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Verfahren zur Herstellung eines Indikatorsystemes für An'igen-
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Pntikörper-Reaktionen.
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Die Erfindung betrifft ein Herstellungsverfahren für ein Irdikatorsystem
zur Bestimmung von solchen biologischen Substanzen, die in der Lage sind, sich mit
einem Indikatorsystem zu verbinden, wobei das Vorhandensein der Substanz durch die
Hämolyse der im Indikatorsystem enthaltenden Erythrozyten, d.h. durch den Austritt
von Hämoglobin aus den Erythozyten, angezeigt wir.
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Die Erfindung betrifft auch das eigentliche Indikatorsystem.
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Um das Vorhandensein von bestimmten biologischen Substanzen zu bestimmen
und zu ermitteln, ist es allgemein üblich, andere urd spezifische Substanzen zu
verwenden, denen die zuerst erwähnten Substanzen in spezifischer und selektiver
Weise zugegeben werden, wobei diese Zugabe qualitativ und. in manchen Fällen auch
quantitativ bestimmt werden kann. Diese Zuschläge oder Zugaben haben normalerweise
einen Antikörper-Antigen-Charakter.- Außerdem sid eine Reihe von speziellen Fähigkeiten
des Immunglobulines, gegen spezifische Antigene Antikörper zu bilden, ausnutzen.
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Unter einem Normalverfahren wird ein solches Verfahren verstanden,
bei dem rote Blutkörperchen verwendet werden, um festzustellen, ob eine Antikörper-Antigen-Reaktion
stattgefunden hat oder nicht.-Die Fähigkeit vieler Antigene, Blutkörperchen zu agglutinieren,
kann direkt beobachtet werden. Das
Verfahren ist jedoch nicht besonders
spezifisch, und viele Serumkomponenten können eine derartige Hamagglutination oder
Blutkörperchenagglutination herbeiführen und verursachen.
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In einem weiteren Indikatorsystem, das als Komplementbindung (KB)
bezeichnet wird, wird zugelassen, daß sich ein Antigen mit einem Antikörper verbindet,
wobei beide in bekannter Menge zugegeben werden.
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Auch ein weiteres und als Komplement bezeichnetes System ist in diesem
System in bekannter und vorgegebener Menge enthalten und verbindet sich mit dem
speziellen Antigen-Antikörper-Komplex. Sodann wird ein Indikator zugegeben, der
aus Blutkörperchen besteht, die mit Hämolysin (einem Ambozeptor/Immunkörper) sensitiviert
worden sind. Dieser Indikator hämolysiert bei Vorhandensein eines freien Komplementes.
Sollte es zu keiner Hämolyse kommen, dann ist dies ein Anzeichen dafür, daß der
gesuchte Antikörper oder das gesuchte Antigen vorhanden ist.
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Weder bei dem Hämagglutinations-Inhibitionsverfahren, noch bei dem
Komplementbindungsverfahren handelt es sich um ein positives Verfahren, die beide
zudem auch noch technisch kompliziert sind. Aus diesem Grunde hat man sich schon
seit langem darum bemüht, das Verfahren der immunologisch oder serologischen Untersuchung
zu verbessern.
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So ist ein System entwickelt worden, daß als passive immunologische/serologische
Hämolyse oder als passive Immunolyse bezeichnet wird. In diesem System wird das
Antigen mit Chromtrichlorid an die roten Blutkörperchen
gekoppelt,
wobei eine Hämolyse in Gegenwart des Antikörpers und gegen das Antigen und das Komplement
erreicht und erzielt wird.
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Bei einem weiteren Verfahren, das entwickelt worden ist, wird der
Test in einer Gelmatrix durchgeführt.
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In diesem Falle sind das Vorhandensein von hämolysierenden Produkten,
beispielsweise von hämolysierenden Streptokokken, und die Hämolysewirkung von Gamaaglobulin
auf sogenannten Blutplättchen untersucht worden. Bei den sogannten Blutplättchen
handelt es sich um Gel mit eingelagerten Blutkörperchen.
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Untersucht und erforscht worden sind auch die Antikörper- und Antigen-Bestimmungen
durch Ausfällungsreaktionen in Agar-Gel.
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Eine Kombination dieser Systeme ist von Schild und anderen beschrieben
und vorgetragen worden, und zwar anläßlich Intern. Symp on Imaunity of the Respiratory
System in Man and Animals (Internationales Symposion über die Immunität des Atmungssystems
bei Menschen und Tieren), Develop. Biol., Standard, Band 28, Seite 253 bis 272 (1975).
