Immunaggregat gebildet hatte.
Der oben beschriebene Indikator zeigte auch Agglutinierung durch den Antikörper des menschlichen CGTK, wenn der Agglutiniertest nach dem System des Röhrchentests durchgeführt wurde, Diese Agglutinierungen konnten durch Zugabe geringerer Mengen einer CGTH enthaltenden Lösung zu dem Testmedium leicht gehemmt werden.
Bei der Herstellung der diagnostischen Zusammensetzungen auf einem aufsaugenden Trägermaterial un ter Verwendung eines Indikators, der Mikrobenzellen enthält, ist es wesentlich, dass das aus Zellen bestehende Material durch Behandlung mit einem Schutzmittel, wie oben beschrieben, stabilisiert wird.
Eine andere Indikatorvorrichtung kann hergestellt werden, indem man den oben beschriebenen Indikator mit dem Antikörper unter Bildung eines Immunaggregats mischt und einen einzigen Fleck auf eine Stelle, die vom Rand des Streifens entfernt ist, aufträgt und trocknet. Bei der Verwendung wird ein Tropfen einer Ilarnprobe auf diesen Fleck aufgetragen oder an einer Stelle aufgetragen, die sich zwischen diesem Fleck und dem Rand des Papiers befindet, worauf dann das Ende des Streifens in eine Salzlösung eingetaucht wird.
Wenn der Harn CGTH enthält, dann dissoziiert das Aggregat und der gefärbte Indikator wandert mit der Salzlösung und es bilden sich Streifen. Falls kein CGTH anwesend ist, tritt keine Veränderung auf.
Andererseits kann auch die Harnprobe als chromatographische Entwicklerflüssigkeit verwendet werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist die Testvorrichtung so geartet, dass das diagnostische Reagens in Form eines Streifens vorliegt, der beispielsweise dadurch hergestellt wird, dass man ein Band des Indikators und Antikörperaggregats etwa 15 mm vom langen Rand eines Eaton-Dikeman Filterpapiers Nr. 609, das die Dimension 13 cm X 26 cm aufweist, aufträgt und das Reagens bei Zimmertemperatur trocknen lässt und das Papier der Breite nach in Streifen zerschneidet und diese Streifen bis zu deren Verwendung in einem geeigneten Behälter aufbewahrt.
Man sieht, dass viele verschiedene Materialien als saugfähige Streifen bei dem beschriebenen Streifentest angewandt werden können. Beispielsweise können viele Arten chromatographischer Materialien angewandt werden und es können auch viele Arten chromatographischer Entwicklerflüssigkeiten verwendet werden.
Beispiel 2
Escherichia coli wurde als Indikatorteilchen zur Erzeugung eines Mittels zur Herstellung eines Indikators verwendet, wobei das Mittel aus Mikrobenzellen und BDB bestand. Dieses Mittel wurde durch Umsetzung mit CGTH in einen Indikator verwandelt, der zusammen mit dem Antikörper für CGTH angewandt wurde, wobei ein Agglutinationstest nach dem Plattentyp vorgenommen wurde und eine klinische Feststellung der Schwangerschaft wurde mit diesem Test durchgeführt.
Herstellung der Reagentien 0,850/obige Salzlösung:
Es wurden 68g Natriumchlorid in 8 Litern destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde bei einer atü und 3500 C 30 Minuten lang im Autoklaven behandelt. Sie wurde dann abgekühlt und bei 4" C aufbewahrt. Die Behandlung im Autoklaven wurde durchgeführt, um die Salzlösung zu sterilisieren.
1 0/oige Formaldehydlösung: eine 37Einige Formalinlösung wurde behandelt, indem man gepulvertes Calciumcarbonat zu der Lösung zusetzte und die Mischung 24 bis 28 Stunden lang stehen liess. Das überstehende Material wurde dann in einen anderen Behälter abgegossen und dreimal durch ein hochwertiges, weisses Filterpapier mit gecreppter Oberfläche abfiltriert. Wenn der pH-Wert unter 7 lag, dann wurde er durch Zugabe einer 0,loloigen NaOH Lösung auf 7 eingestellt. Eine ausreichende Menge dieser behandelten 370/0igen Formalinlösung wurde destilliertem Wasser zugesetzt, so dass sich eine 1 l0ige Lösung ergab.
Phosphatpufferlösung: es wurden 100 ml eines Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,4 hergestellt, indem man 80,8 ml einer Natriumphosphatlösung mit 19,2 ml einer Kaliumphosphatlösung bei 200 C mischte. Die Natriumphosphatlösung enthielt 53,726 g Na2HPO4 12H2O pro Liter destilliertem Wasser. Die Kaliumphosphatlösung enthielt 20,441 g KH2PO4 pro Liter destilliertem Wasser.
Bis-diazobenzidin (BDB):
0,640 g Benzidindihydrochlorid (Benzidin 2HCl) wurden in 100 ml einer 0,56 /0igen Salzsäurelösung in einem 250 ml Erlenmeyerkolben aus Pyrexglas gelöst.
Dieser Kolben wurde auf eine mit Eis gefüllte magnetische Rührvorrichtung gegeben und der magnetische Rührer wurde in die Lösung eingetaucht. Wenn die Temperatur 40C erreicht hatte, wurde ein 5 ml Anteil einer Natriumnitritlösung, die durch Zugabe von 0,68 g NaNO2 zu 10 ml Wasser hergestellt wurde, mit einer serologischen Pipette aufpipettiert und tropfenweise zu der Benzidinlösung während einer Zeit von 7 bis 10 Minuten gleichmässig zugegeben, wobei der magnetische Rührer mit einer Geschwindigkeit von 200 Umdrehungen pro Minute lief. Es wurde alle 4 bis 6 Sekunden ein Tropfen Natriumhydridlösung zugegeben, wobei die Natriumnitritlösung ebenfalls eine Temperatur von 40 C aufwies.
Die Lösung wurde kontinuierlich 20 Minuten lang gerührt, und nach dieser Zeit wurde sie sofort eingefroren und bei -60" C in einer Anzahl von 1 Gramviolen aufbewahrt. Die Lösung kann sich sogar bei einer Temperatur von 0 bis 5 C zersetzen und daher wurde sie eingefroren, damit sie stabil gehalten wurde. Sie kann dann erwärmt werden, wenn sie zur Verwendung gebraucht wird.
Antikörper für das CGTH.
Eine Emulsion, die 10 mg CGTH pro ml enthält, wurde hergestellt, indem man 100 mg gereinigtes CGTH in 5 ml der obigen Salzlösung löste und 5 ml des kräftig gemischten kompletten Freund's Hilfsmittel zugab und zur Herstellung einer Emulsion schüttelte.
Eine Menge von 0,2ml der Emulsion wurde in jede Fussballe eines gesunden Kaninchens injeziert, das sich in standardisierter Laboratoriumsumgebung befand, wobei das Kaninchen eine Gesamtmenge von 0,8 ml der Emulsion (8mg CGTH) injiziert erhielt.
Dem Kaninchen wurde dann eine Reihe von Injektionen verabreicht, wobei jede aus einer 0,5 ml Lösung bestand, die hergestellt wurde, indem man ausreichend gereinigtes CGTH in 0,85 /Oiger Salzlösung löste. so dass eine Konzentration von 5 mg pro ml erhalten wurde. Die Injektionen wurden in die Ohrvenen gegeben. Diese folgenden Injektionen wurden an den fol genden Tagen nach der ersten Emulsionsinjektion verabreicht und zwar am 22. Tag, am 24., 38., 40., 71.
und 73. Tag. Zwei Proben von 40 bis 50 ml Blut wurden dem Kaninchen durch Kardiapunktur sowohl am 50. als auch am 83. Tag entnommen. Die roten Blutkörperchen dieser Proben wurden vom Serum jeder Probe abgetrennt, indem man das Blut in einem Zen trifugierröhrchen bei etwa 25 C etwa 2 Stunden lang ausflocken liess und das darüberstehende Serum wurde dann in ein Röhrchen mit einem geringeren Durchmesser (weniger als 30mm) gegeben und das Röhrchen 30 Minuten lang in ein Wasserbad von 56" C gegeben.
10 mg mit Formaldehyd behandelter roter Blutkörperchen des Schafes (lyophilisiert) wurden dann pro ml der Serumprobe zugegeben und 15 Minuten bei 25 C gemischt, um heterophile Antikörper aus dem Serum zu adsorbieren. Das adsorbierte Serum wurde mittels Zentrifugieren von den roten Blutkörperchen getrennt, wobei während des Abzentrifugieres etwa die tausendfache Erdbeschleunigung herrschte.
Eine Menge von 40 ml zusammengepackter, roter Blutkörperchen des Schafes wurden für diese Adsorption hergestellt, indem man 200 mol frisches, rotes Schafblut, das in Alserver-Lösung dispergiert ist, abzentrifugierte und die darüberstehende Flüssigkeit entfernte und dann dreimal mit 0,850/oiger Salzlösung wusch, wobei pro Waschung 120 bis 200 ml Salzlösung angewandt wurden Zu den so erhaltenen roten Blutkörperchen wurden 460 ml der oben angegebenen Salzlösung und 500 ml einer 3obigen Formalinlösung des pH-Wertes 7,3 gegeben. Die dabei erhaltene Suspension wurde gemischt und man liess sie 18 bis 20 Stunden lang bei 370 C stehen.
Die roten Blutkörperchen wurden dann durch Zentrifugieren entfernt und sie wurden fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen, wobei bei jedem Waschvorgang etwa 200 ml destilliertes Wasser verwendet wurde. Es wurde dann eine ausreichende Menge an destilliertem Wasser zugegeben, so dass sich eine 100/oige Suspension der Zellen ergab. Diese Suspension wurde bei 40 C aufbewahrt bis sie dann zur Adsorption verwendet wurde.
Mikrobenzellen: Die Zellen der Escherichia coli wurden erhalten, indem man einen Darmabstrich eines toten Laboratoriumskaninchens in einer Hirn-Herz-Infusionsbrühe (HHI-Brühe) züchtete. Ein Volumen von 68 ml einer gut gewachsenen Kultur (18 Stunden) wurde verwendet, um 3 Liter der Him-Herz-Infusionsbrü- he zu beimpfen, wobei die Brühe vor der Impfung auf Sterilität geprüft wurde. Die Zellen wurden 41/2 Stunden lang bei 37 C unter Schütteln bebrütet. Die so erhaltenen Zellen wiesen einheitliche Grösse und Form auf.
Herstellung des Indikators
Die drei Liter an suspendierten Escherichia coli Zellen wurden mit 10l000 Umdrehungen pro Minute 10 Minuten lang abzentrifugiert, um die überschüssige Flüssigkeit von den zusammengepackten Zellen zu isolieren. Das darüberstehende Material wurde abgegossen und die zurückbleibenden zusammengepackten Zellen wurden mit etwa 45 ml einer Formaldehydlösung, die mit 37 /o Calciumcarbonat behandelt war, zusammengebracht, um eine Tötung der Escherichia coli zu gewährleisten.
Man liess das Formalin mit den Zellen eine Stunde lang in Berührung und nach dieser Zeit wurden die Zellen dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und dann in 1600 ml einer 1 /oigen Formaldehydlösung 21 Stunden lang bei Zimmertemperatur (25 C) suspendiert. Diese Zellen wurden dann abzentrifugiert und als zusammengepackte, mit Schutzmittel behandelte Zellen isoliert. Die zusammengepackten Zellen wurden dann erneut mit 500 ml der oben beschriebenen Salzlösung suspendiert und bei 4" C aufbewahrt. Die Konzentration der Zellen betrug 4a/o, wie eine Messung mit einem Hämatokrit ergab.
Ein Teil der oben beschriebenen Suspension der Zellen wurde zentrifugiert, um ein Volumen an zusammengepackten Zellen zu gewinnen und 0,5 ml dieser zusammengepackten Zellen wurden entfernt und 10 ml der oben beschriebenen Salzlösung zugegeben, der vor/ her 12 ml Phosphatpuffer und 40 ml verdünnte BDB-Lösung zugegeben worden waren. Die verdünnte BDB-Lösung wurde hergestellt, indem man 8 ml BDB mit 32 ml Phosphatpuffer zusammenbrachte. Das so erhaltene Mittel zur Herstellung eines Indikators wurde durch Umsetzung mit 20 mg CGTH in einen speziellen Indikator umgewandelt. Das CGTH hatte eine Aktivität von 36 000 internationalen Einheiten pro mg und wurde bei der Vitamerican Copr. gekauft.
