DE2429231A1

DE2429231A1 - DIAGNOSTIC MEDICINE FOR TREPONEMA BACTERIA

Info

Publication number: DE2429231A1
Application number: DE19742429231
Authority: DE
Inventors: Gareth Denzil Ball
Original assignee: GREYWARD LAB INTERCONTINENTAL
Current assignee: GREYWARD LAB INTERCONTINENTAL
Priority date: 1973-06-15
Filing date: 1974-06-18
Publication date: 1975-01-09
Also published as: FR2233024A1

Description

TH. HEGEL · DIPL.-ING. KtAUS DICKEL P A T E NT ANWÄLTE 2429231 TH. HEGEL DIPL.-ING. KtAUS DICKEL PATE NT ANWÄLTE 2429231

200Ό Haipburg BO200Ό Haipburg BO

Große Bergstraße 223 Postfach, 5Q08 62 Telefon: (04O) 396295 Telegramin-Adresse: DoellnerpatentGroße Bergstrasse 223 P.O. Box, 5Q08 62 Telephone: (04O) 396295 Telegramin address: Doellnerpatent

Ihr Zeichen: Unser Zeichen: DatumYour reference: Our reference: the date

H 2340 Dr.He/schH 2340 Dr. He / sch

Greyward Laboratories Intercontinental LimitedGreyward Laboratories Intercontinental Limited

Shuttleworth Road ; Bedford ; Bedfordshire, EnglandShuttleworth Road; Bedford; Bedfordshire, England

"Diagnostikum für Treponema-Bakterien""Diagnostic for Treponema Bacteria"

Die Erfindung bezieht sich auf ein diagnostisches Präparat und besonders auf solche Präparate, die zur Verwendung beim Treponema-Blutgerinnungstest geeignet sind. Mit anderen Worten richtet sich die Erfindung in erster Linie auf Präparate, die als Testagentien in der Diagnose bei Treponema-Erkrankungen, die im allgemeinen als Syphilis oder Frambösie bekannt sind, geeignet sind.The invention relates to a diagnostic preparation and more particularly to such preparations for use in Treponema blood coagulation tests are suitable. In other words, the invention is primarily aimed at preparations acting as testing agents in the diagnosis of treponemal disease, commonly known as syphilis or yaws are suitable.

Innerhalb der letzten 40 Jahre sind verschiedene Blutgerinnungsteste für Syphilis vorgeschlagen und versucht worden aber stets nur mit begrenztem Erfolg. In den letzten Jahren ist ein Treponema-Blutgerinnungstest vorgeschlagen worden, der in beschränktem Maße erfolgreich gewesen ist (vgl. denVarious blood coagulation tests have been carried out over the past 40 years It has been suggested and attempted for syphilis but has always had limited success. In recent years a Treponema blood coagulation test has been proposed, which has been successful to a limited extent (cf.

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Aufsatz von T. Rathiev in der Weltgesundheitsorganisation VDT/ RES/77,65). Eine hohe Empfindlichkeit unter Verwendung dieses besonderen Tesies wurde durch Tomizawa und Kasamatsu in der Zeitschrift Jap.J.Med.Sci.Biol. 19, 305 und von Rathiev im Brit. J.Vener.Dis. 43, 181 bestätigt. Im Handel waren Reagentien zur Verwendung auf dem Gebiet der Serologie von Geschlechtskrankheiten zu finden, die auf diesen Arbeiten beruhen. Wie unten näher angegeben, unterscheidet sich das diagnostische Präparat der vorliegenden Erfindung von dem Vorschlag von Rathiev in sehr beträchtlicher Hinsicht.Article by T. Rathiev in the World Health Organization VDT / RES / 77,65). A high sensitivity using this special tesies was made by Tomizawa and Kasamatsu in the Journal Jap.J.Med.Sci.Biol. 19, 305 and by Rathiev in Brit. J.Vener.Dis. 43, 181 confirmed. Reagents for To find use in the field of serology of venereal diseases based on this work. As detailed below stated, the diagnostic preparation of the present invention differs from Rathiev's proposal in a very considerable way Respect.