Mit dieser Arbeit ist ein Verfahren geschaffen worden, mit dem eine Immunität gegen
Grippe festgestellt und bestimmt werden kann. Ein Grippevirus ist in einer Gelmatrix
an bestimmte und ausgewählte Erythrozyten (Hühnerblut) gekoppelt worden, denen in
Gegenwart eines Komplementes (Meerschweinchen-Komplement) ein Serum zugegegeben
worden ist. Falls dieses Serum Antikörper gegen das vorerwähnten Grippevirus enthält,
hat dies zur Folge, daß sich ringsum die Stelle, wo das den Antikörper enthaltende
Serum auf die Gelmatrix aufgetra gen wird eine Hämolysezone bildet.
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Nach J. Gen. Virol. 27, Seite 1 bis 10 (1975) arbetteten Russel und
seine Mitarbeiter mit der gleichen Technik, wobei jedoch unter Verwendung von Jodaten,
einer bereits gut bekannten Technik, eine Reihe von anderen Antigenen mit bestimmten
und ausgewählten Erythrozyten (Rind, Schaf) gekoppelt worden sind.
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Neben den Jodaten gibt es noch eine große Anzahl anderer Kopplungssubstanzen
oder Härtungssubstanzen.
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Eine der ältesten dieser Kopplungssubstanzen oder Härtungssubstanzen
ist das Kultivierungsagglutinat Conconovalin A ist, wenn auch in ähnlichen Systemen,
die während der letzten Jahre entwickelt worden sind, Chromtrioxid, Carbodiimide,
Tanin und Bis-Diazo-Benzidine verwendet worden sind.
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Alle bekannten Systeme weisen jedoch den Nachteil auf, daß die Gelmatrix
nicht ohne Zersetzungserscheinung über eine zweckmäßige Periode gelagert und aufbewahrt
werden kann. Darüber hinaus sind für die bekannten Systeme teuere Maßnahmen erforderlich,
mit denen eine weitere Verkürzung der bereits begrenzten Lagerfähigkeit verhindert
werden soll, oder aber die Gelmatrix muß dann hergestellt werden, wenn sie gebraucht
wird. Die vorerwähnten Indikatorsysteme enthalten Erythrozyten oder rote Blutkörperchen,
die in der Lage sein sollen, sich im wesentlichen auf chemische Weise mit proteinhaltigem
Material zu verbinden. Bekannte und geeignete Erythrozyten erhält man aus dem Blut
von Hühnern, Meerschweinchen, Pferden, Schafen, Affen und Gänsen. Zu dem System
gehört auch ein Komplement, das ein Komplement in allen
normalen
Sera/Seren ist und 3-Globuline enthält.
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Als gel-bildende Substanz wird Agar, Agarose oder Gelatine verwendet.
Die mit den Erythrozyten gekoppelten Proteine bilden somit einen Teil des Antigen-Antikörper-Systemes,
in dem entweder das Antigen oder der Antikörper an die Erythrozyten gebunden ist.
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In diesem Zusammenhange sei darauf hingewiesen, daß in einem anderen
Antigen-Antikörper-System ein Antikörper das Antigen enthalten kann. Von besonderem
Interesse sind jene Systeme, bei denen ein Virus als das Antigen enthalten ist und
bei denen die Antikörper gegen diesen Virus im Serum enthalten sind.
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Diese Systeme bieten sich als einfaches Testverfahren dann an, wenn
festzustellen ist, ob ein Patient an einer durch diesen bestimmten Virus verursachten
Infektion leidet, oder nicht. In anderen Fällen, beispielsweise bei Hepatit B, kann
es wünschenswert sein, das Vorhandensein des Virus im Serum festzustellen; in diesem
Fall können spezifische Antikörper gegen diesen Virus mit den Erythrozyten verbunden
und gekoppelt werden.
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Wie bereits zuvor erwähnt worden ist, ist das Indikatorsystem in eine
Gelmatrix eingebettet und eingelagert. Die Testsubstanz, beispielsweise das Serum,
wird in geeigneter Weise in eine in die Gelmatrix eingearbeitete Vertiefung gegeben,
sie kann aber auch unter Verwendung eines Stückes Filterpapiers oder dergleichen
mehr, das mit der Testsubstanz getränkt ist, auf die Gelmatrix übertragen werden.
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Weil die Gelmatrix Blutkörperchen, das Komplement und verschiedene
Proteine enthält, darf sie auf gar
keinen Fall auf eine höhere Temperatur
als 42UC erwärmt werden. Enzyme können das Indikatorsystem deswegen leicht zerstören,
weil sie die Bindung zwischen den Erythrozyten und beispielsweise dem Virus sogar
bei niedrigen Temperaturen aufbrechen können.
