CH633825A5 - Preparation of sub-units of the inner capsid of the rotavirus - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft Zubereitungen des Rotavirus, welche sich als diagnostisches Mittel in immunologischen Testverfahren eignen. The invention relates to preparations of the rotavirus which are suitable as diagnostic agents in immunological test methods.
Die Rotaviruspartikel wurden das erstemal in den Stühlen von freilebenden Kälbern von A. L. Ferneluis et al., Archiv für die gesamte Virusforschung, Band 37, 1972, Seiten 114 bis 130, entdeckt, und wurden wegen ihres radähnlichen Aussehens unter dem Elektronenmikroskop als Rotaviren bezeichnet. Später wurde festgestellt, dass sich Partikel von identischer Morphologie in den Stühlen anderer Arten, beispielsweise von Schweinen und Menschen, fanden und ständig mit einer Gastroenteritis verbunden waren. Tatsächlich kann das Rotavirus als eine der Hauptursachen bei kindlicher Gastroenteritis betrachtet werden. The rotavirus particles were first discovered in the stables of free-range calves by A.L. Ferneluis et al., Archives for the Entire Virus Research, volume 37, 1972, pages 114 to 130, and were called rotaviruses under the electron microscope because of their wheel-like appearance. It was later found that particles of identical morphology were found in the stools of other species, such as pigs and humans, and were constantly associated with gastroenteritis. In fact, the rotavirus can be considered a major cause of childhood gastroenteritis.
Oberflächlich ähneln die Partikel dem Reovirus, indem sie ein inneres und ein äusseres Capsid aufweisen, deren Durchmesser 55 nm bzw. 70 nm sind, (T.H. Flewett et al., J. Clin. Path. Band 27, 1974, Seiten 603 bis 614). Die Par-5 tikel sind jedoch morphologisch vom Reovirus verschieden, da die Untereinheiten in dem äusseren Capsid eine weiche oder glatte äussere Oberfläche aufweisen. On the surface, the particles resemble the reovirus in that they have an inner and an outer capsid, the diameter of which is 55 nm and 70 nm, respectively (TH Flewett et al., J. Clin. Path. Volume 27, 1974, pages 603 to 614) . However, the particles are morphologically different from the reovirus because the subunits in the outer capsid have a soft or smooth outer surface.
Nach der Entdeckung der Rotavirusgruppe zeigte es sich, dass serologische Beziehungen zwischen den Viren je nach io den unterschiedlichen Arten bestanden (A.Z. Kapikian et al., Science, Band 185, 1974, Seiten 1049 bis 1053). Tatsächlich wurde wiederum von A.Z. Kapikian et. al., Lancet, Band 1, 1975, Seiten 1056 bis 1061 aufgezeigt, dass es möglich war, ein aus den Stühlen freilebender Kälber isoliertes 15 Virus als diagnostisches Antigen beim Studium der menschlichen Rotavirusinfektion zu verwenden. In letzter Zeit hat es sich gezeigt, dass serologisches Kreuzen zwischen den Mitgliedern der Rotavirusgruppe zum grössten Teil durch die Antigene des inneren Capsids vermittelt wird (G.N. 20 Woode et. al. in Infection and Immunity im Druck). After the discovery of the rotavirus group, it was found that there were serological relationships between the viruses depending on the different types (A.Z. Kapikian et al., Science, Volume 185, 1974, pages 1049 to 1053). In fact, A.Z. Kapikian et. al., Lancet, vol. 1, 1975, pages 1056 to 1061, demonstrated that it was possible to use a virus isolated from the stool of free-range calves as a diagnostic antigen in the study of human rotavirus infection. Lately, it has been shown that serological crossbreeding between members of the rotavirus group is largely mediated by the antigens of the inner capsid (G.N. 20 Woode et. Al. In Infection and Immunity in press).
Es hat sich nun herausgestellt, dass Zubereitungen von durch Rotavirus infizierten Stühlen beträchtliche Mengen des inneren Capsids in Form von Virus-Untereinheiten enthalten können und dass der relative Anteil solcher Unter -25 einheiten durch entsprechende Behandlung gesteigert werden kann. It has now been found that preparations from stools infected with rotavirus can contain considerable amounts of the inner capsid in the form of virus subunits and that the relative proportion of such subunits can be increased by appropriate treatment.
