CH632789A5

CH632789A5 - Enzympraeparat auf der basis traegerfixierter enzyme sowie ihre herstellung.

Info

Publication number: CH632789A5
Application number: CH975477A
Authority: CH
Inventors: Winfried Dr Hartmeier
Original assignee: Boehringer Sohn Ingelheim
Priority date: 1976-08-12
Filing date: 1977-08-09
Publication date: 1982-10-29
Also published as: SE432779B; DK146446B; DK146446C; JPS5341489A; CA1088009A; NO149550C; DE2636206A1; NO772816L; NL7708867A; IT1079813B; DE2636206B2; FR2361413A1; AU2782177A; DE2636206C3; FR2361413B1; DK357677A; US4182655A; BE857718A; ZA774855B; SE7709112L

Description

Die Erfindung betrifft ein wasserunlösliches Enzympräparat auf der Basis trägerfixierter Enzyme, die mittels Glutardialdehyd kovalent an einen hochmolekular-porösen Kunststoff gebunden sind, der aus gehärtetem Protein besteht und eine Wasseraufnahmefähigkeit vom Zwei- bis Achtfachen seines Trockengewichts aufweist. Weiterhin betrifft die Erfindung die Herstellung dieses wasserunlöslichen Enzympräparates.

Aus der Fach- und Patentliteratur sind in den letzten Jahren zahlreiche Verfahren zur Fixierung von Enzymen an wasserunlösliche Trägerstoffe bekanntgeworden. Eine zusammenfassende Übersicht gibt z. B. R. A. Messing (Herausgeber): Immo-bilized Enzymes for Industriai Reactors, Academic Press, New York, 1975. Grundsätzlich kommen nach dem bisherigen Erkenntnisstand für die Unlöslichmachung eines Enzyms vier Bindungsarten in Betracht: 1. die Adsorption, 2. die ionische Bindung, 3. die Verkapselung und 4. die kovalente Bindung an einen Träger oder der Enzyme untereinander. Auch Kombinationen dieser Immobilisierungs-Grundtypen sind bekannt.

Enzyme, die durch Adsorption an einen enzymfreien Träger wie z. B. Aktivkohle oder Polysaccharide gebunden sind, haben insbesondere den Nachteil, dass es infolge der relativ schwachen adsorptiven Bindung leicht zur Desorption kommt. Vor allem, wenn Änderungen der Ionenkonzentration und der Temperatur eintreten, kann es leicht zu Lösung der Adsorptionsbindung und zum sogenannten «Ausbluten» der Enzyme kommen.

Im Falle einer ionischen Bindung des Enzyms an einen polyanionischen oder polykationischen Träger (wie z. B. Ionenaustauscherharze) besteht ebenfalls der Nachteil der relativ schwachen Bindung zwischen polyionischem Träger und Enzym, da das Enzym in der Regel nur schwach ionische Gruppen aufweist. Ein entscheidender Nachteil ist auch die bei vielen Reaktionen störende Ionenaustauscherwirkung der derart fixierten Enzyme, die dazu führt, dass im Verlauf eines Einsatzes z. B. zur Getränkebehandlung unbeabsichtigt gewisse Ionen aus dem Getränk entfernt werden.

Enzyme, die in polymere Stoffe (z. B. vernetztes Polyacrylamid) eingeschlossen (verkapselt) sind, haben als Hauptnachteil die relativ schwierige Diffusion durch das Molekularsieb des Einschlussmaterials. Die scheinbare Michaelskonstante des derart eingeschlossenen Enzyms wird dadurch auch schon gegenüber niedermolekularen Substraten erhöht. Zusätzlich besteht die Gefahr, dass die eingeschlossenen Enzyme infolge ihrer Elastizität durch die Poren des Einschlussmaterials hindurchdringen und so «ausbluten».

