DE2560402C2 - Process for the preparation of human immune serum globulin suitable for the therapy of hepatitis A - Google Patents
Process for the preparation of human immune serum globulin suitable for the therapy of hepatitis AInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von zur Therapie von Hepatitis A geeignetem, menschlichem ImmunserumglobuHn mit einem Hepatitis-A-Antikörpertiter von wenigstens etwa 4000 Einheiten/ml.The invention relates to a process for the production of human which is suitable for the therapy of hepatitis A. Immune serum globules with a hepatitis A antibody titer of at least about 4000 units / ml.
Hepatitis A ist eine Leberkrankheit, die zwar im allgemeinen nicht tödlich verläuft, aber zu einer vielwöchigen schwächenden Erkrankung führen kann. Gewöhnlich verbreitet sie sich durch direkte Berührung mit infizierten Personen oder durch infiziertes Trinkwasser oder infizierte Nahrungsmittel.Hepatitis A is a disease of the liver that is generally not fatal, but can last for many weeks debilitating disease. It usually spreads through direct contact with infected people People or through infected drinking water or infected food.
Personen, die in Gefahr sind, von Hepatitis A befallen zu werden, verabreicht man /^Globulin. Dae Prinzip dieser Behandlung beruht auf der Erwartung, daß das /-Globulin Hepatitis- Α-Antikörper in genügender Menge enthält, um der behandelten Person Immunität zu verleihen. Es ist aber bekannt, daß /-Globulin einigen damit behandelten Personen keine Immunität verleiht.People at risk of contracting hepatitis A are given / ^ globulin. The principle this treatment is based on the expectation that the / -Globulin hepatitis Α antibodies in sufficient quantity to give immunity to the person being treated. But it is known that / -Globulin some with it does not confer immunity on treated individuals.
Aufgabe der Erfindung ist es. ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem Immunserumglobulin zur Verfügung zu stellen, mit dem ein solches /-Globulin erhalten wird, das den damit behandelten Personen auf zuverlässige Weise eine ausreichende Immunität verleiht.It is the object of the invention. a process for the preparation of human immune serum globulin for To provide with which such / -Globulin is obtained that the people treated with it reliable way confers adequate immunity.
Im Stammpatent Nr. 25 55 188 ist ein Verfahren zum Nachweis von Antigen oder Antikörper von infektiöser
Hepatitis A in einer Probe beschrieben. Mit diesem Verfahren kann unter anderem auch die Menge an Hepatitis-A-Antikörper
im menschlichen Immunserumglobulin bestimmt werden, das aus Plasma von Blutspendern
gewonnen worden ist.
Die Blutspender können in drei bestimmte Gruppen eingeteilt werden. Die erste Gruppe von Blutspendern
besteht aus demjenigen Teil der allgemeinen Bevölkerung, der Blut durch das Rote Kreuz spendet. Die zweite
Gruppe von Blutspendern sind Personen, die ihr Blut an kommerzielle Blutbanken verkaufen. Die dritte Gruppe
von Blutspendern sind Gefangene. Obwohl in neuerer Zeit vorgeschlagen worden ist, bei der Verarbeitung vom
Plasma zu /-Globulin das Plasma von kommerziellen Blutbanken und Gefangenen nicht zu verwenden, weil
angenommen wurde, daß dieses Plasma unerwünschte Bestandteile enthält, geht die allgemein geübte Praxis
dahin, zwischen der Herkunft des Plasmas keinen Unterschied zu machen und Plasma aus allen drei Quellen
ohne Unterschied zu kombinieren.In the parent patent no. 25 55 188 a method for the detection of antigen or antibodies of infectious hepatitis A in a sample is described. This method can also be used, among other things, to determine the amount of hepatitis A antibodies in human immune serum globulin obtained from the plasma of blood donors.
The blood donors can be divided into three specific groups. The first group of blood donors consists of that part of the general population who donate blood through the Red Cross. The second group of blood donors are people who sell their blood to commercial blood banks. The third group of blood donors are prisoners. Although it has recently been proposed not to use the plasma of commercial blood banks and prisoners in the processing of plasma into / -globulin because it was believed that this plasma contained undesirable components, the common practice is to distinguish between the origin of the Plasmas make no distinction and combine plasma from all three sources without distinction.
