DE2551208A1 - STABLE ERYTHROCYTE PREPARATION, METHOD OF PRODUCTION AND USE - Google Patents

STABLE ERYTHROCYTE PREPARATION, METHOD OF PRODUCTION AND USE

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DE2551208A1 DE19752551208 DE2551208A DE2551208A1 DE 2551208 A1 DE2551208 A1 DE 2551208A1 DE 19752551208 DE19752551208 DE 19752551208 DE 2551208 A DE2551208 A DE 2551208A DE 2551208 A1 DE2551208 A1 DE 2551208A1
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Description

AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg(Lahn)AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg (Lahn)

Aktenzeichen: Hoe 75/B 013 - Ma 232File number: Hoe 75 / B 013 - Ma 232

Datum: 12. November 1975Date: November 12, 1975

Stabile Erythrozyten-Präparation, Verfahren zu deren Hers teil urtg und deren Verwendung Stable erythrocyte preparation, procedures for their manufacture and use

Die Erfindung betrifft eine stabile lyophilisierbare, für die Beschichtung mit Antigen geeignete Erythrozyten-Präparation, ein Verfahren zu deren Herstellung durch Behandlung der Erythrozyten mit einem niedrigen Aldehyd und einem Chromsalz sowie deren Verwendung, insbesondere in einem Hämagglutinationstest.The invention relates to a stable lyophilizable, for Coating with antigen-suitable erythrocyte preparation, a process for their production by treating the erythrocytes with a low aldehyde and a chromium salt and their use, especially in one Hemagglutination test.

Seit langem werden Antikörper im passiven oder indirekten Hämagglutinationstest nachgewiesen. Dabei werden Blutkörperchen verschiedenster Tierspezies, meist des Hammels, als Träger für gelöste Antigene benutzt. Da native Erythrozyten nur über eine kurze Zeitdauer stabil sind, hat man später eine Behandlung der Zellen mit Aldehyden (Formaldehyd, Pyruvaldehyd, Glutardialdehyd) oder Sulfosalizylsäure vorgenommen. So behandelte Zellen können längere Zeit konserviert werden. Sie werden erst vor Gebrauch mit dem entsprechenden Antigen beladen.Antibodies have long been passive or indirect Hemagglutination test proven. Blood cells of various animal species, mostly of the mutton, are used as carriers for used dissolved antigens. Since native erythrocytes are only stable for a short period of time, treatment of the Cells made with aldehydes (formaldehyde, pyruvaldehyde, glutaraldehyde) or sulfosalicylic acid. Cells treated in this way can be preserved for a long time. They are only used before use loaded with the appropriate antigen.

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Derart mit Antigen beladene Erythrozyten sind im allgemeinen nur in Kolloid wie z.B. Serum, Albumin, Gelatine enthaltenden Lösungen suspensions stabil. Je nach der Menge der in dem ge-Such antigen-loaded erythrocytes are generally only stable in solutions containing colloids such as serum, albumin, gelatin. Depending on the amount of

kann das zu untersuchende Serum im Kochsalz-Milieu oder in anderen geeigneten Medien eingesetzt werden. Die Verwendbarkeitsdauer beträgt je nach dem verwendeten Antigen Stunden bis Tage. Eine Verbesserung der Haltbarkeit kann durch lyophile Trocknung erreicht werden.the serum to be examined can be used in a saline medium or in other suitable media. The usability period ranges from hours to days depending on the antigen used. The shelf life can be improved by lyophiles Drying can be achieved.

Es ist auch schon beschrieben. Erythrozyten gleichzeitig mit Chrom (III) chlor id und einem Antigen zu behandeln, wonach das Antigen an die Erythrozyten gekoppelt wird.It has already been described. Erythrocytes simultaneously with Chromium (III) chlorid and an antigen to treat, after which the antigen is coupled to the erythrocytes.

Die von verschiedenen Autoren vorgenommene Koppelung von Antigenen an native Hammel-Erythrozyten bei gleichzeitiger Einwirkung von. Antigen und Chrom (III) chlor id hat wesentliche Nachteile,, da die Chromsalze sowohl auf die Erythrozytenoberflache als auch auf das zugesetzte Antigen einwirken und damit eine optimale Einstellung der Reagenzien erschweren.The coupling of antigens carried out by various authors on native mutton erythrocytes with simultaneous exposure from. Antigen and chromium (III) chlorine id have significant disadvantages, since the chromium salts both on the erythrocyte surface as also act on the added antigen and thus make an optimal setting of the reagents difficult.

