DE2126766B

DE2126766B - Process for the preparation of carrier particles for antigens

Info

Publication number: DE2126766B
Authority: DE
Inventors: Raymond Vincent Caldwell N.Y.; Beagle Robert Jay Goshen; Blanken Robert Milton Elkhart; Ind.; Davis (V.StA.)
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp

Description

²⁰ Beispiel 1 ²⁰ Example 1

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung 10 ml einer 2°/_oigen Suspension mit Formalin be-The invention relates to a method of treating 10 ml of a 2 ° / _o aqueous suspension with formalin loading

von mit Formalin behandelten Bakterienzellen mit handelter E.coli-Zellen in physiologischer Kochsalz-of bacterial cells treated with formalin with treated E. coli cells in physiological saline

einem Cyanhalogenid, wobei Trägerteilchen für Anti- lösung wurden gründlich mit destilliertem Wasser ge-a cyanide halide, with carrier particles for anti-solution being thoroughly mixed with distilled water

gene gebildet werden. 25 waschen und in 2 ml destilliertem Wasser resuspendiert.genes are formed. Wash 25 and resuspend in 2 ml of distilled water.

Viele Krankheiten sind gekennzeichnet durch die Er- Ein gleiches Volumen Cyanbromid in einer Konzenzeugung von Antikörpern als Reaktion auf eine mikro- tration von 50 mg/ml destilliertem Wasser wurde biologische Infektion. Wenn diese Antikörper in einem schnell unter Rühren zugegeben. Das Reaktionsfrühen Zustand nachgewiesen werden können, ist ihr gemisch wurde sofort mit 4n-NatriumhydroxidIösung Vorhandensein ein diagnostischer Hinweis auf die 30 ungefähr 5 Minuten bei Raumtemperatur behandelt, Krankheit. Antigene werden üblicherweise an Träger- um den pH-Wert auf 10 bis 12 einzustellen, und anzellen wie Erythrocyte^ Polystyrol oder gramnegative schließend mit 5000 UpM zentrifugiert. Die überBakterien gekuppelt, so daß es bequem ist, diese Anti- stehende Flüssigkeit wurde dekantiert, und die mit gene mit dem entsprechenden Antikörper in Berührung Cyanbromid behandelten E.coli-Zellen wurden in zu bringen. Einer der größten Nachteile dieser immu- 35 10 ml einer OJmolaren Natriumbicarbonatlösung, die nologischen Nachweissysteme ist die nichtspezifische auf einen pH-Wert von 9 gepuffert war, bei einer Agglutinierung von gekuppelten Antigenen und Anti- Temperatur von 4⁰C resuspendiert. Nach dem Zentrikörpern, die zu falschen Untersuchungsergebnissen fugieren wurden die behandelten Zellen in 2 ml dieser führt. Um bakterielle Teilchen, die mit einem Antigen gepufferten Natriumbicarbonatlösung resuspendiert, gekuppelt sind, zum Nachweis von homologen Anti- 40 Anschließend wurden 0,4 ml einer physiologischen körpern, die im menschlichen Serum vorhanden sind, Kochsalzlösung, enthaltend 10 mg Rinderserumalbuzu verwenden, dürfen die Teilchen nur in Gegenwart min, unter Rühren zugegeben, und das Reaktionsdes speziellen, nachzuweisenden Proteins agglutinieren gemisch wurde bei 4^CC 24 Stunden lang leicht ge- bzw. ausflocken. schüttelt. Die erhaltenen E.coli-7w-Ilen, die mit Rinder-Many diseases are characterized by the formation of an equal volume of cyanogen bromide in a concentration of antibodies in response to micration of 50 mg / ml of distilled water became a biological infection. When this antibody is added in a rapid stirring. The early reaction state can be demonstrated is their mixture was treated immediately with 4N sodium hydroxide solution in the presence of a diagnostic indication of the disease for about 5 minutes at room temperature. Antigens are usually attached to a carrier in order to adjust the pH to 10 to 12, and cells such as erythrocytes, polystyrene or gram negatives are then centrifuged at 5000 rpm. The bacteria were coupled over, so that it is convenient, this anti-standing liquid was decanted, and the E. coli cells which had been treated with cyanogen bromide in contact with the gene with the appropriate antibody were brought in. One of the biggest disadvantages of this Immunology 35 10 ml of a sodium bicarbonate solution OJmolaren that gical detection systems is the non-specific was buffered to a pH of 9, resuspended at an agglutination of the coupled antigens, and anti temperature of 4 ⁰ C. According to the centric bodies, which lead to incorrect test results, the treated cells were converted into 2 ml of this. Bacterial particles, which are resuspended with an antigen-buffered sodium bicarbonate solution, are coupled to detect homologous anti- 40 Subsequently, 0.4 ml of a physiological body present in human serum, saline solution containing 10 mg of bovine serum albumin is allowed to use the particles , min only in the presence of added with stirring, and the special Reaktionsdes, protein to be detected agglutinate mixture was for 24 hours easily overall or flocculate at 4 ^C C. shakes. The E.coli-7w-Ilen obtained with bovine