Mit Hilfe der Antikörperanalyse konnte festgestellt werden, daß einige Ansätze von /-Globulin entweder überhaupt keinen Hepatitis-A-Antikörper oder nur eine so geringe Konzentration davon enthalten, daß es unwahrscheinlich ist. daß damit ein Immunisierungseffekt erzielt werden kann. Dies erklärt die bekannte Tatsaehe, daß in einigen Fällen mit /-Globulin behandelte Personen nicht immunisiert werden. Wenn keine zuverlässige Analysenmethode auf Hepatitis-A-Antikörper zur Verfugung steht, ist die Darreichung von /-Globulin gewissermaßen ein Glücksspiel. Wenn das /-Globulin Hepatitis-A-Antikörper in ausreichender Konzentration enthält, wird die betreffende Person gegen Ansteckung mit Hepatitis A geschützt. Wenn das /-Globulin andererseits keinen Hepatitis-A-Antikörper oder eine zu geringe Konzentration davon, d. h. weniger als 4000 Einheiten/ ml, enthält, ist es wahrscheinlich, daß damit behandelte Personen nicht gegen die Krankheit immunisiert werden, es sein denn, daß sie bereits eigenen Hepatitis-A-Antikörper besitzen.With the help of the antibody analysis it could be determined that some approaches of / -Globulin either contain no hepatitis A antibody at all, or so low a concentration that it does is unlikely. that an immunization effect can be achieved with it. This explains the well-known fact that in some cases, subjects treated with / -globulin are not immunized. If not a reliable one The method of analysis available for hepatitis A antibodies is the administration of / -Globulin a game of chance, so to speak. If the / -globulin hepatitis A antibodies in sufficient concentration contains, the person concerned is protected against infection with hepatitis A. On the other hand, if the / -globulin no hepatitis A antibody or too low a concentration thereof, d. H. less than 4000 units / ml, it is likely that people treated with it will not be immunized against the disease, unless they already have their own hepatitis A antibodies.
Es wurde ferner gefunden, daß die von jeder dieser drei Gruppen von Blutspendern gewonnenen /-Globuline sich erheblich in ihrem Gehalt an Hepatitis-A-Antikörper unterscheiden. /-Globulin aus Plasma, das von der allgemeinen Bevölkerung stammt, enthält keinen Hepatitis-A-Antikörper oder eine zu geringe Konzentration daran. Andererseits enthält /-Globulin aus Plasma von kommerziellen Blutbanken eine hohe Kovizentration an Hepatitis-A-Antikörper. während /-Globulin aus Plasma von Gefangenen eine noch höhere Konzentration an Hepatitis-A-Antikörper enthält. Durch die NichtVerwendung von Plasma solchen Ursprungs wird also, entgegen der bestehenden Absicht, ein Immunisierungseffekt nicht erzielt.It was also found that the / -globulins obtained from each of these three groups of blood donors differ significantly in their level of hepatitis A antibodies. / -Globulin from plasma produced by the general population does not contain an antibody to hepatitis A or its concentration is too low to it. On the other hand, / -globulin from plasma from commercial blood banks contains a high covicentration Hepatitis A antibodies. while / -globulin from prisoner plasma shows an even higher concentration Contains antibodies to hepatitis A. By not using plasma of such origin, it is against the existing intention of not achieving an immunizing effect.
Durch diese Analysenmethode, die nicht Gegenstand des vorliegenden Patents ist, und die die genaue Bestimmung der Konzentration an Hepatitis-A-Antikörper im /-Globulin erlaubt, ist es nun möglich geworden, ein zuverlässiges Verfahren zur Herstellung von /-Globulin zur Verfügung zu stellen, das der behandelten Person eine zuverlässige Immunität verleiht. Es ist nämlich festgestellt worden, daß das /-Globulin eine Konzentration von 4000 Einheiten/ml oder mehr aufweisen muß. Es wurde weiterhin festgestellt, daß das von kommerziellen Blutbanken und von Gefangenen stammende Plasma ein /-Globulin mit einem Hepatitis-A-Antikörpertiter vonBy this method of analysis, which is not the subject of the present patent, and which provides the exact determination the concentration of hepatitis A antibodies in / -globulin allowed, it has now become possible to use a to provide a reliable process for the production of / -globulin for the person being treated confers reliable immunity. Namely, it has been found that the / -globulin has a concentration of 4000 units / ml or more. It was also found to be used by commercial Blood banks and prisoner-derived plasma in / -globulin with a hepatitis A antibody titer of
mi 4000 Einheiten/ml oder mehr ergibt.mi is 4000 units / ml or more.