Demnach ist Gegenstand der Erfindung eine Zubereitung von Untereinheiten des inneren Capsids des Rotavirus, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens annähernd 30 frei von vollständigen Viruspartikeln und deren Fragmenten ist. Accordingly, the invention relates to a preparation of subunits of the inner capsid of the rotavirus, which is characterized in that it is at least approximately free of complete virus particles and their fragments.
Das Aussehen der Untereinheit ist im Elektronenmikroskop im allgemeinen kreisförmig und hat einen Durchmesser von weniger als 2 nm. The appearance of the subunit is generally circular in the electron microscope and has a diameter of less than 2 nm.
35 Ferner ist Gegenstand der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Konzentrierung der Untereinheiten des inneren Capsids des Rotavirus, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man eine Probe faekalischen Materials eines durch das Rotavirus infizierten Säugetieres suspendiert, die Sus-40 pension bei 30 bis 40°C mindestens 20 Minuten lang inkubiert, die Untereinheiten aus der Suspension durch Zentrifugieren und/oder Filtrieren entfernt und konzentriert. 35 The invention further relates to a method for producing and concentrating the subunits of the inner capsid of the rotavirus, which is characterized in that a sample of faecal material of a mammal infected by the rotavirus, the Sus-40 pension at 30 to 40 ° C. incubated for at least 20 minutes, the subunits removed from the suspension by centrifugation and / or filtration and concentrated.
Um nun eine Zubereitung von Untereinheiten des Rotavirus zu erhalten, kann man das faekalische Material von 45 einem Säugetier beziehen, welches mit einem Rotavirus infiziert ist, was wiederum durch Immun-Elektronenmikroskopie unter Verwendung des Serums von genesenden Säugetieren nachgewiesen werden kann, wobei die Säugetiere entweder Kälber, Schweine oder Mäuse oder aber Kinder sein können, so Das faekalische Material wird bevorzugt in einer geeigneten Pufferlösung bei einem pH-Wert von 5 bis 9 suspendiert, so dass eine Suspension von etwa 5 bis 30 Gew.-%, vorzugsweise etwa 20 Gew.-%, resultiert. Die Suspension wird sodann in einen verschlossenen Behälter eingebracht und bei 55 einer Temperatur von 30 bis 45°C, vorzugsweise etwa 37°C, mindestens 20 Minuten lang, für gewöhnlich jedoch 30 Minuten lang, inkubiert. Die Suspension wird sodann durch Zentrifugieren bei einer entsprechenden Geschwindigkeit geklärt, so dass bevorzugt die ganzen Viruspartikel und 60 Fragmente sedimentieren, jedoch die Untereinheiten nicht sedimentieren können. Die überstehende Flüssigkeit kann sodann abfiltriert werden und die resultierende Flüssigkeit, die beinahe klar ist, wird im allgemeinen mindestens auf den 10. Teil, vorzugsweise auf den 25. Teil, vorzugsweise 65 durch das Konzentrationsverfahren durch Molekularfiltration nach «Minicon» oder «Amicon» (Amicon Corp.) eingeengt. In order to obtain a preparation of subunits of the rotavirus, one can obtain the faecal material from a mammal infected with a rotavirus, which in turn can be detected by immunoelectron microscopy using the serum from recovering mammals, the mammals either Calves, pigs or mice or children, so the faecal material is preferably suspended in a suitable buffer solution at a pH of 5 to 9, so that a suspension of about 5 to 30 wt .-%, preferably about 20 wt .-%, results. The suspension is then placed in a sealed container and incubated at a temperature of 30 to 45 ° C, preferably about 37 ° C, for at least 20 minutes, but usually for 30 minutes. The suspension is then clarified by centrifuging at an appropriate speed, so that preferably the whole virus particles and 60 fragments sediment, but the subunits cannot sediment. The supernatant liquid can then be filtered off and the resulting liquid, which is almost clear, is generally reduced to at least the 10th part, preferably the 25th part, preferably 65 by the concentration method by molecular filtration according to "Minicon" or "Amicon" ( Amicon Corp.).