Bei der Herstellung, .Lagerung und Gebrauch von mit Antigenen beschichteten ■ Erythrozyten-Präparationen sind noch eine Reihe von Problemen nicht gelöst, beispielsweise die soeben erwähnte optimale Einstellung der Kachweisempfindlichkeit der Hämagglutinationsantigene. Auch hinsichtlich der Stabilität der Erythrozyten unter Lagerungsbedingungen und der Reproduzierbarkeit lassen
''die damxt durchgeführten Hämagglutinationsuntersuchungen zuweilen zu wünschen übrig.In the manufacture, storage and use of erythrocyte preparations coated with antigens, a number of problems have not yet been solved, for example the above-mentioned optimal setting of the detection sensitivity of the hemagglutination antigens. Also with regard to the stability of the erythrocytes under storage conditions and reproducibility
'' the hemagglutination examinations carried out by damxt sometimes leave something to be desired.

Es bestand deshalb die Aufgabe, für die Beschichtung mit Anti-; genen geeignete Ery throzyten-Präparationen herzustellen, die bei der quantitativen Bestimmung in Häinagglutinationsuntersuchungen zuverlässige Resultate liefern, welche sich auch bei langer lagernden Präparationen reproduzieren lassen.There was therefore the task of coating with anti- ; genen to produce suitable erythrocyte preparations which, when quantitatively determined in haemagglutination examinations, provide reliable results which can also be reproduced in preparations that have been stored for a long time.

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Es wurde nun gefunden, dass eine wesentliche Verbesserung von in den Hämagglutinationstesten verwendbaren Reagenzien erreicht werden kann, wenn man auf in einer Pufferlösung suspendierte Erythrozyten einen niedrigen alipliä-tischen Aldehyd und ein. wasserlösliches Salz des 2- oder 3-wertigen Chroms einwirken lässt, die Erythrozyten wäscht und gewünschtenfalls lyophilisiert. Nach dem Waschen kann gewünschtenf alls ein diagnostisches Antigen auf die erhaltene Erythrbzyten-Präparation aufgebrachtIt has now been found that a substantial improvement has been achieved in the reagents which can be used in the hemagglutination tests can be, if one has a low aliphatic aldehyde and a. Let the water-soluble salt of 2- or 3-valent chromium take effect, wash the erythrocytes and, if desired, lyophilize them. If desired, a diagnostic test can be carried out after washing Antigen applied to the erythrocyte preparation obtained

werden. »gleichzeitig oder in. beliebiger Reihenfolge nacheinanderwill. »At the same time or in any order after another

Als Erythrozyten werden vorzugsweise kernhaltige Vogelerythrozyten verwendet. Durch Verwendung der zellkernhaltigen Vogelerythrozyten kommt es zu einer Beschleunigung der Sedimentation und gleichzeitig damit zu einfacher ablesbaren Sedimentationsmustern. Damit ist eine rasche und sichere Beurteilung der Reaktion gegeben.Nucleated avian erythrocytes are preferably used as erythrocytes used. By using the avian erythrocytes containing cell nuclei there is an acceleration of the sedimentation and, at the same time, sedimentation patterns that are easier to read. This is a quick and reliable assessment of the Response given.

Die Behandlung der Zellen mit einem Chromsalz verbessert vor allem wesentlich deren Lagerfähigkeit bei ca. 37°C. Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäss behandelten Erythrozyten liegt in der geringen Tendenz zu unspezifisch positiven Reaktionen, womit in den meisten Fällen die Verwendung eines Kontroll-Reagenzes überflüssig wird. Insbesondere die behandelten Geflügelerythrozyten zeichnen sich durch rasche, empfindliche und spezifische Reaktionsfähigkeit in Hämagglutionstesten ebenso wie durch Stabilität in flüssiger- oder lyophil getrockneter Form aus.Treatment of the cells with a chromium salt improves their storage life at approx. 37 ° C. Another The advantage of the erythrocytes treated according to the invention lies in the low tendency towards unspecific positive reactions, which means in most cases the use of a control reagent becomes unnecessary. In particular the treated poultry erythrocytes are also characterized by rapid, sensitive and specific reactivity in haemagglution tests such as stability in liquid or lyophilically dried form.

Die mit Aldehyden und Chroinsalzen vorbehandelten Geflügel-Erythrozyten sind zur Adsorption der Verschiedenesten Bakterien-, Parasiten- und Virus-Antigene geeignet und ermöglichen auch eine Anlagerung von Antikörpern zum Nachweis von Antigenen.The poultry erythrocytes pretreated with aldehydes and chroin salts are suitable for the adsorption of the most diverse bacterial, parasite and virus antigens and also enable an accumulation of antibodies to detect antigens.

