DE2237204C3 - Method for the detection of the Australian antigen or the antibody for this in a blood test sample - Google Patents
Method for the detection of the Australian antigen or the antibody for this in a blood test sampleInfo
- Publication number
- DE2237204C3 DE2237204C3 DE19722237204 DE2237204A DE2237204C3 DE 2237204 C3 DE2237204 C3 DE 2237204C3 DE 19722237204 DE19722237204 DE 19722237204 DE 2237204 A DE2237204 A DE 2237204A DE 2237204 C3 DE2237204 C3 DE 2237204C3
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- antigen
- antibody
- test sample
- suspension
- resin particles
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 62
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 title claims description 62
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 title claims description 62
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 title claims description 43
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 title claims description 43
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 12
- 238000009534 blood test Methods 0.000 title claims description 5
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 claims description 56
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 30
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 24
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 20
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 19
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 19
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 claims description 18
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 7
- 229920003002 synthetic resin Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000057 synthetic resin Substances 0.000 claims description 7
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 claims description 5
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 5
- 241000700198 Cavia Species 0.000 claims description 4
- 230000002335 preservative Effects 0.000 claims description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical group [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 claims description 3
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 claims description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims 2
- 238000000034 method Methods 0.000 claims 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 14
- 230000024126 agglutination involved in conjugation with cellular fusion Effects 0.000 description 14
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 9
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 7
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 4
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 4
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 3
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 2
- 210000001736 Capillaries Anatomy 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- UDTHXSLCACXSKA-UHFFFAOYSA-N 3-tetradecylbenzenesulfonic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 UDTHXSLCACXSKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000601 Blood Cells Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M Caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 208000006454 Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000002672 Hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108090000745 Immune Sera Proteins 0.000 description 1
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000004523 agglutinating Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 239000003618 borate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229940098124 cesium chloride Drugs 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- FFLYUXVZEPLMCL-UHFFFAOYSA-N ethylchloranuidyl formate Chemical compound CC[Cl-]OC=O FFLYUXVZEPLMCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L na2so4 Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
Description
Das von B 1 u m b e r g et al. entdeckte Australien-Antigen (J. Amer. Med. Assoc, 191 [1965] 541; Ann. Int. Med., 66 [1967] 924) ist im Blut eines sehr kleinen Bevölkerungsanteils vorhanden; jedoch ist sein Nachweis durch schnelle und verläßliche Methoden von größter Wichtigkeit, damit die Transfusion von dieses Antigen enthaltenden Blut, die zur sog. Serumhepatitis beim Empfänger führen kann, vermieden wird. Diese Hepatitis, die auch nach langer Inkubationszeit auszubrechen vermag, kann ernsthafte und in einigen Fällen fatale Folgen haben. Es ist weiterhin wichtig, daß man den gegen das Australien-Antigen gerichteten Antikörper bei Menschen oder Tieren nachweisen kann, die sich eventuell mit dem Australien-Antigen infiziert oder immunisiert haben.That of B 1 u m b e r g et al. discovered Australian antigen (J. Amer. Med. Assoc, 191 [1965] 541; Ann. Int. Med., 66 [1967] 924) is present in the blood of a very small proportion of the population; however, his proof is through quick and reliable methods of the utmost importance to enable the transfusion of this Antigen-containing blood, which can lead to so-called serum hepatitis in the recipient, is avoided. This Hepatitis, which may break out even after a long incubation period, can be serious and in some cases have fatal consequences. It is also important to have the antibody directed against the Australian antigen in humans or animals that may be infected with the Australian antigen or have immunized.
Es besteht somit ein Bedürfnis für diagnostische Untersuchungsmethoden, die schnell und empfindlich sind, routinemäßig bei einer großen Anzahl vonThere is thus a need for diagnostic test methods that are quick and sensitive are routine for a large number of
Blutproben wiederholt werden können, minimale Mengen an diagnostischen Reagenzien verbrauchen und verläßlich sind, d. h., die Untersuchungsn den müssen eine Bestimmung des Antigens (ode eines Antikörpers) in jeder Blutprobe (sowohl Vollblut als auch Serum oder Plasma), in der es enthalten ist, gestatten und dürfen gleichzeitig nur eine minimale Anzahl falscher Positivanzeigen erbringen, d. h., Ergebnisse, die fälschlicherweise die Anwesenheit des Antigens(oder des Antikörpers) anzeigen. ]0 Blood samples can be repeated, use minimal amounts of diagnostic reagents, and are reliable, i.e. the test must allow the determination of the antigen (or antibody) in any blood sample (both whole blood and serum or plasma) in which it is contained and must produce a minimal number of false positives at any one time, that is, results that falsely indicate the presence of the antigen (or antibody). ] 0
Ein diagnostisches Reagenz zum Nachweis agglutinierender Antikörper im Serum von Patienten mit einer Virushepatitis, bestehend aus synthetischen Harzteilchen, die mit dem aus einem Virusisolat bestehenden Antigen überzogen sind, ist aus Medizinische Klinik, Bd 65, 1970, Heft 27, Seiten 1302-1304 bekannt. Der Latex-Aggiutinatiorrstest zum Nachweis von Antigenen und Antikörpern ist aus der US-PS 30 88 875 bekannt.A diagnostic reagent used to detect agglutinating antibodies in the serum of patients with a Viral hepatitis, consisting of synthetic resin particles that interact with that consisting of a virus isolate Antigen coated is known from Medical Clinic, Vol 65, 1970, Issue 27, pages 1302-1304. the Latex agglutination test for the detection of antigens and antibodies is known from US Pat. No. 3,088,875.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß der Zusatz von normalem Serum die Trefferrate ausgeprägt erhöht.Surprisingly, it has now been found that the The addition of normal serum markedly increased the hit rate.