Diese Mischung wurde kontinuierlich 5 Minuten lang bei Zimmertemperatur geschüttelt und dann wurde der gebildete Indikator durch Zentrifugieren gewonnen und dreimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und sodann zentrifugiert und erneut in einer 1:50 Verdünnung von Rinder-Serumalbumin (3O0/o) in der obigen Salzlösung suspendiert. Das Rinder-Serumalbumin (BSA) wurde bei der Armour & Co. erworben.
Die erhaltene Suspension des Indikators zeigte eine bräunliche Farbe und es stellte sich heraus, dass sie über weite Temperaturbereiche stabil war.
Vorprüfung des Indikators
Zur Bestimmung der geringsten feststellbaren Mengen an CGTH wurden normale Harnproben hergestellt, indem man ihnen bekannte Mengen an CGTH zusetzte. Der oben hergestellte Indikator wurde dann zusammen mit dem obigen Antikörper für CGTH (AkCGTH) zur Durchführung eines Agglutinationstests nach dem Plattentyp angewandt.
Bei dieser Prüfung wurde der obige Indikator erneut in ausreichender Menge an 1:50 BSA-Salzlösung resuspendiert, wobei eine 80/obige Zellenkonzentration erhalten wurde. Darauffolgend wurden drei Lösungen der oben beschriebenen Antikörperlösung hergestellt, indem man einen Teil der Antikörperlösung mit 250 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung sowie mit 500 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung und ferner mit 1000 Teilen der oben beschriebenen Salzlösung verdünnte. Diese Verdünnungen wurden als 1:250, 1:500 und 1:1000 bezeichnet.
Harnproben jeder der folgenden Konzentrationen an CGTH wurden hergestellt, indem man 0,25 ml einer Vorratslösung aus 4mg CGTH pro ml Salzlösung (3600 internationale Einheiten pro mg) zu 100 mol einer Harnprobe einer nichtschwangeren Frau zugab und dann in der Serie mit Salzlösung 2,25, 4,5, 6, 9, 18 und 36 internationalen Einheiten CGTH pro ml Harn und Salz verdünnte.
Ein Teil dieser Harnprobe wurde dann als Leerwert aufbewahrt.
Ein Tropfen jeder dieser Harnproben wurde mit einem Tropfen der geeigneten Antikörperverbindung gemischt und die Mischung wurde auf eine Platte aufgetragen. Dann wurde ein Tropfen der oben beschriebenen 80/obigen Suspension des Indikatorsystems den Zellen, die sich bereits auf der Platte befanden, zugesetzt und gemischt. Die Ergebnisse dieser Testreihe werden in der unten angeführten Tabelle 1 angegeben. In dieser Tabelle bedeutet - Agglutination und daher ein körniges Aussehen in der Suspension auf der Platte, während + ein glattes, nicht agglutiniertes Muster auf der Platte bedeutet.
Tabelle 1 CGTH-Konzentration Verdünnungen an CGTH-Antikörpern im Harn in internat.
Einheiten pro ml 1:250 1:500 1:1000 0 (Leerwert) - - -
22
2,25 - - -
4,5 - - +
6,0 - + +
9,0 + + +
18,0 + + +
36,0 + + +
Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, dass für den Fall, dass kein CGTH in der Harnprobe anwesend ist, Agglutination eintritt. Diese Erscheinung ist darauf zurückzuführen, dass die Harnprobe kein CGTH enthält, das bevorzugt mit dem Antikörper des CGTH reagieren könnte, so dass der Antikörper des CGTH mit dem Indikator agglutiniert und das körnige Aussehen der balligen oder klumpigen Zellen auf dem benetzten Teil der Platte liefert.
Wenn man 2,25 internationale Einheiten CGTH pro ml einer Harnprobe zusetzt, dann ist noch immer genug CGTH Antikörper in dem System anwesend, dass bei Umsetzung des gesamten CGTH noch eine ausreichende Menge an CGTH-Antikörper anwesend ist, der ein Zusammenballen der Zellen oder eine Agglutination selbst bei einer Verdünnung von 1:1000 liefert. Wenn Harnproben, die 4,5 internationale Einheiten CGTH pro ml enthalten, mit drei Verdünnungen an Antikörper des CGTH's getestet wurden, dann setzt sich der Antikörper mit dem CGTH bei Verdünnungen zwischen 1:500 und 1:1000 vollständig um, so dass das Aussehen bei einer Verdünnung von 1:1000 nicht körnig ist, sondern ein glattes Muster von suspendierten Indikatorzellen geliefert wird, d. h., dass in diesem Fall keine Agglutination auftritt.
Man sieht, dass mit 6,0 internationalen Einheiten an CGTH pro ml die nötige Menge an Antikörper zwischen den Verdünnungen von 1:250 und 1:500 liegt, wie dies auch zu erwarten war, da eine grössere Menge an CGTH anwesend ist und daher auch eine grössere Menge an Antikörper der CGTH's notwendig ist, um eine vollständige Reaktion mit dem CGTH hervorzurufen. In diesem Fall tritt daher das körnige Muster bei einer Verdünnung von 1:250 auf. Aus Tabelle 1 sieht man, dass sehr geringe Mengen an CGTH im Harn, nämlich etwa 4,5 internationale Einheiten CGTH pro ml dann festgestellt werden können, wenn man geringe Konzentrationen an Antikörper des CGTH's im Testsystem, nämlich Verdünnungen von 1:10000 oder weniger, anwendet.
Es hat sich auch herausgestellt, dass durch eine Verdoppelung der Harnmenge, nämlich durch eine Verwendung von zwei Tropfen, Konzentrationen an CGTH, die nur 2 internationale Einheiten CGTH pro ml betragen, festgestellt werden können.
Um die genauen Zeiten, die zur Entwicklung des körnigen Musters in einem Bereich von CGTH-Antikörperkonzentrationen und Zellkonzentrationen festzustellen, wurden die folgenden zusätzlichen Tests aufgeführt.
Anteile des Indikators wurden in einer ausreichenden Menge der oben beschriebenen BSA 1:T0 Verdünnung in Salzlösung wieder suspendiert, so dass Konzentrationen von 0,6250/0 1,250/0, 2,50/o und 50/o Zellen erhalten wurden. Sodann wurde eine Verdünnungsreihe an CGTH-Antikörperlösungen mit Hilfe der obigen BSA hergestellt und zwar 1:50 in Salzlösung, so dass die Verdünnungen 1:125, 1:250, 1:500, 1:1 000, 1:2 000, 1:4 000, 1:8 000 und 1:16 000 erhalten wurde. Vier Tropfen jeder der CGTH-Antikörperverdün- nungen wurden in getrennten Parallelenreihen auf die Oberfläche einer kreuzweise schraffierten Glasplatte aufgetragen. Dem ersten Tropfen jeder dieser Verdünnungen wurde ein Tropfen der niedrigsten Konzentration der Indikatorzellsuspensionen zugesetzt.
Dem zweiten Tropfen jeder Verdünnung des CGTH-Antikörpers wurde ein Tropfen einer 1,250/oigen Suspension zugesetzt und den dritten und vierten Tropfen jeder der Verdünnungen ein Tropfen der 2,50/oigen, bzw.
50/oigen Zellsuspensionen zugefügt. Die dabei erhaltenen Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt, wobei die Zeit bis zur Entwicklung eines körnigen Agglutinationsmusters für jede Testmischung in Sekunden angegeben ist.
Die Bezeichnung S in der Tabelle zeigt an, dass in diesem Fall eine ungenügende Menge an CGTH-Antikörper in der Antikörperverdünnung anwesend war, so dass in diesem Fall keine Agglutination der Zellen auftrat und daher das Muster glatt blieb.
Tabelle 2
Agglutinationszeiten in Sekunden Konzentrationen Verdünnung an CGTH-Antikörpern des Indikatorsystems, /o 1:125 1:250 1:500 1:1000 1:2000 1:4000 1:8000 1:16000
0,625 34 50 213 85 107 280 S S
1,25 31 30 36 58 56 150 120 S
2,5 25 31 43 62 92 140 S S
5,0 35 30 55 60 75 S S S
Die in Tabelle 2 angeführten Agglutinationszeiten zeigen, dass eine relativ kurze Zeitperiode notwendig ist, um die Agglutination festzustellen, wobei Agglutination beim tatsächlichen Test dann die Abwesenheit von Schwangerschaft bedeutet. Aus diesem Grunde kann Schwangerschaft nach dem Plattenagglutinationstest mit dem obigen Indikatorsystem in einer Zeit von etwa einer Minute oder in noch kürzerer Zeit festgestellt werden.
Dies ist ein wesentlich kürzerer Zeitraum als derjenige, der bei den Röhrchen-Agglutinationssystemen angewandt werden muss, die auf der Verwendung von roten Blutkörperchen beruhen. Auch die Muster, durch die die Erscheinung der Agglutination von dem Fehlen der Agglutination unterschieden wird, sind sehr klar gezeichnet und es gibt praktisch bei diesen Tests keine unklaren, dazwischenliegenden Muster, bei denen es zweifelhaft ist, ob Agglutination oder keine Agglutination auftreten kann. Es ist daher möglich, die Reagentien so auszuwählen, dass genau bestimmte Muster für die Diagnose der Schwangerschaft erhalten werden können.
Tabelle 2 zeigt auch, dass ein weiter Bereich an CGTH-Antikörperverdünnungen angewandt werden kann, und dass auch ein weiter Bereich an Indikator Konzentrationen verwendbar ist. Die Konzentration des Indikators in BSA 1:50 Verdünnung in Salzlösung kann bei einem verwendbaren Testsystem im Bereich von weniger als 10/o bis etwa 120/0 liegen.
Zur Prüfung des Indikators des Beispiels 2 mit tatsächlichen Harnproben wurden 16 Harnproben von 16 nichtschwangeren Frauen gewonnen, wobei 4 dieser Frauen unter einer regelmässigen Behandlung mit Empfängnis-verhütenden Pillen standen. Die Testmethode war die gleiche wie die oben angegebene. Dies heisst, ein Tropfen der Harnprobe wurde mit einem Tropfen einer 1:1000 CGTH-Antikörperverdünnung gemischt und dann wurde ein Tropfen dieser Mischung auf eine Glasplatte gegeben und ein Tropfen einer 40/obigen Suspension des oben beschriebenen Indikators wurde der Mischung, die bereits auf der Platte anwesend war, zugegeben. In all diesen 16 Fällen, bildete sich ein körniges Muster, das Agglutination anzeigte, und deshalb der Test anzeigte, dass keine Schwangerschaft vorlag.
Dieses Testergebnis zeigt an, dass falsche, positive Resultate nicht zu den Schwierigkeiten des obigen Indikators gehören, und dass für diese spezielle Art der Testung Hormonspiegel, die durch Schwangerschaftswerhütende Pillen hervorgerufen werden, nicht stören.
Klinischer Test unter Verwendung eines Indikators
31 gefrorene Harnproben wurden verwendet, und die Tests wurden ausgeführt, wobei die Gesundheitsbedingungen der Patienten, von denen diese Proben genommen wurden, unbekannt waren. Ein bekannter Harn einer Schwangeren wurde als Kontrollwert mitaufgenommen und ebenso ein Harn einer Nichtschwangeren als weiterer Konfroflwert Die Plattentests wurden in der oben beschriebenen Weise durchgeführt und mit Plattentests verglichen, die mit den gleichen ETarn- proben aber mit einem käuflich erhältlichen Plattentest zur Bestimmung der Schwangerschaft, der aus einem Indikator aus Latexpartikeln in Kombination mit CGTH bestand, durchgeführt.
Der Indikator wurde als 4zeigte Suspension verwendet. Die Antikörperlösung bestand aus einer 1:1000 Verdünnung der oben beschriebenen Antikörperlösung in Kochsalzlösung. Das Testverfahren bestand darin, dass man einen Tropfen jeder Harnprobe mit einem Tropfen der Antikörperlösung vermischt und dann je einen Tropfen dieser Mischung auf eine reine Glasplattenoberfläche gab und dann einen Tropfen einer 40/oigen Indikatorsuspension zusetzte und mischte. Die Ergebnisse wurden mit + als positiv bezeichnet, d. h.
es zeigte sich ein glattes Muster, durch das angezeigt war, dass die Agglutination gehemmt war und daher dieses Ergebnis einen positiven Test auf Schwangerschaft darstellte. Mit negativ, also mit einem - Zeichen wurde die Anwesenheit eines körnigen Musters bezeichnet, dh. eines Musters, das Agglutination zeigte und daher anzeigte, dass keine Schwangerschaft vorlag.
