DE2126766C

DE2126766C - Process for the production of carrier particles for antigens

Info

Publication number: DE2126766C
Application number: DE19712126766
Authority: DE
Inventors: Raymond Vincent Caldwell N Y Beagle Robert Jay Goshen Blan ken Robert milton Elkhart Ind Davis, (V St A)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1970-06-01
Filing date: 1971-05-28
Publication date: 1973-03-08

Description

ao B e i s ρ i e 1 1ao B e i s ρ i e 1 1

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung 10 ml einer 2⁰/„igen Suspension mit Formalin be-The invention relates to a method of treating 10 ml of a 2 ⁰ / "weight suspension with formalin loading

von mit Formalin behandelten Bakterienzellen mit handelter E.coli-Zeilen in physiologischer Kochsal,-of bacterial cells treated with formalin with traded E. coli lines in physiological kitchen,

einem Cyanhalogenid, wobei Trägerteilchen für Anti- lösung wurden gründlich mit destilliertem Wasser gta cyanide halide, where carrier particles for anti-solution have been washed thoroughly with distilled water

gene gebildet werden. 25 waschen und in 2 ml destilliertem Wasser resuspendier;.genes are formed. Wash 25 and resuspend in 2 ml of distilled water.

Viele Krankheiten sind gekennzeichnet durch die Er- Ein gleiches Volumen Cyanbromid in einer Konzenzeugung von Antikörpern als Reaktion auf eine mikro- tration von 50 mg/ml destilliertem Wasser wurde biologische Infektion. Wenn diese Antikörper in einem schnell unter Rühren zugegeben. Das Reaktiont frühen Zustand nachgewiesen werden können, ist ihr gemisch wurde sofort mit 4n-Natriumhydroxidlösung Vorhandensein ein diagnostischer Hinweis auf die 30 ungefähr 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, Krankheit. Antigene werden üblicherweise an Träger- um den pH-Wert auf 10 bis 12 einzustellen, und an zellen wie Erythrocytes Polystyrol oder gramnegative schließend mit 5000 UpM zentrifugiert. Die überBakterien gekuppelt, so daß es bequem ist, diese Anti- stehende Flüssigkeit wurde dekantiert, und die mit g.-ne mit dem entsprechenden Antikörper in Berührung Cyanbromid behandelten E.coli-Zellen wurden in zu bringen. Einer der größten Nachteile dieser immu- 35 10 ml einer O.lmolaren Natriumbicarbonatlösung, die nologischen Nachweissysteme is; die nichtspezifische auf einen pH-Wert von 9 gepuffert war, bei einer Agglutinierung von gekuppelten Antigenen und Anti- Temperatur von 4° C resuspendiert. Nach dem Zentrikörpei n, die zu falschen Untersuchungsergebnissen fugieren wurden die behandelten Zellen in 2 ml dieser führt. Um bakterielle Teilchen, die mit einem Antigen gepufferten Natriumbicarbonatlösung resuspendiert, gekuppelt sind, zum Nachweis von homologen Anti- 40 Anschließend wurden 0,4 ml einer physiologischen körpern, die im menschlichen Serum vorhanden sind, Kochsalzlösung, enthaltend 10 mg Rinderserumalbuzu verwenden, dürfen die Teilchen nur in Gegenwart min, unter Rühren zugegeben, und das Reaktionsdes speziellen, nachzuweisenden Proteins agglutinieren gemisch wurde bei 4⁰C 24 Stunden lang leicht ge- bzw. ausflocken. schüttelt. Die erhaltenen E.coli-Zellen, die mit Rinder-Many diseases are characterized by the formation of an equal volume of cyanogen bromide in a concentration of antibodies in response to micration of 50 mg / ml of distilled water became a biological infection. When this antibody is added in a rapid stirring. The reaction to the early state can be demonstrated is their mixture was treated immediately with 4N sodium hydroxide solution in the presence of a diagnostic indication of the disease for about 5 minutes at room temperature. Antigens are usually centrifuged on carriers to adjust the pH to 10 to 12, and then on cells such as erythrocytes, polystyrene or gram negative, centrifuged at 5000 rpm. The bacteria were coupled, so that it is convenient, this anti-standing liquid was decanted, and the E. coli cells which had been treated with g.-ne with the appropriate antibody in contact with the corresponding antibody were brought in. One of the main disadvantages of this immune system is; the non-specific was buffered to a pH of 9, resuspended with agglutination of coupled antigens and anti-temperature of 4 ° C. According to the centrifugal bodies, which lead to incorrect test results, the treated cells were converted into 2 ml of this. Bacterial particles, which are resuspended with an antigen-buffered sodium bicarbonate solution, are coupled to detect homologous anti-40 Subsequently, 0.4 ml of a physiological body present in human serum, saline solution containing 10 mg of bovine serum albumin are allowed to use the particles only in the presence of min, added with stirring, and the reaction of the special protein to be detected agglutinate mixture was ^{easily flocculated or flocculated at 4 °} C. for 24 hours. shakes. The E. coli cells obtained, which were