Die Erfindung bezieht sich also auf ein Verfahren zum Nachweis des Australien-Antigens oder des Antikörpers hierzu in einer Blut-Testprobe, bei dem man die Testprobe mit einem geeigneten Volumen einer wäßrigen Suspension vermischt, die fein verteilte, synthetische Harzteilchen von im wesentlichen gleichmäßiger Form und Größe, überzogen mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper bzw. dem Australien-Antigen selbst enthält, und das Vermischen mindestens 2 Minuten fortsetzt, wobei das Auftreten sichtbarer Agglomerate die Anwesenheit des Antigens bzw. des Antikörpers in der Testprobe anzeigt, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man die Testprobe mit normalem Serum in Berührung bringt, das von den gleichen Säugerarten herrührt, von denen auch das zum Überziehen der Harzteilchen verwendete antikörper- oder antigenhaltige Serum stammt.The invention thus relates to a method for the detection of the Australian antigen or the antibody this in a blood test sample, in which the test sample with a suitable volume of a mixed aqueous suspension, the finely divided, synthetic resin particles of substantially more uniform Shape and size coated with the antibody specific to the Australian antigen or contains the Australian antigen itself, and mixing continues for at least 2 minutes, the appearance of visible agglomerates indicating the presence of the antigen or the antibody in the Indicates test sample, and is characterized in that the test sample is in contact with normal serum which comes from the same mammalian species that used to coat the resin particles used antibody- or antigen-containing serum.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf ein Verfahren zum Nachweis des gegen Australien-Antigen gerichteten Antikörpers in einer Blut-Testprobe, bei dem man die Testprobe mit einem Standardvolumen einer gereinigten Lösung oder Suspension des aus Humanblutplasma gewonnenen Australien-Antigens versetzt, anschließend ein geeignetes Volumen einer wäßrigen Suspension aus fein verteilten, synthetischen Harzteilchen von im wesentlichen gleichmäßiger Form und Größe, die mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper überzogen sind, hinzufügt und mindestens 2 Minuten mischt, wobei das Nicht-Auftreten von Agglomeraten innerhalb von 10 Minuten die Anwesenheit des Antikörpers in der Testprobe anzeigt, und ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine Harzteilchen-Suspension verwendet, welche weiterhin normales Serum enthält, das von den gleichen Säugerarten herrührt, von denen auch das zum Überziehen der Harzteilchen verwendete antikörperhaltige Serum stammt.The invention also relates to a method for the detection of the antigen directed against Australia Antibody in a blood test sample, in which the test sample is mixed with a standard volume of a a purified solution or suspension of the Australian antigen obtained from human blood plasma is added, then a suitable volume of an aqueous suspension of finely divided synthetic resin particles of substantially uniform shape and size with that of the Australian antigen specific antibodies are coated, added and mixed for at least 2 minutes, the non-occurrence of agglomerates indicates the presence of the antibody in the test sample within 10 minutes, and is characterized in that a resin particle suspension is used, which further Contains normal serum derived from the same mammalian species that used for the Antibody-containing serum used to coat the resin particles.
Weiterhin bezieht sich die Erfindung auf ein diagnostisches Reagenz zum Nachweis des Australien-Antigens oder des Antikörpers hierzu, im wesentlichen bestehend aus einer wäßrigen Suspension aus fein verteilten, synthetischen Harzteilchen von im wesentlichen gleichmäßiger Form und Größe, die mit dem gegenüber dem Australien-Antigen spezifischen Antikörper bzw. mit dem Australien-Antigen selbst überzogen sind und ist dadurch gekennzeichnet, daß die Suspension auch normales Serum, das von den gleichen Säugerarten herrührt, von denen auch das zum Überziehen der Harzteilchen verwendete antikörper- oder antigenhaltige Serum stammt, enthält.The invention also relates to a diagnostic reagent for the detection of the Australian antigen or the antibody to this, consisting essentially of an aqueous suspension of fine dispersed synthetic resin particles of substantially uniform shape and size associated with the antibodies specific to the Australian antigen or with the Australian antigen itself are coated and is characterized in that the suspension also contains normal serum that of the same Mammalian species, including the antibody used to coat the resin particles or antigen-containing serum.