Der Test mit dem käuflich erhältlichen Testsystem wurde genau nach den oben auf der Packung angegebenen Instruktionen durchgeführt und die Ergebnisse wurden als schwanger und nichtschwanger mit plus und minus bezeichnet. Diese Ergebnisse sind in der unten angeführten Tabelle 3 aufgeführt.
Tabelle 3
Klinische Studien der Ergebnisse
Käuflich Unbekannte erhältliches Urinprobe Indikator des Schwangerschafts
Nr. Beispiels 2 testsystem
1 + -
2 + ¯
3 + +
4 + +
5 + +
6 + -
7 + +
8 + kein Versuch
9 + +
10 +
11 +
12 + +
13 + +
14 + +
15 + +
16 + -
17 +
18 +
Tabelle 3 (Fortsetzung)
Klinische Studien der Ergebnisse
Käuflich Unbekannte erhältliches Urinprobe Indikator des Schwangerschafts.
Nr. Beispiels 2 testsystem
19 + +
20 +
21 + +
22 + kein Versuch
23 +
24 + +
25 +
26 + +
27 + +
28 + +
29 + +
30 + kein Versuch
31 + kein Versuch
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, dass bei Durchführung des Testes mit Hilfe des Indikators nach Beispiel 2 alle Harnproben als Harnproben von schwangeren Frauen beurteilt wurden. 11 der 27 Harnproben, die mit dem käuflich erhältlichen Testsystem durchgeführt wurden, zeigten negative Ergebnisse, d. h.
gemäss diesem Test sollten diese Harnproben von nichtschwangeren Frauen stammen. Es wurde dann von der die Proben liefernden Stelle bekannt gegeben, dass alle unbekannten Harnproben von schwangeren Frauen stammten, wobei die Proben im Zeitraum zwischen wenigen Wochen Schwangerschaft und 8 1/2 Monaten Schwangerschaft abgenommen wurden.
Der bekanntermassen von einer Schwangeren stammende Harn und bekanntermassen von einer Nichtschwangeren stammende Harn wurden nur mit dem Indikator des Beispiels 2 getestet und deshalb wurden diese Werte nicht in der Tabelle 3 aufgenommen. Die Ergebnisse bei diesen beiden Tests waren jedoch wie erwartet, d. h. negativ für den Harn der Nichtschwangeren und positiv für den Harn der Schwangeren, die sich in der 8. Woche der Schwangerschaft befand.
Beispiel 3
Das Mittel zur Herstellung des Indikators wurde hergestellt, indem man zuerst Zellen der Escherichia coli einer Pufferlösung zugab und dann eine BDB-Lösung unter Bildung des Mittels zusetzte. Zur Herstellung eines Indikators wurde dann eine CGTH-Lösung zugefügt, und die Kupplungsreaktion wurde dann ausgeführt.
Herstellung der Reagentien
Salz-Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7. Es wurden 150 ml einer sekundären Natriumphosphat Kochsalzlösung (Na2HPO4) mit Hilfe von 75 ml einer primären Natriumphosphat-Salzlösung (NaH2PO4) auf einen pH-Wert von 7,0 gebracht Die erste Lösung wurde hergestellt, indem man 150ml einer 0,5-molaren NayHPO4 7H2O-Lösung mit 350 ml destilliertem entionisiertem Wasser und 500ml einer 0,850/oigen Kochsalzlösung mischte. Die primäre Natiumphosphat-Kochsalzlösung wurde hergestellt, indem man 150 ml einer 0,5 molaren NaH2PO4 H2O-Lösung mit 350 ml destilliertem, entionisiertem Wasser und 500 ml einer 0,850/ oigen Salzlösung mischte.
Salzphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5.
Es wurden 180ml der oben beschriebenen sekundären Natriumphosphat-Kochsalzlösung mittels der oben beschriebenen primären Natriumphosphat-Kochsalzlösung auf einen pH-Wert von 7,5 gebracht.
BDB-Lösung: Es wurden 1 Vol.-Teil einer 0,025molaren Benzidinhydrochloridlösung (Benzidin . 2HCl) in 0,36 molarer HCI einem Volumen einer 0,1-molaren NaNO2-Lösung in destilliertem entionisiertem Wasser zugesetzt und man liess die erhaltene Mischung zwei Minuten lang reagieren. Dann wurde die Mischung auf einen pH-Wert von 7 gebracht, indem man gleiche Volumina der Mischung des oben beschriebenen Salz Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7 und 0,31 molare NaOH in destilliertem Wasser zugab. Sofort nachher wurden 6 ml und 2 ml Anteile der BDB-Lösung in Behälter gegeben, die verschlossen und versiegelt wurden und bei -83 C eingefroren wurden. Diese BDB-Lösungen wurden bei Verwendung bei +40 C aufgetaut.
Zellen der Escherichia coli: die Zellen der Escherichia coli wurden in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise mit Formaldehyd behandelt und dann zu einer 1,40/oigen Zellsuspension verdünnt und diese wurde in 50ml Zentrifugengläser pipettiert und mit 3100 Umdrehungen pro Minute 15 Minuten lang zentrifugiert.
Das darüberstehende Material wurde dann verworfen und die zusammengepackten Zellen wurden erneut suspendiert, indem man sie zuerst mit einem Vortex mischte, bis das Produkt glatt erschien und dann wurden 20 ml der Salzlösung des Beispiels 2 zugegeben.
Die Zellen wurden dann abzentrifugiert und das dar überstehende Material verworfen. Diese Saizwaschung wurde bei zwei weiteren Waschungen zweifach durchgeführt. Eine Menge von 0,2ml der erhaltenen zusammengepackten Zellen wurde in 2 ml der oben beschriebenen Salzlösung suspendiert. Diese Suspension wurde dann eine Stunde lang bei 40 C aufbewahrt. Nach dieser Zeit wurden 2ml einer 1:5 Verdünnung der obigen BDB-Lösung in der Phosphatlösung des Beispiels 2 zugegeben und die Mischung wurde in eine Rotationsschüttelapparatur bei 4 C gegeben und 30 Minuten lang im Dunkeln geschüttelt. Die Zellen wurden dann 5 Minuten lang bei 40 C abzentrifugiert und zweimal mit 4 ml einer kalten-Salz-Phosphatpufferlösung, deren pH-Wert 7m5 betrug, gewaschen, wobei sich eine relativ stabile Suspension bildete.
Daraufhin wurden 1,6ml des kalten Salz-Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,8ml CGTH in 6 ml einer Salzlösung, die 4 mg Kochsalz pro ml enthielt, zu der Zellsuspension zugefügt. Der hierbei erhaltene Indikator wurde zur Testung vorbereitet, indem man die Mischung einmal mit 25ml BSA 1:50 in Salzlösung wusch und bei 300 Umdrehungen pro Minute 5 Minuten lang abzentrifugierte und das Material in einem Vortex-Mischer erneut suspendierte.
Eine 0,9 ml Lösung von BSA 1:50 in Kochsalzlösung wurde dann zugegeben, um den Indikator erneut zu suspendieren, worauf es dann in einem Kühlschranl gelagert wurde. Ein Anteil von 0,3ml dieses obigen Präparats wurde bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang auf der Schüttelmaschine geschüttelt. Die Suspension wurde dann eine Stunde lang bei 37"C auf einer Schüttelmaschine behandelt. Die Suspension wurde zweimal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen und einmal mit BSA 1:50 in Salzlösung gewaschen. Die Zellen wurden dann erneut zu 0,3 ml in BSA 1:50 in Salzlösung suspendiert, wobei eine 100/oige Zellenkonzentration erhalten wurde.
Ein indirekter Agglutinationstest wurde dann durchgeführt, indem man einen Tropfen der Zellensuspension mit einem Tropfen jeder der Antikörperlösungen mit steigender Verdünnung vermischte. Die Verdünnungen waren 1:250, 1:5001 und 1:10001. Ein glattes Muster zeigte eine gute, indirekte Agglutination an und ein derartiges Muster zeigte sich bei beiden Verdünnungen 1:1000. Wenn auch dieses Muster nicht so stark war, wie die beiden anderen, wurde es als glatte Agglutination betrachtet. Dies zeigt, dass das erfindungsgemässe Mittel getrennt hergestellt und aufbewahrt werden kann und zur Kupplung von Antigenma terialien verwendet werden kann, die nachher zur Testung herangezogen werden können.
Beispiel 4
Ein Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde aus Hefezellen und BDB erhalten.
Bei Zugabe von menschlichem CGTH zu diesem Mittel konnte die Kupplung des menschlichen CGTH an Hefezellen mit Hilfe des chemischen Kupplungsmittels BDB erreicht werden. Der dabei erhaltene Indikator wurde in Kombination mit dem Antikörper für CGTH zur Ausführung eines Tests auf die Hemmung der Agglutination verwendet.
Ein Gramm der Hefe Saccharomyces cerevisiae wurde ausgewogen und dreimal mit 200ml der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen. Die agewandte Hefe war diejenige, die unter dem Handelsnamen Fleischmanns aktive Trockenhefe vertrieben wird.
Die Hefezellen wurden dann wieder suspendiert, und zwar in 400 ml einer 10/o Formaldehyd enthaltenden Kochsalzlösung. Man liess die Suspension bei Zimmertemperatur 24 Stunden lang unter manchmaligem Umschütteln stehen. Die Zellen wurden dann mit 2000 Umdrehungen pro Minute, während einer Zeit von 10 Minuten abzentrifugiert und die zusammengepackten Zellen entfernt und in 200 ml der oben beschriebenen Salzlösung bei 40 C aufbewahrt. Bei der Messung im Hämatokrit zeigte die Suspension einen Wert von 1,40/0.
Zu 0,5 ml der zusammengepackten, mit Formaldehyd behandelten Hefezellen wurden 12ml des oben beschriebenen Phosphatpuffers und dann 6ml einer Kochsalzlösung zugegeben, und dann wurden die Zellen mit 40ml einer 1:5-Verdünnung der obigen BDB-Lösung zusammengebracht. Das so erhaltene Mittel wurde mit CGTH zu einem Indikator umgesetzt, dieser wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und drei.
mal mit der oben beschriebenen Salzlösung gewaschen, wobei nach der Waschung die zusammengepackten Zellen erneut in einer BSA-Salzlösung der Verdünnung 1:50 suspendiert wurden. Die erhaltenen Suspension zeigte im Hämatokrit einen Wert von 60/o.
Die 60/obige Zellsuspension wurde dann mit CGTH-Antikörper einer Verdünnung von 1:500 verwendet, um zwei Harnproben auf die Anwesenheit von CGTH zu prüfen. Ein Anteil von 0,2ml der 60/obigen Zellsuspension wurde einmal gewaschen und mit BSA 1:50 in Kochsalzlösung auf die übliche Konzentration verdünnt, um ein Endvolumen von 0,2 ml zu erreichen. Ein Tropfen eines Harns einer Frau, von der bekannt war, dass sie schwanger ist, wurde mit einem Tropfen der CGTH-Antikörperlösung gemischt und die Mischung wurde 2 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde ein Tropfen dieser Mischung auf eine Glasplatte gegeben. Ein Tropfen des Indikators wurde mit dem auf der Glasplatte befindlichen Material gemischt. Es bildete sich ein glattes Muster, das das Vorhandensein einer Schwangerschaft anzeigte.
Der Test wurde mit dem Harn einer Nichtschwangeren wiederholt und in kurzer Zeit bildete sich ein körniges agglutiniertes Muster.
Dieses Beispiel zeigt, dass Hefezellen als Indikatorpartikeln in einem Mittel bzw. einem daraus hergestellten Indikator verwendet werden können. Diese Zellen bringen den Vorteil mit sich, dass sie in trockener, stabiler Form käuflich erworben werde können.
Beispiel 5
Ein Mittel zur Erzeugung eines Indikators wurde hergestellt, indem man Escherichia coli als Mikrobenzellen verwendete und ein Carbodiimid als Kupplungsmittel anwandte. Bei der Herstellung eines Indikators aus diesem Mittel wurde CGTH als Antigensubstanz verwendet. Dieser Indikator wurde sowohl zur Prüfung der Agglutination als auch zur Prüfung der Hemmung der Agglutination verwendet.
Herstellung der Reagentien
Mikrobenzellen: die Zellen der Escherichia coli wurden wie in Beispiel 2 gezüchtet, aus dem Zuchtmedium isoliert und mit Formaldehyd behandelt. Ein Volumen von 20 ml einer 2,5obigen Suspension wurde auf diese Weise hergestellt. Diese Suspension wurde abzentrifugiert und 0,5 ml der zusammengepackten Zellen wurden zur Herstellung des Indikatorsystems verwendet.