Man kann nun ein ,!'-Globulin mit ausreichend hohem Hepatilis-A-Antikörpertiter von 4000 Einheiten/ml oder mehr dadurch herstellen, daß man das von kommerziellen Blutbanken und von Gefangenen siammendes Plasma gesondert von dem von Blutspendern aus der allgemeinen Bevölkerung stammenden Plasma zu /-Globulin verarbeitet, so daß dieses /-Globulin als solches verwendet werden kann, oder man kann ein auf diese WeiseOne can now use a '!' Globulin with a sufficiently high hepatilis A antibody titer of 4000 units / ml or manufacture more by using plasma collected from commercial blood banks and prisoners separate from plasma to / -globulin from blood donors from the general population processed so that this / -globulin can be used as such, or one can be one in this way
bä gewonnenes /-Globulin mit einer vorgegebenen Menge eines -'-Globulins vereinigen, das aus Plasma von Blutspendern aus der allgemeinen Bevölkerung gewonnen worden ist, und einen Titer von weniger als 4000 Einheiten/ml aufweist, so daß man am Ende ein Produkt mit einem Titer von mindestens 4000 Einheiten/mlCombine recovered / -globulin with a predetermined amount of a -'-globulin obtained from plasma of Blood donors have been obtained from the general population and have a titre less than 4,000 Units / ml, so that in the end a product with a titer of at least 4000 units / ml
Das im Stammpatent beschriebene Analyseverfahren wird nachstehend näher erläutert.The analysis method described in the parent patent is explained in more detail below.
Zur Untersuchung einer Probe auf Hepatitis-A-Antikörper setzt man Hepatitis-A-Antigen von bekannter Konzentration zu einer Verdünnungsreihe der zu untersuchenden Proben zu. Nach der Inkubation, um das Antigen mit dem Antikörper unter Bildung eines Komplexes reagieren zu lassen, setzt man Komplement zu und läßt das Komplement durch eine weitere Inkubation mit dem Komplex reagieren. Vorzugsweise setzt man auch noch einen Stoff zu, der die Agglutination irreversibel macht, und sodann setzt man vorgegebene menschliche rote Blutzellen der Gruppe 0 zu. Wenn die Agglutination vollständig ist, wird das Ausmaß der Agglutination bestimmt. Der Endpunkt der Titration ist die niedrigste Konzentration, die einen vorgegebenen Agglutinationsgrad zeigt. A known hepatitis A antigen is used to test a sample for antibodies to hepatitis A Concentration to a dilution series of the samples to be examined. After incubation to get the To allow antigen to react with the antibody to form a complex, complement is added and allows the complement to react with the complex by a further incubation. It is also preferable to bet Another substance is added that makes the agglutination irreversible, and then one adds a given human group 0 red blood cells. When the agglutination is complete, the degree of agglutination will increase certainly. The end point of the titration is the lowest concentration that shows a given degree of agglutination.
Bei der Analysenmethode werden die folgenden Reagenzien verwendet:The following reagents are used in the analytical method:
GVB (Gelatine-Veronalpuffer) ist ein 1 % Gelatine enthaltender Veronalpuffer.GVB (gelatin-veronal buffer) is a veronal buffer containing 1% gelatin.