Gegenstand der Erfindung ist zunächst das Verfahren zur Herstellung der stabilen, zur Beschichtung mit Antigenen geeigneten Erythrozyten-Präparation.- Dazu werden native ErythrozytenThe invention initially relates to the method of production the stable erythrocyte preparation suitable for coating with antigens - native erythrocytes are used for this

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im Vollblut von verschiedenen Tieren sowie von Menschen, vorzugsweise jedoch kernhaltige wie die von Vögeln wie Huhn, Taube und Truthahn gesammelt. Die Blutprobe wird mit herkömmlichen gerinnungshemmenden Substanzen versetzt, wonach die Erythrozyten beispielsweise durch Zentrifugieren gewonnen und mit verträglichen isotonischen Pufferlösungen mehrfach gewaschen werden, um die in dem Blut noch vorhandenen Antigene zu entfernen. Das gewaschene Erytiirozy tens ediment wird in nicht weniger als 8 Volumenteilen, einer isotonischen neutralen Pufferlösung: oder einer isotonisdien Salzlösung suspendiert. Zu dieser Suspension wird eine wässrige Lösung eines niedrigen aliphatischen Aldehyds, vorzugsweise eines solchen mit einer Kettenlänge von C 1 bis C 6 wie Formaldehyd, Methylglyoxal oder Glutaraldehyd in einer Menge von 0,2-10 Gewichtsprozent des Aldehyds bezogen auf das vorhandene Volumen des Erythrozytensediments zugesetzt. Die Reaktionszeit für die Einwirkung des Aldehyds auf die Erythrozyten, hängt von der Reaktionstemperatur und der eingesetzten Konzentration des Aldehyds ab. Zweckraässig werden diejenigen Reaktionsbedingungen eingehalten, die die Erythrozyten härten, ohne dass es zu Aggregaten kommt. Die Aggregatbildung kann mikroskopisch beobachtet werden.in the whole blood of various animals as well as humans, preferably however, nucleated such as those collected from birds such as chicken, pigeon, and turkey. The blood sample is with conventional Added anticoagulant substances, after which the erythrocytes obtained, for example, by centrifugation and washed several times with compatible isotonic buffer solutions in order to remove the antigens still present in the blood to remove. The washed erythrocyte tens ediment is in not less than 8 parts by volume, of an isotonic neutral buffer solution: or an isotonic saline solution. To this suspension, an aqueous solution of a lower aliphatic aldehyde, preferably one with a Chain length from C 1 to C 6 such as formaldehyde, methylglyoxal or glutaraldehyde in an amount of 0.2-10 weight percent of the aldehyde based on the existing volume of the erythrocyte sediment added. The reaction time for the action of the aldehyde on the erythrocytes depends on the reaction temperature and the concentration of the aldehyde used. Those reaction conditions are expediently observed, which harden the erythrocytes without aggregates occurring. The formation of aggregates can be observed microscopically.

In diesem Sinne werden in der Reg/el Reaktionszeiten von 1-24 Stunden bei Temperaturen von 5 - k5°C eingehalten. Gemäss bev—orzugten Bedingungen bei der Verwendung von Formaldehyd, das als ca. 35$ige Lösung handelsüblich ist, wird auf die Ery-fchrozytenS.uspension eine auf etwa 10-15$ vorverdünnte Formaldehydlösung zur Einwirkung gebracht. Im einzelnen kann nach dem Vorschlag von L.Csizmas, Proc. Exp. Biol. Med. 1O3, 157 ff. (i960) vorgegangen werden. Das vorgelegte Beispiel 1 erläutert das Verfahrensprinzip. Im Anschluss an die Aldehydbehandlung werden die Erythrozyten mehrere Male gewaschen. Falls sie nicht unmittelbar weiterverarbeitet werdenIn this sense, reaction times of 1-24 hours at temperatures of 5 - 5 ° C are generally observed. According to the preferred conditions when using formaldehyde, which is commercially available as an approx. 35% solution, a formaldehyde solution, prediluted to about 10-15%, is applied to the erythrocyte suspension. In detail, following the suggestion of L.Csizmas, Proc. Exp. Biol. Med. 1O3, 157 ff. (1960). Example 1 presented explains the principle of the process. Following the aldehyde treatment, the erythrocytes are washed several times. If they are not processed further immediately

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sollen, können die derartig vorbeiiandelten Erythrozyten mit einem antimikrobiell wirksamen Agens, beispielsweise Natriumtimerfcnat in einer Konzentration von. 0,.SJs-G, 03?», vejr-setist werden und als 10-30$ige, vorzugsweise 25?6ige, Suspension bei 4°C aufbewahrt werden.should, the erythrocytes that have passed by in this way can go along with it an antimicrobial agent, for example sodium timerfcnate in a concentration of. 0, .SJs-G, 03? », Vejr-setist and as a 10-30 $, preferably 25-6, suspension 4 ° C.