Die Gegenwart von normalem Serum, das von den gleichen Säugerarten gewonnen wird, aus denen auch das den Antikörper oder das Antigen enthaltende Serum erhalten worden ist, verringert beträchtlich die Anzahl der falschen positiven Ergebnisse bei der Bestimmung des Australien-Antigens (oder des Antikörpers) in Blutproben. Vorzugsweise ist in 20 bis 50, z. B 35, Volumteilen der wäßrigen Suspension der Harzteilchen, die mit dem Antikörper oder dem Antigen überzogen sind, e'.wa 1 Teil normales Serum enthalten.The presence of normal serum obtained from the same mammalian species that were obtained from the serum containing the antibody or antigen is obtained considerably reduces the Number of False Positive Results in the Australian Antigen (or Antibody) Determination in blood samples. Preferably in 20 to 50, e.g. B 35, parts by volume of the aqueous suspension of the Resin particles coated with the antibody or antigen contain about 1 part normal serum.
Wird z. B. dem diagnostischen Reagenz, das den aus Meerschweinchen-Antiserum erhaltenen Antikörper enthält, kein normales Meerschweinchen-Serum einverleibt, so findet bei etwa 10 Prozent derjenigen Humanseren, die kein Australien-Antigen enthalten, eine Agglutination der Harzteilchen statt, die den gegen das Australien-Antigen gerichteten Antikörper adsorbiert enthalten. Dies ist vermutlich auf die Anwesenheit von Substanzen in solchen Humanseren zurückzuführen, die mit anderen Verbindungen reagieren, die von dem Meerschweinchen-Antiserum herrühren, aus dem der gegen das Australien-Antigen gerichtete Antikörper erhalten worden ist. 1st das normale Meerschweinchen-Serum jedoch enthalten, so findet nur bei etwa 1 bis 3 Prozent der Humanseren eine Agglutination der Harzteilchen in Abwesenheit des Australien-Antigens im Serum statt. Dies kann auf Bestandteile im normalen Meerschweinchen-Serum zurückzuführen sein, die mit solchen Substanzen in Humanseren reagieren können und auf diese Weise ihren auslösenden Effekt für die Agglutination der Harzteilchen zu verhindern vermögen. Is z. B. the diagnostic reagent containing the antibody obtained from guinea pig antiserum does not incorporate normal guinea pig serum, this is found in around 10 percent of those Human sera that do not contain an Australian antigen, agglutination of the resin particles takes place, which is against the the Australian antigen-directed antibodies contain adsorbed. This is presumably due to the presence of substances in such human sera that react with other compounds that are caused by originate from the guinea pig antiserum from which the antibody directed against the Australian antigen originates has been received. If it does contain normal guinea pig serum, only about 1 up to 3 percent of the human sera agglutination of the resin particles in the absence of the Australian antigen instead of in the serum. This may be due to components in normal guinea pig serum that contain such substances in human sera can react and in this way their triggering effect for the Able to prevent agglutination of the resin particles.
Das normale Serum braucht nicht im diagnostischen Reagenz enthalten zu sein, sondern kann auf andere Weise mit der Testprobe in Berührung gebracht werden. Das normale Serum kann z. B. mit der Testprobe vor dem Vermischen mit der Harzteilchen-Suspension vermischt werden. Die Testprobe kann auch unter Verwendung eines Rührers gerührt werden, der mit den Feststoffen aus dem normalen Serum überzogen worden ist, z. B. indem man ihn in das normale Serum eingetaucht und anschließend den Überzug zur Trockne eingedampft hat. Die Testprobe kann auch auf eine Oberfläche aufgebracht werden, die in ähnlicher Weise mit den Feststoffen aus dem normalen Serum überzogen worden ist, z. B. auf die Oberfläche einer Glas- oder Kunststoffplatte.The normal serum does not have to be contained in the diagnostic reagent, but can be used for others Manner to be brought into contact with the test sample. The normal serum can e.g. B. with the Test sample must be mixed with the resin particle suspension prior to mixing. The test sample can also be stirred using a stirrer with the solids from normal serum has been coated, e.g. B. by dipping it in the normal serum and then the Coating has evaporated to dryness. The test sample can also be applied to a surface that has similarly been coated with the solids from normal serum, e.g. B. on the Surface of a glass or plastic plate.