Die früheren Vorschläge verwendeten Schaafs-Erythrocyten, insbesondere solche von Freilandschaafen, die mit Treponema-Pallidum gepaart waren. In der Praxis haben derartige diagnostische Präparate sich als ungenügend zuverlässig erwiesen. Mit anderen Worten, sie ergaben falsche positive oder falsche negative Resultate mit bei weitem zu großer Häufigkeit. Dies bedeutete, daß manche Fälle von Syphilis nicht diagnostiziert wurden, oder, was möglicherweise noch schlechter war,' bei routinemäßig untersuchte Patienten, beispielsweise im Falle von schwangeren Frauen, irrtümlich festgestellt wurde, daß sie möglicherweise Syphilis haben.The earlier proposals used Schaaf's erythrocytes, in particular those from free-range sheep that were mated with Treponema pallidum. In practice such diagnostic preparations have proved to be insufficiently reliable. In other words, they gave false positives or false negatives far too often. This meant that some cases of syphilis were undiagnosed, or, possibly worse, 'when examined routinely Patients, for example in the case of pregnant women, have mistakenly determined that they may have syphilis to have.

Die Anmelder haben ihre Anstrengungen auf die Entwicklung eines einfachen und raschen pathologischen Testverfahrens gerichtet, daß eine Diagnose von Treponema-Krankheiten mit wesentlich verbesserter Zuverlässigkeit hinsichtlich positiver und negativer Resultate ermöglicht. Das Reagenz kann als Packung für einen Treponema-Blugerinnungstest in bequemer Form zur Verwendung in pathologischen Laboratorien ausgeliefert werden. Die vorliegende Erfindung beruht auf diesen Untersuchungen.Applicants have directed their efforts to the development of a simple and rapid pathological test procedure, that a diagnosis of treponemal diseases with much improved Reliability in terms of positive and negative Enables results. The reagent can be packaged in a treponemal coagulation test pack in a convenient form for use in pathological laboratories. The present invention is based on these studies.

In erster Hinsicht betrifft die Erfindung gegerbte Vogelerythrocyten. In a first aspect, the invention relates to tanned avian erythrocytes.

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Gemäß einer zweiten und abgeänderten Form der Erfindung wird ein diagnostisches Präparat hergestellt, das zur Verwendung beim Treponema-Blutgerinnungstest verwendbar ist, welches aus gegerbten Vogelerythrocyten besteht. ^According to a second and modified form of the invention a diagnostic preparation prepared for use in Treponema blood coagulation test can be used, which is made from tanned Avian erythrocytes. ^

In dritter abgeänderter Hinsicht schafft die Erfindung ein diagnostisches Präparat, das geeignet ist,,, für einen Treponema-Blutgerinnungstest, weiches aus gegerbten Vogelerythrocyten besteht, tile mit: einem Treponema-An ti gen beladen sind.In a third modified aspect, the invention provides a diagnostic Preparation that is suitable for a treponema blood coagulation test, which consists of tanned avian erythrocytes, tiles are loaded with: a Treponema antigen.

Ein vierter Gegenstand der Erfindung ist eine Packung für einen Treponema-Blutgerinnungstest, die aus zwei Fläschchen besteht, von denen das erste ein diagnostisches Präparat enthält, welches aus gegerbten Vogelerythrocyten besteht, die mit Treponema-Antigen beladen sind, während das zweite Fläschchen ein diagnostisches Präparat enthält, das aus gegerbten Vogelerythrocyten besteht_r die nicht mit Trepora|ma-Antigen beladen, aber im übrigen mit den gegerbten Vogelerythrocyten, welche im ersten Fläschchen enthalten sind, identisch sind. Der Packung beigefügt sind Instruktionen zur Durchführung des Treponema-Blutgerinnungstestes unter Verwendung des Inhaltes der beiden Fläschchen.A fourth subject of the invention is a pack for a Treponema blood coagulation test, which consists of two vials, the first of which contains a diagnostic preparation which consists of tanned avian erythrocytes which are loaded with Treponema antigen, while the second vial contains a diagnostic preparation contains, from the tanned Vogelerythrocyten _r is the non with Trepora | loaded antigen-ma, but are otherwise identical to the tanned Vogelerythrocyten contained in the first vial. The package includes instructions for performing the treponema blood coagulation test using the contents of the two vials.

Offensichtlich besteht der einzige Unterschied der Sustanz gemäß vorliegender Erfindung und den früheren Vorschlägen in der Verwendung gegerbter Vogelerythrocyten anstelle von Schaafserythrocyten, wie es bisher vorgeschlagen worden ist. Wir machten lediglich die Entdeckung, daß die Verwendung gegerbter Vogelerythrocyten eine sehr wesentliche Verbesserung in der Verläßlichkeit des Testes im Vergleich mit Schaafserythrocyten mit sich bringt} dies war das Ergebnis wesentlicher Untersuchungen, die sich auf die Trennung von Erythrocyten aus einer Anzahl verschiedener Quellen bezog. Wir waren überrascht zujfinden, daß die Verläßlichkeit des Testes so weitgehend durch die Quelle der Erythrocyten bestimmt war, aber als Ergebnis der Forschungen, dieObviously, the only difference between the substance of the present invention and the previous proposals is that Use of tanned avian erythrocytes instead of sheep erythrocytes, as has been suggested so far. We merely made the discovery that the use of tanned avian erythrocytes a very substantial improvement in the reliability of the test compared to sheep erythrocytes brings} this was the result of major studies focused on the separation of erythrocytes from a number of different ones Sources related. We were surprised to find the reliability of the test so largely due to the source of the erythrocytes was intended, but as a result of the research that