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Wie bereits erwähnt worden ist, kann die Bindungsfestigkeit durch
die Verwendung von Kopplungssubstan zen beeinflußt werden. Zu diesen Kopplungssubstanzen
gehören:- Tannin, Manganchlorid, Glutaraldehyd, Bis-Diazoterat-Benzidine, Cyanchlorid,
Tetra-Azoteratisiertes Orthoanisidine, Periodate und Äthyldimethylaminopropyl-Carbodiimide.
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Nun hat man überraschend festgestellt, daß die Zeit, während der ein
Indikatorsystem, zu dem eine aus Erythrozyten, einem Komplement und ein mit den
Erythrozyten verbundenes Antigen oder verbundene Antikörper gehören, ohne Schaden
zu nehmen, vor der Verwendung gelagert und aufbewahrt werden kann, dann beträchtlich
verlängert wird, wenn das System Magnesiumionen enthält und in der Gelmatrix einen
hohen Anteil an Phosphat hat. Das Vorhandensein von Magnesiumionen im System und
das Vorhandensein von Phosphat im Gel während der Verbindungsreaktion kann das System
derart stabilisieren, daß es 12 Wochen lang gelagert werden kann, wohingegen ein
System, das unter identischen Bedingungen hergestellt und aufbewaht wird, aber kein
Magnesium und Phosphate enthält, nach einer kurzen Zeit nicht mehr verwendet werden
kann, beispielsweise nach einem Tag oder nach zwei Tagen und normalerweise dann,
wenn reproduzierbare Bedingungen erzielt werden sollen, nach höchstens einer Woche
verwendet und gebraucht werden muß.
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Indikatorsysteme, die unter Verwendung der bisher bekannten Verfahren
und Techniken hergestellt werden, werden schon nach nur einem Tag oder nach zwei
Tagen unbrachbar, weil es sowohl zu einer Zersetzung der Erythrozyten als auch zu
einer Zersetzung des Komplementes kommt, wohingegen das mit dieser Erfindung geschaffene
Indikatorsystem erst unbrauchbar wird, wenn das komplement inaktiv wird, d.h.
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nach rund 12 Wochen.
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In Übereinstimmung mit dieser Erfindung ist es wichtig, daß während
der Bindungsreaktion eine Pufferlösung verwendet wird, die 0.0001 - 0.005 M Magnesiumionen
enthält. Während des Bindungsreaktionsvorganges kann die Pufferlösung beispielsweise
0.001 - 0.1 M Phosphationen, 0.0001 - 0.05 M Magnesiumionen sowie 0.0005 - 0.01
M Kalziumionen enthalten, die normalerweise in den Erythrozytenpuffern enthalten
sind. Als Bindemittel wird normalerweise Chromtrioxide in einem Gewichtsanteil von
0.005 - 1.0 ffi verwendet. Der Erfindung zufolge soll das hergestellte Gel ebenfalls
Phosphationen in einer Menge von 0.001 - 0.5 mM aufweisen. Damit aber sollen in
der Gelmatrix enthalten sein: beispielsweise 0.001 - 0.5 m Phosphationen, 0.005
- 0.5 tM Magnesiumionen, 0.01 - 0.5 mM Kalziumionen. Das Gel sollte einen pH-Wert
von 6 - 8 haben.
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Eine längere Aufbewahrungszeit oder Lagerzeit ist natürlich ein großer
Vorteil, weil es dann möglich ist spezielle Indikatorsysteme auf Lager zu nehmen
und die Gelplättchen dann zu liefern, wenn sie benötigt werden. Diese Gelplättchen
können dann auch von solchen verwendet werden, die diese Indikatorsysteme
nur
sporadisch benötigen. Wenn das System nur für kurze Zeit gelagert und aufbewahrt
werden kann, dann muß es in direkter Abhängigkeit von Zulieferung und Verbrauch
hergestellt werden, wobei dringend benötigte Systeme zu Gegenstand von Speziallieferungen
gemacht werden müssen. Es wird allen klar sein, daß eine Verlängerung der Lagerzeit
für den technischen und wirtschaftlichen Einsatz von Gelmatrix-Indikatorsystemen
eine sehr große Bedeutung hat. Nachstehend wird die Erfindung nun anhand von Beispielen
näher erläutert.