2. Menschliches Immunserumglobulin: Das Globulin wird im Verhältnis 1:10 mit GVB verdünnt, so daß man eine Konzentration von etwa 15 mg Protein je ml erhält Zu 1 Raumteil verdünntem ^-Globulin setzt man 1 Raumteil 10- bis 50prozentiges Absorptionsmittel (Gewicht/Volumen) in GVB zu. Beispiele für geeignete Absorptionsmittel sind 25°/o Kaolin (Gewicht/Volumen), 25% Fullererde (Gewicht/Volumen) usw. Das Gemisch wird in einem mit Stopfen versehenen Gefäß 20 Minuten lang a'tre 5 Minuten geschüttelt und dann 10 Minuten mit einer Geschwindigkeit von 1500 U/min zentrifugiert, worauf man die überstehende Flüssigkeit für die Verwendung bei der Analyse gewinnt. Die endgültige Globulinverdünnung beträgt 1 :20.2. Human immune serum globulin: The globulin is diluted 1:10 with GVB, so that a concentration of about 15 mg Protein per ml is obtained. To 1 part by volume of diluted ^ -globulin add 1 part by volume of 10 to 50 percent Absorbents (weight / volume) in GVB too. Examples of suitable absorbents are 25% Kaolin (weight / volume), 25% fuller's earth (weight / volume) etc. The mixture is in one with Stoppered jar shaken for 20 minutes a'tre 5 minutes and then 10 minutes with a Centrifuged speed of 1500 rpm, whereupon the supernatant liquid is ready for use wins in the analysis. The final globulin dilution is 1:20.
3. Antigen:3. Antigen:
Das Hepatitis-A-Antigen (Antigen der infektiösen Hepatitis) wird aus der Leber eines nicht-menschlichen Primaten, z. B. eines Seidenäffchens, gewonnen, der intravenös mit Hepatitis-Α-Virus nach der Methode von Mascoli und Mitarbeitern j»Proc. Soc. Exp. Biol. Med.«. Band 142,1973. Seite 276) infiziert worden ist. Die Leber wird zu einem Zeitpunkt, zu dem der Serumspiegel an Glutamat-Gxaloacetat-Transaminoseenzym und an Isocitronensäure-Dehydrogenaseenzym erhöht wird, was gewöhnlich etwa 14 bis 40 Tage nach der Impfung der Fall ist, entfernt. Die Leber wird mit physiologischer Kochsalzlösung von einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,8, z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die O.OOSroolares Natriumphosphat und 0,143molares Kochsalz enthält und einen pH-Wert von 7,2 aufweist, perfundiert. Dann wird die Leber zerkleinert, gemahlen und in solcher Menge zu physiologischer Kochsalzlösung zugesetzt, daß man eine lOgewichtsprozentige Suspension in physiologischer Kochsalzlösung erhält. Das Antigen besteht aus der überstehenden Flüssigkeit, -die man nach der Klärung durch Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit, z.B. durch kurzzeitiges, beispielsweise 5 bis 15 Minuten langes. Zentrifugieren mit 1000 bis 2000 U/min, erhält.The hepatitis A antigen (infectious hepatitis antigen) is obtained from the liver of a non-human Primates, e.g. B. a marmoset, obtained intravenously with hepatitis Α virus according to the method by Mascoli and co-workers j »Proc. Soc. Exp. Biol. Med. «. Volume 142, 1973. Page 276) has been infected. The liver is at a time when the serum level of glutamate-gxaloacetate-transaminosis enzyme and isocitric acid dehydrogenase enzyme increased, which is usually about 14 to 40 days after vaccination is the case. The liver is treated with physiological saline solution of a pH from about 6.8 to 7.8, e.g. B. phosphate buffered saline, the O.OOSroolares sodium phosphate and Contains 0.143 molar saline and has a pH value of 7.2. Then the liver crushed, ground and added to physiological saline solution in such an amount that one 10 weight percent suspension in physiological saline solution. The antigen consists of the supernatant liquid, -which after clarification by centrifugation at low speed, e.g. by short-term, for example 5 to 15 minutes long. Centrifugation at 1000 to 2000 rpm, receives.
Das geklärte Antigen kann dann durch Behandeln mit Kaolin gereinigt und unmittelbar für die Analyse verwendet werden, oder es kann durch isopyknische Bandbildung nach Dichtegradient-Zeatrifugiermethoden gereinigt werden. Wenn man mit Caesiumchlorid arbeitet, entspricht das Antigen einer A,:ftriebsdichte von etwa 132 bis 1,36 g/cm3 und wird für die Verwendung bei der Hepatitis-A-Analyse abgetrennt. Die Stärke des Antigens wird nach Standardmethoden durch Blocktitration gegen Hepatitis-A-Antikörper bestimmt.The cleared antigen can then be purified by treatment with kaolin and used immediately for analysis, or it can be purified by isopycnic banding using density gradient centrifugation methods. When working with cesium chloride, the antigen corresponds to an A,: shoot density of about 132 to 1.36 g / cm 3 and is separated off for use in the hepatitis A analysis. The strength of the antigen is determined according to standard methods by block titration against hepatitis A antibodies.