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wir bei der Selektion durchgeführt haben, besteht kein Zweifel, daß die Verwendung von Vogelerythrocyten die deutlichste Verbesserung mit sich bringt.As we have done in the selection, there is no doubt that the use of avian erythrocytes is the most significant improvement brings with it.

Um die Erfindung besser verständlich zu machen, wird im folgenden beispielsweise die Herstellung von diagnostischen Präparaten gemäß der Erfindung beschrieben, die zur Verwendung bei einem Treponema-Blutgerinnungstest geeignet sind. Es soll im einzelnen erläutert werden, wie diese diagnostischen Präparate verwendet werden, um sowohl einen qualitativen wie einen quantitativen Test durchzuführen. Wie im einzelnen in der folgenden Beschreibung näher ausgeführt wird, ist zur Erzielung vollständiger Ergebnisse im Testverfahren sowohl ein Testzellenpräparat mit Treponemaantigen und ein Kontrollzellpräparat erforderlich, das im übrigen völlig deich ist^ aber kein Treponemaantigen enthält. Im folgenden soll daher zunächst beschrieben werden, wie das Treponemaantigen hergestellt werden kann.In order to make the invention better understood, the following is an example of the production of diagnostic preparations according to the invention, which are suitable for use in a treponemal blood coagulation test. It should be in detail explains how these diagnostic preparations are used to be both qualitative and quantitative Perform test. As will be explained in more detail in the following description, it is more complete to achieve this Results in the test procedure both a test cell preparation with treponema antigen and a control cell preparation required, which is otherwise completely dyke, but does not contain any treponema antigen. In the following, it will therefore first be described how the treponema antigen can be produced.

Herstellung des Treponema AntigenProduction of the Treponema antigen

Wir bevorzugen einen Treponemastamm, der bekannt ist unter dem Namen Nichol's Treponema Pallidum.We prefer a treponema strain known by the Name Nichol's Treponema Pallidum.

Das Antigen wird durch Beimpfung von Kaninchen hergestellt. Wir fanden es zweckmäßig, für jedes Programm 6 Tiere zu verwenden. Zunächst wurde eine Suspension geeigneter Konzentration hergestellt. Es handelt sich beispielsweise um 100 Treponema-Bakterien, die im mikroskopischen Feld bei Dunkelfeldbeleuchtung mitThe antigen is produced by inoculating rabbits. We found it convenient to use 6 animals for each program. First, a suspension of a suitable concentration was prepared. There are, for example, 100 Treponema bacteria, those in the microscopic field with dark field illumination

3 einem 4,2mm-Objektiv sichtbar sind. 1 cm wird in jeden Hoden großer,geschlechtsreifer,männlicher Kaninchen eingeimpft. Jedes Tier wird dann mit 0,3 ecm Kortison-Acetat B.P. geimpft, und zwar 25 mg/ccm intramuskulär täglich 9 Tage lang. Die Diät der Tiere bestand aus einer täglichen Portion Kohl. Am neunten Tage3 are visible with a 4.2mm lens. 1 cm is in each testicle large, sexually mature, male rabbit inoculated. Each Animal is then treated with 0.3 ecm cortisone acetate B.P. vaccinated, and 25 mg / ccm intramuscularly daily for 9 days. The diet of the Animals consisted of a daily serving of cabbage. On the ninth day

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wurden die Tiere getötet, ihre Hoden wurden herausgenommen und in ein geeignetes Kulturmedium,z.B. T.P.I. Medium, eingebracht.the animals were sacrificed, their testes removed and placed in a suitable culture medium, e.g. T.P.I. Medium, introduced.