Es hat sich gezeigt, daß E.coli-Zellen, die mit For- 45 serumalbumin gekoppelt waren, wurden dann mitIt has been shown that E. coli cells, which were coupled with for- 45 serum albumin, were then with

malin, Bis-diazobenzidin oder Protein oder Kombi- physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und inmalin, bis-diazobenzidine or protein or combined physiological saline solution and washed in

nationen dieser Substanzen behandelt sind, in Gegen- 10 ml der Lösung für Untersuchungszwecke resuspen-nations of these substances are treated, resuspend in counter- 10 ml of the solution for investigation purposes.

wart von 60°/₀ normalem menschlichem Serum agglu- diert. Die so erhaltenen Zellen reagierten stark mitwaiting from 60 ° agglu- diert / ₀ normal human serum. The cells obtained in this way reacted strongly

tinieren. Derartige E.coli-Zellen, die mit einem Antigen Antirinderalbumin von Kaninchen, aber agglutiniertentinate. Such E. coli cells which agglutinated with an antigen, rabbit anti-bovine albumin

sensibilisiert sind, können nicht zum Nachweis homo- 50 nicht in Gegenwart von normalem menschlichemare sensitized, cannot detect homo- 50 not in the presence of normal human

loger Antikörper verwendet werden, solange die nicht- Serum,
spezifischen bindenden Stellen an der bakteriellenloger antibodies can be used as long as the non-serum,
specific binding sites on the bacterial

Oberfläche nicht zerstört oder verdeckt sind. Beispiel 2Surface are not destroyed or covered. Example 2

Es hat sich nun gezeigt, daß die Behandlung von mitIt has now been shown that the treatment of with

Formalin behandelten bakteriellen Zellen, wie E.coli, 55 Entsprechend dem im Beispiel 1 angegebenen Ver-Formalin-treated bacterial cells, such as E. coli, 55 According to the procedure given in Example 1

mit einem Cyanhalogenid wie Cyanchlorid, -jodid, fahren wurden mit Formalin behandelte E.coli-ZellenE. coli cells treated with formalin were used with a cyan halide such as cyan chloride or iodide

-fluorid oder -bromid vor der Kupplung mit einem mit Cyanchlorid unter den gleichen Bedingungen be--fluoride or -bromide before coupling with a charged with cyanochloride under the same conditions

Antigen Trägerteilchen ergibt, die frei sind von nicht- handelt und anschließend mit menschlichem y-Glo-Antigen results in carrier particles that are free of non- and then with human y-glo-

spezifisch bindenden Stellen. Wenn ein Antigen mit bulin vermischt. Die so behandelten Zellen aggluti-specific binding sites. When an antigen is mixed with bulin. The cells treated in this way agglutinate

so behandelten bakteriellen Zellen gekuppelt wird, 60 nierten entsprechend mit Antihuman-y-Globulin vonso treated bacterial cells is coupled, renated accordingly with antihuman-γ-globulin from

können die entstehenden, mit Antigen sensibilisierten Kaninchen, aber nicht mit normalem menschlichemcan the resulting rabbits sensitized with antigen, but not with normal human

Zellen nur in Gegenwart des für dieses Antigen spezi- Serum,
fischen Antikörpers agglutinieren bzw. ausflocken, undCells only in the presence of the serum specific for this antigen,
agglutinate or flocculate fish antibodies, and

es werden falsche Untersuchungsergebnisse vermieden. Beispiel 3false test results are avoided. Example 3

E.coli-Zellen wurden 3 Stunden bei 37⁰C in einer 65E. coli cells were stored for 3 hours at 37 ^° C. in a 65