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Beispiel 1 Gelplättchen zur Mengenbestimmung von Mumps-Antikörpern
wurden dadurch hergestellt, daß 1 ml ausgewaschener Erythrozyten von jungen Hähnchen
tropfenweise mit 1 ml des Virus-Antigens (Mumpsvirus) mit einem HA-Titer auf 320
und 1 ml von 0.15 % Gewichtsanteilen Chromtrioxid (CrC13 . 6H20) in physio-6H20)
logischer Kochsalzlösung (0.85 *) vermischt wurden.
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Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für die Dauer von fünf Minuten
verrührt. Nach dem Verrühren des Gemisches wurden die Erythrozyten 20 ml einer Pufferlösung
ausgewaschen. Diese Pufferlösung enthält Natriumphosphat. 9 mM Magnesiumchlorid
0.4 mM Klaziumchlorid 1 mM (BSA) Rinderserumalbumin 0.2 * pH-Wert 7.2 Nach dem Zentrifugieren
wurden die nunmehr mit dem Virus verbundenen Erythrozyten mit der gleichen
Pufferlösung,
die aber kein BSA (Rinderserumalbumin) enhielt , zur Bildung einer Suspension, in
der 10 % Erythrozyten enthalten sind, vermischt.
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Zur Herstellung der Plättchen wurden 1.5 ffi Agaros in 78 ml einer
Pufferlösung, in der 0.05 M Natriumphosphat , 0.13 M Natriumchlosird enthalten sind
und die einen pH-Wert von 7,5 hat, gelöst. Der Agarospuffer wurde dann auf eine
Temperatur von 430C abgekühlt, weiterhin wurden zugegeben NaN3 bis aus 3 0.02 *,
9 ml der vorerwähnten 10 * Erythrozytensus pension und schließlich auch noch 2.7
ml an Meerschweinchenkomplement. Sodann wurden die Agarosplättchen hergestellt,
und zwar dadurch, daß Plättchen mit einer Abmessung von 6 x 8 cm und mit einer Dicke
derAgarosschicht von 1.5 mm bei einer Temperatur von 420C geformt. In die Agarosschicht
wurde schließlich eine geeignete Anzahl von Bohrungen eingestanzt, die jeweils einen
Durchmesser von 2 mm haben.
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Die Platte oder das Plättchen war sodann fertig und konnte für mehr
als zwölf Wochen gelagert und aufbewahrt werden, ohne seine Aktivität zu verlieren.
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Beispiel 2 Plättchen für die Bestimmung des Vorhandenseins von Grippe-Antikörper,wurden
dadurch hergestellt, daß tropfenweise 1 ml einer Virus-Antigen-Suspension (640 HAU/lml)
einem Gemisch aus 1 ml ausgewaschenen Erythrozyten hunger Hähnchen und aus 1 ml
einer physsiologischen Lösung aus gewöhnlichem Kochsalz zugegeben wurde. 6 ml einer
0.27 M-Lösung aus Piperazin, die einen pH-Wertvon 6.5 hat, und 5 ml
Chromtroixid
in einem Gewichtsanteil von 0.01 % wurden dann einer physiologischen Kochsalzlösung
unter Rühren zugegeben. Die derart erzielte Lösung konnte dann für die Dauer von
fünf Minuten stehen, woraufhin dann 30 ml einer Pufferlösung zugegeben wurden, in
der enthalten waren Phosphat 9 mM Magnesium 0.4 mM Kalziumionen 1 mM BSA 0.2 %.
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Nach dem Zentrifugieren wurden die separaten Erythrozyten in einer
Pufferlösung zu einer 10 * Erythrozytensuspension gelöst. Diese Pufferlösung hatte
die nachstehende Zusammensetzung Phosphationen 0.085 M Natriumchlorid 0.09 M pH-Wert
7.0.
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Zum Herstellen und Formen der Plättchen wurde Agaros derart in der
vorerwähnten Phosphatpufferlösung gelöst, daß eine 1.5 ffi Agaroslösung entstand.
Nach 0 Abkühlung auf 43 C wurden den 78 ml der Agarospufferlösung sorgfältig zugemischt
9 ml der vorerwähnten 10 96 Erythrozyten-Pufferlösung und 2.7 ml eines Meerschweinchenkomplementes
(Meerschweinchenserum 1:30 mit der Phosphatpufferlösung). Hergestellt und geformt
wurden zehn Plättchen. Die hergestellten und geformten Plättchen konnten bei einer
Temperatur von 40C ohne jede Veränderung für mindestens acht Wochen und normalerweise
für die Dauer von zwölf Wochen gelagert und aufbewahrt werden.