Die Hoden wurden mit dem gleichen Medium gewaschen, vorzugsweise wiederum T.P.I. Medium und seziert, um eine große Oberfläche zu schaffen. Die Hoden wurden dann mit T.P.I.Medium gewaschen, um Treponema Bakterien für weitere tierische Impfungen zu erhalten, was unmittelbar erfolgen mußte. Die Suspensionen wurden vorsichtig geschüttelt, um genügend Ausbeute an Treponema—Bakterien zu erhalten, oder sie wurden Kochsalzlösung gewaschen, um Treponema— Bakterien für Antigenhersteilung zu gewinnen. Die Suspensionen wurden in der Kochsalzlösung kräftig geschüttelt, um eine maximale Ausbeute zu erhalten.The testes were washed with the same medium, preferably again T.P.I. Medium and dissected to cover a large surface area create. The testes were then washed with T.P.I. medium in order to To receive Treponema bacteria for further animal vaccinations, what had to be done immediately. The suspensions became cautious shaken to get enough Treponema bacteria yield obtained, or they were washed with saline solution to remove Treponema— Obtaining bacteria for antigen production. The suspensions were shaken vigorously in the saline solution to a maximum Yield.

Im letzteren Fall wurden die vereinigten Suspensionen mit verhältnismäßig geringer Geschwindigkeit zentrifugiert, um Bruchstücke zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wurde abgezogen, mikroskopisch auf ihre Reinheit und durch Züchtung auf mögliche Verunreinigungen geprüft. Die abgezogene. Flüssigkeit wurde bei 4°C aufbewi
erhalten worden war.In the latter case, the combined suspensions were centrifuged at a relatively low speed to remove debris. The supernatant liquid was drawn off, examined microscopically for purity and by culturing for possible contamination. The withdrawn. Liquid was stored at 4 ° C
had been received.

wurdebei 4°C aufbewahrt, bis ein genügendes Volumen hiervonwas stored at 4 ° C until a sufficient volume thereof

Die Treponema-iSuspension Wurde dann mit hoher Geschwindigkeit zentrifugiert, um die Treponema—Bakterien als Niederschlag zu erhalten. Die überstehende Flüssigkeit wurde verworfen. Die Treponema—Bakterien wurden wieder in Kochsalzlösung suspendiert und 6 Mal zvecks sorgfältiger Wäsche zentrifugiert. Schließlich wurden die Treponema—Bakterien in destilliertem Wasser in einer Konzentration suspendiert, die der Trübung einer Brownschen Röhre Nr. 4 entsprach. Dann wurden die Bakterien in der Suspension 10 Minuten lang durch Einwirkung von Ultraschallwellenenergie zerschlagen, während der Behälter durch fließendes Wasser gekühlt wurde. Schließlich wurde Kochsalz bis zu einer Schlußkonzentration von 1:1000 zugesetzt.The Treponema iSuspension was then applied at high speed centrifuged to precipitate the Treponema bacteria obtain. The supernatant liquid was discarded. the Treponema bacteria were resuspended in saline and centrifuged 6 times for careful washing. In the end were the Treponema bacteria in distilled water in a Concentration suspended corresponding to the turbidity of a No. 4 Brownian tube. Then the bacteria were in suspension Smashed by the action of ultrasonic wave energy for 10 minutes while the container by running water was cooled. Finally, common salt was added to a final concentration of 1: 1000.

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Die Proben des Antigens können in ihrer Wirksamkeit von der einen zur anderen schwanken. Wir ziehen es daher vor, die geeignetste Verdünnung für jede einzelne Probe auszuwählen. Verschiedene Verdünnungen einer besonderen Probe von Antigen wurden verwendet, um eine Reihe von Testzellen zur Verwendung bei einem geeigneten Testverfahren zu gewinnen. Diese werden bei dem quantitativen Test benutzt, der weiter unten näher beschrieben wird, wobei sowohl positive wie negative Standardkontrollseren benutzt werden. Die zu wählende korrekte Verdünnung ist die, bei der die maximale Empfindlichkeit im positiven Test und die charakteristischsten Merkmale im negativen Test erhalten werden.Samples of the antigen can vary in effectiveness from one to the other. We therefore prefer the most suitable Select dilution for each individual sample. Various dilutions of a particular sample of antigen were made used to obtain a number of test cells for use in an appropriate test procedure. These are at the quantitative test described in more detail below, using both positive and negative standard control sera to be used. The correct dilution to be chosen is that at which the maximum sensitivity is positive Test and the most characteristic features are obtained in the negative test.