Es hat sich gezeigt, daß E.coli-Zellen, die mit For- 45 serumalbumin gekoppelt waren, wurden dar.n mitIt has been shown that E. coli cells which were coupled with for- 45 serum albumin were dar.n with

malin, Bis-diazobenzidin oder Protein oder Kombi- physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und inmalin, bis-diazobenzidine or protein or combined physiological saline solution and washed in

nationen dies« Substanzen behandelt sind, in Gegen- Io ml der Lösung für Untersuchungszwecke resuspen-Nations treated these substances are resuspended in counter- Io ml of the solution for investigation purposes.

wart von 60°/₀ normalem menschlichem Serum agglu- diert. Die sn erhaltenen Zellen reagierten stark mitwas aggluted by 60 ° / ₀ normal human serum. The cells obtained sn reacted strongly

tinieren. Derartige E.coli-Zellen, die mit einem Antigen Antirinderalbumin von Kaninchen, aber agglutinierten sensibilisiert sind, können nicht zum Nachweis homo- so nicht in Gegenwart von normalem menschlichemtinate. Such E. coli cells which agglutinated with an antigen, rabbit anti-bovine albumin are sensitized, cannot detect homo- so not in the presence of normal human

loger Antikörper verwendet werden, solange die nicht- Serum, spezifischen bindenden Stellen an der bakteriellenloger antibodies can be used as long as the non-serum, specific binding sites on the bacterial

Oberfläche nicht zerstört oder verdeckt sind. Beispiel 2Surface are not destroyed or covered. Example 2 Es hat sich nun gezeigt, daß die Behandlung von mitIt has now been shown that the treatment of with Formalin behandelten bakteriellen Zellen, wie E.coli, 55 Entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Ver-Formalin-treated bacterial cells, such as E. coli, 55 According to the procedure given in Example 1

mit einem Cyanhalogenid wie Cyanchlorid, -jodid, fahren wurden mit Formalin behandelte E.coli-ZellenE. coli cells treated with formalin were used with a cyan halide such as cyan chloride or iodide

-fluorid oder -bromid vor der Kupplung mit einem mit Cyanchlorid unter den gleichen Bedingungen be--fluoride or -bromide before coupling with a charged with cyanochloride under the same conditions

Antigen Trägerteilchen ergibt, die frei sind von nicht- handelt und anschließend mit menschlichem y-Glo-Antigen results in carrier particles that are free of non- and then with human y-glo-

spezifisch bindenden Stellen. Wenn ein Antigen mit bulin vermischt. Die so behandelten Zellen aggluti-specific binding sites. When an antigen is mixed with bulin. The cells treated in this way agglutinate

so behandelten bakteriellen Zellen gekuppelt wird, 60 nierten entsprechend mit Antihuman-y-Globulin vonso treated bacterial cells is coupled, renated accordingly with antihuman-γ-globulin from

können die entstehenden, mit Antigen sensibilisierten Kaninchen, aber nicht mit normalem menschlichemcan the resulting rabbits sensitized with antigen, but not with normal human

Zellen nur in Gegenwart des fUr die»» Antigen spezi- Serum, fischen Antikörpers agglutinieren bzw. ausflocken, undCells only in the presence of the serum specific for the »» antigen, agglutinate or flocculate fish antibodies, and

es werden falsche Untersuchungsergebnisse vermieden. Beispiel 3false test results are avoided. Example 3

E.coli-Zellen wurden 3 Stunden bei 37⁰C in einer «jE. coli cells were stored for 3 hours at 37 ^° C. in a «j