Das auf diese Weise hergestellte Konzentrat der Untereinheiten kann weiter durch «Dichtegefälle-Zentrifugierung» The concentrate of the subunits produced in this way can be further processed by «density gradient centrifugation»
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gereinigt werden, indem man beispielsweise ein Saccharose-Dichtegefälle verwendet. Darüberhinaus ist es möglich, den Anteil der Untereinheiten in dem Konzentrat zu steigern, indem man die anfängliche faekalische Suspension mit Enzymen, wie beispielsweise Trypsin oder Papain, behandelt, welche die vollständigen Viruspartikel in ihre Untereinhei-ten-Komponenten aufspalten. So kann beispielsweise eine 0,5%ige Trypsin-Lösung 1 Stunde lang bei 37°C angewendet werden. can be cleaned using, for example, a sucrose density gradient. Furthermore, it is possible to increase the proportion of subunits in the concentrate by treating the initial faecal suspension with enzymes, such as trypsin or papain, which break down the complete virus particles into their subunit components. For example, a 0.5% trypsin solution can be used at 37 ° C for 1 hour.
Das Vorliegen von Virusuntereinheiten im Konzentrat kann z.B. durch direkte negativfärbende Elektronenmikroskopie oder durch Immun-Elektronenmikroskopie, welche bevorzugt ist, nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung unter Verwendung der Immun-Elektronenmikroskopie bestehen die Zubereitungen beinahe vollständig aus kreisförmigen, ausgefransten Untereinheiten, deren Grösse weniger als 2 nm beträgt, und die an Antikörper komplex gebunden sind. Ferner können auch ein oder zwei vollständige Viruspartikel von etwa 70 nm Durchmesser oder grosse Fragmente davon, sichtbar sein. The presence of virus subunits in the concentrate can e.g. by direct negative staining electron microscopy or by immunoelectron microscopy, which is preferred. When examined using immuno-electron microscopy, the preparations consist almost entirely of circular, frayed subunits, the size of which is less than 2 nm, and which are complexly bound to antibodies. Furthermore, one or two complete virus particles approximately 70 nm in diameter or large fragments thereof can also be visible.
Das vorliegende Untereinheiten-Konzentrat kann für verschiedene immunologische Diagnosetests verwendet werden, wie beispielsweise für die Immun-Elektronenmikroskopie, für den Immunodiffusionstest, für den Haemagglutinationstest, für den «Complément Fixation-Test» und für den Radioimmuntest. The present subunit concentrate can be used for various immunological diagnostic tests, such as, for example, for immunoelectron microscopy, for the immunodiffusion test, for the haemagglutination test, for the “complement fixation test” and for the radioimmunoassay.
Die Immun-Elektronenmikroskopie kann dazu verwendet werden, die Ursache einer Gastroenteritis bei einem Patienten zu diagnostizieren oder zu bestimmen, ob ein Individuum kürzlich daran gelitten hat oder nicht oder eine subklinische Infektion erfahren hat. Um solch einen Test durchzuführen wird ein Untereinheiten-Konzentrat wie oben beschrieben, hergestellt und mit einer Serumprobe des Patienten vermischt, die Mischung bei Zimmertemperatur reagieren gelassen und sodann zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird abgegossen und das zurückbleibende Sediment-plättchen negativ mit Phosphorwolframsäure gefärbt und unter dem Elektronenmikroskop auf das Vorliegen von Untereinheiten, welche an Antikörper komplex gebunden sind, untersucht. Immunoelectron microscopy can be used to diagnose the cause of gastroenteritis in a patient or to determine whether an individual has suffered recently or not or has experienced a subclinical infection. To perform such a test, a subunit concentrate is prepared as described above and mixed with a serum sample from the patient, the mixture allowed to react at room temperature and then centrifuged. The supernatant liquid is poured off and the remaining sediment plate is stained negatively with phosphotungstic acid and examined under the electron microscope for the presence of subunits which are complexly bound to antibodies.