Herstellung des Vorrates an VogelerythrocytenManufacture of avian erythrocyte stocks

Frisches Vogelblut wird durch Muslintuch filtriert, um etwaiges Gerinnsel zu entfernen und dann mit Kochsalzlösung gewaschen, bis eine klare überstehende Flüssigkeit erhalten wird. Die Schicht mit den weißen Blutzellen wird entfernt. Die gewaschenen Zellen werden mit einer auf einen pH-Wert von 7,2 gepufferten Phosphatsalzlösung auf ein^e Konzentration von 7% eingestellt. In einer ebenfalls auf einen pH-Wert von 7,2 gepufferten Phosphatsalzlösung wird ein gleiches Volumen einer 7%-igen Formalinlösung hergestellt ( 7 ecm Formalin mit 37-40% Formaldehyd + 30 ecm Verdünnungsmittel). Das Formalin wird, wie oben angegeben, den gewonnenen roten Vogelblutkörperzellen in zwei Stufen zugegeben. Zunächst werden 25 Vol.-% des Formalins sorgfältig mit den roten Blutzellen gemischt und bei 37°C eine Stunde lang im Wasserbad bebrütet. Die übrige Formallnlösung wird dann zugegeben und das ganze wiederum bei 37°C 18 Stunden lang bebrütet, wobei das ganze während der ersten drei oder vier Stunden häufig durchgemischt wird. Hierauf wird die Suspension der roten Blutkörperzellen zentrifugiert, die überstehende Flüssigkeit wird verworfen. Dies wird mindestens für 10 Wäschen mit Kochsalz-Fresh bird blood is filtered through muslin cloth to remove any clots and then washed with saline, until a clear supernatant liquid is obtained. The white blood cell layer is removed. The washed ones Cells are buffered with a pH of 7.2 Phosphate salt solution adjusted to a concentration of 7%. An equal volume of a 7% formalin solution is added to a phosphate salt solution also buffered to a pH of 7.2 produced (7 ecm formalin with 37-40% formaldehyde + 30 ecm diluent). The formalin is, as stated above, added to the recovered avian red blood cells in two stages. First, 25% by volume of the formalin are carefully mixed with the red blood cells and immersed at 37 ° C for one hour Incubated water bath. The remaining formal solution is then added and the whole is again incubated at 37 ° C for 18 hours, mixing frequently for the first three or four hours. Thereupon the suspension becomes the red Blood cells are centrifuged and the supernatant is discarded. This is done for at least 10 washes with saline

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lösung wiederholt. Die roten Blutkörperzellen werden dann zu einer 10 %-igen Suspension in 0,1 %-iger Kochsalzlösung verdünnt. Der Vorrat an Erythrocytensuspension muß gegenüber einer vorhandenen Suspension getestet werden, um sicherzustellen, daß er mit dem positiven und dem negativen Serum die gleichen Erscheinungen wie das Standardpräparat liefert.solution repeated. The red blood cells then become too a 10% suspension diluted in 0.1% saline solution. The stock of erythrocyte suspension must be tested against an existing suspension to ensure that that it is the same with the positive and negative serum Provides phenomena like the standard preparation.

Herstellung des TestpräparatsManufacture of the test preparation

Die Vorratssüspension der formalisierten Vogelerythrocyten stellt ein stabiles Erzeugnis dar und kann im Vorrat hergestellt und zu geeigneten Anteilen zur Herstellung von Test- und KontrollPräparaten verwendet werden. Zur Sicherheit wird jede einzelne Probe für sich gegerbt, wie dies noch näher ausgeführt wird,und dann in zwei Teile geteilt, von denen der eine zur Herstellung des Testpräparats und der andere für ein Zellkontrollpräparat verwendet wird.The supply suspension of formalized avian erythrocytes represents a stable product and can be produced in stock and in suitable proportions for the preparation of test and Control preparations can be used. To be on the safe side, each individual sample is tanned individually, as will be explained in more detail below and then divided into two parts, one for making the test preparation and the other for a cell control preparation is used.

Ein derartiger Teil des formalisierten Vorrats an Vogenerythrocyten wird verdünnt und unter Verwendung einer 0,005 %-igen Gerbsäurelösung gegerbt. Nach dem Waschen und Zentrifugieren werden die gegerbten Zellen mit Treponema—Antigen in geeigneter Verdünnung beladen, wobei die Verdünnung vorher durch einen Versuch, wie oben angegeben, festgestellt worden ist. Die Beladung erfolgt bei 37°C in einer auf einen pH-Wert von 6,4 gepufferten Salzlösung. Nach dem Waschen werden die Zellen wieder in einer schwachen Verdünnung eines vorbereiteten tierischenSuch a part of the formalized supply of venerythrocytes is diluted and using a 0.005% strength Tanned tannic acid solution. After washing and centrifugation, the tanned cells are appropriately treated with Treponema antigen Load the dilution, the dilution having previously been determined by an experiment as indicated above. The loading takes place at 37 ° C in a buffered to a pH of 6.4 Saline solution. After washing, the cells are reassembled in a weak dilution of a prepared animal