Nährlösung gezüchtet, und anschließend wurde die 10 ml einer 2%igen Suspension mit Formalin beKultur durch 30 Minuten lange Behandlung bei 37°C handelter E.coli-Zellen in physiologischer Salzlösung mit einer 36,8⁰/(,igen wäßrigen Lösung von mit CaI- wurden gewaschen und mit Cyanjodid, wie oben be-Broth grown, and then 10 ml was a 2% suspension of formalin beKultur by 30 minutes long treatment at 37 ° C-treated E. coli cells in physiological saline solution having a 36.8 ⁰ / (, aqueous solution of with CaI - were washed and treated with cyano iodide as above

schrieben, behandelt. Die erhaltenen Zellen wurden lösung in Konzentrationen von 0,5 mg/ml Lösungs-wrote, treated. The cells obtained were solution in concentrations of 0.5 mg / ml solution

nach einmaligem Waschen mit O.lmolarer wäßriger mittel bis zur Sättigung, aber vorzugsweise nicht mehrafter washing once with 0.1 molar aqueous medium to saturation, but preferably no more

Natriumbicarbonatlösung, die abgepuffert war, bei als 5 mg/ml Lösungsmittel, gelöst.Sodium bicarbonate solution, which was buffered at than 5 mg / ml solvent, was dissolved.

4° C in physiologischer Salzlösung resuspendiert und Die Temperatur für die Behandlung der bakteriellen dreimal mit dieser Salzlösung gewaschen, bevor sie in 5 Zellen mit dem Cyanhalogenid kann von 15 bis 30° C4 ° C resuspended in physiological saline and The temperature for the treatment of bacterial Washed three times with this saline solution before putting in 5 cells with the cyanide halide can be 15 to 30 ° C

5 ml Natriumphosphat-Salzlösung, die auf einen variieren, obwohl ungefähr 25° C vorteilhaft, und be-5 ml of sodium phosphate saline, which vary on one, although about 25 ° C advantageous, and be

pH-Wert von 7,2 gepuffert war, resuspendiert wurden. quem sind. Die Antigene werden üblicherweise mit denpH 7.2 was buffered, were resuspended. are quem. The antigens are usually associated with the

9 ml gepufferter Natriumphosphat-Salzlösung, enthal- mit Cyanhalogenid behandelten Zellen bei ungefähr9 ml of buffered sodium phosphate saline solution containing cyanide halide treated cells at approximately

tend ungefähr 9 mg Insulin, wurden zu den obigen 4° C gekuppelt, obwohl Temperaturen von ungefähr Zellen zugegeben und unmittelbar vor der Zugabe von io 0 bis 40° C gegebenenfalls ebenfalls angewandt werdentend about 9 mg of insulin, were coupled to the above 4 ° C, although temperatures of about Cells are added and, if necessary, can also be used immediately before the addition of 10 to 40 ° C

25 ml einer Lösung, enthaltend 1 mg Bis-diazobenzidin können. In jedem Fall ist es günstig, die Oberfläche der25 ml of a solution containing 1 mg of bis-diazobenzidine can. In any case, it is beneficial to the surface of the

pro Milliliter Natriumphosphat-Salzlösung, vermischt. bakteriellen Zellen mit Formalin zu stabilisieren, bevorper milliliter of sodium phosphate saline solution, mixed. stabilize bacterial cells with formalin before proceeding

Die erhaltenen Zellen wurden bei Raumtemperatur sie mit einem Cyanhalogenid behandelt werden, umThe obtained cells were treated with a cyanide halide at room temperature to make them

30 Minuten rotiert und anschließend bei 2000 UpM sicherzustellen, daß alle Stellen blockiert sind, dieRotated for 30 minutes and then at 2000 rpm to ensure that all sites are blocked

τΑΜ«-,-ΐΡ,»φϊ«ι-ί CJt* ιιηιΐ-ιΐιιη rinnn mti ftlijrr·* λΙ r\£* cr*Vt Ai- »c Ortriof TiI oiriAf Δ fjjjl" ti ηΪΑΠΙΠ0 A ΡΠ1 rtl ßf*r 7 P^.Xt^n Α\\ΤΓ*\\ τΑΜ «-, - ΐΡ,» φϊ «ι-ί CJt * ιιηιΐ-ιΐιιη rinnn mti ftlijrr · * λΙ r \ £ * cr * Vt Ai-» c Ortriof TiI oiriAf Δ fjjjl " ti ηΪΑΠΙΠ0 A ΡΠ1 rtl. ßff P ^ .Xt ^ n Α \\ ΤΓ * \\