Für die Immunodiffusion wird ein geeignetes Gel als Schicht auf einer Platte hergestellt, in welches mit gleichem Abstand voneinander gleich grosse Vertiefungen eingeschnitten werden. In einige der Vertiefungen wird das Untereinheiten-Konzentrat eingebracht und in die anderen ein Testserum vom Patienten. Sodann wird das Gel bei Zimmertemperatur für wenige Stunden stehengelassen und sodann auf die Reaktion hin geprüft. Liegen in dem Testserum spezifische Antikörper gegen das Rotavirus vor, so bildet sich in dem Gel eine Precipitin-Linie, und zwar an der Stelle, an der das in das Medium diffundierende Serum auf das ebenfalls in das Medium diffundierende Untereinheiten-Konzentrat trifft. Unter Verwendung eines entsprechend plazierten Bezugsantigens und Antisera kann der Immunodiffusionstest erfolgreich dazu verwendet werden, Serumproben von Patienten auf das Vorliegen eines Antikörpers oder Faekalextrakte auf das Vorliegen von Virusantigen auszulesen. Das Untereinheiten-Konzentrat eignet sich besonders gut für den Gel-Diffusionstest, da sich herausgestellt hat, dass die Untereinheiten eine wesentlich grössere Beweglichkeit im Gel als komplette Viren aufweisen. Dies zeigt sich durch das Fehlen jeder anderen Precipitin-Linie, welche den Komplex des ganzen Virus und der Antikörper zeigt. A suitable gel for immunodiffusion is produced as a layer on a plate, into which wells of equal size are cut with the same distance from one another. The subunit concentrate is introduced into some of the wells and a test serum from the patient into the others. The gel is then left to stand at room temperature for a few hours and then checked for the reaction. If specific antibodies against the rotavirus are present in the test serum, a precipitin line forms in the gel, specifically at the point at which the serum diffusing into the medium meets the subunit concentrate which also diffuses into the medium. Using an appropriately placed reference antigen and antisera, the immunodiffusion test can be successfully used to read patient serum samples for the presence of an antibody or faecal extracts for the presence of virus antigen. The subunit concentrate is particularly suitable for the gel diffusion test, since it has been found that the subunits have a much greater mobility in the gel than complete viruses. This is evidenced by the lack of any other Precipitin line which shows the complex of the whole virus and the antibodies.
Die Untereinheiten wandern rasch durch das Gel, so dass die Ergebnisse schneller und mit grösserer Genauigkeit abgelesen werden können. The subunits migrate quickly through the gel so that the results can be read more quickly and with greater accuracy.
Unter Verwendung der eingeführten Technik der «Complément Fixation», wie sie von Bradstreet & Taylor in Public Health Laboratory Services Bulletin, Band 21, 1962, Seite 96, beschrieben wird, kann das Untereinheiten-Konzentrat zur Diagnose von Rotavirusinfektionen verwendet werden. Using the introduced complement fixation technique as described by Bradstreet & Taylor in Public Health Laboratory Services Bulletin, Vol. 21, 1962, page 96, the subunit concentrate can be used to diagnose rotavirus infections.
Um einen Haemagglutinationstest durchzuführen, kann es möglich sein, künstlich die Untereinheiten an rote Blutkörperchen zu heften und sodann solche roten Blutkörperchen in ein Haemagglutinations-Testsystem einzubringen, wie es beispielsweise von Sequeira, P.J.L., und Eldrige, A.E. in Br. J. Vener. Dis., Band 49, 1973, Seite 3 beschrieben ist, oder sie sogar in ein Gelsystem einzuarbeiten, zu dem Anti-serum und Complément zugesetzt werden kann. To perform a hemagglutination test, it may be possible to artificially attach the subunits to red blood cells and then insert such red blood cells into a hemagglutination test system, as described, for example, by Sequeira, P.J.L., and Eldriges, A.E. in Br. J. Vener. Dis., Volume 49, 1973, page 3, or even incorporate them into a gel system to which anti-serum and complement can be added.