ist Serums suspendiert. Diese Suspension so eingestellt, daß sie die korrekte Sedimentationsgeschwindigkeit liefert, wenn der Treponema—Blütgerinnungstest durchgeführt wird. Es wurde gefunden, daß das tierische Serum, das hierfür ausgewählt wird, nicht von großer Bedeutung ist; für die technische Herstellung wird im allgemeinen 1,5 %-iges Kaninchenserum verwendet. Versuche haben jedoch ergeben, daß auch anderes tierisches Serum verwen-is serum suspended. This suspension adjusted so that it Provides the correct rate of sedimentation when using the Treponema Clotting Test. It was found, that the animal serum chosen for this is not is of great importance; 1.5% rabbit serum is generally used for technical production. try have shown, however, that other animal serum is also used.

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det werden kann, wenn es in passend verdünnter Lösung angewendet wird. Wie weiter unten näher auseinandergesetzt, werden Präparate sowohl zur Verwendung bei Makroversuchen als auch für Mikroversuche hergestellt. Dabei wird ein höherer Prozentsatz der Zellen zur Herstellung der Makrotestproben als für Mikrotestproben verwendet, um ein leicht erkennbares, sichtbares Ergebnis bei der Durchführung des Treponema—Blutgerinnungstestes zu erzielen.can be det, if it is used in a suitably diluted solution. As will be discussed in more detail below Preparations made for use in both macro and micro tests. There will be a higher percentage of the cells used for the preparation of the macro test samples than for micro test samples in order to have an easily recognizable, visible Result of performing the treponema blood coagulation test to achieve.

Herstellung des KontrollpräparatsManufacture of the control preparation

Die Herstellung des Kontrollpräparats geschieht in ähnlicher Weise wie die des Testpräparats unter Verwendung der anderen Hälfte der formalisierten Vogelerythrocyten. Aber bei der Herstellung des Antigens erfolgt keine Verdünnung und es wird eine gleiche Menge von auf einen pH-Wert von 6,4 gepufferter Kochsalzlösung zugefügt. Wir bevorzugen es, diagnostische Testpackungen herzustellen, in denen zwei Fläschchen mit Testpräparat und ein Fläschchen mit Kontrollpräparat vorhanden ist, zusammen mit einer schriftlichen Instruktion, wie das Testverfahren durchzuführen ist. Zur leichteren Verwendung werden die Reagentien in flüssiger Form dargeboten, die nach Schütteln unmittelbar gebrauchsfertig ist. Es werden zwei verschiedene Größen für einen Makrotest und für einen Mikrotest mit verschiedenen Verdünnungen vorgesehen, sodaß der Test sich leicht in die Arbeitsweise jedes vorhandenen pathologischen Laboratoriums einfügt. Die in Form einer Suspension aufbewahrten Reagentien haben eine stabile Lebensdauer von mindestens 4 Wochen, wenn sie bei 4°C unter üblichen Laboratoriumsbedingungen gelagert werden. Dennoch ist es für eine verlängerte Lebensdauer oder für eine Exportverschiffung in Betracht zu ziehen, friegetrocknete Präparate herzustellen. Die Forschung wird noch fortgesetzt, um die günstigste Form der Herstellung für lange Lebensdauer in gefro«-The preparation of the control preparation is carried out in a similar manner to that of the test preparation using the others Half of the formalized avian erythrocytes. But in manufacturing the antigen is not diluted and an equal amount of buffered to pH 6.4 is used Saline solution added. We prefer to produce diagnostic test packs in which two vials of the test product and a vial of control is provided, along with written instructions on how to test is to be carried out. For ease of use, the reagents are presented in liquid form, which is immediately ready for use after shaking. It'll be two different Sizes are provided for a macro test and for a micro test with different dilutions, so that the test can be easily converted into incorporates the operation of any existing pathology laboratory. The reagents stored in the form of a suspension have a stable lifespan of at least 4 weeks if they are stored at 4 ° C under normal laboratory conditions. Nonetheless, freeze-dried preparations should be considered for an extended lifespan or for export shipping to manufacture. Research is still ongoing to find the most favorable form of manufacture for long life in frozen

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renem Zustande zu ermitteln.to determine renem condition.

Der Treponema—BlutgerinnungstestThe Treponema Blood Clotting Test

Der Test kann entweder zur raschen Orientierung dienen, wobei eine negative oder eine positive oder auch nur eine schwache Reaktion erzielt wird, oder er kann auch auf quantitativer Basis durchgeführt werden.The test can be used either for quick orientation, with a negative or a positive or just a weak reaction or it can be done on a quantitative basis.