Für die Behandlung mit einem Chrom-II- oder Chrom-Ill-salz werden die mit Aldehyd behandelten. Erythrozyten in einem wässrigen Milieu suspendiert. Zweckmässig: wird hierfür Wasser verwendet. Die Konzentration der Erythrozyten beträgt 0,5-25$» vorzugsweise 1 ,25$. Dieser Erythrozytenßtxspension wird eine wässrige Chromsalz—Lösung in einer Konzentration von 0,0001-2,0$ zugesetzt und nach dem Vermischen 5—30 Min. bei 5-**5 C belassen. Danach werden die Erytlirozyten durch Sedimentation oder Zentrifugati on abgetrennt« Zur Entfernung von überschüssigem Chromsalz wird mehrmals gewaschen.For treatment with a chromium-II or chromium-III salt are those treated with aldehyde. Erythrocytes in one suspended in aqueous medium. Useful: water is used for this used. The concentration of erythrocytes is 0.5-25 $ » preferably $ 1.25. This erythrocyte expansion becomes a aqueous chromium salt solution at a concentration of $ 0.0001-2.0 added and after mixing 5 - 30 min. at 5 - ** 5 ° C left. After that, the erytlirocytes are caused by sedimentation or centrifugation separated «To remove excess Chromium salt is washed several times.

Als Chromsalze im Sinne der Erfindung koiassnen alle wasserlöslichen Chrom-II- und Chrom-III-Salze infar-age wie Chrom-II- oder Chrom-III-chlorid, -sulfat, -nitrat, —phosphat oder -acetat.All water-soluble salts can be used as chromium salts for the purposes of the invention Chromium II and chromium III salts infar-age such as chromium II or chromium III chloride, sulfate, nitrate, phosphate or -acetate.

Die Reihenfolge der Anwendung von Aldehyd und Chromsalz kann ohne nachteiligen Einfluss auf das Ergebnis vertauscht werden. Ebenso erfolgreich können Aldehyd und Chromsalz gleichzeitig zur Anwendung gebracht werden.The order of application of aldehyde and chromium salt can be can be swapped without adversely affecting the result. Aldehyde and chromium salt can be just as successful at the same time can be applied.

Die auf diese ¥eise erhaltenen Formaldehyd- und Chromsalzbehandelten Erythrozyten sind geeignet, i&xt verschiedenen Antigenen beschichtet zu werden.The formaldehyde and chromium salt treated in this way Erythrocytes are capable of i & xt different Antigens to be coated.

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Im allgemeinen.werden die stabilisierten Erythrozyten mit Antigenen in einer wäßrigen Lösung überzogen, die auf einen pH-Wert unter 7, zweckmäßig auf einen schwachsauren pH-Wert zwiscHen 5,5 und 6,5, eingestellt wird. Unter Antigenen sollen die verschiedensten Substanzen verstanden werden, deren Nachweis im Blut oder Harn von Interesse ist. Su den beispielhaft ausgewählten Antigenen, die erfolgreich zum Überziehen der" stabilisierten Erythf'ozyten-Pra'parate verwendet v/erden können, gehören insbesondere Proteinantigene, vor allem die Plasmaproteinantigene menschlicher oder tierischer Herkunft, mikrobielle Antigene, beispielsweise Toxoplasma-Antigene, wie sie durch Ultraschall-Einwirkung erhalten werden können, oder Treponema-pällidum-Antigene, die aus infizierten Kaninchenhoden gewonnen werden, und andere. Es ist ein besonderer Vorteil der Erythrozyten-Praparation der vorliegenden Erfindung, daß sie für das Überziehen von Substanzen mit; unterschiedlichen chemischen Strukturen geeignet ist.In general, the stabilized erythrocytes are coated with antigens coated in an aqueous solution adjusted to pH below 7, expediently to a weakly acidic pH value between 5.5 and 6.5. Antigens are said to be of the most varied Substances are understood, the detection of which in the blood or urine is of interest. Su the selected examples Antigens that can be used successfully to coat the "stabilized red blood cell preparations" include in particular protein antigens, especially plasma protein antigens of human or animal origin, microbial antigens, for example Toxoplasma antigens such as those obtained by exposure to ultrasound can be obtained, or Treponema pällidum antigens, obtained from infected rabbit testicles and others. It is a particular advantage of the erythrocyte preparation of the present invention that it is suitable for coating substances with; different chemical structures suitable is.

Die mit den Antigesen beschichteten stabilisierten Erythrozyten werden zweckmäßig in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung, beispielsweise einer O,l-l?£igen Gummi arabicum-Lösur.g oder einer entsprechenden Lösung eines Gelatine-Abbau-Produktes oder Polyvinylpyrrolidon zweckmäßig in Gegenwart weiterer stabilisierender Substanzen wie Aminosäuren, z.B. Natriximglutaminat, oder Glycin in einer Konzentration von 1-10% und/oder eines tierischen Serums in einer Konzentration von 0,5-20% suspendiert. In dieser Suspensionsflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei Kühl schrank temperatur, also etwa .4°C, gelagert oder aber nach dem Einfrieren lyopail getrocknet werden. Nach Auflösung des getrockneten' Präparates in destilliertem Wasser steht das Reagenz für die Durchführung von Hämagglutinationstesten in der gleichen Qualität zur Verfügung, wie dies vor der Trocknung der. Fall war.The stabilized erythrocytes coated with the antigesis are expediently in a solution containing a lyophilic colloid, for example an 0.1-solution gum arabic solution or a corresponding solution of a gelatin degradation product or polyvinylpyrrolidone, expediently in the presence of other stabilizing agents Substances such as amino acids, e.g. natriximglutaminate, or glycine in a concentration of 1-10% and / or an animal serum in a concentration of 0.5-20%. In this suspension liquid, the reagent can be stored in liquid form at refrigerator temperature, i.e. about .4 ° C, or after freezing lyopail to be dried. After dissolving the dried preparation in distilled water, the reagent is available for performing hemagglutination tests in the same quality available as this before drying the. Case was.