Kupplungsmittel: es wurden 0,2g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid in 0,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und dann wurden 1,0ml destilliertes Wasser zu der Lösung zugegeben.
Antigensubstanz: es wurden 40 mg CGTH in 2ml destilliertem Wasser gelöst. Das verwendete CGTH hatte eine Aktivität von 2590 internationalen Einheiten pro mg und wurde bei der Vitamerican Corp., Little Falls, New York erworben.
Lösung des CGTH-Antikörpers: Anteile der Antikörperlösung und der 0,85 /0igen Kochsalzlösung, die nach Beispiel 2 hergestellt wurde, wurden verwendet, um Verdünnungen des CGTH/Antikörpers von 1:50, 1:100 und 1:200 herzustellen.
Dieses Beispiel zeigt, dass Carbodimid als Kupplungsmittel zum Binden der Antigensubstanz an die Mikrobenzellen verwendet werden kann.
Zur Herstellung weiterer Indikatoren wurden als Antigene menschliches Serumalbumin (human serum albumin = HSA) und Pferde y-globulin verwendet.
Beispiel 6
Die Indikatoren und die Agglutinationstests des Beispiels 5 wurden mit gleichen Resultaten wiederholt, indem man N-t-Butyl-5-methylisoxazolium perchlorat anstelle von Carbodiimid als Kupplungsmittel verwendete.
Dieses Kupplungsmittel wurde verwendet, indem man 10 ml einer 2,50/oigen Suspension der mit Formaldehyd behandelten Zellen des Beispiels 2 anwandte und 5 bis 10 Minuten lang zentrifugierte, um die dar überstehende Lösung zu entfernen. Die Zellen wurden dann viermal mit kaltem Wasser gewaschen und wieder suspendiert und zwar in 20ml einer 0,10/obigen Natriumbicarbonatlösung in destilliertem Wasser. Eine Menge von 3 mg Bernsteinsäureanhydrid wurde dann zugegeben und die Zellen wurden über Nacht bei 4" C geschüttelt. Die Zellen wurden zentrifugiert und noch dreimal mit Wasser gewaschen, worauf dann die succi nilierten Zellen in 5 ml destilliertem Wasser wieder suspendiert wurden. Eine Pipette wurde verwendet, um den Zellen 10 Mikroliter Triäthylamin zuzugeben.
Sodann wurden 17 mg N-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat zugegeben. Dieses Kupplungsmittel ist unter dem Namen Woodward's Reagenz L bekannt.
Das so gebildete Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators wurde verwendet, um die im Beispiel 5 beschriebenen Antigene in den dort angegebenen Mengen zu kuppeln. Menschliches Serumalbumin und Pferde-y-globulin wurden an die Zellen der Escherichia coli nach dem oben angeführten Verfahren gekuppelt, wobei eine Umsetzung mit 1:10 des Kaninchen-Antikörpers bezüglich menschlichen Serumalbumins und eine Umsetzung mit 1:10 des Kaninchenantikörpers gegen Pferde-y-globulin jeweils Agglutination lieferte. Keine Agglutination wurde hingegen hervorgerufen, wenn normales Kaninchenserum 1:10 verwendet wurde.
Beispiel 7
12 verschiedene Indikatoren wurden hergestellt, indem man gemäss Beispiel 2 die Formaldehydbehandlung der Mikrobenzellen durchführte und die Kupplung des Antigens an diese Mikrobenzellen mit Hilfe BDB durchführte. Es wurden die folgenden Mikrobenzellen verwendet: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii und Pseudomonas fragi und die Antigene, die in Kombination mit diesen Indikatorpartikeln angewandt wurden, waren menschliches Serum- albumin, Pferde-y-globulin und menschliches Insulin.
Agglutinationstests nach dem Plattentyp wurden durchgeführt.
Der Bacillus subtilis und der Bacillus pumilus wurden in der gleichen Weise gezüchtet, wie für die Zellen der Escherichia coli in Beispiel 2 beschrieben wurde.
Der Lactobacillus leichmannii wurde während der gleichen Zeit unter der gleichen Temperatur von 370 C auf einer Brühe gezüchtet, die wie fogt zusammengesetzt war: 890 ml Wasser, 100 mol Tomatensaftfiltrat,
10ml Bacto-Tween 80 , 7,5g Hefeextrakt, 7,5g Peptone, 10 g Dextrose und 2 g sekundäres Natriumphosphat. Die Brühe wies einen pH-Wert von 6,8 auf und war im Autoklaven 10 Minuten lang bei 1210 C unter einem Druck von 1 atü zur Sterilisierung behandelt worden.
Die Zellen der Pseudomonas fragi wurden 4 1/2 Stunden lang bei Zimmertemperatur (250 C) in einer vorher sterilisierten Brühe gezüchtet, die aus 1 Liter Wasser, 5 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 1 g Dextrose und 1g sekundärem Natriumphosphat bestand.
Die gewonnenen Zellen wurden mit Formalin behandelt und 0,25ml des zusammengepackten Zellenvolumens jeder der beschriebenen Zellen wurden für das in Beispiel 2 beschriebene Kupplungsverfahren verwendet. Es wurden hiezu drei Ansätze jeder dieser Zellen in 6ml des in Beispiel 2 beschriebenen Phosphatpuffers suspendiert und zu jeder Portion der suspendierten Zellen wurden die folgenden Antigene zugegeben, die in 5 mol einer 0,85 /oigen Kochsalzlösung gelöst waren. Als Antigene wurden verwendet: 3mg menschliches Serumalbumin, 40mg Pferde-y-globulin und 20 mg Insulin. Dann wurden 20ml einer 1:5 Verdünnung der BDB-Lösung des Beispiels 2 in Phosphatpuffer zugegeben, um ähnliche Kupplungsreaktionen durchzuführen.
Jeder der 12 genannten Indikatoren wurde mit den entsprechenden Antikörpern und mit gewöhnlichem Serum als Vergleichsversuch getestet. Die Indikatoren, die menschliches Serumalbumin bzw. Pferde-y-globulin enthielten, wurden mit einer 1:50 Verdünnung des im Kaninchen gebildeten Antikörpers für menschliches Serumalbumin bzw. des im Kaninchen gebildeten Antikörpers für Pferde-y-globulin in Salzlösung getestet.
Die Insulin-Indikatorsysteme wurden mit einem unverdünnten Insulin-Antikörper enthaltenden Meerschweinchenserum in Salzlösung getestet. Die Vergleichsversuche jedes der 12 Tests wurden durchgeführt, indem man eine 1:10 Verdünnung eines gewöhnlichen Kaninchenserums in Kochsalzlösung prüfte. Die jedem der Antigene entsprechenden Antikörper agglutinierten jede der vier Indikatoren, die mit den einzelnen Antigenen hergestellt wurden, und bei den Vergleichsversuchen wurde jeweils keine Agglutination gefunden.
Die Erfindung betrifft sämtliche Mittel zur Herstellung immunologischer Indikatoren, sofern es Mittel des Typs Mikrobenzellen-Kupplungsmittel sind. Diese Mittel können an Antigensubstanzen gebunden sein, wodurch ein immunologischer Indikator des Typs Mi krobenzellen-Kupplungsmfttel-Antigensubstanz erh- ten wird, der zur Durchführung sehr vieler Tests und zur Herstellung von Testvorrichtungen verwendet werden kann.
PATENTANSPRUCH 1
Mittel zur Herstellung eines immunologischen Indikators, das zur chemischen Bindung an Antigene geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, dass es aus Mikrobenzellen aufgebaut ist, an die über eine kovalente chemische Bindung eine Verbindung gebunden ist, die noch mindestens eine freie reaktive Gruppe aufweist, wobei diese reaktive Gruppe in der Lage ist, mit Antigenen zu reagieren, wenn das Mittel mit diesen zusammengebracht wird.
UNTERANSPRÜCHE
1. Mittel nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen Bakterienzellen, Pilzzellen, Parasitenzellen, Protozoenzellen oder Virenzellen sind.
2. Mittel nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Mikrobenzellen gleiche Form und Grösse aufweisen und in einer Richtung eine maximale Ausdehnung im Bereich von 0,2 bis 10 Mikron besitzen.
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Means for producing an immunological indicator, method for its production and its use
The present invention relates to an agent for producing an immunological indicator which is composed of microbial cells, the agent being bound to antigens during the production of the indicator.
The agent according to the invention is made up of microbial cells to which a compound is bound by a covalent chemical bond, this compound also having a free reactive group which can be chemically bound to antigen substances. The invention also relates to a process for the production of this agent and its use for the production of an indicator, for which purpose an antigen substance is bound to the free reactive group of the agent, whereby an immunological indicator is obtained which is used for the visual determination of homologous antigens or antibodies can.
The possibility of determining the presence of antigen substances in different liquids is very important. In many industrial processes proteinaceous materials that possess antigenic properties are either used as reactants or these materials are otherwise treated. The ability to determine the changes in the concentration of these materials in order to follow such reactions is particularly important in the control and repeatability of such industrial processes. Another very important field of application is the detection of various antigens and antibodies in body fluids.
The level of many hormones, proteins, lipoproteins, mucoproteins, glycoproteins, etc., and the level of the hydrolysis products of these materials, which are normally found in the body and also when various pathological phenomena occur, are of great importance for medical practice. Some of these substances, which are of great interest, are difficult to determine by methods known up to now using conventional chemical analysis methods. However, using immunochemical testing methods, some of these antigens and antibodies can be detected in mixtures containing other large molecules that have similar chemical groups but do not have exactly the same configuration as the macromolecule to be determined.
However, a number of these immunological procedures are difficult to carry out and often require a long time and special working techniques, but they have been used to detect the presence of such substances in various body fluids. For some antigens and antibodies, however, no test methods were previously available.
More recently, hemagglutination systems have been devised for the detection of antigens or the detection of their antibodies. These systems employ red blood cells as indicator particles which, for their use, are linked in some way to an antigenic substance so that an indicator is obtained which can be used to detect the homologous antibody or to detect the antigenic substance itself. In order to determine the presence or absence of the substance being tested for using such indicators, it is generally necessary to interpret the appearance of the red blood cell pattern to determine whether hemagglutination has occurred.
Hemagglutination occurs when the homologous antibody is present in the test medium in a form that is capable of reacting with the antigenic substance that is bound to the red blood cells to form an immune complex therewith. Hemagglutination does not occur if the homologous antibody cannot complex with the red blood cells to which the antigenic substance is coupled. Due to many conditions, including the presence of buffers and other reactive materials, this test method has limited applicability and it is necessary to have trained personnel available who are able to interpret the appearance of the samples obtained, although well-functioning test systems are already in use for some substances.
Another troublesome phenomenon that occurs with hemagglutination systems is the phenomenon known as the heterophilic antibody problem, which is caused by some serum proteins contained in the antiserum solution that react with the groups of antigens that are usually present on the surface of the red blood cells also occur when the antiserum is taken from a species other than the animal species from which the red blood cells are used. In this way, ovalbumin was discovered in the serum early on by Pressmann, D., Campbell, D. H., Pauling, L .: Journal of Immunology 44, pages 101-105 (1942). A similar procedure was used to detect tuberculin purified protein derivative, a method described by Cole, L. R., Farell, V.
R. in the Journal of Experimental Medicine 102, page 157 (1955), and insulin was found in the serum of Arquilla, E.R. and Stavitsky, A.B. as described in the Journal of Clinical Investigation 35.
Pages 458466 (1956). A similar system for testing for the hormone chorionic gonadotropin is described in U.S. Patent No. 3,236,732 to Edward R. Arquilla. A pathological antigenic substance, diphtheria toxin, was tested in this way and this method is described by Butler W.T. in the Journal of Immunology 90, pp. 663-671 (1963).
It is believed that the limited applicability of these types of hemagglutination tests is in part due to the narrow range of sizes and specific configurations of animal red blood cells that are commonly used, and greater applicability of agglutination in immune ecological indicators and test systems could be achieved if indicator particles could be found,
which can replace the red blood cells and which would allow more variation in size. In general, the use of animal red blood cells as indicator particles for various antigens precludes the use of both a chromatographic and a plate-type agglutination mechanism. The red blood cells are also expensive to use because animals have to be kept in the laboratory and the collection conditions have to be carefully prescribed so that hemolysis of the cells is avoided and a uniformity is achieved without which the hemagglutination test cannot be carried out reproducibly.