Besteht die Testprobe aus Vollblut, so muß zunächst eine Behandlung zur Auflösung der Zellen und zur Verhinderung der Koagulation erfolgen, bevor die Probe auf die Anwesenheit des Australien-Antigens oder des entsprechenden Antikörpers geprüft werden kann. Für diesen Zweck kann die Probe zunächst mit einer Lösung verdünnt werden, die ein Auflösungsmittel und ein Antikoagulans enthält. Das Auflösungsmittel ist z. B. ein nichtionogenes Netzmittel vom Typ der polyoxyäthylierten Alkylphenole, z. B.If the test sample consists of whole blood, a treatment to dissolve the cells and to Prevention of coagulation is done before the sample for the presence of the Australian antigen or the corresponding antibody can be tested. For this purpose, the sample can first be used with a solution containing a dissolving agent and an anticoagulant. The dissolving agent is z. B. a nonionic wetting agent of the polyoxyethylated alkylphenol type, e.g. B.
Isooctylphenoxypolyoxyäthyläthanol, das Antikoagulans z. B. Natriumeitrat.Isooctylphenoxypolyoxyethylethanol, the anticoagulant z. B. Sodium citrate.
Vorteilhafte Weiterbildungen des diagnostischen Reagens nach der Erfindung sowie ein Verfahren zu dessen Herstellung sind in den Patentansprüchen 11 bis 15 beschrieben.Advantageous developments of the diagnostic reagent according to the invention and a method to its production are in claims 11 to 15 described.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.The following examples illustrate the invention.
A. Herstellung der diagnostischen ReagenzienA. Preparation of Diagnostic Reagents
Eine 40prozentige (Gewicht/Volumen) wäßrige Suspension aus Polystyrolkügelci.en von 0,16 μ Teilchengröße wird auf 5 Prozent (Gewicht/Volumen) >nit einer boratgepufferten Salzlösung verdünnt und durch eine Membran mit 1,2 μ Porengröße filtriert. Die Suspension wird anschließend sofort zu 9 Volumteilen von gereinigtem Meerschweinehen-Antiserum, das den gegen das Australien-Antigen gerichteten Antikörper enthält (verdünnt auf 0,5% Gewicht/Volumen) hinzugefügt und 30 Minuten gleichmäßig gerührt. Nach der Zugabe von 1 Volumteil Rinderserumalbumin (1% Gewicht/Volumen) wird schließlich mit Natriumazid versetzt, so daß man eine Konzentration von 0,1% (Gewicht/Volumen) in dem Endprodukt erhält. Das Produkt wird bei 4°C gelagert, wobei es mindestens 3 Monatestabilist.A 40 percent (weight / volume) aqueous suspension of polystyrene beads with a particle size of 0.16 μ is diluted to 5 percent (weight / volume) with a borate-buffered saline solution and replaced by a Membrane with 1.2 μ pore size filtered. The suspension is then immediately to 9 parts by volume of purified guinea pig antiserum containing the antibody directed against the Australian antigen contains (diluted to 0.5% weight / volume) added and stirred evenly for 30 minutes. After Addition of 1 part by volume of bovine serum albumin (1% w / v) is finally made with sodium azide added so that a concentration of 0.1% (weight / volume) is obtained in the end product. The Product is stored at 4 ° C, where it is stable for at least 3 months.
Eine 40prozentige (Gewicht/Volumen) Suspension der gleichen Polystyrolkügelchen wie in Beispiel 1 wird auf 5% mit glycingepufferter Salzlösung verdünnt und durch Zusatz von jS-Propiolacton unter pH-Kontrolle sterilisiert. Die Suspension wird dann zu 9 Volumteilen eines zweckmäßig verdünnten, gereinigten Meerschweinchen-Serums von mit dem Australien-Antigen immunisierten Tieren hinzugefügt. Die Zugabe der Polystyrolsuspension erfolgt langsam unter Rühren und das Rühren wird 30 Minuten fortgesetzt. Die Polystyrolkügelchen werden zentrifugiert, einmal auf der Zentrifuge mit gepufferter Salzlösung gewaschen und zu dem ursprünglichen Volumen in gepufferter Salzlösung erneut suspendiert. Nach Zugabe von Rinderserumalbumin (1%, Gewicht/Volumen) zur Stabilisierung der Suspension der Polystyrolkügelchen wird das Rühren 30 Minuten fortgesetzt. Nach Zugabe von Vio Volumteil verdünntem, normalem Serum von nichtimmunisierten Meerschweinchen (verdünnt 1 :3,5 mit glycingepufferter Salzlösung) wird das Gemisch erneut 30 Minuten gerührt. Schließlich wird das Gemisch heftig geschüttelt, um jegliche Teilchenagglomerationen zu zerteilen. Alle verwendeten Lösungen werden durch Filtration sterilisiert und enthalten 0,1% Natriumazid als Konservierungsmittel. Das Produkt wird bei 4°C gelagert, wobei es mindestens 3 Monate stabil ist.A 40 percent (weight / volume) suspension of the same polystyrene beads as in Example 1 is made diluted to 5% with glycine-buffered saline solution and pH controlled by the addition of jS-propiolactone sterilized. The suspension then becomes 9 parts by volume of a suitably diluted, purified guinea pig serum from animals immunized with the Australian antigen added. The polystyrene suspension is added slowly with stirring and stirring is continued for 30 minutes. The polystyrene beads are centrifuged, once on the Centrifuge washed with buffered saline and returned to the original volume in buffered saline suspended again. After adding bovine serum albumin (1%, weight / volume) for stabilization stirring of the suspension of polystyrene beads is continued for 30 minutes. After adding Vio Partially diluted normal serum from nonimmunized guinea pigs (diluted 1: 3.5 with glycine-buffered saline) the mixture is stirred again for 30 minutes. Eventually the mixture becomes violent shaken to break up any particle agglomerations. All solutions used are through Filtration sterilized and contain 0.1% sodium azide as a preservative. The product is at 4 ° C stored, where it is stable for at least 3 months.