Salzlösung gewaschen und in 10 ml der Salzlösung vor unbekannte Bestandteile des menschlichen Serums der Durchführung der Untersuchungen resuspendiert. führen würden. Wie in den Beispielen gezeigt, werden Es zeigte sich keine nichtspezifische Agglucinierung die mit Formalin behandelten bakteriellen Zellen mit mit menschlichem Serum. einem Cyanhalogenid behandelt und dann mit einem Obwohl die obigen Beispiele sich spezifisch auf die 20 Antigen über die Iminocarbonsäureestergruppen geBehandlung von mit Formalin behandelten E.coli- kuppelt oder alternativ können die mit Cyanhalogenid Zellen beziehen, können andere bakterielle Zellen mit behandelten Zellen mit einem Antigen umgesetzt Lipo- oder Mukopolysacchariden auf der Oberfläche werden, das vorher mit einem üblichen Kupplungsauf ähnliche Weise mit Formalin und mit einem Cyan- mittel wie Bis-diazobenzidin gekuppelt worden ist.
halogenid behandelt werden. Derartige Bakterien sind 25 Die Cyanhalogenidbehandlung der mit Formalin unter anderem B. subtilis, S. marcescens, B. abortus, behandelten bakteriellen Zellen sollte in einem alka-P. fragi, L. casei ur.d A. aerogenes. Das Cyanhalogenid lischen Medium bei einem pH-Wert von ungefähr 10 wird in Form eines wäßrigen Konzentrats mit 25 mg/ml bis 12 und vorzugsweise bei einem pH-Wert von Wasser bis zur Sättigung, vorzugsweise enthaltend ungefähr 11 durchgeführt werden. Obwohl Cyan-25 bis 100 mg/ml, besonders nicht weniger als 50 mg/ml 30 bromid bevorzugt ist, können andere Cyanhalogenide Wasser, verwendet. Die verwendeten Antigene sind in wie das Chlorid, Jodid oder Fluorid gegebenenfalls einem Lösungsmittel wie einer physiologischen Salz- ebenfalls verwendet werden.Washed saline solution and resuspended in 10 ml of the saline solution before carrying out the investigations into unknown components of the human serum. would lead. As shown in the examples, there was no non-specific agglucination of the formalin-treated bacterial cells with human serum. treated with a cyanide halide and then treated with a. Although the above examples relate specifically to the 20 antigen via the iminocarboxylic acid ester groups, treatment of formalin-treated E.coli coupled or alternatively the cyanide halide cells, other bacterial cells with treated cells can react with an antigen Lipo- or mucopolysaccharides on the surface which have previously been coupled with a conventional coupling in a similar manner with formalin and with a cyanant such as bis-diazobenzidine.
halide treated. Such bacteria are 25 The cyanide halide treatment of bacterial cells treated with formalin inter alia B. subtilis, S. marcescens, B. abortus should be carried out in an alka-P. fragi, L. casei ur.d A. aerogenes. The cyan halide medium at a pH of about 10 will be carried out in the form of an aqueous concentrate containing from 25 mg / ml to 12, and preferably at a pH from water to saturation, preferably containing about 11. Although cyan-25 to 100 mg / ml, particularly not less than 50 mg / ml 30 bromide, is preferred, other cyan halides, water, can be used. The antigens used are in such as the chloride, iodide or fluoride optionally a solvent such as a physiological salt- can also be used.

Claims

formaldehyde treated with calcium carbonate is killed. Claims: The killed cells were obtained by centrifugation and alternating centrifugation

1. Process for the preparation of carrier particles and resuspension in physiological table salt for Antigens which are free from unspecific bin solution are washed. The washed E. coli cells The end points, thereby marked, were then treated with a 1% aqueous formaldehyde e t that bacterial solution treated with formalin is treated in physiological saline solution cells in aqueous medium with a cyanhalo and 2 days at 26 ° C with occasional shaking genid treated. ditched. The E. coli treated with formalin

2. The method of claim 1, characterized io marked cells were drawn in a physiological saline solution in that washing as a cyanogen halide, cyanogen bromide, / used in the 0.2 ° ₀ aqueous formaldehyde solution. resuspended in physiological saline and

3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the cell concentration by hematocrit r.uf 2%

pekenn7pirhnpt HaR man P ™-»1ΐ_"7»Πο« traniraM/4at _e:»_0ee*.li*.pekenn7pirhnpt HaR man P ™ - »1ΐ_" 7 »Πο« traniraM / 4at _e : » _0ee * .li *.

15 The following examples show the procedure for Treatment of formalin-treated E. coli cells prepared as indicated above with a cyanide halide.