It has now been found that microbial cells can serve as immunological indicator particles and that in this way many of the difficulties described above can be overcome. Microbial cells exist in very broad size ranges and their colors are also very different and the sizes are in the ranges that are required for both tube agglutination tests and plate agglutination tests and are also accessible for tests of the chromatographic type. Therefore, a variety of test mechanisms are applicable when microbial cells are used as indicator particles. The cells can be easily grown under laboratory conditions and can be manufactured cheaply.
The microbial cells can be selected according to the required size, according to the surface properties which are particularly advantageous for the respective test mechanism and according to the point of view from which the cells can be cultivated particularly easily. Therefore a greater possibility of variation in the production of the immunological indicator or immunological test system is possible if microbial cells are used. The use of microbial cells can also eliminate the heterophilic antibody problem.
The term indicator particles is to be understood here as meaning microbial cells to which no compound is chemically bound that still has a free reactive group after binding to the microbial cells. This compound, which has 2 unbound reactive groups before it is bound to the microbial cells, one of which then reacts with the microbial cells to form a covalent chemical bond, is also called coupling agent in the following. The term means for producing an immunological indicator are to be understood as meaning microbial cells to which the coupling agent is bound, but without an antigen substance being bound to the same. The term immunological indicator is understood to mean the combination of cells, coupling agent and antigen substance.
The present invention therefore relates to the means for producing an immunological indicator which is suitable for chemical binding to antigen substances and which is characterized in that it is made up of microbial cells to which a compound is bound via a covalent chemical bond which is still at least has a free reactive group, which reactive group is capable of reacting with antigens when the agent is brought into contact with them.
The microbial cells of the agent according to the invention for producing an indicator can be bacterial cells, fungal cells, parasite cells, protozoan cells or virus cells. Preferably the microbial cells are of the same shape and size and have a maximum unidirectional dimension in the range of 0.2 to 10 microns. The microbial cells can be microbial cells pretreated with an inactivating agent and / or colored microbial cells.
As an example of the compounds which in the agent according to the invention are bound to the microbial cells via a free reactive group and still have a free reactive group, the following may be mentioned: bis-diazobenzidine, bis-diazobenzidine-disulfonic acid, tetraazo-p-phenylenediamine, difluoronitrobenzene, Carbodiimide, toluene diisocyanate, cyanuric chloride, dichloro-s-triazine or Nt-butyl-5-methylisoxazolium perchlorate.
Another object of the present invention is a method for producing the agent according to the invention, this method being characterized in that microbial cells are brought together with a compound which has at least 2 unbound reactive groups, and that one of these reactive groups is combined with the microbial cells Reacts formation of a covalent chemical bond and leaves the other of said reactive groups in the unbound state.
When performing this process, the microbial cells can be suspended and this suspension can be brought together with the compound which has at least 2 reactive groups. Examples of compounds with at least 2 reactive groups are: bis-diazobenzidine, bis-diazobenzidinedisulfonic acid, tetraazo-p-phenylenediamine, difluoronitrobenzene, a carbodiimide, toluene diisocyanate, cyanuric chloride, dichloro-s-triazine and Nt-butyl-5-methylisoxazolium .
Another object of the invention is the use of the agent according to the invention for producing an indicator. This use is characterized in that the agent is reacted with an antigen, the antigen being bound to the reactive groups of the agent by covalent bonds.
An immunological indicator thus obtained can be used for the detection of an antigen and can also be suitable for use in combination with the homologous antibodies, the indicator being composed of microbial cells bound to the antigen by means of a chemical coupling agent. With this use, the indicator obtained can be applied to an absorbent material as a deposit. The agent according to the invention can be reacted with an antigen which is a serum antigen, preferably γ-globulin, serum albumin or a blood group substance, or a microbe antigen, an antigenic hormone substance, a protein hydrolysis product or an enzyme.
Specific examples of antigens with which the indicator can be implemented are: ovalbumin, a protein derivative purified with tuberculin, insulin, the hormone chorionic gonadotropin (CGTH), which can be of human or animal origin, as well as human serum albumin or equine globulin.
The microbial cells of the agent according to the invention and the immunological indicator which can be produced therefrom can be any self-reproducing microorganisms which reproduce as a function of or independently of other organisms. Both gram-positive and gram-negative bacterial cells can be used; furthermore, the cells of fungi and protozoa cells can also be used, and virus cells can also be used for some test systems. These are generally unicellular organisms that are sometimes linked together in clumps or aggregates. The cells can be used in this form, provided that their aggregate size does not form a carrier particle that is so large that the test system formed with it does not agglutinate in the presence of a substance that is homologous to the antigen substance to be bound to the aggregated cells.
In general, the preferred microbial cells, bacterial cells, or aggregates thereof are uniform in shape and size and have maximum external dimensions in the range of about 0.2 to 10 microns. Although not preferred, a mixture of different but uniform cells can be used. In the case of these bacteria, the usable microbial cells include those from Division I of the plant kingdom, to which classes I, II and III, order I belong. Class III order 1 of the microbial cells includes the intracellular virus organisms which have sizes in the range of about 0.2 microns.
Regarding the complete list of usable bacterial cells, see Bergey's Manual of Determinative Bacteriology by R. S. Breed, E. G. D.
Murray, N. R. Smith., 7th Edition 1947, (Williams and Wilkins Company). Bacteria of class II, suborder II, family IV (Pseudomonadaceae) and of class II, order IV, family IV (Enterobacteriaceae) are particularly suitable. It is believed that all strains I through IV are preferred cells for practicing the present invention. Class II, order IV, family V (Brucellaceae), X (Lactobacillaceen) and XIII (Bacillaceen) are preferred microorganisms. Both orders I and II of class III organisms can be used when particles as small as about 0.2 microns or even smaller are desired. In particular the virals of the order II are of very small size, which limits their usability.
Particularly preferred bacterial cells are Brucella abortus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii and Pseudomonas fragi. The yeast growth phase of the fungal cells are also preferred for practicing the invention. The commonly available yeast, namely Saccharomyces cerevisiae, is particularly preferred.
The microbial cells can be used in their natural state; H. the coupling agent can be reacted with them directly. However, if the natural pathogenic properties of any microbial cells are to be viewed as dangerous, then the natural antigenicity and hence the pathological properties can be removed by treating or killing the microbial cells with inactivating agents. The most common inactivating agents are formaldehyde and phenol. It is noteworthy that in the event that microbial cells were pretreated with such an inactivating agent and then modified by attaching the coupling agent to them, the antigen groups naturally occurring on the cell surface were sufficiently modified so that they became inactive.
In order to completely switch off any cells that have natural antigenic activity, the test system produced can be bound to the antigen with an antibody containing serum, which is naturally present on the cell surface, thereby forming a complex that no longer interferes with further tests .
If z. B. Escherichia coli are used for the indicator particles of the agent for producing an indicator and the antibodies for Escherichia coli are present in the test sample, then the reaction between the indicator and its antibody can be caused by the adsorption of the Escherichia coli cells of the indicator with antisera that contain the corresponding antibody. It can therefore no longer be assumed that the microbial cells which are present in the indicator according to the invention have their natural antigenicity.
If desired, the microbial cells can be stained to improve the visual distinguishability of the resulting indicator from the surrounding background. In general, dyes such as hematoxylin, fuchsin, and crystal violet are used for this purpose. Another treatment that may be undertaken is that the cells with organic solvents, such as. B.
Washes alcohols, ethers, etc. to remove any polysaccharide or wax layers that may be present.
The compounds which have at least 2 reactive groups, namely the coupling agents, must have such reactive groups which react both with the microbial cell and with the antigen substances. The coupling agents are generally compounds having two or more of the following reactive groups: azo groups, sulfonic acid groups, fluorine groups combined with nitro groups, acids, imines, and reactive chlorine groups connected with a ring having a suitable resonance structure.
These reactive groups are able to react with the primary amino groups with the SH groups (mercapto groups) and with the hydroxyl groups in the polymer chains and on the surface of the microbial cells and when using the agent they then react with analogous groups of the antigen Training of the immunological indicator.
Examples of coupling agents are: bis-diazobenzidine, bis-diazobenzidine-disulfonic acid, tetraazo-p-phenylenediamine, difluoronitrobenzene, various carbodiimides, toluene diisocyanate, cyanuric chloride, dichloro-S-triazine and N-t-butyl-5-methylisoxazolium perchlorate.
Some of these coupling agents, particularly the cyanurating agents, are able to protect the cells at the time they couple with groups on the surface of the microbial cells so that when using these coupling agents no separate pretreatment is necessary to protect the cells. When using the last-listed compound, the indicator particles are first treated with a succinilating agent such as succinic anhydride.
To form the agent for producing the immunological indicator, the coupling agent is first made to react with the microbial cells, which are expediently suspended in a liquid, and then the indicator is made from it, if it is needed, by adding the agent to the antigen substance Formation of the indicator mixes.
The composition of the present invention can be viewed as a tradable article since it can be manufactured and sold so that the consumer can use it to manufacture an indicator for any antigenic substance.
In general, any desired antigenic substance can be coupled with the agent according to the invention. The term antigenic substance is understood to mean a material which, when introduced into the circulatory system of an animal, provides the corresponding antibody. This broad term therefore includes serum antigens, such as. B. y-globulin and serum albumin and also the blood group substances A and B, which are used to test the various blood types.
Microbe antigens can be coupled to the indicator and either the microbe itself or its antibody in the liquids can then be determined. Antigenic hormone substances that can be present in the fluid systems of the organism can also be coupled to the indicator. Protein hydrolysis products and enzymes can also be used as antigen substances. The microbe antigens or antibodies can be bacterial, fungal, parasitological or viral in nature. The main requirement that is made of the antigen substances is that they have at least one group in their polymer chains which can react with the reactive group of at least one of the known coupling agents. As far as is known, all antigenic substances meet this requirement.
The antigenic substance can be a naturally occurring material or it can be a man-made material. Some naturally occurring substances which can be coupled to an agent according to the invention for producing an immunological indicator are; Ovalbumin, tuberculin-purified protein derivative, insulin, the hormone chorionic gonadotropin (CGTH), both that of human and that of animal origin, human serum albumin and horse γ-globulin.
There are three general methods of carrying out the tests on the immunological indicators obtained using the agent of the present invention. These methods employ the principles of chromatography, those of agglutination in a tube and those of agglutination in a sheet or on a plate. Which method is actually selected depends essentially on the size of the microbial cells that are used.
Microbial cells which are in the form of ellipsoidal rods and are about 0.3 to 0.4 microns long are preferred for the chromatographic test. For the plate agglutination tests, the microbial cells can be longer rods which, for example, have a length in the range of 1 to 3 microns and a diameter in the range of 0.5 microns, it also being possible for the cells to be cocci-shaped.
A tube agglutination test can be devised for a wide range of sizes of microbial cells, the size range being between about 0.2 to about 10 microns in each spatial direction of the microbes.
d. H. can lie in the longitudinal direction or in the transverse direction.
The plate or tube agglutination tests are based on the ability of the immunological indicator generated from the composition of the invention to agglutinate, with the agglutination forming a discernible difference in pattern to the pattern that the system in the absence of agglutination shows. This type of testing can be carried out in two fundamentally different ways, with agglutination occurring in the first case and agglutination inhibition in the second case. In the case of agglutination, an antigen is coupled to the microbial cells, forming an indicator, and this is used to determine the presence of the appropriate antibody in the sample.
If the sample contains the antibody, then the indicator agglutinates with the antibody, and this fact can be determined by the pattern that the indicator shows. When agglutination is inhibited, the antigen is coupled to the microbial cells, an immunological indicator being formed which is then used with the homogeneous antibody to test for the presence of antigen in the sample. If the sample contains the antigen, the homologous antibody will be inhibited or neutralized by the antigen and the indicator system will not be agglutinated. Under the condition of non-agglutination, the indicator, which consists of insoluble microbial cells and the bound antigen, will separate out of the test liquid, forming a noticeable difference in the pattern compared to the pattern exhibited by the agglutinated indicator.
In the case of the plate test, agglutination is shown by the formation of a granular pattern, while in the case of the tube test, agglutination is indicated by a uniform, uniform suspension of the cells. If non-agglutination occurs in the plate test, this is shown in the form of a smooth pattern, and in the case of the tube test, the non-agglutination is shown by the sedimentation of the indicator at the bottom of the tube, this sedimentation being either in the form of a ring or a stain.
The same type of agglutination or inhibition of agglutination is responsible for the type of chromatographic testing, in the event that the tested sample contains a special antigen or an antibody, then a special migration property is shown by the chromatographic solution. In the event that agglutination occurs, a spot of the indicator is applied to a suitable chromatographic carrier, for example a filter paper, during the chromatographic test and then a drop of the liquid to be tested on the outside of the antibody is applied to the same place and the edge of the The carrier is brought into contact with the developer liquid, for example a saline solution.