Die Eignung einer Charge des diagnostischen Reagenz wird so überprüft, daß man eine Reihe von mindestens 50 Humanseren, die verschiedene bekannte Titer an Australien-Antigen aufweisen, testet. Diese Eignung wird verglichen mit der Eignung von Standardtests zum Nachweis des Australien-Antigens (Geldiffusion und Gegenstrom-lmmunoelektrophorese), wobei ebenfalls unter Verwendung der 50 Proben getestet wird. Die Prüfung sollte mindestens die gleiche Empfindlichkeit ergeben. Die Selektivität ist gegeben, wenn bei mindestens 100 Humansera- und -blutproben, die kein Australien-Antigen enthalten, nicht mehr als 3% der Proben eine Reaktion ergeben.The suitability of a batch of the diagnostic reagent is checked by making a number of tests at least 50 human sera that have various known titers of Australian antigen. This Eligibility is compared to the eligibility of standard tests for the detection of the Australian antigen (Gel diffusion and countercurrent immunoelectrophoresis), also using the 50 samples Is tested. The test should give at least the same sensitivity. The selectivity is given, if at least 100 human sera and blood samples that do not contain Australia antigen do not exceed 3% of the samples give a reaction.
Die in den Beispielen 1 und 2 verwendeten gereinigten Meerschweinchen-Antiseren werden wie foigi hergesielli:The purified guinea pig antisera used in Examples 1 and 2 are as foigi hergesielli:
Meerschweinchen werden mit Australien-Antigen immunisiert, das in gereinigter Form aus Humanplasma
durch isopyknisches »banding« in einem Caesiumchlorid- oder Kaliumbromidgradient in einer »zonal
ί
centrifuge« und anschließendes »rate zonal centrifuga-Guinea pigs are immunized with Australia antigen in purified form from human plasma by isopyknisches "banding" in a cesium chloride or Kaliumbromidgradient in a "zonal ί
centrifuge "and subsequent" rate zonal centrifugal
tion« in einem Saccharosegradient erhalten worden ist. Einer primären Imnunisierung mit Antigen in Freunds vollständigem Hilfsstoff (»complete adjuvant«) in die Fußballen schließen sich zwei intraperitoneale Impfungen mit Antig3n ohne Hilfsstoff an. Nach dem Vereinigen der aus den Meerschweinchen erhaltenen Seren weiden restliche, gegen Humanserumproteine gerichtete Antikörper gegebenenfalls dadurch entfernt, daß man das Antiserum mit unter Verwendung von Äthylchloroformiat polymerisiertem normalem Humanserum in Berührung bringt. Das Serum wird anschließend durch Ausfällung mit Hprozentigem wäßrigem Natriumsulfat gereinigt, gegen wäßrige, phosphatgepufferte Salzlösung dialysiert und gegebenenfalls zur Zerstörung von Komplement 30 Minuten auf 560C erhitzt. Hierauf wird Natriumazid (0,1 %) als Konservierungsmittel zugegeben. Bei der Verwendung zur Herstellung des diagnostischen Reagenzes wird das Antiserum zweckmäßig verdünnt. Die optimale Verdünnung wird so bestimmt, daß man kleine Ansätze des diagnostischen Reagenzes mit verschiedenen Verdünnungen des Antiserums herstellt und diese gegen eine Reihe von Humansera prüft, die Australien-Antigen enthalten. Diejenige Verdünnung, die nach dem Aufbringen auf Harzteilchen das beste Testergebnis zeigt, wird zur Herstellung des diagnostischen Reagenzes ausgewählt. Normalerweise liegt die optimale Verdünnung zwischen 1 : 20 und 1 :100.tion «has been obtained in a sucrose gradient. A primary immunization with antigen in Freund's complete adjuvant in the ball of the foot is followed by two intraperitoneal vaccinations with antigen without an adjuvant. After the sera obtained from the guinea pigs have been combined, any remaining antibodies directed against human serum proteins are removed by contacting the antiserum with normal human serum polymerized using ethyl chloroformate. The serum is then purified by precipitation with Hprozentigem aqueous sodium sulfate, dialyzed against aqueous phosphate buffered saline solution and optionally heated to the destruction of complement 30 minutes at 56 0 C. Sodium azide (0.1%) is then added as a preservative. When used for the preparation of the diagnostic reagent, the antiserum is expediently diluted. The optimal dilution is determined by making small batches of the diagnostic reagent with various dilutions of the antiserum and testing them against a number of human sera which contain Australian antigen. The dilution which shows the best test result after application to resin particles is selected for the preparation of the diagnostic reagent. Usually the optimal dilution is between 1:20 and 1: 100.