Bei dem vierten genannten Fixierungstyp ist das Enzym konvalent und damit sehr fest an eine reaktive Gruppe eines wasserunlöslichen Trägers gebunden. Weitaus die meisten Publikationen über Enzymfixierung und auch die vorliegende Patentanmeldung betreffen diese Art Immobilisierung. Eine ganze Reihe derart hergestellter bekannter Präparate sind jedoch schon deshalb wirtschaftlich-technisch nicht anwendbar, weil zu teure Kupplungsreagenzien oder Trägersubstanzen oder zu aufwendige Herstellungsverfahren angewandt werden müssen. Bei der Kupplung nach den bisher bekannten Verfahren muss nämlich zumeist mit einem erheblichen Enzymüberschuss gear-' beitet werden, weil der überwiegende Teil der Enzyme bei der Kupplungsprozedur inaktiviert wird. Die meisten Verfahren lassen auch nur einen geringen Anteil Enzyme pro Trägerstoff zu, weil die Trägerstoffe nur an ihrer Oberfläche mit Enzymprotein besetzt werden können. Teilweise Abhilfe kann zwar in Form feinster Vermahlung (Mikronisierung) der Fertigprodukte geschaffen werden, diese Präparate sind jedoch aufgrund ihrer Feinheit bei Anwendung in gepackter Säule (packed bed-Reaktor) nur schwer von einem Flüssigkeitsstrom zu passieren. Ein weiterer Nachteil der meisten Verfahren zur Enzymfixie-

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rung ist, dass die Trägerstoffe (z. B. Glas, Diatomeenerde) an nés Trockengewichts) Wasser auf, während Albumin und gewisse vorgegebene Formen gebunden sind und es nicht mög- Eiklar in kaltem Wasser voll löslich sind. Es ist jedoch möglich,

lieh ist, sie z. B. sowohl in Kugel-, Splitter- oder Membranform aus diesen beispielhaft genannten sowie anderen ursprünglich oder als Überzug über anderen Materialien (z. B. Sieben) herzu- sehr unterschiedlichen Proteinen, in einfacher Weise einen stellen. Manche Trägerstoffe und Kupplungsreagenzien sind 5 Kunststoff mit den erfindungsgemäss erwünschten Eigenschaf-

auch wegen ihrer Toxizität bedenklich. ten herzustellen, indem man das Ausgangsprotein in Wasser

Einige der vorgenannten Nachteile bekannter fixierter bei geeigneter Temperatur löst, mit einem Härtungs- bzw. VerEnzyme werden bei nichtproteolytischen Enzymen nach dem netzungsmittel (z. B. Formalin) vernetzt und dann gewünsch-Stand der Technik bereits dadurch überwunden, dass man diese tenfalls einer trocknenden Wärmebehandlung unterwirft. Auf Enzyme z. B. mittels Glutardialdehyd an Kollagen koppelt. Die io diese Weise ist die Erfindung nicht auf den Einsatz relativ teu-derart hergestellten Präparate sind jedoch mikrobiell sehr rer, gelbildender Proteine angewiesen, sondern es können auch anfällig und ihre spezifische Aktivität ist gering. Ähnlich ver- minderwertige Proteine, z. B. Gelatine mit niedriger Bloomzahl hält es sich mit Präparaten, die durch Vernetzung von Enzy- oder auch überhaupt nicht mehr gelierende Abfall-FIüssiggela-men mit gelbildendem Protein erzielt werden (vgl. DT-OS tine sowie andere nicht gelierende Eiweissstoffe verwendet 22 46 002). Hierbei entsteht ein homogenes Gemisch, da 15 werden.