Gegebenenfalls, aber vorzugsweise, kann das Antigen in an sich bekannter Weise, z. B. durch Behandeln mit Formaldehyd oder anderen bekannten Inaktivierungsmitteln. inaktiviert oder geschwächt werden, bevor es für die erfindungsgemäße Analyse verwendet w ird.Optionally, but preferably, the antigen can be used in a manner known per se, e.g. B. by treating with Formaldehyde or other known inactivating agents. inactivated or weakened before it is used for the analysis according to the invention.
4. Komplement:4. Complement:
Serum von frisch ausgebluteten Meerschweinchen wird hergestellt und nach Entfernung der Zellen in Anteilen zu je 0,3 ml bei —70°C ausgefroren und gelagert. Jeder Anteil wird unmittelbar vor der Verwendung aus dem Tiefkühllager entnommen und mit GVB zu einem zuvor bestimmten Grad verdünnt, der so bemessen ist, daß man den maximalen Agglutinationstiter ohne Störung erhält, wie es von Mayumi und Mitarbeitern in »Vox. Sang.«, 20:178—181 (1971) beschrieben ist. In typischer Weise wird diese Verdünnung auf etwa 1 :50 bis etwa I : 100 durchgeführt.Serum from freshly bled guinea pigs is prepared and after removal of the cells in 0.3 ml portions frozen at -70 ° C and stored. Each share is immediately prior to use taken from the freezer and diluted with GVB to a predetermined degree, the so is measured so that the maximum agglutination titer is obtained without interference, as described by Mayumi and Employees in »Vox. Sang. ", 20: 178-181 (1971). Typically this will be dilution performed at about 1:50 to about 1/100.
5. DTT-EDTA-GVB:5. DTT-EDTA-GVB:
Eine O.lOmolare Lösung von Äthylendiamintetracssigsäure (EDTA) wird mit In Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt. 2 Teile EDTA werden mit 3 Teilen GVB versetzt. Zu dieser Lösung setzt man so viel festes Dithiothreit (DTT) zu, daß man eine Konzentration von 3 mg DTT/ml erhält. Anstelle von DTT kann man auch andere, eine Sulfhydrylgruppe enthaltende Reduktionsmittel, wie z. B. Mercaptoätha- t>0 nol, Dithioerythrit und dergleichen, in äquivalenter Menge verwenden.An O.lOmolar solution of ethylenediaminetetracetic acid (EDTA) is in sodium hydroxide on a pH adjusted to 7.5. 2 parts EDTA are mixed with 3 parts GVB. To this solution one sets so much solid dithiothreitol (DTT) that a concentration of 3 mg DTT / ml is obtained. Instead of DTT can also use other reducing agents containing a sulfhydryl group, such as. B. Mercaptoether> 0 Use nol, dithioerythritol and the like in an equivalent amount.