Nährlösung gezüchtet, und anschließend wurde die 10 ml einer 2°/oigen Suspension mit Formalin beKultur durch 30Minuten lange Behandlung bei 37⁰C handelter E.coli-Zellen in physiologischer Salzlösung mit einer 36,8°/»igen wäßrigen Lösung von mit CaI- wurden gewaschen und mit Cyanjodid, wie oben be-Broth grown, followed by 10 ml of a 2 ° / o suspension with formalin beKultur by 30 minutes long treatment at 37 ⁰ C-treated E. coli cells in a physiological saline solution with a 36.8 ° / »aqueous solution of CAI with were washed and treated with cyano iodide as above

schrieben, behandelt. Die erhaltenen Zellen wurden nach einmaligem Waschen mit O.lmolarer wäßriger Natriumbicarbonatlösung, die abgepuffert war, bei 4° C in physiologischer Salzlösung resuspendiert und dreimal mit dieser Salzlösung gev.aschcn, bevor sie in SmI Natriumphosphat-Salzlösung, die auf einen pH-Wert von 7,2 gepuffert war, resuspendiert wurden. 9 ml gepufferter Natriumphosphat-Salzlösung, enthaltend ungefähr 9 mg Insulin, wurden zu den obigen Zellen zugegeben und unmittelbar vor der Zugabe von 25 ml einer Lösung, enthaltend 1 mg Bis-diazobenzidin pro Milliliter Natriumphosphat-Salzlösung, vermischt. Die erhaltenen Zellen wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten rotiert und anschließend bei 2000 UpM zentrifugiert. Sie wurden dann mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 10 ml der Salzlösung vor der Durchführung der Untersuchungen resuspendiert. Es zeigte sich keine nichtspezifische Agglutinierung mit menschlichem Serum.wrote, treated. The cells obtained became more aqueous after washing once with 0.1 molar Sodium bicarbonate solution, which was buffered, resuspended in physiological saline solution at 4 ° C and Wash three times with this saline solution before pouring it into SmI sodium phosphate saline solution, which is applied to a pH 7.2 was buffered, were resuspended. Containing 9 ml of buffered sodium phosphate saline approximately 9 mg of insulin was added to the above cells and just prior to the addition of 25 ml of a solution containing 1 mg bis-diazobenzidine per milliliter of sodium phosphate saline solution, mixed. the cells obtained were rotated at room temperature for 30 minutes and then at 2000 rpm centrifuged. They were then washed with physiological saline and pre-immersed in 10 ml of the saline resuspended before carrying out the examinations. There was no non-specific agglutination with human serum.

Obwohl die obigen Beispiele r<ch spezifisch auf die Behandlung von mit Formalin behandelten E.coli-Zellen beziehen, können andere bakterielle Zellen mit Lipo- oder Mukopolysacchariden auf der Oberfläche auf ähnliche Weise mit Formalin und mit einem Cyanhalogenid behandelt werden. Derartige Bakterien sind unter anderen*. B. subtilis, S. marcescens, B. abortus, P. fragi, L. casei und A. aerogenes. Das Cyanhalogenid wird in Form eines wäßrigen Konzentrats mit 25 mg/ml Wasser bis zur Sättigung, vorzugsweise enthaltend 25 bis 100 mg/ml, besonders nichi weniger als 50 mg/ml Wasser, verwendet. Die verwendeten Antigene sind in einem Lösungsmittel wie einer physiologischen Salzlösung in Konzentrationen von 0,5 mg/ml Lösungsmittel bis zur Sättigung, aber vorzugsweise nicht mehr als 5 mg/ml Lösungsmittel, gelöst.
Die Temperatur für die Behandlung der bakteriellenAlthough the above examples relate specifically to the treatment of formalin-treated E. coli cells, other bacterial cells with lipo- or mucopolysaccharides on the surface can be treated in a similar manner with formalin and with a cyanide halide. Such bacteria are among others *. B. subtilis, S. marcescens, B. abortus, P. fragi, L. casei and A. aerogenes. The cyanide halide is used in the form of an aqueous concentrate containing 25 mg / ml of water to saturation, preferably containing 25 to 100 mg / ml, especially not less than 50 mg / ml of water. The antigens used are dissolved in a solvent such as a physiological saline solution in concentrations of 0.5 mg / ml solvent to saturation, but preferably not more than 5 mg / ml solvent.
The temperature for treating the bacterial

S Zellen mit dem Cyanhalogenid kann von x5 bis 30° C variieren, obwohl ungefähr 25° C vorteilhaft und bequem sind. Die Antigene werden üblicherweise mit den mit Cyanhalcjeuid behandelten Zellen bei ungefähr 4° C gekuppelt, obwohl Temperaturen von ungefährS cells with the cyanide halide can grow from x5 to 30 ° C vary, although around 25 ° C is beneficial and convenient. The antigens are usually associated with the cells treated with cyanide cyanide are coupled at about 4 ° C, although temperatures of about