Enzyme und gelbildendes Protein wahllos miteinander vernetzt Das Herstellungsverfahren für den Kunststoff, an den die werden. Diese Präparate sind zwar mikrobiell stabiler, ihre Enzyme fixiert werden sollen, kann innerhalb weiter Grenzen Wirkung ist jedoch mangelhaft, weil die Enzyme eben gleich- variieren, je nach dem verwendeten Ausgangsprotein, dem ver-mässig über den gesamten Partikelquerschnitt verteilt liegen. wendeten Härtungsmittel, der gegebenen apparativen Einrich-Im Hinblick auf einen hohen Aktivitätserhalt kann die Vernet- 20 tung, der gewünschten Trägerstofform (z. B. Splitter, Kugeln, zung nur relativ schwach vorgenommen werden. Das führt zu Membranen, Siebe u. a.) usw. Die Beispiele geben einige grund-derart weichen Präparaten, dass es bei Anwendung z. B. in sätzliche Möglichkeiten an, deren beliebige Abänderung im einer Säule zum Verstopfen und Ausbluten der Enzyme kommt. Ermessen und handwerklichen Können des Fachmannes liegt. Im Falle stärkerer Vernetzung hingegen kommt es zur Inakti- Als Härtungsmittel kommen übliche Protein-Härtungsmit-vierung infolge zu starker Bindung und infolge von Einschluss 25 tel (z. B. Formaldehyd, Glutardialdehyd, Diisocyanat) in Frage, innenliegender Enzymmoleküle. Ein erheblicher Nachteil bei Besonders günstig ist die Verwendung von Formaldehyd, weil den letztgenannten Fixierungsverfahren ist auch, dass sie nicht an einen derart gehärteten Trägerstoff anschliessend mehr für proteolytische Enzyme angewandt werden können. Enzymaktivität gebunden werden kann als z. B. an ein mittels Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, wasserunlös- Glutardialdehyd gehärtetes Protein. Ausserdem hat ein z. B. liehe nichtproteolytische und proteolytische Enzympräparate 30 mit Glutardialdehyd vernetzter Trägerstoff eine zusätzliche, herzustellen, die möglichst gleichzeitig die folgenden Vorteile oft unerwünschte gerbstoffadsorbierende Wirkung, die formalbeinhalten : dehydgehärtete Proteine nicht haben. Auch aus ökonomischen billige Herstellungsweise, Gründen stellt die Formaldehydhärtung der Proteine eine hoher Aktivitätserhalt sowohl bei der Fixierungsprozedur wie bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar.

auch nach langer oder wiederholter Anwendung, 35 Gemäss einer besonders bevorzugten Ausführungsform grosse Resistenz gegenüber Mikroorganismen, der Erfindung wird das zur Herstellung des Trägerstoffes vorgrosse Formvariabilität des Trägermaterials, gesehene wasserlösliche Ausgangsprotein zunächst in die dreigute Durchflusseigenschaften bei Anwendung in gepackter bis zehnfache Wassermenge (bezogen auf Proteinmenge) einForm, getragen und das Gemisch auf 40 bis 80 °C erwärmt. Dieser hohe spezifische Aktivität, 40 Proteinlösung wird sodann eine Formaldehydlösung (z. B. Forniedrige scheinbare Michaeliskonstante, malin) in solcher Menge zugesetzt, dass ca. 2 bis 5% Formalde-keine unerwünschten Ionenaustauscher- oder Adsorptions- hyd bezogen auf die eingesetzte Proteintrockensubstanz in die eigenschaften, Lösung gelangen. Die gerührte Lösung erstarrt nach einiger verträgliche, toxisch unbedenkliche Trägerstoffe. Zeit, wobei die Erstarrungszeit im allgemeinen verkürzt wer-Es wurde gefunden, dass man Enzympräparate auf der 45 den kann durch möglichst hohe Temperatur, einen möglichst Basis trägerfixierter Enzyme erhält, die alle vorgenannten Kri- nahe an 8-10 liegenden pH-Wert und hohe Formaldehyd-terien erfüllen, wenn man die Enzyme zunächst in wässrig gelö- Zugabe. Normalerweise ist jedoch eine allzu schnelle Erstar-ster Form von einem quellfähigen, gehärteten (denaturierten) rung gar nicht erwünscht, weil sonst eine homogene Durchmi-Protein mit der zwei- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit schung des Protein-Formaldehyd-Wasser-Gemisches seines Trockengewichtes aufsaugen lässt und sie anschliessend 50 erschwert wird. Auch bietet eine verzögerte Erstarrung eine mittels Glutardialdehyd in Gegenwart einer enzymfällend wir- gute Möglichkeit, den Trägerstoff zuvor noch in eine kenden Substanz bindet. Hierbei entstehen Präparate, bei gewünschte Form zu bringen. Zum Beispiel kann er durch Ein-denen das Enzym an bestimmten Stellen auf der Aussenseite tauchen von Gegenständen (Rührer, Siebe) als Überzug auf und im Inneren des hochmolekular-porösen Trägerproteins mit diese Gegenstände aufgebracht werden, oder er kann durch vorgegebener Struktur gleichsam «angehängt» wird. 55 Sprühtrocknung in feinste Kugelpartikelform gebracht wer-