Die Durchführung der Häiaagglutinationsuntersuchungen ist den* Fachmann bekannt. Ik allgemeinen wird dazu eine Serumprobe, welche den vermuteten Antikörper enthält, mit dem entsprechendenCarrying out the hemophilia agglutination examinations is the * Known to those skilled in the art. In general, a serum sample is used for this purpose, which contains the suspected antibody with the corresponding one

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antigenbeschichteten Erythrozyten—Präparat in einem wäßrigen Milieu vermischt, um zu bestimmen, ob eine Agglutination auftritt. Die Agglutinationsreaktion, wird vorteilhaft in Mikrofciterplatten durchgeführt- Dazu, wird beispielsweise 0,05 ml Serum bzw. Serumverdünnung mit O,O25 ml der erfindungsgemäßen mit Antigen beschichteten .. Erythrozyten (l,25%ig) vermischt und 30 Sekunden bis 1 Minute geschüttelt. Bei Anwendunq des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Herstellung der beschichteten Erythrozyten kann die Ablesung der Testergebnisse bereits nach 30 Minuten erfolgen.antigen-coated erythrocyte preparation in an aqueous Mixed environment to determine if agglutination is occurring. The agglutination reaction is advantageously carried out in microfitre plates carried out- For this purpose, for example, 0.05 ml Serum or serum dilution with 0.025 ml of the with antigen coated .. erythrocytes (1.25%) mixed and shaken for 30 seconds to 1 minute. When using the method described above for producing the coated erythrocytes, the test results can be read after 30 minutes.

• *• *

Wie oben ausgeführt, können die erfindungsgemäß stabilisierten Erythrozyten-Präparationen mit Proteinantigenen beschichtet werden. Dies bedeutet, daß sie auch mit einem spezifischen Antikörper überzogen werden können, so daß bei nachfolgender H Mmagg lut inat ion sunte rs uchung die Erythrozyten in Gegenwart des entsprechend spezifischen Antigens agglutinieren. Der passive Hämagglutinationstest kann dazu verwendet werden, um bakterielle Infektionen nachzuweisen, für die Entdeckung von Virusinfektionen, für die Bestimmung der Histokompatibilität, für die Entdeckung von Autoimmunitätserkrankungen und anderen vergleichbaren Phänomenen.As stated above, the stabilized according to the invention can Red cell preparations are coated with protein antigens. This means that they also work with a specific Antibodies can be coated so that the erythrocytes in the presence of the agglutinate according to specific antigen. The passive hemagglutination test can be used to detect bacterial Detect infections, for the detection of viral infections, for the determination of the histocompatibility, for the detection of autoimmunity diseases and other similar ones Phenomena.

Die Erfindung soll an nachfolgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.The invention is to be explained in more detail using the following exemplary embodiments.

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/to/ to

Beispiel 1 · .Example 1 · .

a) Stabilisierung der Erythrozytena) Stabilization of the erythrocytes

300 ml Hühnerblut werden in 100 ml 3,5%iger Citratlösung aufgefangen und noch am gleichen Tag verarbeitet.300 ml of chicken blood are collected in 100 ml of 3.5% citrate solution and processed the same day.