B.Testmethoden
zum Nachweis von Australien-AntigenB. Test methods
for the detection of Australian antigen
1 Tropfen (etwa 25 μΐ) einer Testprobe Humanserum wird auf einem Objektträger mit einem ähnlichen Tropfen von verdünntem (1:20) normalem Meerschweinchenserum versetzt. Dann wird mit einem kleinen Holzstäbchen einige Sekunden vorsichtig gerührt. Nach Zugabe eines Tropfens des gemäß Beispiel J hergestellten diagnostischen Reagenzes wird das Gemisch «nit dem Holzstäbchen gerührt, bis der Durchmesser des Tropfens etwa 2 cm beträgt. Der Objektträger wird dann auf einer schwarzen Platte 2 Minuten vorsichtig hin- und hergeschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt sich bei einer Australien-Antigen enthaltenden Serumprobe eine bestimmte Agglutination, während eine stark positive Probe innerhalb von 15 bis 30 Sekunden zu einer Agglutination mit den Polystyrolteilchen führt. Negative Seren erzeugen innerhalb von 2 Minuten keine sichtbare Agglutination.1 drop (about 25 μΐ) of a test sample of human serum is placed on a slide with a similar drop of diluted (1:20) normal guinea pig serum offset. Then gently stir with a small wooden stick for a few seconds. After adding a drop of the according to Diagnostic reagent prepared in Example J, the mixture is stirred with the wooden stick until the The diameter of the drop is about 2 cm. The slide is then placed on a black plate 2 Shaken gently back and forth for minutes. At this point an Australian antigen is shown serum sample containing a certain agglutination, while a strongly positive sample within 15 leads to agglutination with the polystyrene particles for up to 30 seconds. Generate negative sera no visible agglutination within 2 minutes.
1 Tropfen (40 μΐ) einer Testprobe Humanserum wird auf einer schwarzen Glas-(oder Kunststoffplatte mit einem Tropfen des gemäß Beispiel 2 hergestellten diagnostischen Reagenzes versetzt. Das Gemisch wird mit einem kleinen Holzstäbchen gerührt, bis der Durchmesser des Tropfens etwa 2 cm beträgt. Die Platte wird dann 5 Minuten vorsichtig hin- und hergeschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt zeigt eine Australien-Antigen enthaltende Serumprobe eine bestimmte Agglutination, während eine stark positive Probe innerhalb von 15 bis 30 Sekunden zu einer Agglutination mit den Polystyrolteilchen führt. Negative Seren erzeugen innerhalb von 5 Minuten keine sichtbare Agglutination.1 drop (40 μΐ) of a test sample of human serum is used on a black glass (or plastic plate with a drop of the prepared according to Example 2) diagnostic reagent added. The mixture is stirred with a small wooden stick until the The diameter of the drop is about 2 cm. The plate is then gently back and forth for 5 minutes shaken. At this point, a serum sample containing Australia antigen shows a certain one Agglutination, while a strongly positive sample causes agglutination within 15 to 30 seconds with the polystyrene particles. Negative sera do not produce any visible sera within 5 minutes Agglutination.
1 Tropfen (etwa 40 ul) menschliches venöses Blut oder kapillares Blut aus der Fingerspitze wird in ein Röhrchen gegeben, das 200 μΐ eines Verdünnungsmittels folgender Zusammensetzung enthält: 0,1 % Trinatriumcitrat, 0,1% Natriumazid und 0,02% nichtionogenes Netzmittel (Isooctylphenoxypolyäthoxyäthanol) in destilliertem Wasser. Nach dem Vermischen durch vorsichtiges Schütteln und lOminütigem Stehenlassen zur Zerstörung der in dem Blut enthaltenen Zellen werden 2 Tropfen des Gemisches zusammen auf eine schwarze Glas-(oder Kunststoffplatte gegeben. Nach Zugabe eines Tropfens des gemäß Beispiel 2 hergestellten diagnostischen Reagenzes wird der in Beispiel 4 beschriebene Test durchgeführt.1 drop (approximately 40 µl) of human venous blood or capillary blood from the fingertip turns into a Given a tube containing 200 μΐ of a diluent of the following composition: 0.1% trisodium citrate, 0.1% sodium azide and 0.02% non-ionic wetting agent (isooctylphenoxypolyethoxyethanol) in distilled Water. After mixing, shake gently and leave to stand for 10 minutes to destroy the cells contained in the blood, 2 drops of the mixture are put together on one black glass (or plastic plate. After adding a drop of the prepared according to Example 2) diagnostic reagent, the test described in Example 4 is carried out.