If the sample contains the antibody, the indicator agglutinates and forms an immune aggregate with the antibody. This aggregate does not move further when the developer liquid penetrates and only a slight change in the stain will occur. However, if the sample does not contain antibody, then no immune aggregate will form and the indicator will then migrate as the solvent front advances, creating a striped pattern. When performing a test for inhibition of agglutination, a stain of the immune aggregate is formed according to the chromatographic test method by placing a drop of an antibody-containing solution on a drop of the sample to be tested for the presence of the antigen, then applied to the stain of the immune aggregate and a solution is allowed to rise in the carrier material.
It is also possible to bring the edge of the carrier material directly together with the sample so that the antigen, if present, comes into contact with the drop of the immune aggregate. If the sample contains the antigen, the immune aggregate is caused to dissociate due to the preferred reaction between antibody and antigen and the indicator then migrates and forms a striped pattern.
In the event that no antigen is present in the sample, there will of course be no migration of the spot containing the immune aggregate.
The invention will be explained in more detail with reference to the examples. In the examples, the parts are given as parts by weight per volume and the buffer concentrations are given in molarities M, unless it is expressly stated that other notations are used.
example 1
A means for preparing an immunological indicator was prepared by using Brucella abortus cells as microbial cells, and bis-diazobenzidine (BDB) was used as a coupling agent. The agent obtained was then reacted with human chorionic gonadotropin (CGTH), which served as an antigen, to form a special indicator, and this was then applied to an absorbent carrier material in connection with the antibody of the CGTH, and urine samples were then tested for the presence of CGTH checked. This indicator worked according to the chromatographic mechanism described below.
Preparation of the reagent
Isotonic saline solution:
A 0.850 percent saline solution was prepared by dissolving 8.5 grams of sodium chloride in one liter of distilled water.
Phosphate Buffer: A 0.15 molar buffer solution of pH 7 was prepared by dissolving a dry mixture of 81% secondary sodium phosphate (Na2HPO4) and 19% primary sodium phosphate (NaH2PO +) in distilled water until the desired pH was reached Value was reached.
Bis-diazobenzidine solution:
100 ml of distilled water and 6 ml of 6 normal hydrochloric acid were added to 0.92 g of benzidine. An additional 100 ml of distilled water was added to the Mi mixture. After the benzidine had dissolved, the solution was cooled to 0 ° C. in an ice-salt cooling bath. As soon as ice crystals began to form in the solution, 6.5 ml of a 100% solution of sodium nitrite were quickly added with stirring. Stirring was continued until the solution reacted negatively to starch iodide paper. During the stirring, care was taken to ensure that the temperature never rose above about 10 ° C.
This material was faintly yellow in color. When the phosphate buffer was added, the color changed to red-brown. The pale yellow solution was stable at room temperature between 5 and 7 hours, at 40 C it was stable for about 7 days.
When this solution was frozen and stored at -200 C, it was stable for 60 days. When stored at -35 "C, it was stable for at least 6 months.
Formalinization of the microbial cells: cells of the Brucella abortus were cultured for 72 hours at 37 ° C. on tryptose agar and then the agar was washed away with a 0.050% saline solution containing 10/0 formaldehyde. The cells were immediately treated with formaldehyde by leaving them in a saline-formaldehyde solution for 24 hours at room temperature (250 ° C.). The cells were then washed thoroughly to remove the rest of the protective agent (formaldehyde). Washing of the cells of the Brucella abortus was carried out by suspending the cells in distilled water.
The cells were then centrifuged and resuspended in distilled water, these procedural steps being repeated several times. The preserved cells were then stained.
Staining of formalinized microbial cells: 2 g of the wet packed formalinized cells of Brucella abortus, 1 ml of 20 / above ferrous sulfate and 5 ml of 10 / above aqueous hematoxylin were added to 100 ml of distilled water and the mixture was stirred continuously for 24 hours. The cells were stained permanently and the color did not leach out.
Production of the means for producing the indicator: (formalinized microbial cells-BDB-CGTH) cells of the Brucella abortus, which were stained with hematoxilin as described above, were used as indicator particles. A volume containing 0.5 g of packed stained cells was added to 10 ml of a saline solution, and then 12 ml of phosphate buffer and 40 ml of a dilute BDB solution obtained by mixing 8 ml of the above-described BDB solution with 32 mol of phosphate buffer was prepared, added. The coupling reaction was allowed to proceed for 20 minutes at room temperature (250 ° C.) with constant stirring.
The agent thus obtained was used for the preparation of an indicator by reacting it with human CGTH available from Vitamerican Corp. Little Falls, New Jersey, reacted at the rate of 20 mg of CGTH per 0.9 g of cells (based on their weight before coupling). The indicator obtained was a brown complex which was centrifuged off. Since the indicator was to be applied to an absorbent carrier, a portion of 0.1 g of this indicator was homogenized in a mortar. A vigorous mixture was made with a drop of 10% of the above methiolate and 1 g of sucrose syrup (25% by weight per volume) was slowly added.
Preparation of the antibody to the CGTH: Laboratory rabbits were treated with injections of human CGTH in Freund's complete adjuvant in a series of vaccinations. After a predetermined period of time, the rabbits were bled and the serum containing the antibody was separated from the whole blood. The CGTIR applied can be any of the commercially available preparations. Particularly useful is that sold by Vitamerican Corp. and which has an activity of about 2000 to 2500 international units (I.U) per mg.
A typical scheme for the injection treatment and the separation of the antibody is as follows: A solution containing 10 mg of CGTH per ml of saline was mixed with equal parts of Freund's complete adjuvant, 1/10 (0.1 ml) of the mixture was added to each Injected toe ball of a rabbit weighing 3 t / 2 kg.
At the end of a 2 week period, a first injection of 0.5 ml of a solution containing 5 mg of CGTH per ml of saline was given. The injection was given intravenously. A second injection was given two days after the first injection. Blood samples were drawn from the rabbit seven days after the last injection. The antiserum had a titer of 1: 2560 as determined by hemagglutination.
Test method (chromatographic test method): A spot of the indicator prepared above was applied about 19 mm from the edge of a piece of filter paper and a drop of the above antiserum was then applied, whereby an immune aggregate was formed. The edge of the paper was then placed in contact with a normal urine sample from a non-pregnant woman. When the urine rose in the paper, the stain on the immune unit stuck to the paper. This showed that the immune aggregate formed was not dissociated by the usual urine components.
Another strip of the filter paper was stained with immune aggregate as described above and the edge of the paper was placed in a urine specimen from a pregnant woman, the urine rose up in the paper, part of the immune aggregate dissociated and caused streaking or upward migration of the colored one Indicator from the aggregate spot, which correspondingly lost color intensity.
In another test, the spots of the immune aggregate were applied to different strips of paper and then the urine samples were spotted on these strips. The edges of the strips were then immersed in a physiological saline solution. As soon as the saline solution rose above the spots treated with the urine of a pregnant woman, part of the colored indicator migrated with it, forming a striped pattern. Relatively little streaking was seen when the saline solution migrated over stains treated with normal urine from a non-pregnant woman.
Test devices were made to test for the presence of the antibody to human CGTH by placing spots of the indicator described above about 1.9 cm from the edge of a piece of filter paper. A drop of rabbit serum containing the antibody was applied to the spot of the indicator on one of the strips and the edge of the filter paper was immersed in a physiological saline solution. The saline solution migrated across the stain without streaking the indicator, indicating that an insoluble immune aggregate had formed. One drop of normal I (aninch serum was tested in the same way with the indicator and it was found that there was migration from the neck, indicating that no immune aggregate had formed.
The above-described indicator also showed agglutination by the antibody of human CGTK when the agglutination test was carried out according to the tube test system. This agglutination could be easily inhibited by adding smaller amounts of a solution containing CGTH to the test medium.
In preparing the diagnostic compositions on an absorbent carrier material using an indicator containing microbial cells, it is essential that the cellular material be stabilized by treatment with a protective agent as described above.
Another indicator device can be made by mixing the indicator described above with the antibody to form an immune aggregate, applying a single stain to a site away from the edge of the strip and drying. In use, a drop of a sample of Ilarn is applied to this stain or to an area between that stain and the edge of the paper, and then the end of the strip is dipped in a saline solution.
If the urine contains CGTH, the aggregate will dissociate and the colored indicator will migrate with the saline and streaks will form. If no CGTH is present, no change occurs.
On the other hand, the urine sample can also be used as a chromatographic developer liquid.
In a preferred embodiment, the test device is such that the diagnostic reagent is in the form of a strip which is prepared, for example, by running a tape of the indicator and antibody aggregate about 15 mm from the long edge of an Eaton-Dikeman # 609 filter paper, which measuring 13 cm X 26 cm, apply and allow the reagent to dry at room temperature and cut the paper widthwise into strips and store these strips in a suitable container until use.
It can be seen that many different materials can be used as the absorbent strips in the strip test described. For example, many types of chromatographic materials can be used, and many types of chromatographic developing liquids can also be used.
Example 2
Escherichia coli was used as an indicator particle for producing an agent for producing an indicator, the agent consisting of microbial cells and BDB. This agent was converted into an indicator by reacting it with CGTH, which was applied together with the antibody for CGTH, an agglutination test according to the plate type, and clinical determination of pregnancy was carried out with this test.
Preparation of reagents 0.850 / above saline solution:
68 g of sodium chloride were dissolved in 8 liters of distilled water and the solution was autoclaved at atmospheric temperature and 3500 ° C. for 30 minutes. It was then cooled and stored at 4 ° C. The treatment in the autoclave was carried out in order to sterilize the saline solution.
10% formaldehyde solution: A 37% formalin solution was treated by adding powdered calcium carbonate to the solution and allowing the mixture to stand for 24 to 28 hours. The excess material was then poured into another container and filtered three times through a high-quality, white filter paper with a creped surface. If the pH was below 7, then it was adjusted to 7 by adding a 0.12 NaOH solution. A sufficient amount of this treated 370/0 formalin solution was added to distilled water to make a 10 liter solution.
Phosphate buffer solution: 100 ml of a phosphate buffer with a pH of 7.4 were prepared by mixing 80.8 ml of a sodium phosphate solution with 19.2 ml of a potassium phosphate solution at 200.degree. The sodium phosphate solution contained 53.726 g Na2HPO4 12H2O per liter of distilled water. The potassium phosphate solution contained 20.441 g of KH2PO4 per liter of distilled water.
Bis-diazobenzidine (BDB):
0.640 g of benzidine dihydrochloride (benzidine 2HCl) were dissolved in 100 ml of a 0.56 / 0 hydrochloric acid solution in a 250 ml Erlenmeyer flask made of Pyrex glass.
This flask was placed on a magnetic stirrer filled with ice, and the magnetic stirrer was immersed in the solution. When the temperature had reached 40C, a 5 ml portion of a sodium nitrite solution, which was prepared by adding 0.68 g NaNO2 to 10 ml water, was pipetted with a serological pipette and added dropwise to the benzidine solution over a period of 7 to 10 minutes added, the magnetic stirrer running at a speed of 200 revolutions per minute. A drop of sodium hydride solution was added every 4 to 6 seconds, the sodium nitrite solution also having a temperature of 40.degree.
The solution was continuously stirred for 20 minutes, after which time it was immediately frozen and stored at -60 "C in a number of 1 gramvioles. The solution can decompose even at a temperature of 0-5 C and therefore it was frozen so that it has been kept stable and can then be heated when it is needed for use.
Antibodies for the CGTH.
An emulsion containing 10 mg of CGTH per ml was prepared by dissolving 100 mg of purified CGTH in 5 ml of the above saline solution and adding 5 ml of the vigorously mixed complete Freund's tool and shaking to make an emulsion.
An amount of 0.2 ml of the emulsion was injected into each soccer ball of a healthy rabbit, which was located in a standardized laboratory environment, the rabbit being injected with a total of 0.8 ml of the emulsion (8 mg CGTH).
The rabbit was then given a series of injections, each consisting of a 0.5 ml solution prepared by dissolving sufficiently purified CGTH in 0.85% saline. so that a concentration of 5 mg per ml was obtained. The injections were given into the ear veins. These following injections were given on the following days after the first emulsion injection, namely on the 22nd day, on the 24th, 38th, 40th, 71st day.
and 73rd day. Two samples of 40 to 50 ml of blood were drawn from the rabbit by cardiac puncture on both the 50th and 83rd days. The red blood cells of these samples were separated from the serum of each sample by allowing the blood to flocculate in a centrifuge tube at about 25 C for about 2 hours and the serum above was then transferred to a tube with a smaller diameter (less than 30 mm) and placed the tube in a 56 "C water bath for 30 minutes.