Der Makroorientierungstest wird durchgeführt mit einer Standardblutgerinnungsplatte der Weltgesundheitsorganisation unter Verwendung einer einmaligen Verdünnung des Serums des Patienten im Verhältnis 1:30. Diese Lösung wird mit dem Makrotestpräparat im Verhältnis 3:2 vermischt. Bei dem entsprechenden Mikroorientierungstest wird eine Standardplatte für Mikrotiter mit u-förmigem Boden angewendet* und eine einmalige Verdünnung des Patientenserums im Verhältnis 1:20 wird mit dem Mikrotestpräparat im Verhältnis 1:3 vermischt. Zur Durchführung eines quantitativen Testes erfolgt eine Verdoppelung, Vervierfachung, usw. der Verdünnung des Patientenserums j dann werden Mischungen mit den •Testpräparaten in gleichen Verhältnissen wie für die Orientierungsversuche vorgenommen.The macro-orientation test is performed with a standard blood clotting plate of the World Health Organization using a single dilution of the patient's serum in a ratio of 1:30. This solution is used with the macro test preparation mixed in a ratio of 3: 2. With the corresponding micro-orientation test a standard microtiter plate with a U-shaped bottom is used * and a single dilution of the patient's serum in a ratio of 1:20 is mixed with the micro test preparation in a ratio of 1: 3. To carry out a quantitative Testes a doubling, quadrupling, etc. of the dilution takes place of the patient serum j are then mixtures with the • test preparations in the same proportions as for the orientation experiments performed.

Bei der Durchführung aller dieser Versuche werden die diagnostischen Präparate und das Serum des Patienten vorsichtig miteinander verrührt, um sie gleichmäßig zu mischen. Dann läßt man 30 bis 40 Minuten lang absetzen, um Sedimente in den Vertiefungen der Platten zu erzeugen. Die Sedimente lassen sich leicht mitWhen performing all of these experiments, the diagnostic ones are used Gently stir the preparations and the patient's serum together to mix them evenly. Then one lets Let sit for 30 to 40 minutes to create sediment in the wells of the plates. The sediments can easily be with

dem unbewaffnetem. Auge..als^^ps.itiv^.s.chviach.-.re.agl.eren.d-.-od.er- the unarmed. Eye..als ^^ ps.itiv ^ .s.chviach .-. Re.agl.eren.d -.- or.er-

negativ gemäß folgender Anleitung erkennen:detect negative according to the following instructions:

ein glatter Ring oder ein knopfartiger Niederschlag der Zellen bedeutet eine negative Reaktion,a smooth ring or button-like precipitate of the cells means a negative reaction,

eine gleichmäßige Verteilung eines dünnen, körnigen Niederschlags, die den Boden der Vertiefung bedeckt, bedeutet eine positive Reaktion, 409882/0950an even distribution of a thin, granular precipitate, which covers the bottom of the well means a positive reaction, 409882/0950

ein granulierter Niederschlag wie bei der positiven Reaktion, der jedoch weniger ausgesprochen ist und irreguläre Ringea granular precipitate as in the positive reaction, but less pronounced, and irregular rings

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oder Zellen bildet, bedeutet eine schwache Reaktion.or forms cells means a weak response.

Es können sehr häufig sogenannte Prozonreaktionen auftreten, die als schwache Reaktion bei der Orientierungsprobe und als deutlich positiv bei der quantitativen Probe in Erscheinung treten. Wenn eine schwache oder positive Reaktion eintritt, sollte das Serum des Patienten in gleichen Verdünnung mit dem Kontrollpräparat geprüft werden, um eindeutige Resultate zu erzielen.So-called prozone reactions can occur very often, as a weak reaction in the orientation sample and as a appear clearly positive in the quantitative sample. If there is a weak or positive reaction, the patient's serum should be tested in the same dilution as the control preparation in order to obtain clear results achieve.