Etwa 50 μΐ Verdünnungsmittel (Zusammensetzung wie in Beispiel 5) werden auf einer schwarzen Glas-(oder Kunststoffplatte mit 20 μΙ Blut (venöses oder kapillares Blut) versetzt. Nachdem Blut und Verdünnungsmittel mit einem Holzstäbchen gerührt worden sind, läßt man das Gemisch 5 bis 10 Minuten stehen, um eine vollständige Blutzellenauflösung zu gewährleisten. Nach Zugabe von 1 Tropfen des gemäß Beispiel 2 hergestellten diagnostischen Reagenzes wird der in Beispiel 4 beschriebene Test durchgeführt.About 50 μΐ diluent (composition as in Example 5) are on a black glass (or plastic plate with 20 μΙ blood (venous or capillary blood). After blood and diluent have been stirred with a wooden stick allow the mixture to stand for 5 to 10 minutes to ensure complete dissolution of the blood cells. After adding 1 drop of the diagnostic reagent prepared according to Example 2, the in Example 4 described test carried out.
Blutproben, die beliebige Standard-Antikoagulantia, z. B. Citrat, enthalten, werden zentrifugiert, um die Hauptmenge der Zellen zu entfernen. Die von den abgesetzten Zellen abgetrennten Plasmen werden nach den Methoden der Beispiele 5 oder 6, genau wie für Vollblut, auf Australien-Antigen getestet.Blood samples containing any standard anticoagulant, e.g. B. citrate, are centrifuged to remove the Remove main body of cells. The plasmas separated from the deposited cells are after tested for Australian antigen using the methods of Examples 5 or 6, exactly as for whole blood.
Bei der Durchführung einer Testreihe gemäß den Beispielen 3 bis 7 ist es von Vorteil, in jeder Testreihe für Verglcichszwecke ein bekanntes Positivserum bzw. Negativserum zu verwenden.When carrying out a series of tests according to Examples 3 to 7, it is advantageous in each series of tests for Use a known positive or negative serum for comparison purposes.
C.Testmethoden für den Nachweis des gegen Australien-Antigcn gerichteten AntikörpersC. Test methods for the detection of the antibody directed against the Australian antigen
Eine Anzahl von zweifach-Verdünnungen eines bekannten, Auslralien-Antigcn enthaltenden Humanserums wird unter Verwendung von Normalhumanserum (d. h. frei von Australien-Antigen oder AntikörperA number of two-fold dilutions of a known human serum containing Australian antigens is made using normal human serum (i.e. free of Australian antigen or antibody
ίο hierzu), als Verdünnungsmittel hergestellt. 1 Tropfen jeder dieser Verdünnungen wird mit dem diagnostischen Reagenz des Beispiels 4 getestet. Die höchste Verdünnung, bei der noch eine maximale Agglutination stattfindet, wird bestimmt. Diese Verdünnung wird für den Test verwendet. 1 Tropfen (40 μΐ) einer Testprobe Humanserum wird auf einer schwarzen Glas-(oder Kunststoffplatte mit 1 Tropfen (40 μΙ) der ausgewählten Verdünnung des Antigen-enthaltenden Serums versetzt; die Tropfen werden mit einem Holzstäbchen vermischt. Man läßt 5 Minuten stehen, um die Antigen-Antikörper-Reaktion zu ermöglichen, fügt 1 Tropfen (40 μΐ) des gemäß Beispiel 1 hergestellten diagnostischen Reagenzes hinzu und mischt kurz mit einem Holzstäbchen. Dann wird die Platte vorsichtig 5 Minuten hin- und hergeschüttelt. Zu dieser Zeit hat eine Agglutination stattgefunden, wenn das Testserum keinen Antikörper enthält. Findet keine Agglutination statt, so zeigt dies die Anwesenheit des Antikörpers im Testserum an. Für Vergleichszwecke wird vorzugsweise ein Silmultantest unter Verwendung eines Tropfens eines bekannten Serums durchgeführt, das frei vor Australien-Antigen oder des Antikörpers hierzu ist Hierbei muß eine starke Agglutinationsreaktion auftreten. ίο this), produced as a diluent. 1 drop each of these dilutions is tested with the diagnostic reagent of Example 4. The highest Dilution at which maximum agglutination still takes place is determined. This dilution is used for used the test. 1 drop (40 μΐ) of a test sample of human serum is placed on a black glass (or Plastic plate with 1 drop (40 μΙ) of the selected Dilution of the antigen-containing serum added; the drops are made with a wooden stick mixed. The mixture is left to stand for 5 minutes to allow the antigen-antibody reaction, 1 Add drops (40 μΐ) of the diagnostic reagent prepared according to Example 1 and mixes in briefly a wooden stick. Then the plate is gently shaken back and forth for 5 minutes. At that time has one Agglutination has occurred when the test serum does not contain antibodies. Does not find agglutination instead, this indicates the presence of the antibody in the test serum. For comparison purposes, is preferred a Silmultan test was carried out using a drop of a known serum that was free Australia antigen or the antibody to this is here a strong agglutination reaction must occur.