Die Erythrozyten v/erden bei ca. 2.O00 χ g al>zentrifugiert und 5 Mal in 1Ό Volumina kalter (ca. 1O°C) O,85%iger NaCl-Lösung gewaschen. Dabei soll Schaumbildung vermieden werden. Das ge-, waschene Zellsediment wird in 8 Volumina O,85%iger NaCl-Lösung mit einem pH von 6,8 suspendiert. 1/4 des Volumens der Zellsuspension einer 14%igen Formaldehydlösung pH 5,5 wird in einen Zellophan-Dialyseschlauch gegossen {Breite 2,5 cm) und an einem Ende* verschlossen. Dabei wird etwa. 1/3 des Schlauches leer belassen. Die Luft wird ausgedrückt, das offene Ende zugebunden, der Schlauch auf den Boden eines Bechers gelegt und die Erythrozytensuspension darüber gegossen. Der Becher wird bei Raumtemperatur auf einem mechanischen Schüttler (orbital shaker) bewegt. Die Geschwindigkeit wird so reguliert, daß starke Mischung bei ,geringster Schaumbildung erreicht wird- Nach 3 Stunden wird der Zellophansack entfernt, sein Inhalt in öen Becher gegossen und weitere 16-18 Stunden geschüttelt. Danach werden verklumpte Zelltrümmer auf der Oberfläche öer Flüssigkeit und an den Becherwandungen gefunden, die durch vorsichtiges Dekantieren entfernt werden können.The erythrocytes are centrifuged and grounded at approx 5 times in 1Ό volumes of cold (approx. 10 ° C) O, 85% NaCl solution washed. Foaming should be avoided. The washed cell sediment is dissolved in 8 volumes of 0.85% NaCl solution suspended at pH 6.8. 1/4 the volume of the cell suspension a 14% formaldehyde solution pH 5.5 is in a Cast cellophane dialysis tube (width 2.5 cm) and sealed at one end *. This is about. Leave 1/3 of the hose empty. The air is squeezed out, the open end is tied, the tube is placed on the bottom of a beaker and the erythrocyte suspension is added poured over it. The beaker is placed on a mechanical orbital shaker at room temperature emotional. The speed is regulated in such a way that strong mixing is achieved with the least amount of foam formation - after 3 hours the cellophane bag removed, its contents poured into an open beaker and shaken for a further 16-18 hours. After that will be clumped cell debris was found on the surface of the liquid and on the walls of the beaker, which was caused by careful decanting can be removed.

Zu der homogenen Zellsuspension wixd 1/2 Volumen isotonische NaCl-Lösung gegossen und dann 6 Mal mit jeweils .. 75Ο ml gewaschen. Schließlich wird das gewaschene, forraalinisierte Zellsediment in phosphatgepufferter Kochsalzlösung pH 7,2 (PBS) mit 0,02% Natriumtimerfonat suspendiert, so daß eine 25%ige Lösung entsteht, die bei 4 C aufbewahrt wird.1/2 volume isotonic to the homogeneous cell suspension Poured NaCl solution and then washed 6 times with each .. 75Ο ml. Finally, the washed, forraalinized cell sediment becomes in phosphate-buffered saline pH 7.2 (PBS) with 0.02% sodium timerfonate suspended, making a 25% solution arises, which is stored at 4 C.

Für die Behandlung der aldehydbeKandelten, gewaschenen, stabilisierter. Erythrozyten mit CrCl^ v/erden sie in einer ca. 1:4 ver-For the treatment of aldehyde treated, washed, stabilized. Erythrocytes with CrCl ^ v / ground them in an approx. 1: 4

709821 /0824709821/0824

MaMa

dünnten gepufferten Kochsalzlösung pH 7,5 suspendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen feiner wäßrigen Chrom(III)-chlorid-Lösung in einer Konzentration von O,002% zugesetzt und der Ansatz 10 Min. bei 37°C belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen in physiologischer Kochsalzlösung. suspended in a dilute buffered saline solution pH 7.5. This Suspension becomes an equal volume of fine aqueous chromium (III) chloride solution added in a concentration of 0.002% and leave the batch at 37 ° C. for 10 minutes. The chromium salt is then removed by washing it several times in physiological saline solution.

b) Beschichtung mit Antigen - . -b) coating with antigen -. -

1. Ein durch Ultraschalleinwirkung (2 χ 1 Min. 22 KHz) aus Toxopläsiuen erhaltener und durch Zentrifugation von partikulären Bestandteilen gereinigter Antigenextrakt wird in geeigneter Verdünnung, die in einem Vorversuch ermittelt wird, mit der Aldehyd-Chrom (III) chlorid-behandelten Erythrozytensuspension (l,25%ig) versetzt und für eine Einwirkungszeit von 1 Stunde bei 37°C belassen. Der pH-Wert wird dabei auf 6,4 gehalten.1. On by the action of ultrasound (2 χ 1 min. 22 KHz) Toxoplasms obtained and by centrifugation of particulate Components of purified antigen extract is in a suitable dilution, which is determined in a preliminary test with the Aldehyde-chromium (III) chloride-treated erythrocyte suspension (1.25%) added and left to act for 1 hour leave at 37 ° C. The pH is kept at 6.4.

Danach erfolgt eine zweimalige Waschung in O,l-l%iger Gummi arabicum-Lösung und die Suspendierung des Sedimentes in m/15 Trishydroxymethyl-aminoinethan-ECl-Puffer pH 8,0, dem 5% Natriuin-Glutaminat und 15% Kaninchen serum zugesetzt ist.This is followed by two washes in 0.1-1% strength gum arabic solution and the suspension of the sediment in m / 15 Trishydroxymethylaminoinethane ECl buffer pH 8.0, the 5% sodium glutaminate and 15% rabbit serum is added.

«
Die Suspension enthält 1,25% Erythrozyten.«
The suspension contains 1.25% erythrocytes.

In dieser Suspensions- und Stabilisatorflüssigkeit kann das Reagenz flüssig bei +4 C gelagert oder lyophil getrocknet werden. Die Auflösung erfolgt in dem Originalvolumen destillierten Wassers.In this suspension and stabilizer liquid, the reagent can be stored in liquid form at +4 C or dried lyophilically. The dissolution takes place in the original volume distilled Water.