Als Rohstoff zur Herstellung des wasserunlöslichen Träger- den.

stoffes werden wasserlösliche Proteine verschiedener Art (z. B. Nicht geeignet als Trägerstoff gemäss der Erfindung sind Gelatine, Eiklar, Albumin, Sojaprotein u. a.) verwendet. die unter dem Namen Kunsthorn bekannten gehärteten Wesentlich ist, dass diese Proteine durch Härtung (z. B. durch Eiweissstoffe. Es zeigte sich nämlich, dass Kunsthorn, das nur Formaldehyd, Glutardialdehyd oder Diisocyanat) wasserunlös- 6o eine Wasseraufnahmefähigkeit von bis zu einem Drittel seines lieh gemacht und gegebenenfalls durch sonstige Behandlung Trockengewichtes hat, nur sehr beschränkt mit Enzymen (z. B. denaturierende Temperatureinwirkung) so modifiziert gekoppelt werden kann, so dass die derart hergestellten fixierwerden können, dass sie im Temperaturbereich zwischen 0 und ten Enzympräparate nur sehr geringe spezifische Aktivitäten 100 °C eine im wesentlichen gleichbleibende Wasseraufnahme- erreichen.

fähigkeit vom Zwei- bis Achtfachen ihres Trockengewichts es Zur Ankopplung der Enzyme werden die gehärteten erhalten. Das Quellverhalten der unbehandelten Ausgangspro- Trägerstoffe im trockenen Zustand mit den wässrig gelösten teine kann hingegen verschieden sein; trockene Gelatine Enzymen bevorzugt in solcher Menge versetzt, dass die nimmt z. B. in kaltem Wasser nur etwa 10% (= ein Zehntel sei- gesamte enzymhaltige Flüssigkeit unter Quellung der wasser-

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unlöslichen Trägerstoffe aufgesogen wird. Dabei werden die äusseren und inneren Oberflächen der Trägerstoffe mit der Enzymlösung benetzt. Sodann wird eine übliche enzymfällend wirkende Flüssigkeit, in welcher Glutardialdehyd löslich ist, beispielsweise Aceton, Äthanol, Isopropanol, zusammen mit dem in ihr gelösten Glutardialdehyd als Kopplungsreagenz zugegeben. Nach erfolgter Bindung der Enzyme wird das Präparat vorzugsweise gut mit Wasser ausgewaschen und entweder in geeigneter Weise (z. B. mit Lösungsmitteln oder durch Sprühtrocknung) getrocknet oder in feuchter Form, gewünsch-tenfalls unter Zugabe von stabilisierenden Substanzen (z. B. Glycerin, Sorbit, Propylenglycol) aufbewahrt bzw. seiner weiteren Verwendung zugeführt.