Wir haben gefunden, daß Vogelerythrocyten anstelle der bisher verwendeten Schaafserythrocyten beträchtlich die Zahl der nicht eindeutigen Resultate vermindern. Wenn kein eindeutiges Resultat erzielt werden kann, muß eine weitere Probe des Reaktionsserums zunächst mit dem Kontrollpräparat zusammengebracht und dann nochmals getestet werden. Dies beseitigt die Möglichkeit falscher positiver Gerinnungsfaktoren, die im Serum des Patienten möglicherweise vorhanden sein können, da diese auch mit dem Kontrollpräparat allein reagieren, ohne daß das Antigen vorhanden ist. Wenn solche Faktoren zunächst mit dem Kontrollpräparat ausgeschaltet werden, kann die Serumsverdünnung noch einmal mit dem Testpräparat geprüft werden, um nun eindeutige Resultate zu liefern. In der bisherigen Praxis mit den aus Schaafserythrocyten hergestellten Präparaten hat sich ergeben, daß eine große Zahl falscher positiver Reaktionen erzielt wurden, sodaß es notwendig war, um ein Grad von Sicherheit zu erreichen, jedes Serum tatsächlich in dieser Weise zu untersuchen. Im Gegensatz hierzu tritt bei Verwendung der diagnostischen Präparate gemäß vorliegender Erfindung diese Notwendigkeit nur in seltenen Fällen ein.We have found that avian erythrocytes, instead of the sheep erythrocytes used hitherto, do not significantly increase the number of reduce clear results. If no clear result can be achieved, a further sample of the reaction serum must first be combined with the control preparation and then be tested again. This eliminates the possibility of false positive clotting factors that are in the patient's serum may be present, as these also react with the control preparation alone without the antigen being present is. If such factors are first eliminated with the control preparation, the serum dilution can be repeated be tested with the test preparation in order to deliver clear results. In previous practice with those from sheep erythrocytes It has been found that a large number of false positive reactions were obtained, so that it was necessary, in order to achieve a degree of certainty, to actually test each serum in this manner. In contrast for this purpose, when the diagnostic preparations according to the present invention are used, this need only arises in rare cases a.

Vergleichsversuche von Beispielen diagnostischer Präparate, die gemäß vorliegender Erfindung hergestellt worden sind, haben ergeben, daß die Produkte hohe Empfindlichkeit und hohe spezifische Wirkung besitzen, sodaß sie für die generelle Anwendung alsComparative tests of examples of diagnostic preparations which have been produced according to the present invention have shown that the products have high sensitivity and high specific effect, so that they are suitable for general use as

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Orientierungstest für spezifische patologische Treponemaantikörper empfohlen werden können. Das Testverfahren unter Verwendung der diagnostischen Präparate gemäß der Erfindung kann neben den weniger empfindlichen Standardverfahren, die für die Diagnose von Syphilis zur Verfügung stehen, angewendet werden, oder es läßt sich als rasches Testverfahren zur Ausmerzung falscher positiver Resultate verwenden, die mit weniger spezifischen Standardversuchen für Syphilis erzielt worden sind.Orientation test for specific pathological Treponema antibodies can be recommended. The test procedure using the diagnostic preparations according to the invention can be used in addition to the less sensitive standard methods that are used for Diagnosis of syphilis can be available, applied, or it can be used as a rapid test for eradication use false positive results with those with less specific ones Standard trials for syphilis have been made.

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Claims

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1. Tanned avian erythrocytes.

2.) Diagnostic preparation for a Treponema blood coagulation test, consisting of from tanned avian erythrocytes.

3. Diagnostic preparation for a treponema blood coagulation test, consisting of tanned avian erythrocytes loaded with a Treponema antigen.

4. Diagnostic preparation according to claims 2 or 3, at that of the tanned avian erythrocytes with the addition of dilute tannic acid solution as a suspension of formalized avian erythrocytes are present.

5. Diagnostic preparation according to claims 2, 3 or 4, characterized in that the tanned avian erythrocytes are suspended in dilute animal serum present,

6. Diagnostic preparation according to claims 3-5, characterized in that that the Treponema antigen is produced by breaking up Treponema cells.

7. Diagnostic preparation according to claim 6, characterized in that that the disintegration is caused by ultrasonic energy.

8. Diagnostic preparation according to claims 6 or 7, characterized in that the Treponema bacteria for production of the antigen are obtained from the testes of rabbits, which are obtained with a Nichol strain of Treponema pallidum

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are vaccinated.

9. Diagnostic preparation according to claim 2 to 8 in freeze-dry Shape.

10. Pack for a Treponema blood coagulation test, consisting of 2 vials, the first of which is a diagnostic one Contains a preparation consisting of tanned avian erythrocytes, which are loaded with Treponema antigen, while the second vial contains a diagnostic preparation that consists of tanned avian erythrocytes that do not have treponemal antigen loaded but otherwise with the tanned avian erythrocytes of the invented vial are identical, as well Instructions for performing the treponema blood coagulation test using the contents of the two vials.

11. Pack according to claim 10, characterized in that the first vial is a diagnostic preparation according to one of the Claims 3 to 9 contains.

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