2. In entsprechender Weise kann ein Lues-Reagenz hergestellt werden, indem man anstelle eines Ultraschallextraktes von Toxoplasmen einen Extrakt von Treponeiaa pallidum aus infizierten Kaninchenhoden einsetzt und die Serumverdünnung in einem Absorption smedium durchführt. 2. In a similar manner, a Lues reagent can be prepared by instead of an ultrasonic extract of Toxoplasma an extract of Treponeiaa pallidum from infected ones Rabbit testicles are inserted and the serum dilution is carried out in an absorption medium.

709821 /0824709821/0824

Ma 232Ma 232

-yr--yr-

Beispiel 2Example 2

Frisch gewonnene Schaferythrozyten werden in dem zweifachen Volumen der Alsever's. Lösung folgender Zusammensetzung suspendiert: Freshly obtained sheep erythrocytes are in twice the volume of the Alsever's. Suspended solution of the following composition:

20,5 g Dextrose20.5 g of dextrose

8 g Natriumeitrat (Na2C6H5O7 · 2H2O) 0/552 g Citronensäure (H3CgHcO7 * H2O) 4,2 g Natriumchlorid ad 1000 ml mit Aqua dest.8 g sodium citrate (Na 2 C 6 H 5 O 7 · 2H 2 O) 0/552 g citric acid (H 3 CgHcO 7 * H 2 O) 4.2 g sodium chloride ad 1000 ml with distilled water.

Danach werden die Erythrozyten bei ca. 2.000 χ g abzentrifugiert und fünfmal in 10 Volumenteilen kalter phosphatgepufferter 0,15 molarer Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 gewaschen. Nach dem Waschen werden die Erythrozyten bis zu einer Konzentration von 8% (v/v) in 0,15 molarer gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 suspendiert. Zu einem Volumenteil dieser Erythrozyten-Suspension wird das gleiche Volumen einer 3%igen Glutardialdehydlösung in gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 7,2 tropfenweise unter langsamen Rühren der Zellsuspension zugesetzt. Danach läßt man 17 Stunden bei Raumtemperatur rühren, wäscht die Suspension anschließend fünfmal mit gepufferter Kochsalzlösung von pH 7,2 und resuspendiert die aldehydbehandelten Erythrozyten in Kochsalzlösung, so daß eine 15%ige (v/v) Suspensj.on der auf diese Weise stabilisierten Erythrozyten entsteht.The erythrocytes are then centrifuged off at approx. 2,000 χ g and washed five times in 10 parts by volume of cold phosphate-buffered 0.15 molar saline solution with a pH of 7.2. After washing, the erythrocytes are suspended up to a concentration of 8% (v / v) in 0.15 molar buffered saline solution with a pH of 7.2. The same volume of a 3% strength glutaraldehyde solution in buffered saline solution of pH 7.2 is added dropwise to one volume of this erythrocyte suspension while slowly stirring the cell suspension. The mixture is then stirred for 17 hours at room temperature, the suspension is then washed five times with buffered saline solution of pH 7.2 and the aldehyde-treated erythrocytes are resuspended in saline, so that a 15% (v / v) suspension of the erythrocytes stabilized in this way arises.

Für die Behandlung der aldehydbehandelten, gewaschenen, stabilisierten Erythrozyten mit Chrom (II) chlorid werden sie in einer ca. 1:4 verdünnten gepufferten Kochsalzlösung von pH 7,2 suspendiert. Dieser Suspension wird ein gleiches Volumen einer wäßrigen Chrom (II) chlorid-Lösung in einer Konzentration von 0,0 5% zugesetzt, der Ansatz bei 37°C 30 Minuten belassen. Danach entfernt man das Chromsalz durch mehrmaliges Waschen mit physiologischer Kochsalzlösung.For the treatment of the aldehyde-treated, washed, stabilized Erythrocytes with chromium (II) chloride are suspended in an approx. 1: 4 diluted buffered saline solution of pH 7.2. An equal volume of an aqueous chromium (II) chloride solution at a concentration of 0.0 5% is added to this suspension, leave the batch at 37 ° C. for 30 minutes. The chromium salt is then removed by washing several times with physiological Saline solution.

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-y--y-

4343

MaMa

Die Beschichtung mit. Antigen kann in der gleichen Weise wie unter Beispiel 1 b) beschrieben vorgenommen werden.The coating with. Antigen can be used in the same way as described under Example 1 b).

Geeignete Erythrozyten-Präparationen für die Beschichtung mit Antigen erhält man auch, wenn statt Glutardialdehyd, wie im vorliegenden Beispiel ausgeführt, Methylgiyoxal verwendet: wird.Suitable erythrocyte preparations for coating with Antigen is also obtained if instead of glutaraldehyde, as explained in the present example, methylgiyoxal is used.