10 mg of formaldehyde-treated sheep red blood cells (lyophilized) were then added per ml of the serum sample and mixed for 15 minutes at 25 ° C to adsorb heterophilic antibodies from the serum. The adsorbed serum was separated from the red blood cells by means of centrifugation, with about a thousand times the gravitational acceleration prevailing during the centrifugation.
A quantity of 40 ml packed, sheep red blood cells were prepared for this adsorption by centrifuging off 200 mol of fresh red sheep blood which is dispersed in Alserver solution and removing the excess liquid and then washing it three times with 0.850% saline solution, 120 to 200 ml of saline solution were used per wash. To the red blood cells thus obtained, 460 ml of the above-mentioned saline solution and 500 ml of the above formalin solution of pH 7.3 were added. The resulting suspension was mixed and allowed to stand at 370 ° C. for 18 to 20 hours.
The red blood cells were then removed by centrifugation and washed five times with distilled water, using approximately 200 ml of distilled water for each wash. A sufficient amount of distilled water was then added to give a 100% suspension of the cells. This suspension was stored at 40 ° C. until it was then used for adsorption.
Microbial cells: Escherichia coli cells were obtained by culturing an intestinal swab from a dead laboratory rabbit in a brain-heart infusion broth (HHI broth). A volume of 68 ml of a well-grown culture (18 hours) was used to inoculate 3 liters of the Him-Heart Infusion Broth, the broth being tested for sterility prior to inoculation. The cells were incubated for 41/2 hours at 37 ° C. with shaking. The cells obtained in this way were uniform in size and shape.
Manufacture of the indicator
The three liters of suspended Escherichia coli cells were centrifuged at 10,000 revolutions per minute for 10 minutes in order to isolate the excess fluid from the packed cells. The overlying material was poured off and the remaining packed cells were combined with about 45 ml of a formaldehyde solution which had been treated with 37% calcium carbonate in order to ensure that the Escherichia coli were killed.
The formalin was left in contact with the cells for one hour, after which time the cells were washed three times with the saline solution described above and then suspended in 1600 ml of a 1 / o formaldehyde solution for 21 hours at room temperature (25 ° C.). These cells were then spun down and isolated as packaged, protectant-treated cells. The packed cells were then resuspended with 500 ml of the saline solution described above and stored at 4 ° C. The concentration of the cells was 4a / o, as measured by a hematocrit.
A portion of the above-described suspension of cells was centrifuged to obtain a volume of packed cells, and 0.5 ml of these packed cells were removed and 10 ml of the above-described saline solution was added to the previously diluted 12 ml of phosphate buffer and 40 ml of BDB Solution had been added. The diluted BDB solution was prepared by combining 8 ml of BDB with 32 ml of phosphate buffer. The agent for producing an indicator thus obtained was converted into a special indicator by reacting it with 20 mg of CGTH. The CGTH had an activity of 36,000 international units per mg and was approved by the Vitamerican Copr. Bought.
This mixture was continuously shaken for 5 minutes at room temperature and then the formed indicator was collected by centrifugation and washed three times with the saline solution described above and then centrifuged and again in a 1:50 dilution of bovine serum albumin (30%) in the above Suspended saline solution. The bovine serum albumin (BSA) was purchased from Armor & Co.
The resulting suspension of the indicator showed a brownish color and it was found that it was stable over wide temperature ranges.
Preliminary check of the indicator
Normal urine samples were prepared by adding known amounts of CGTH to determine the lowest detectable levels of CGTH. The indicator prepared above was then used together with the above antibody for CGTH (AkCGTH) to conduct a plate-type agglutination test.
In this test, the above indicator was again resuspended in a sufficient amount of 1:50 BSA saline solution, an 80 / above cell concentration being obtained. Subsequently, three solutions of the above-described antibody solution were prepared by diluting one part of the antibody solution with 250 parts of the above-described saline solution and with 500 parts of the above-described saline solution and further with 1000 parts of the above-described saline solution. These dilutions were designated 1: 250, 1: 500 and 1: 1000.
Urine samples of each of the following concentrations of CGTH were prepared by adding 0.25 ml of a stock solution of 4 mg of CGTH per ml of saline (3600 international units per mg) to 100 moles of a urine sample from a non-pregnant woman and then adding 2.25 in the series with saline , 4.5, 6, 9, 18 and 36 international units of CGTH per ml of urine and salt diluted.
Part of this urine sample was then saved as a blank.
One drop of each of these urine samples was mixed with one drop of the appropriate antibody compound and the mixture was applied to a plate. Then a drop of the above-described 80 / above suspension of the indicator system was added to the cells which were already on the plate and mixed. The results of this series of tests are given in Table 1 below. In this table - means agglutination and therefore a grainy appearance in the suspension on the plate, while + means a smooth, non-agglutinated pattern on the plate.
Table 1 CGTH concentration Dilutions of CGTH antibodies in urine in internat.
Units per ml 1: 250 1: 500 1: 1000 0 (blank) - - -
22nd
2.25 - - -
4.5 - - +
6.0 - ++
9.0 +++
18.0 +++
36.0 +++
From Table 1 it can be seen that in the event that no CGTH is present in the urine sample, agglutination occurs. This phenomenon is due to the fact that the urine sample does not contain any CGTH, which could preferentially react with the antibody of the CGTH, so that the antibody of the CGTH agglutinates with the indicator and provides the granular appearance of the spherical or lumpy cells on the wetted part of the plate.
If one adds 2.25 international units of CGTH per ml of a urine sample, then there is still enough CGTH antibody present in the system that, when all of the CGTH is converted, there will still be a sufficient amount of CGTH antibody present to cause a clumping of cells or a Provides agglutination even at a 1: 1000 dilution. If urine samples containing 4.5 international units of CGTH per ml have been tested with three dilutions of the antibodies of the CGTH, then the antibody reacts completely with the CGTH at dilutions between 1: 500 and 1: 1000, so that the appearance of a 1: 1000 dilution is not granular, but provides a smooth pattern of suspended indicator cells, d. that is, no agglutination occurs in this case.
It can be seen that with 6.0 international units of CGTH per ml, the required amount of antibody lies between the dilutions of 1: 250 and 1: 500, as was also to be expected, since a larger amount of CGTH is present and therefore also a larger amount of antibodies of the CGTH's is necessary to produce a complete reaction with the CGTH. In this case, therefore, the grainy pattern occurs at a dilution of 1: 250. From Table 1 it can be seen that very low amounts of CGTH in the urine, namely about 4.5 international units of CGTH per ml, can be determined if low concentrations of antibodies of the CGTH in the test system, namely dilutions of 1: 10,000 or less, applies.
It has also been found that by doubling the amount of urine, namely by using two drops, concentrations of CGTH that are only 2 international units of CGTH per ml can be determined.
To determine the precise times it took for the granular pattern to develop over a range of CGTH antibody levels and cell levels, the following additional tests were performed.
Portions of the indicator were resuspended in a sufficient amount of the BSA 1: T0 dilution in saline solution described above, so that concentrations of 0.6250/0, 1.250 / 0, 2.50 / o and 50 / o cells were obtained. A dilution series of CGTH antibody solutions was then prepared using the above BSA, 1:50 in saline, so that the dilutions 1: 125, 1: 250, 1: 500, 1: 1,000, 1: 2,000, 1: 4,000, 1: 8,000 and 1:16,000 was obtained. Four drops of each of the CGTH antibody dilutions were applied in separate parallel rows to the surface of a cross-hatched glass plate. One drop of the lowest concentration of the indicator cell suspensions was added to the first drop of each of these dilutions.
One drop of a 1.250% suspension was added to the second drop of each dilution of the CGTH antibody, and one drop of 2.50%, respectively, was added to the third and fourth drops of each of the dilutions.
50% cell suspensions added. The results obtained are shown in Table 2, with the time taken for a granular agglutination pattern to develop for each test mixture being given in seconds.
The designation S in the table indicates that in this case an insufficient amount of CGTH antibody was present in the antibody dilution so that in this case no agglutination of the cells occurred and therefore the pattern remained smooth.
Table 2
Agglutination times in seconds Concentrations Dilution of CGTH antibodies of the indicator system, / o 1: 125 1: 250 1: 500 1: 1000 1: 2000 1: 4000 1: 8000 1: 16000
0.625 34 50 213 85 107 280 S S
1.25 31 30 36 58 56 150 120 S.
2.5 25 31 43 62 92 140 S S
5.0 35 30 55 60 75 S S S
The agglutination times given in Table 2 show that a relatively short period of time is necessary to determine agglutination, with agglutination in the actual test then signifying the absence of pregnancy. For this reason, pregnancy can be determined after the plate agglutination test with the above indicator system in a time of about a minute or in an even shorter time.
This is a much shorter period of time than would have to be used with the tube agglutination systems which rely on the use of red blood cells. The patterns by which the appearance of agglutination is distinguished from the absence of agglutination are also very clearly drawn and there are practically no unclear, intermediate patterns in these tests in which it is doubtful whether agglutination or no agglutination can occur. It is therefore possible to select the reagents in such a way that precisely defined patterns for the diagnosis of pregnancy can be obtained.
Table 2 also shows that a wide range of CGTH antibody dilutions can be used and that a wide range of indicator concentrations can also be used. The concentration of the indicator in BSA 1:50 dilution in saline solution can be in the range of less than 10 / o to about 120/0 in a usable test system.
To test the indicator of Example 2 with actual urine samples, 16 urine samples were obtained from 16 non-pregnant women, 4 of these women were under regular treatment with contraceptive pills. The test method was the same as that given above. That is, one drop of the urine sample was mixed with one drop of a 1: 1000 CGTH antibody dilution and then one drop of this mixture was placed on a glass plate and one drop of a 40 / above suspension of the indicator described above was added to the mixture already on the Plate was present, admitted. In all of these 16 cases, a grainy pattern was formed, indicating agglutination, and therefore the test indicated that there was no pregnancy.
This test result indicates that false, positive results do not belong to the difficulties of the above indicator and that hormone levels caused by pregnancy-preventing pills do not interfere with this particular type of test.
Clinical test using an indicator
Thirty-one frozen urine samples were used and the tests carried out, the health conditions of the patients from whom these samples were taken were unknown. A known urine of a pregnant woman was included as a control value and also a urine of a non-pregnant woman as an additional confofl value. The plate tests were carried out in the manner described above and compared with plate tests that were carried out with the same ET cam samples but with a commercially available plate test to determine pregnancy, which consisted of an indicator made of latex particles in combination with CGTH.
The indicator was used as the suspension shown. The antibody solution consisted of a 1: 1000 dilution of the antibody solution described above in saline solution. The test procedure consisted of mixing one drop of each urine sample with one drop of the antibody solution and then placing one drop of this mixture on a clean glass plate surface and then adding and mixing one drop of a 40% indicator suspension. The results were labeled positive with +; H.
a smooth pattern was exhibited, indicating that agglutination was inhibited and therefore that this result was a positive test for pregnancy. The presence of a grainy pattern was denoted by negative, i.e. with a - sign, ie. a pattern showing agglutination and therefore indicating that there was no pregnancy.
The test with the commercially available test system was carried out exactly according to the instructions given on the top of the package and the results were marked as pregnant and non-pregnant with plus and minus. These results are shown in Table 3 below.
Table 3
Clinical studies of the results
Unknown commercially available urine sample indicator of pregnancy
No. Example 2 test system
1 + -
2 + ¯
3 ++
4 ++
5 ++
6 + -
7 ++
8 + no attempt
9 ++
10+
11 +
12 ++
13 ++
14 ++
15 ++
16 + -
17 +
18 +
Table 3 (continued)
Clinical studies of the results
Unknown commercially available urine sample indicator of pregnancy.
No. Example 2 test system
19 ++
20 +
21 ++
22 + no attempt
23 +
24 ++
25 +
26 ++
27 ++
28 ++
29 ++
30 + no attempt
31 + no attempt
From the table above it can be seen that when the test was carried out with the aid of the indicator according to Example 2, all urine samples were assessed as urine samples from pregnant women. Eleven of the 27 urine samples taken with the commercially available test system showed negative results; H.
according to this test, these urine samples should come from non-pregnant women. It was then announced by the body providing the samples that all unknown urine samples came from pregnant women, the samples being taken between a few weeks of pregnancy and 8 1/2 months of pregnancy.