6. Rote Blutzellen:6. Red blood cells:
Citratisiertes frisches Blut (menschliche Blutgruppe 0) wird dreimal in mit Phosphin auf einen pH-Wert von 7,2 gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in einer Konzentration von 50 Volumprozent suspendiert und b5 bei 5°C gelagert. Vorder Verwendung werden die roten Blutzellen mit GVB auf etwa 0.25 bis 2% verdünnt. Da einige Ansätze bei diesem Test nicht agglutinieren. müssen die Zellen vor der Verwendung für die eigentliche Analyse mit bekanntem Antigen und Antikörper geprüft werden. Der Test für die AuswahlCitrated fresh blood (human blood group 0) is mixed three times in with phosphine to a pH of Washed 7.2 buffered saline, suspended in a concentration of 50 percent by volume and b5 stored at 5 ° C. Before use, the red blood cells are diluted to approximately 0.25 to 2% with GVB. Because some approaches do not agglutinate in this test. must be the cells before use for the actual analysis can be tested with known antigen and antibodies. The test for selection
menschlicher Blutzellen der Gruppe 0 auf ihre Brauchbarkeit wird folgendermaßen durchgeführt: Die roten Blutzellen werden dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und unter Verwendung einer Verdünnungsreihe eines menschlichen Immunserumgtobuüneinsatzes von bekanntem Titer untersucht, wobei man die richtige Verdünnung des. z. B. durch isopyknische Bandbildung nach Dichtegradienten-Zentrifugiermethoden. gereinigten Antigens verwendet Das Hämagglutinationsergebnis wird nach der Methode von Hansson und Mitarbeitern (»Vox. Sang.«, 24-35 —101,1973) und von Gozin und Mitarbeitern (»Vox. Sang.«, 23:472—477.1972) durch die Werte 0 bis 4 + gekennzeichnet. Brauchbare Ansätze geben für das bekannte positive menschliche Immunserumglobulin einen Agglutinationswert von 4 + . Ansätze, die einen Agglutinationswen von weniger als 4 ergeben, sind im allgemeinen weniger zufriedenstellend.Human blood cells of group 0 for their usefulness is carried out as follows: The red blood cells are washed three times with phosphate-buffered saline solution and examined using a dilution series of a human immune serum tablet of known titre, the correct dilution of the. B. by isopycnic banding after density gradient centrifugation methods. The purified antigen used Hämagglutinationsergebnis is the method of Hansson and colleagues ( "Vox Sang," 24-35 - 101.1973..) and Gozin and employees: by the ( "Vox Sang," 23 472-477.1972..) Values 0 to 4 + marked. Usable approaches give an agglutination value of 4+ for the known positive human immune serum globulin. Batches that give an agglutination value of less than 4 are generally less than satisfactory.
Analysenmethode auf AntikörperAnalysis method for antibodies
Die Vertiefungen 1 der Reihe A (Kontrolle) und der Reihe B (Analyse) einer geeigneten U-Boden-Mikrotiterplatte werden mit je 0.05 ml der auf Antikörper zu untersuchenden Probe beschickt. Die Vertiefung 1 der Reihe C (Antigenkontrolle) wird mit 0.05 ml GVB beschickt. Die Vertiefungen 2 bis 11 der Reihen A, B und C werden mit Hilfe einer 0.025 ml fassenden Pipettenspitze mit je 0,025 ml GVB beschickt Dann wird eine Verdünnungsreihe mit jeweils doppelter Verdünnung von der Vertiefung 1 zu der Vertiefung 11 der Reihen A, B und C mit Hilfe von von Hand betätigten oder automatischen Verdünnern durchgeführt. Wenn die Verdünnung vollständig ist, setzt man zu allen Vertiefungen der Reihe A 0,025 ml GVB and zu allen Vertiefungen der Reihen B und C 0,025 ml Antigen zu. Die Platte wird bedeckt, einige Minuten, z. B. 2 Minuten, von einer vibrierenden Schüttelmaschine in Schwingungen versetzt, um den Inhalt der Vertiefungen gut zu mischen, und in> wbiert, am Antigen und Antikörper unter Bildung eines Komplexes reagieren zu lassen. Diese Inkubation erfoigi bei etwa 25 bis 60= C, vorzugsweise bei etwa 37C C, für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 48 Stunden, vorzugsweise von etwa 1 bis 18 Stunden.Wells 1 of row A (control) and row B (analysis) of a suitable U-bottom microtiter plate are each filled with 0.05 ml of the sample to be examined for antibodies. Well 1 of row C (antigen control) is filled with 0.05 ml of GVB. The wells 2 to 11 of rows A, B and C are loaded with 0.025 ml GVB each using a 0.025 ml pipette tip Carried out with the help of manually operated or automatic thinners. When the dilution is complete, add 0.025 ml of GVB to all wells in row A and 0.025 ml of antigen to all wells of rows B and C. The plate is covered for a few minutes, e.g. B. 2 minutes, vibrated by a vibrating shaker to mix the contents of the wells well, and in> wbiert to react on the antigen and antibody to form a complex. This incubation erfoigi at about 25 to 60 = C, preferably at about 37 C C for a period of about 0.25 to 48 hours, preferably from about 1 to 18 hours.