-.o 0 bis 40° C gegebenenfalls ebenfalls angewandt werden können. In jedem Fall ist es günstig, die Oberfläche der bakteriellen Zellen mit Formalin zu stabilisieren, bevor sie mit einem Cyanhalogenid behandelt werden, um sicherzustellen, daß alle Stellen blockiert sind, die-.o 0 to 40 ° C may also be used be able. In any case, it is beneficial to stabilize the surface of the bacterial cells with formalin beforehand they are treated with a cyanide halide to ensure that all sites are blocked

is sonst zu einer Agglutinierung derartiger Zellen durch unbekannte Bestandteile des menschlichen Serums führen würden. Wie in den Beispielen gezeigt, werfen die mit Formalin behandelten bakteriellen Zellen mit einem Cyanhalogenid behandelt und dann mit einemOtherwise such cells will agglutinate unknown components of the human serum. As shown in the examples, throw the formalin treated bacterial cells are treated with a cyanide halide and then with a

ao Antigen über die Iminocarbonsäureestergruppen gekuppelt oder alternativ können die mit Cyanhalogenid behandelten Zc'len mit einem Antigen umgesetzt • werden, das vorher mit einem üblichen Kupplungsmittel wie Bis-diazobenzidin gekuppelt worden ist.ao antigen coupled via the iminocarboxylic acid ester groups or, alternatively, the cells treated with cyanide halide can be reacted with an antigen • that has been previously coupled with a common coupling agent such as bis-diazobenzidine.

as Die Cyanhalogenidbehandlung der mit Formalin behandelten bakteriellen Zellen sollte in einem alkalischen M idium bei einem pH-Wert von ungefähr 10 bis 12 und vorzugsweise bei einem pH-Wert von ungefähr 11 durchgeführt werden. Obwohl Cyan-as The cyanide halide treatment with formalin treated bacterial cells should be kept in an alkaline medium at a pH of approximately 10 to 12 and preferably at a pH of about 11. Although cyan

bromid bevorzugt ist, können andere Cyanhalogenide wie das Chlorid, Jodid oder Fluorid gegebenenfalls ebenfalls verwendet werden.bromide is preferred, other cyanogen halides such as the chloride, iodide or fluoride can optionally can also be used.

Claims

formaldehyde treated with calcium carbonate is killed. Claims: The killed cells were obtained by centrifugation and alternating centrifugation

1. Verfahren zur Herstellung von Trägerteilchen und Resuspendieren in physiologischer Kochsalzfür Antigene, die frei sind von unspezifisch bin- 5 lösung gewaschen. Die gewaschenen b.coli-Zellen denden Stellen, dadurch ge kennzeich- wurden dann mit einer l°/_oigen wäßrigen Formaldehydn e t, daß man m t Formalin behandelte Bakterien- lösung in physiologischer Kochsalzlösung behandelt zellen in wäßrigem Medium mit einem Cyanhalo- und 2 Tage bei 26°C unter gelegentlichem Schutte η genid behandelt. stehengelassen. Die mit Formalin behandelten E.coh-1. Process for the production of carrier particles and resuspension in physiological saline for antigens which are free from unspecific bin solution. The washed cells b.coli Denden places, so ge labeling were then et a l ° / _o aqueous Formaldehydn that one mt formalin-treated bacterial solution in physiological saline treated cells in aqueous medium with a Cyanhalo- and 2 days treated at 26 ° C under occasional rubble η genid. ditched. The formalin treated E. coh-

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- io Zellen wurden in physiologischer Kochsalzlosung gezeichnet, daß man als Cyanhalogenid Cyanbromid waschen, in 0,2°/₀iger wäßriger Fonnaldehydlösung verwendet. in physiologischer Kochsalzlösung resuspendiert und2. The method of claim 1, characterized io marked cells were drawn in a physiological saline solution in that washing as a cyanogen halide, cyanogen bromide, / used in the 0.2 ° ₀ aqueous Fonnaldehydlösung. resuspended in physiological saline solution and

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch die Zellenkonzentration durch Hämatocrit auf 2°/₀ gekennzeichnet, daß man E.coli-Zellen verwendet. eingestellt.3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell concentration by hematocrit to 2 ° / ₀ , that E. coli cells are used. set.

15 Die folgenden Beispiele zeigen das Verfahren zur Behandlung von mit Formalin behandelter E.co: -Zellen, die wie oben angegeben hergestellt worden sind mit einem Cyanhalogenid.The following examples demonstrate the method of treating formalin treated E.co: cells prepared as indicated above with a cyanide halide.