Der Antikörpertiter in jedem Testserum kann se bestimmt werden, daß man den Test, wie ober beschrieben, mit einer 2fach-Verdünnung des Testserums in normalem Serum durchführt. Der Endpunkt isi gegeben durch die höchste Verdünnung des Testserums die keine Agglutination mit dem diagnostischer Reagenz nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Tes ergibt.The antibody titer in each test serum can be determined by using the test as described above is carried out with a 2-fold dilution of the test serum in normal serum. The endpoint isi given by the highest dilution of the test serum which does not agglutinate with the diagnostic Reagent according to the test described in Example 8 results.
Claims (15)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB3609771 | 1971-07-31 | ||
GB3609771A GB1390617A (en) | 1971-07-31 | 1971-07-31 | Diagnostic reagents test method and pack |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2237204A1 DE2237204A1 (en) | 1973-02-08 |
DE2237204B2 DE2237204B2 (en) | 1977-04-07 |
DE2237204C3 true DE2237204C3 (en) | 1977-12-01 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CH630465A5 (en) | METHOD FOR DETECTING OR DETERMINING AN ANTIBODY / ANTIGENT COMPLEX IN A FLUID SAMPLE. | |
DE1598945B2 (en) | METHOD FOR DETERMINATION OF PROTEINS AND POLYPEPTIDES | |
DE2608667A1 (en) | SOLIDS DIAGNOSTIC REAGENT AND METHOD FOR MANUFACTURING THEREOF | |
DE2604844C3 (en) | Method for the detection of hepatitis B surface antigen in human blood | |
DE2653032A1 (en) | RADIOIMMUNE DETECTION METHOD FOR THYROID HORMONE AND SUITABLE REAGENT | |
DE2322562C2 (en) | Method for the determination of antigens in a sample | |
DE2551208B2 (en) | Process for the production of a stable erythrocyte preparation | |
EP0001223A2 (en) | Latex coated with a polyhydroxy compound, process for the preparation of this latex, immunological reagent containing this latex, process for the preparation of this reagent, application of this reagent, testing procedure utilising this reagent and reagent kit containing this reagent | |
DE2934757C2 (en) | Composition and method for the determination of human immunoglobulin-G | |
DE2934756C2 (en) | Composition for the determination of beta 2 -human microglobulin and process for its preparation and its application | |
DE2714751C2 (en) | ||
DE2237204C3 (en) | Method for the detection of the Australian antigen or the antibody for this in a blood test sample | |
DE2850950B2 (en) | Use of native or thermally modified cytochrome c as a stabilizer for an immunochemical measuring reagent, immunochemical measuring reagent and buffer solution for diluting samples in immunochemical measuring processes | |
DE1617734B1 (en) | Process for the preparation of an immunological reagent | |
DE2025718C3 (en) | Method for stabilizing lyophilized erythrocytes | |
EP0011716B1 (en) | Reagent for the determination of infectious mononucleosis and process for its preparation | |
DE2054805A1 (en) | Indirect agglutination test with simultaneous adsorption of heterologous antibodies | |
DE2237204B2 (en) | METHOD OF DETECTING AUSTRALIAN ANTIGEN OR ANTIBODY IN A BLOOD TEST | |
CH643069A5 (en) | IMMUNOCHEMICAL DETERMINATION OF LACTATE DEHYDROGENASE ISOENZYME LDH (1). | |
DE2560402C2 (en) | Process for the preparation of human immune serum globulin suitable for the therapy of hepatitis A | |
EP0034301A2 (en) | Method for the determination of immuno-complexes | |
DE2618449A1 (en) | SERUM DIAGNOSTIC COMPOSITION | |
EP0014965A1 (en) | Immunological diagnostic reagent for pregnancy detection, process for its preparation and its use in pregnancy detection | |
DE4112999A1 (en) | Detection of auto-antibodies resulting from Epstein-Barr infection - using antigen comprising all or part of the protein triose phosphate isomerase, for diagnosing infectious mononucleosis rapid and reliably | |
DE2844060A1 (en) | Haemagglutination method using two differently sensitised particles - e.g erythrocytes of different sedimentation speeds, allowing two tests on single sample |