Die Mikrotiterplatte wird dann aus dem Inkubator entfernt, worauf man zu jeder Vertiefung 0,025 mi Komplement zusetzt. Die Mikrotiterplatte wird wieder bedeckt, einige Minuten, z. B. 2 Minuten, auf eine Vibrierschüttelmaschine gesetzt, um den Inhalt der Vertiefungen zu mischen, und dann inkubiert, um das Komplement mit dem Komplex reagieren zu lassen. Diese Inkubation erfolgt bei etwa 25 bis 45°C, vorzugsweise bei etwa 37r C. für einen Zeitraum von etwa 0,25 bis 24 Stunden, vorzugsweise etwa 40 Minuten.The microtiter plate is then removed from the incubator and 0.025 ml of complement is added to each well. The microtiter plate is covered again for a few minutes, e.g. B. 2 minutes, placed on a vibrator to mix the contents of the wells and then incubated to allow the complement to react with the complex. This incubation is carried out at about 25 to 45 ° C, preferably at about 37 r C. for a period of about 0.25 to 24 hours, preferably about 40 minutes.
Die Platte wird aus dem Inkubator entfernt, worauf man zu jeder Vertiefung 0,025 ml DTT-EDTA-GVB
zusetzt und dann einige Minuten, z. B. 2 Minuten, auf der Vibrierschüttelmaschine mischt Sofort danach werden
zu jeder Vertiefung unter Mischen 0.025 ml etwa 0 25- bis 2prozentige. vorzugsweise lprozentige, menschliche
rote Blutzelten, der Gruppe 0 zugesetzt. Nach mindestens 2stündigem bis mehrtägigem Stehenlassen bei Raumtemperatur
werden die Vertiefungen auf Agglutination untersucht. Das Hämagglutinationsergebnis wird durch
die Werte 0 bis 4+ gekennzeichnet. Infolge des Zusatzes von DTT ist die Agglutination irreversibel geworden.
Der Endpunkt der Titration ist die letzte Vertiefung, die einen Agglutinationswen von 4 + zeigt.
Das für die Analyse verwendete Antigen ist im einzelnen in der DE-OS 25 55 169 beschrieben.
Die im Zusammenhang mit dem Hepatitis-A-Antikörpertiter angegebenen Einheiten sind lAHA-Einheiten
(IAHA = Abkürzung von Immune Adherence Hemaggiutination Assay Units). Diese Einheiten geben den
Verdünnungstiter an. Beispielsweise bedeutet ein lAHA-Tiier von 4000, daß 4000 Verdünnungseinheiten pro ml
vorliegen.The plate is removed from the incubator, whereupon 0.025 ml of DTT-EDTA-GVB is added to each well and then a few minutes, e.g. B. 2 minutes, mix on the vibrating shaker Immediately thereafter, 0.025 ml of about 0 25 to 2 percent are added to each well while mixing. preferably 1 percent human red blood cells, group 0 added. After standing for at least 2 hours to several days at room temperature, the wells are examined for agglutination. The hemagglutination result is indicated by the values 0 to 4+. As a result of the addition of DTT, the agglutination has become irreversible. The end point of the titration is the last well showing an agglutination value of 4+.
The antigen used for the analysis is described in detail in DE-OS 25 55 169.
The units specified in connection with the hepatitis A antibody titer are IAHA units (IAHA = Abbreviation for Immune Adherence Hemaggiutination Assay Units). These units indicate the dilution titer. For example, an IAHA animal of 4000 means that there are 4000 units of dilution per ml.
A. 1429 1 Plasma werden nach der herkömmlichen Cohn'schen Alkoholfällungsmethode zu 30 000 ml ^Globulin verarbeitet. Das /-Globulin wird nach der immunologischen Analysenmethode gemäß dem Stammpatent untersucht und zeigt einen Hepatitis-A-Antikörpertiter von 1800 Einheiten/ml. Dieser niedrige Hepatitis-A-Antikörpertiter würde einen mit dem /-Globulin behandelten Patienten nicht mit Sicherheit gegen Hepatitis A schützen.A. 1429 1 plasma becomes 30,000 ml ^ globulin according to the conventional Cohn alcohol precipitation method processed. The / -globulin is determined by the immunological analysis method according to the parent patent examined and shows a hepatitis A antibody titer of 1800 units / ml. This low hepatitis A antibody titer a patient treated with the / -globulin would not with certainty against hepatitis A. protection.