Bevorzugt werden folgende Bedingungen bei der Ankopp-lungsprozedur der Enzyme eingehalten: Die wässrige Enzymlösung wird in bis zu achtfacher Menge des Trägerstoff-Trockengewichtes zugesetzt. Enzymfällend wirkende Flüssigkeit wird in solcher Menge zugesetzt, dass im wesentlichen keine Enzyme, deren Fixierung gewünscht würde, von den Trägerstoffen weg mehr in Lösung gehen. Je nach Enzym und je nach Fällungsmittel schwanken diese Mengen bekanntermassen sehr stark, sie können jedoch vom Fachmann in einfacher Weise durch Ausprobieren für jedes beliebige Enzym ermittelt werden. Glutardialdehyd wird bevorzugt in solcher Menge angewandt, dass die Konzentration im Reaktionsansatz zwischen 0,5 und 5% liegt. Die ganze Kupplungsreaktion wird bevorzugt bei Raumtemperatur, bevorzugt innerhalb von 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren können im Gegensatz zu bekannten Verfahren auch proteolytisch aktive Enzyme gebunden werden. Durch die Verhärtung des Trägerstoffes gelingt es nämlich, die Proteine soweit resistent gegen den proteolytischen Abbau der zu bindenden Protease zu machen, dass die Fixierung ohne Trägerstoffzerstörung vorgenommen werden kann. Dabei werden bevorzugt auf zwei- bis vierfache Wasseraufnahmefähigkeit vorgehärtete Proteine als Träger verwendet. Trägerstoffe mit der vier- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit eignen sich jedoch auch für gewisse proteolytische Enzyme, wie z. B. Lab. Die Ermittlung der im Einzelfall zweckmässigen Grenzen ist dem Fachmann gegeben. Gewünschtenfalls kann der Trägerstoff auch durch z. B. niedrige Temperaturen bis zur Zugabe der enzymfällend wirkenden Substanzen zusätzlich vor dem proteolytischen Angriff der Proteasen geschützt werden. Nach der Glutaraldehyd-Kopp-lungsreaktion ist die Gefahr des Trägerstoffabbaues dann nicht mehr gegeben.

Die erfindungsgemässen trägerfixierten Enzympräparate eignen sich im allgemeinen zur Durchführung der gleichen biotechnischen Reaktionen, zu denen auch die entsprechenden löslichen Enzyme geeignet sind. Darüber hinaus eignen sie sich aber besonders für den wiederholten und kontinuierlichen Einsatz sowie für Fälle, in denen eine Wiederentfernung der Enzyme aus dem Reaktionsgemisch (z. B. aus Getränken) erwünscht bzw. gesetzlich vorgeschrieben ist. Für die wiederholte und Langzeit-Anwendung ist die hohe Resistenz der Präparate gegen Mikroorganismen sowie ihre leichte Desinfizier-barkeit durch gängige Desinfektionsmittel (z. B. quaternäre Ammoniumverbindungen, Lösungsmittel u. ä.) besonders günstig.