Ein Vorteil des Untereinheiten-Konzentrats besteht darin, dass es gleich gut sowohl mit homologen als auch mit hetero-logen Antisera reagiert und somit ein wertvolles allgemeines diagnostisches Mittel bedeutet, da die serologischen Beziehungen zwischen den Mitgliedern der Rotavirusgruppe durch die Antigene der internen Komponente vermittelt werden. Darüberhinaus kann das Untereinheiten-Konzentrat ganz leicht aus Stuhlproben durch einfache Laboratoriumstech-niken hergestellt werden und sodann unter Verwendung eines Bezugsserums, von dem man weiss, dass es Antikörper gegen das Rotavirus enthält, getestet werden. Auf diese Weise können alle oben beschriebenen Tests angewendet werden, um Stuhlproben auf das Rotavirus durch Anwendung des Rotavirusantiserums zu testen. An advantage of the subunit concentrate is that it reacts equally well with both homologous and heterologous antisera and is therefore a valuable general diagnostic tool, since the serological relationships between the members of the rotavirus group are mediated by the antigens of the internal component . In addition, the subunit concentrate can be easily prepared from stool samples by simple laboratory techniques and then tested using a reference serum known to contain antibodies to the rotavirus. In this way, all of the tests described above can be used to test stool samples for the rotavirus using the rotavirus antiserum.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der erfindungsgemässen Zubereitung von Untereinheiten des inneren Capsids des Rotavirus zur Herstellung eines Rotavirus-Antiserums, welches Antikörper gegen die Untereinheiten des inneren Capsids des Rotavirus enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einem Säugetier eine Zubereitung der Untereinheit des Inneren Capsids des Rotavirus injiziert und nach einigen Tagen dem Säugetier ein zweites Aliquot der Untereinheiten-Zubereitung erneut injiziert, das Säugetier nach weiteren wenigen Tagen ausbluten lässt, das Blut klumpen lässt und das Antiserum abtrennt und entfernt. Another object of the invention is the use of the preparation according to the invention of subunits of the inner capsid of rotavirus for the production of a rotavirus antiserum which contains antibodies against the subunits of the inner capsid of rotavirus, which is characterized in that a preparation of the subunit is given to a mammal of the inner capsid of the rotavirus, and after a few days, the mammal is re-injected with a second aliquot of the subunit preparation, which after a few more days bleeds the mammal, clots the blood and separates and removes the antiserum.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen zur Erläuterung weiterer Vorteile der vorliegenden Erfindung. The following exemplary embodiments serve to explain further advantages of the present invention.
Beispiel 1 example 1
Herstellung eines Untereinheiten-Konzentrats Production of a subunit concentrate
Man erhielt faekalisches Material von infizierten Kälbern aus einer Meiereiherde, in der eine Rotavirus-Infektion ausgebrochen war. In phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurde eine 20% ige Suspension des faekalischen Materials hergestellt. Diese Suspension wurde in ein fest verschlossenes Reagenzglas eingebracht und in einem Wasserbad 30 Minuten lang bei 37°C inkubiert. Während dieser Zeit wurde die Suspension sorgfältig mindestens dreimal gemischt, wobei eine mechanische Mischvorrichtung verwendet wurde. Das Gemisch wurde sodann durch Zentrifugieren während 15 Minuten bei 3000 g geklärt. Faecal material was obtained from infected calves from a dairy herd in which a rotavirus infection had broken out. A 20% suspension of the faecal material was prepared in phosphate buffered saline (PBS). This suspension was placed in a tightly sealed test tube and incubated in a water bath at 37 ° C for 30 minutes. During this time, the suspension was mixed thoroughly at least three times using a mechanical mixer. The mixture was then clarified by centrifugation at 3000 g for 15 minutes.
Die überstehende Flüssigkeit aus dieser Verfahrensstufe wurde durch ein «Millipore»-Vorfilter sowie ein 1,2 p,m Filter geschickt. Die resultierende Flüssigkeit, die beinahe klar war, wurde sodann in ein «Minicon B15» (hergestellt von Amicon Corp.) eingebracht und auf den 25. Teil konzentriert. Nach diesem Verfahren ergab 1 ml Faeces 0,2 ml der Zubereitung als Endkonzentrat. The supernatant liquid from this process stage was passed through a “Millipore” pre-filter and a 1.2 p, m filter. The resulting liquid, which was almost clear, was then placed in a "Minicon B15" (manufactured by Amicon Corp.) and concentrated on the 25th part. Following this procedure, 1 ml of faeces gave 0.2 ml of the preparation as the final concentrate.
Beispiel 2 Example 2
Diagnose durch Immun-Elektronenmikroskopie Diagnosis by immunoelectron microscopy
Aliquote Mengen von 0,5 ml des Untereinheiten-Kon-zentrats aus Beispiel 1 wurden in Reagenzgläser gegeben Aliquots of 0.5 ml of the subunit concentrate from Example 1 were placed in test tubes
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
633 825 633 825
4 4th
und in jedes Reagenzglas 0,1 ml Rinderserum oder menschliches Serum, welches von Individuen stammte, welche an Gastroenteritis leiden, sowie in ein Kontroll-Reagenzglas 0,1 ml einer Standard-Kochsalzlösung gegeben. Die Reagenzgläser wurden bei Zimmertemperatur 1 Stunde lang stehengelassen und dann 1 Stunde lang bei 12000 g zentrifugiert. Die überstehenden Flüssigkeiten wurden abgegossen und das jeweilige Sediment negativ unter Verwendung von Phosphorwolframsäure auf die übliche Weise gefärbt. Beim Betrachten unter dem Elektronenmikroskop konnten Aggregate von kleinen, kreisförmigen Untereinheiten, die mit Antikörpern einen Komplex bildeten, gesehen werden, was bewies, dass die Gastroenteritis des Patienten durch das Rotavirus hervorgerufen wurde. and 0.1 ml of bovine serum or human serum derived from individuals suffering from gastroenteritis as well as 0.1 ml of a standard saline solution in a control test tube. The test tubes were left at room temperature for 1 hour and then centrifuged at 12,000 g for 1 hour. The supernatants were poured off and the respective sediment was stained negatively in the usual way using phosphotungstic acid. When viewed under the electron microscope, aggregates of small, circular subunits that complexed with antibodies could be seen, which proved that the gastroenteritis of the patient was caused by the rotavirus.