so B. Ein Ansatz von /-Globulin aus dem von einer kommerziellen Blutbank gewonnenen Plasma wird nach der immunologischen Analysenmethode gemäß dem Stammpatent untersucht. Es wird ein Hepatitis-A-Antikörpertiter von 4000 Einheiten/ml festgestellt. Ein zweiter Ansatz von /-Globulin aus dem von Gefangenen eines Staatsgefängnisses gewonnenen Plasma wird ebenfalls nach der immunologischen Analysenmethode gemäß dem Stammpateni untersucht, wobei ein Hepaiitis-A-Antik3r;)ertiter von 6400 Einheiten/ml festgestellt wird.so B. A batch of / -globulin from the plasma obtained from a commercial blood bank is examined according to the immunological analysis method according to the parent patent. A hepatitis A antibody titer of 4000 units / ml is determined. A second batch of / -globulin from the plasma obtained from prisoners in a state prison is also examined by the immunological analysis method according to the parent patent, with a hepaiitis A antibody ; ) titre of 6400 units / ml is determined.
Beide Ansatz·?: haben also einen ausreichenden Hepatitis-A-Antikörpertiter.Both approaches · ?: therefore have a sufficient hepatitis A antibody titer.
C. Um die gemäß A. hergestellten 30 000 ml γ Globulin verwenden zu +.önnen, muß ihr Hepatitis· A-Antikörpertiter auf 4000 Einheiten/ml erhöht werden. Da ein kommerzieller Ansatz 63 000 ml enthält, geschieht dies durch Zusatz von 5500 ml des /-Globulins mit einem Titer von 4000 und 27 500 ml des /-Globulins mit einem Titer von 6400 gemäß B. Diese Mengen werden folgendermaßen bestimmt: Wenn die gemäß A. und B. gewonne-C. In order to be able to use the 30,000 ml of γ globulin prepared according to A., your hepatitis A antibody titer must be increased to 4000 units / ml. Since a commercial batch contains 63,000 ml, this is done by adding 5500 ml of / -globulin with a titer of 4000 and 27,500 ml of / -globulin with a titer of 6400 according to B. These amounts are determined as follows: If the according to A. and B. won-
M) nen Raumteile/-Globulin mit X, V'bzu. Zbe/eiehnet werden, betragt das GesamtvolumenM) nen space parts / -globulin with X, V'bzu. Zbe / eiehnet amounts to the total volume
X + Y + Z = 63 000 ml
oder X + Y + Z = 63,000 ml
or
I) 30 000 + Y + Z = 63 000 ml.
Da ieder Milliliter- 4000 Einheiten HcDatiiis-A-Antikörper enthalten soll, ergibt sichI) 30,000 + Y + Z = 63,000 ml.
Since each milliliter should contain 4000 units of HcDatiiis-A antibodies, this results
2) 30 000 · (1800) + Y ■ (4000) + Z ■ (6400) = 252 000 000.2) 30,000 * (1800) + Y ■ (4000) + Z ■ (6400) = 252,000,000.
Wenn man die Gleichung 1 mit 4000 multipliziert und die auf diese Weise erhaltene Gleichung la von
Gleichung 2 abzieht, erhält manIf one multiplies equation 1 by 4000 and equation la of
Subtracting equation 2, one obtains
2) 54 000 000 + Y- (4000) + Z ■ (6400) = 252 000 0002) 54,000,000 + Y- (4000) + Z ■ (6400) = 252,000,000
la) - 120 000 000 - Y · (4000) - Z · (4000) = 252 000 000la) - 120,000,000 - Y * (4000) - Z * (4000) = 252,000,000
- 66 000 000 +Z (2400) = 0- 66 000 000 + Z (2400) = 0
10 Z = 66 000 000 10 Z = 66,000,000
Z = 27 500 ml
Das Volumen von Kwird durch Differenz /u 5500 ml ermittelt.Z = 27,500 ml
The volume of K is determined by the difference / u 5500 ml.
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