Nachfolgende Beispiele sollen die Erfindung erläutern. Beispiel 1

1 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 61 kaltes Wasser eingetragen und auf 60 °C erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 150 ml For-malin (=35 gew.-%ige Forn.aldehydlösung) unter Rühren zugesetzt. Nach 2 Minuten und 30 Sekunden erstarrte die Masse zu einem Gel. Diese gelierte Masse wurde durch einen Fleischwolf gedreht, so dass grobe feuchte Gelkrümel entstanden. In ca. 5 cm hoher Schicht wurden die Gelkrümel auf Hordenblechen im Trockenschrank mit Umluft bei 115 °C 15 Stunden lang getrocknet. Die dann trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so dass eine Partikelgrösse vorwiegend zwischen 50 und 100 |xm entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und hatten eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 4,8fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 0,5 kg des Trägerstoffpulvers wurden 1,51 einer Lösung zugerührt, die 0,11 handelsübliches, flüssiges Glucoseoxidase-Katalase-Gemisch und 1,41 dest. Wasser enthielt. Das handelsübliche Glucoseoxidase-Katalase-Gemisch hatte eine Gluco-seoxidaseaktivität von 1780 Sarett-Einheiten/ml und eine Kata-laseaktivität von 880 Baker-Einheiten/ml. Dann wurden dem Gemisch 21 Aceton und 200 ml 25%ige Glutardialdehydlösung zugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 60 Minuten bei 30 °C stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und die festen Partikel wurden auf dem Filter gründlich mit ca. 501 dest. Wasser ausgewaschen. Der zurückbleibende feuchte Filterkuchen hatte ein Gewicht von 1,95 kg. Unter Zugabe von 1,05 kg Glycerin wurde die Masse fein suspendiert und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Vor Prüfung der Aktivität sowie vor sonstigen Untersuchungen wurde die Glycerinlösung jeweils mit Wasser gut ausgespült. Tabelle 1 gibt die wichtigsten Analysedaten des Präparates wieder.

Tabelle 1

Enzym-Trockensubstanzgehalt 17,6 g/100 g

Glucoseoxidaseaktivität 178 SU/g TS

Katalaseaktivität 96 BU/g TS

Zur Prüfung der Auswaschstabilität des Präparates wurden 10 g in einer Säule kontinuierlich mit dest. Wasser gewaschen. In eintägigen Abständen wurde die Aktivität der Enzympartikel überprüft. Es ergab sich, dass innerhalb von 14 Tagen kein signifikanter Aktivitätsabfall stattfand. Ebenso verhielt es sich als anstelle von Wasser Bier als Auswaschflüssigkeit verwendet wurde.

Die Michaeliskonstanten des fixierten Enzympräparates sowie der löslichen Glucoseoxidase wurden gegenüber Glucose ermittelt. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der gelösten und der fixierten Enzymform. Siehe dazu Figur 1, die die relative Reaktionsgeschwindigkeit des löslichen und des immobilisierten Enzyms in Abhängigkeit von der Glu-cosekonzentration darstellt.

Beispiel 2

3 g getrocknetes Eiklar wurden in 10 ml Wasser bei 40 °C gelöst und mit 0,3 ml Formalin versetzt. Dieses Gemisch wurde im Vakuum-Trockenschrank bei 100 °C und 10-20 Torr getrocknet. Der trockene Kunststoff wurde auf eine Korn-grösse von 100 bis 200 Jim vermählen und ausgesiebt. Es war wasserunlöslich und hatte eine Wasseraufnahmefähigkeit vom vierfachen seines Trockengewichtes.

0,1 g einer handelsüblichen Lactase aus Aspergillus flavus, die eine Lactaseaktivität von 520 LU/g aufwies, wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gelöst. In diese Enzymlösung wurden 0,5 g des oben geschriebenen Kunststoffpulvers eingerührt. Dann wurden 3 ml Aceton und 0,25 ml 25%ige Glutardialdehydlösung hinzugerührt. Diese Mischung wurde 60 Minuten bei 25 °C stehen gelassen und dann filtriert. Das als Filterrückstand verbleibende gebundene Enzym wurde gut mit dest. Wasser ausgewaschen. Es hatte eine Aktivität von 42 LU/g Trockensubstanz. Die Gesamt-Trockensubstanzmenge des gebundenen Enzympräparates betrug 0,61 g.

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Beispiel 3

1 kg Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 51 kaltem Wasser gerührt und auf 45 °C erwärmt. Nach Lösung der Gelatine wurden 100 ml Formalin zugesetzt. Die Lösung wurde weiter bei 45 °C gehalten und in einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 210 °C Lufteingangstem-peratur, 100 °C Luftausgangstemperatur und einer Luftmenge von 500 Nm3/h sprühgetrocknet. Es entstand ein wasserunlösliches feines Pulver mit einer Wasseraufnahmefähigkeit vom Siebenfachen seines Gewichts.