Beispiel 3 Diagnose durch Immunodiffusion Example 3 Diagnosis by Immunodiffusion
Ein Patient, welcher an Gastroenteritis litt, lieferte die Blutproben, aus denen das Serum hergestellt wurde. A patient suffering from gastroenteritis provided the blood samples from which the serum was made.
Agarose wurde in TRIS/Äthylendiamintetraacetat-Puffer aufbereitet, wobei die Zubereitung aus 0,9 Gew./Vol.-% Agarose bestand und es wurde eine aliquote Menge von 2 ml verwendet, um eine Glasplatte zu bedecken. Eine Schablone mit zwei Reihen 3 mm Vertiefungen und 3 mm Zwischenräumen wurde dazu verwendet, Vertiefungen in das Gel zu schneiden. Die eine Reihe der Vertiefungen wurde mit dem in Beispiel 1 hergestellten Untereinheiten-Konzentrat gefüllt und die andere Reihe mit dem Serum eines Patienten, der an Gastroenteritis litt. Nach dem Füllen wurde das Gel über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Agarose was prepared in TRIS / ethylenediaminetetraacetate buffer, the preparation consisting of 0.9 w / v% agarose, and an aliquot of 2 ml was used to cover a glass plate. A template with two rows of 3 mm wells and 3 mm spaces was used to cut wells into the gel. One row of the wells was filled with the subunit concentrate prepared in Example 1 and the other row with the serum of a patient suffering from gastroenteritis. After filling, the gel was left overnight at room temperature.
Wurde das Gel am nächsten Tag geprüft, so stellte sich heraus, dass sich in dem Gel zwischen den Vertiefungen, die das Untereinheiten-Konzentrat und die das Patienten-Serum enthielten, eine Linie aus Precipitin gebildet hatte, was besagte, dass die Gastroenteritis, an der der Patient litt, durch das Rotavirus hervorgerufen wurde. When the gel was examined the next day, it was found that a line of precipitin, indicating gastroenteritis, had formed in the gel between the wells containing the subunit concentrate and the patient serum who suffered the patient who caused rotavirus.
Beispiel 4 Example 4
Diagnose durch den «Complement-Fixations-Test» Diagnosis using the complement fixation test
Menschliche Sera, die auf die Gegenwart von Antikörpern gegen das Rotavirus getestet werden sollten, wurden zuerst 1 : 2 in einer veronal-gepufferten Kochsalzlösung (VBS) verdünnt und in einem Wasserbad, das bei 56°C gehalten wurde, 30 Minuten lang hitzeinaktiviert. Diese Sera wurden sodann über einer «U»-förmigen Mikrotiterplatte von 1 : 2 bis zu 1 : 256 Verdünnungen in der VBS titriert, Human sera to be tested for the presence of antibodies to the rotavirus were first diluted 1: 2 in a veronally buffered saline (VBS) and heat inactivated in a water bath kept at 56 ° C for 30 minutes. These sera were then titrated over a "U" -shaped microtiter plate from 1: 2 to 1: 256 dilutions in the VBS,
wobei Mengen von 0,025 ml verwendet wurden. Jedes Serum wurde in zwei parallelen Reihen titriert. Zu den ersten Verdünnungsreihen wurden 0,025 ml der Rotavirus-Unterein-heiten-Zubereitung in einer Verdünnung von 1 : 8 in VBS 5 hinzugefügt. Die zweiten Verdünnungsreihen wurden als eine Antiserumkontrolle verwendet und anstelle des Antigens 0,025 ml VBS den Sera zugegeben. Eine Antigenkon-trolle war ebenfalls eingeschlossen, wobei das Antigen zu Volumina von 0,025 ml VBS ohne Zugabe von Testserum io zugesetzt wurde. using amounts of 0.025 ml. Each serum was titrated in two parallel rows. To the first series of dilutions, 0.025 ml of the rotavirus subunit preparation was added at a 1: 8 dilution in VBS 5. The second series of dilutions were used as an antiserum control and 0.025 ml of VBS was added to the sera instead of the antigen. Antigen control was also included, adding the antigen to volumes of 0.025 ml VBS without adding test serum io.