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Claims (15)

7RS1208 Ma Patentansprüche7RS1208 Ma claims 1. Verfahren zur Herstellung einer stabilen lyophilisierbaren Erythrozyten-Präparation, dadurcli gekennzeichnet, dass man auf in einer wässrigen isotonisciien Lösung suspendierte Erythrozyten gleichzeitig oder in beliebiger Reihenfolge nacheinander einen niedrigen aliphatischen Aldehyd und ein wasserlösliches Salz des 2- oder 3-wertigen Chroms einwirken lässt, die Erythrozyten wäscht und gewünschtenfalls lyophilisiert.1. Method of making a stable lyophilizable Erythrocyte preparation, characterized by being suspended in an aqueous isotonic solution Erythrocytes simultaneously or in any order one after the other a lower aliphatic aldehyde and a lets the water-soluble salt of 2- or 3-valent chromium take effect, washes the erythrocytes and if desired lyophilized. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als niedrigen aliphatischen Aldehyd einen Aldehyd mit 1-62. The method according to claim 1, characterized in that one as a lower aliphatic aldehyde, an aldehyde with 1-6 - C-Atomen verwendet- C atoms used t.t. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der niedrige aliphatische Aldehyd in einer Konzentration von3. The method according to claim 2, characterized in that the lower aliphatic aldehyde in a concentration of ' 0,1-1096 (g/v) verwendet wird.0.1-1096 (w / v) is used. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß die wasserlöslichen Chromsalze der Erythrozyten-Suspension in einer Konzentration von 0,001-2% verwendet werden.4. The method according to any one of claims 1-3, characterized in, that the water-soluble chromium salts of the erythrocyte suspension used in a concentration of 0.001-2% will. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Chromsalz Chrom(II)chlorid · verwendet wird.5. The method according to any one of claims 1-4, characterized in that that as a water-soluble chromium salt chromium (II) chloride is used. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß als wasserlösliches Chromsalz Chrom(III)chlorid verwendet wird.6. The method according to any one of claims 1-5, characterized in that that as a water-soluble chromium salt chromium (III) chloride is used. 7· Verfahren nach einem der Ansprüche 1—6, dadurch gekennzeichnet, dass der Aldehyd oder das Chromsalz bei etwa 5 C bis etwa h5°G einwirkt.7. Process according to one of Claims 1-6, characterized in that the aldehyde or the chromium salt acts at about 5 C to about h5 ° G. 709821/0824709821/0824 Ma 232Ma 232 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Aldehyd 1-24 Stunden und das wasserlösliche Chromsalz 5-30 Minuten auf die Erythrozyten einwirken läßt.8. The method according to any one of claims 1-5, characterized in that that the aldehyde is allowed to act on the erythrocytes for 1-24 hours and the water-soluble chromium salt for 5-30 minutes. 9. Verfahren zur Beschichtung von Erythrozyten-Präparationen mit einem Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß mit Aldehyd und einem wasserlöslichen Salz des 2- oder 3-wertigen Chroms behandelte Erythrozyten in schwachsaurer wäßriger Lösung mit einem Antigen in Kontakt gebracht, das überschüssige .Antigen abgewaschen und die Erythrozyten in einer ein lyophiles Kolloid enthaltenden Lösung resuspendiert werden.9. A method for coating erythrocyte preparations with an antigen, characterized in that with aldehyde and a water-soluble salt of divalent or trivalent chromium treated erythrocytes in weakly acidic aqueous solution brought into contact with an antigen, the excess antigen washed off and the erythrocytes in a lyophile Resuspended solution containing colloid. 10. Erythrozyten-Präparation hergestellt gemäß einem der Ansprüche 1-9.10. Erythrocyte preparation produced according to one of the claims 1-9. 11. Erythrozyten-Präparation hergestellt gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Beschichtung ein Toxoplasma-Antigen verwendet wird.11. Erythrocyte preparation produced according to claim 9, characterized in that a Toxoplasma antigen for the coating is used. 12. Erythrozyten-Präparation hergestellt gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß für die Beschichtung ein Treponema pallidum-Antigen verwendet wird.12. Erythrocyte preparation produced according to claim 9, characterized in that a Treponema pallidum antigen is used for the coating. 13. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation gemäß einem der Ansprüche 1-12 in einem HämaggXutinationstest.13. Use of an erythrocyte preparation according to any one of claims 1-12 in a hemaggxutination test. 14. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation gemäß Anspruch14. Use of an erythrocyte preparation according to claim 11 für die Diagnose einer Toxoplasma-Erkrankung.11 for the diagnosis of Toxoplasma disease. 15. Verwendung einer Erythrozyten-Präparation gemäß /Anspruch15. Use of an erythrocyte preparation according to / claim 12 für die Diagnose luetischer Erkrankungen.12 for the diagnosis of syphilitic diseases. 703821/0824703821/0824
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