The urine known to originate from a pregnant woman and known to originate from a non-pregnant woman were only tested with the indicator of Example 2 and therefore these values were not included in Table 3. However, the results on these two tests were as expected; H. negative for the urine of the non-pregnant women and positive for the urine of the pregnant woman who was in the 8th week of pregnancy.
Example 3
The means for producing the indicator was prepared by first adding cells of Escherichia coli to a buffer solution and then adding a BDB solution to form the agent. A CGTH solution was then added to prepare an indicator, and the coupling reaction was then carried out.
Preparation of the reagents
Salt-phosphate buffer with a pH value of 7. 150 ml of a secondary sodium phosphate saline solution (Na2HPO4) were brought to a pH value of 7.0 with the aid of 75 ml of a primary sodium phosphate saline solution (NaH2PO4). The first solution was prepared by mixing 150 ml of a 0.5 molar NayHPO4 7H2O solution with 350 ml of distilled deionized water and 500 ml of a 0.850% saline solution. The primary sodium phosphate saline solution was prepared by mixing 150 ml of a 0.5 molar NaH2PO4 H2O solution with 350 ml of distilled, deionized water and 500 ml of a 0.850% saline solution.
Salt phosphate buffer with a pH of 7.5.
180 ml of the above-described secondary sodium phosphate saline solution were brought to a pH of 7.5 by means of the primary sodium phosphate saline solution described above.
BDB solution: 1 part by volume of a 0.025 molar benzidine hydrochloride solution (benzidine. 2HCl) in 0.36 molar HCl was added to a volume of a 0.1 molar NaNO2 solution in distilled deionized water and the resulting mixture was left for two minutes react long. The mixture was then brought to a pH of 7 by adding equal volumes of the mixture of the above-described salt phosphate buffer with a pH of 7 and 0.31 molar NaOH in distilled water. Immediately thereafter, 6 ml and 2 ml portions of the BDB solution were placed in containers which were closed and sealed and frozen at -83 ° C. These BDB solutions were thawed at +40 C when used.
Escherichia coli cells: the Escherichia coli cells were treated with formaldehyde in the manner described in Example 2 and then diluted to a 1.40 per cent cell suspension, which was pipetted into 50 ml centrifuge tubes and centrifuged at 3100 revolutions per minute for 15 minutes.
The overlying material was then discarded and the packed cells resuspended by first vortexing them until the product appeared smooth and then 20 ml of the saline solution of Example 2 was added.
The cells were then centrifuged and the supernatant material discarded. This Saiz wash was carried out twice in two other washes. A 0.2 ml amount of the obtained packed cells was suspended in 2 ml of the above-described saline solution. This suspension was then kept at 40 ° C. for one hour. After this time, 2 ml of a 1: 5 dilution of the above BDB solution in the phosphate solution of Example 2 were added and the mixture was placed in a rotary shaker at 4 ° C. and shaken in the dark for 30 minutes. The cells were then centrifuged for 5 minutes at 40 ° C. and washed twice with 4 ml of a cold salt phosphate buffer solution, the pH of which was 7m5, a relatively stable suspension being formed.
Then 1.6 ml of the cold salt-phosphate buffer with a pH value of 7.5 and 0.8 ml of CGTH in 6 ml of a saline solution containing 4 mg of common salt per ml were added to the cell suspension. The indicator obtained in this way was prepared for testing by washing the mixture once with 25 ml BSA 1:50 in saline solution and centrifuging it at 300 revolutions per minute for 5 minutes and resuspending the material in a vortex mixer.
A 0.9 ml solution of BSA 1:50 in saline was then added to resuspend the indicator and then stored in a refrigerator. A 0.3 ml portion of the above preparation was shaken on the shaker at room temperature for 4 hours. The suspension was then treated on a shaker for one hour at 37 "C. The suspension was washed twice with the saline solution described above and washed once with BSA 1:50 in saline. The cells were then again 0.3 ml in BSA 1 : 50% suspended in saline to give 100% cell concentration.
An indirect agglutination test was then carried out by mixing one drop of the cell suspension with one drop of each of the antibody solutions of increasing dilution. The dilutions were 1: 250, 1: 5001 and 1: 10001. A smooth pattern indicated good, indirect agglutination and such a pattern was shown at both 1: 1000 dilutions. Although this pattern was not as strong as the other two, it was considered smooth agglutination. This shows that the agent according to the invention can be produced and stored separately and can be used for coupling antigen materials, which can then be used for testing.
Example 4
A means for producing an immunological indicator has been obtained from yeast cells and BDB.
When human CGTH was added to this agent, coupling of human CGTH to yeast cells could be achieved with the aid of the chemical coupling agent BDB. The indicator thus obtained was used in combination with the antibody for CGTH to carry out a test for inhibition of agglutination.
One gram of the yeast Saccharomyces cerevisiae was weighed out and washed three times with 200 ml of the saline solution described above. The yeast used was the one sold under the trade name Fleischmanns Active Dry Yeast.
The yeast cells were then resuspended in 400 ml of a saline solution containing 10 / o formaldehyde. The suspension was left to stand at room temperature for 24 hours with occasional shaking. The cells were then centrifuged at 2000 revolutions per minute for a period of 10 minutes and the packed cells were removed and stored at 40 ° C. in 200 ml of the saline solution described above. When measured in the hematocrit, the suspension showed a value of 1.40 / 0.
To 0.5 ml of the packed formaldehyde-treated yeast cells were added 12 ml of the above-described phosphate buffer and then 6 ml of saline, and then the cells were combined with 40 ml of a 1: 5 dilution of the above BDB solution. The agent thus obtained was reacted with CGTH to form an indicator, this was separated by centrifugation and three.
times with the saline solution described above, after which the packed cells were resuspended in a 1:50 dilution of BSA saline. The suspension obtained showed a hematocrit value of 60 / o.
The above cell suspension was then used with CGTH antibody at a dilution of 1: 500 to test two urine samples for the presence of CGTH. A 0.2 ml portion of the 60 / above cell suspension was washed once and diluted 1:50 with BSA in saline to the usual concentration to achieve a final volume of 0.2 ml. One drop of urine from a woman known to be pregnant was mixed with one drop of the CGTH antibody solution, and the mixture was allowed to stand for 2 minutes. Then a drop of this mixture was placed on a glass plate. A drop of the indicator was mixed with the material on the glass plate. A smooth pattern formed, indicating the presence of pregnancy.
The test was repeated with the urine of a non-pregnant woman and a granular agglutinated pattern was formed in a short time.
This example shows that yeast cells can be used as indicator particles in an agent or an indicator produced therefrom. These cells have the advantage that they can be purchased in a dry, stable form.
Example 5
A means for producing an indicator was prepared by using Escherichia coli as microbial cells and using a carbodiimide as a coupling agent. When producing an indicator from this agent, CGTH was used as an antigen substance. This indicator was used both for checking agglutination and checking for inhibition of agglutination.
Preparation of the reagents
Microbial cells: the cells of Escherichia coli were grown as in Example 2, isolated from the growth medium and treated with formaldehyde. A volume of 20 ml of a 2.5 above suspension was prepared in this way. This suspension was centrifuged off and 0.5 ml of the packed cells were used to prepare the indicator system.
Coupling agent: 0.2 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide was dissolved in 0.5 ml of tetrahydrofuran, and then 1.0 ml of distilled water was added to the solution.
Antigenic substance: 40 mg of CGTH were dissolved in 2 ml of distilled water. The CGTH used had an activity of 2590 international units per mg and was purchased from Vitamerican Corp., Little Falls, New York.
Solution of the CGTH antibody: Portions of the antibody solution and the 0.85/0 saline solution prepared according to Example 2 were used to make dilutions of the CGTH / antibody of 1:50, 1: 100 and 1: 200.
This example shows that carbodimide can be used as a coupling agent to bind the antigen substance to the microbial cells.
To produce further indicators, human serum albumin (human serum albumin = HSA) and horses γ-globulin were used as antigens.
Example 6
The indicators and the agglutination tests of Example 5 were repeated with the same results by using N-t-butyl-5-methylisoxazolium perchlorate instead of carbodiimide as the coupling agent.
This coupling agent was used by applying 10 ml of a 2.5% suspension of the formaldehyde-treated cells of Example 2 and centrifuging for 5 to 10 minutes to remove the supernatant solution. The cells were then washed four times with cold water and resuspended in 20 ml of a 0.10 / above sodium bicarbonate solution in distilled water. A quantity of 3 mg succinic anhydride was then added and the cells were shaken overnight at 4 ° C. The cells were centrifuged and washed three more times with water, whereupon the succinilated cells were resuspended in 5 ml of distilled water. A pipette was used used to add 10 microliters of triethylamine to the cells.
17 mg of N-t-butyl-5-methylisoxazolium perchlorate were then added. This coupling agent is known under the name Woodward's Reagent L.
The agent thus formed for producing an immunological indicator was used to couple the antigens described in Example 5 in the amounts indicated there. Human serum albumin and horse y-globulin were coupled to the cells of Escherichia coli according to the above-mentioned procedure, with a conversion of 1:10 of the rabbit antibody with respect to human serum albumin and a conversion of 1:10 of the rabbit antibody against horse y-globulin. globulin each delivered agglutination. On the other hand, no agglutination was produced when normal rabbit serum 1:10 was used.
Example 7
12 different indicators were produced by carrying out the formaldehyde treatment of the microbial cells according to Example 2 and carrying out the coupling of the antigen to these microbial cells with the aid of BDB. The following microbial cells were used: Bacillus subtilis, Bacillus pumilus, Lactobacillus leichmannii and Pseudomonas fragi, and the antigens used in combination with these indicator particles were human serum albumin, horse γ-globulin and human insulin.
Plate-type agglutination tests were performed.
The Bacillus subtilis and the Bacillus pumilus were cultivated in the same manner as described for the Escherichia coli cells in Example 2.
The Lactobacillus leichmannii was grown for the same time under the same temperature of 370 C on a broth which was composed as follows: 890 ml of water, 100 mol of tomato juice filtrate,
10ml Bacto-Tween 80, 7.5g yeast extract, 7.5g peptones, 10g dextrose and 2g secondary sodium phosphate. The broth had a pH of 6.8 and had been treated in the autoclave for 10 minutes at 1210 ° C. under a pressure of 1 atm for sterilization.
The Pseudomonas fragi cells were cultured for 4 1/2 hours at room temperature (250 C) in a previously sterilized broth consisting of 1 liter of water, 5 g of tryptone, 5 g of yeast extract, 1 g of dextrose and 1 g of secondary sodium phosphate.
The recovered cells were treated with formalin and 0.25 ml of the packed cell volume of each of the cells described was used for the coupling procedure described in Example 2. For this purpose, three batches of each of these cells were suspended in 6 ml of the phosphate buffer described in Example 2, and the following antigens, which were dissolved in 5 mol of a 0.85% saline solution, were added to each portion of the suspended cells. The antigens used were: 3 mg human serum albumin, 40 mg horse γ-globulin and 20 mg insulin. Then 20 ml of a 1: 5 dilution of the BDB solution of Example 2 in phosphate buffer was added to carry out similar coupling reactions.
Each of the 12 mentioned indicators was tested with the corresponding antibodies and with normal serum as a comparison test. The indicators containing human serum albumin or horse γ-globulin were tested with a 1:50 dilution of the antibody for human serum albumin formed in rabbits or the antibody for horse γ-globulin formed in rabbits in saline.
The insulin indicator systems were tested with a guinea pig serum containing undiluted insulin antibodies in saline. The comparative runs of each of the 12 tests were performed by testing a 1:10 dilution of a common rabbit serum in saline. The antibodies corresponding to each of the antigens agglutinated each of the four indicators prepared with the individual antigens, and no agglutination was found in any of the comparative experiments.
The invention relates to all means for producing immunological indicators, provided they are means of the microbial cell coupling agent type. These agents can be bound to antigen substances, as a result of which an immunological indicator of the type microbial cell coupling agent antigen substance is obtained which can be used to carry out a large number of tests and to manufacture test devices.
PATENT CLAIM 1
Means for producing an immunological indicator which is suitable for chemical binding to antigens, characterized in that it is composed of microbial cells to which a compound is bound via a covalent chemical bond which still has at least one free reactive group, this being reactive Group is able to react with antigens when the agent is brought into contact with them.
SUBCLAIMS
1. Means according to claim I, characterized in that the microbial cells are bacterial cells, fungal cells, parasite cells, protozoan cells or virus cells.
2. Means according to claim I, characterized in that the microbial cells have the same shape and size and have a maximum dimension in one direction in the range from 0.2 to 10 microns.
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