Das Komplement, welches bei —70°C gelagert war, wurde in VBS auf 1: 50 verdünnt und jeweils 0,025 ml in sämtliche Vertiefungen gegeben. Auf die übliche Weise wurde eine Komplementkontrolle zugesetzt. Die Platte wurde 15 sodann bedeckt und bei 4°C über Nacht stehengelassen. The complement, stored at -70 ° C, was diluted 1:50 in VBS and 0.025 ml added to all wells. Complement control was added in the usual way. The plate was then covered and left at 4 ° C overnight.
Am folgenden Tag wurde Antiserum gegen rote Blutkörperchen vom Schaf, d.h. hämolytisches Serum, das bei —20°C gelagert war, in VBS auf 1 : 100 bis 1 : 800 verdünnt und mit einem gleichen Volumen von einer 4% igen 20 Suspension von roten Blutkörperchen vom Schaf bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert, um ein Hämolysin-System zu bilden. Zur gleichen Zeit wurde die Platte auf 37°C erwärmt, so dass sämtliche Bestandteile des Systems die gleiche Temperatur aufwiesen. Einheiten von jeweils 0,025 ml 25 des Hämolysin-Systems wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platte sanft geschüttelt. Die Platte wurde weiter bei 37°C eine halbe Stunde lang inkubiert und in 15minütigen Abständen geschüttelt. Sie wurde sodann 2 bis 3 Stunden lang erneut bei 4°C vor dem Ablesen aufbewart. The following day, antiserum to sheep red blood cells, i.e. hemolytic serum stored at -20 ° C, diluted 1: 100 to 1: 800 in VBS and incubated with an equal volume of a 4% sheep red blood cell suspension at 37 ° C for 30 minutes to form a hemolysin system. At the same time, the plate was heated to 37 ° C so that all components of the system were at the same temperature. Units of 0.025 ml 25 of the hemolysin system were added to each well and the plate was gently shaken. The plate was further incubated at 37 ° C for half an hour and shaken at 15 minute intervals. It was then re-stored at 4 ° C for 2 to 3 hours before reading.
30 Hatte eine Lysis der roten Blutkörperchen stattgefunden, so wies dies auf das Vorliegen von Antikörpern gegenüber dem Rotavirus in der Testserumprobe hin. 30 If red blood cells had been lysed, this indicated the presence of antibodies to the rotavirus in the test serum sample.
Beispiel 5 Example 5
35 Herstellung von Antiserum gegenüber der inneren 35 Production of antiserum to the inner
Capsid-Untereinheit des Rotavirus Capsid subunit of rotavirus
2 ml einer Zubereitung von Untereinheiten des inneren Capsids des Rotavirus wurde mit einem gleichen Volumen 40 Freund'schen «Komplett-Adjuvans» (complete adjuvant) vermischt und in 2 Aliquot von jeweils 2 ml aufgeteilt. Ein Aliquot wurde subkutan zwei Meerschweinchen appliziert. 21 Tage später wurde das zweite Aliquot auf die selbe Weise den Meerschweinchen appliziert. 35 Tage nach der ersten 45 Verabreichung an die Meerschweinchen wurden diese ausbluten und das Blut klumpen gelassen. Die nach dem Ausklumpen gewonnene Flüssigkeit wies ein vollständiges Antiserum gegenüber den Untereinheiten des inneren Capsids des Rotavirus auf. 2 ml of a preparation of subunits of the inner capsid of the rotavirus was mixed with an equal volume of 40 Freund's “complete adjuvant” and divided into 2 aliquots of 2 ml each. An aliquot was applied subcutaneously to two guinea pigs. 21 days later, the second aliquot was applied to the guinea pigs in the same way. 35 days after the first 45 administration to the guinea pigs, the guinea pigs were bled and the blood clotted. The fluid obtained after clumping showed complete antiserum to the subunits of the inner capsid of the rotavirus.
v v
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