0,50 ml einer katalasefreien Glucoseoxidaselösung mit einer Aktivität von 750 Sarrett-Einheiten/ml wurden mit 1 ml dest. Wasser versetzt. Dann wurden 0,5 g des oben beschriebenen pulvrigen Kunststoffes hinzugerührt. Diese Mischung wurde mit 2 ml Aceton und 0,2 ml 25%iger Glutardialdehydlö-sung verrührt und 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde das Präparat über ein Filter gut mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Es wurden insgesamt 0,59 g fixierte Enzymtrockensubstanz erhalten mit einer Gluco-seoxidaseaktivität von 290 Sarrett-Einheiten pro g Trockensubstanz.

Das handelsübliche Glucoseoxidase-Katalase-Gemisch hatte eine Glucoseoxidaseaktivität von 1780 Sarrett-Einheiten/ml und eine Katalaseaktivität von 800 Baker-Einheiten/ml. Dann wurden dem Gemisch 21 Aceton und 200 ml 25%ige Glutardial-5 dehydlösung zugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann |60 Minuten bei 30 °C stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und die festen Partikel wurden auf dem Filter gründlich mit ca. 501 dest. Wasser ausgewaschen. Der zurückbleibende feuchte Filterkuchen hatte ein Gewicht von 1,80 kg. io Er wurde in 1,20 kg Glycerin fein suspendiert und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Vor Prüfung der Aktivität sowie vor sonstigen Untersuchungen wurde die Glycerinlösung jeweils mit Wasser ausgespült. Tabelle 2 gibt die wichtigsten Analysendaten des Präpa-i5 rates wieder.

Tabelle 2

20 Enzym-Trockensubstanzgehalt Glucoseoxidaseaktivität Katalaseaktivität

17,8 g/100g 134 SU/gTS 58 BU/gTS

Beispiel 4

20 g Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden mit 100 ml dest. Wasser unter Rühren bei 60 °C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 2 ml Formalin zugesetzt. Dann wurde ein gut entfetteter Flügelrührer mit einer Oberfläche von 20 cm2 in die Gelatine-Formalinmischung eingetaucht und sofort wieder daraus entfernt. Überschüssige Gelatine-Forma-linmischung wurde abtropfen gelassen und der Rührer dann 5 Stunden in einen Trockenschrank von 105 °C zum Trocknen und Vernetzen des Formalin-Gelatine-Gemisches eingebracht. Danach wurde der nunmehr mit einer feinen Kunststoffschicht überzogene Rührer abkühlen gelassen und in eine Lösung von 20 g Original-Kälberlab (Fa. Hauser) in 100 ml Wasser 1 Minute lang eingetaucht. Dann wurde der mit Labenzym benetzte Rührer in einer Lösung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und 10 ml 25%igem Glutardialdehyd 60 Minuten lang stehen gelassen und anschliessend 60 Minuten lang im fliessenden Wasser gewaschen.

Zur Prüfung auf Labaktivität wurde der Rührer zum langsamen Rühren von 200 ml frischer Vollmilch eingesetzt. Nach ca. 60 Sekunden trat eine starke Caseinausfällung ein, die anzeigte, dass der Rührer noch Labaktivität aufwies. Der Rührer wurde sodann gespült und nochmals zum langsamen Rühren von 200 ml frischer Vollmilch verwendet. Es zeigte sich bei lOfacher Wiederholung dieses Vorgangs, dass jeweils nach 50 bis 70 Sekunden starke Caseinfällung eintrat.

Beispiel 5

1 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 61 kaltes Wasser eingetragen und auf 60 °C erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 250 ml 25%ige Giutardialdehydlösung unter Rühren zugesetzt. Nach ca. 2 Minuten erstarrte die Masse zu einem Gel, das durch einen Fleischwolf gedreht und in ca. 5 cm hoher Schicht auf Hordenblechen im Umluft-Trockenschrank bei 120 °C getrocknet wurde.

Die trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so dass eine Partikelgrösse vorwiegend zwischen 50 und 100 um entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und hatten eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 3,lfachen ihres Trockengewichtes.

Zu 0,5 kg des Trägerstoffpulvers wurden 1,41 einer Lösung hinzugerührt, die 0,11 handelsübliches, flüssiges Glucoseoxi-dase-Katalase-Gemisch und 1,31 destilliertes Wasser enthielt.

Hinsichtlich Auswaschstabilität und Michaeliskonstante 25 gegenüber Glucosesubstrat wurden innerhalb der analytischen Fehlergrenzen die gleichen Werte wie in Beispiel 1 gefunden.

Beispiel 6

10 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) 3o wurden in 601 Wasser von ca. 20 °C eingetragen und innerhalb von 30 Minuten auf 50 °C erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 3,51 Formalin unter Rühren zugesetzt. Nach etwa 2 Minuten erstarrte die Masse zu einem Gel, das durch einen Fleischwolf gedreht und in ca. 5 cm hohen Schich-35 ten auf Hordenblechen im Umluft-Trockenschrank 24 Stunden lang bei 108 °C getrocknet wurde. Die trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so dass ein Trägerstoffpulver mit einer Partikelgrösse von 50 bis 100 (im entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasse-40 runlöslich und hatten eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 3,2fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 5 kg des Trägerstoffpulvers wurden bei 0 °C 131 einer auf 0 °C gekühlten Lösung zugesetzt, die 0,5 kg handelsübliches Papain mit einer Aktivität von 45 000 NF-Einheiten pro mg ent-45 hielt. Dann wurden 301 Isopropanol und 1125%iges Glutardialdehyd hinzugemischt. Diese Reaktionsmischung wurde innerhalb von 5 Minuten auf 25 °C erwärmt und 60 Minuten bei dieser Temperatur stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und gründlich mit ca. 2001 entionisiertem Wasser gewa-5o sehen. Der zurückbleibende ca. 18 kg schwere Filterkuchen wurde in 201 entionisiertem Wasser resuspendiert und über einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 180 °C Lufteingangstemperatur, 85 °C Luftausgangstemperatur und einem Luftdurchsatz von 450 Nm3/h getrocknet. Es resultierten 55 5,35 kg trägerfixiertes Trockenpräparat mit einer Aktivität von 520 NF-Einheiten pro mg.

Beispiel 7

1 kg handelsübliche Amyloglucosidase am Aspergillus 60 niger mit 1070 Glucoamylase-Einheiten pro g wurden mit 141 entionisiertem Wasser gelöst. Dann wurden 5 kg Trägerstoffpulver, das wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, hinzugemischt. Nach Aufsaugen der Enzymlösung durch das Trägerstoffpulver wurden 201 Aceton und 11 Glutardialdehyd unter 65 Rühren zugegeben und die Mischung 60 Minuten bei 30 °C stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und mit ca. 3001 Wasser gewaschen. Der zurückbleibende Filterkuchen wurde in ca. 301 entionisiertem Wasser resuspendiert und über

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einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 170 °C Lufteingangstemperatur, 85 °C Luftausgangstemperatur und 400 Nm3/h Luftdurchsatz getrocknet. Es resultierten 5,20 kg trägerfixiertes Trockenpräparat mit einer Aktivität von 162 Glucoamylase-Einheiten pro g.

51 gehopfte helle Bierwürze wurden mit 201 dickbreiiger Bierhefe (Stamm Rh der Versuchs- und Lehranstalt für Brauerei in Berlin) und 1 g des oben beschriebenen fixierten Amylo-glucosidasepräparates versetzt. Parallel dazu wurde ein zweiter Ansatz in gleicher Weise, jedoch ohne Amyloglucosidase-präparat angestellt; beide Ansätze wurden im temperierten Wasserbad bei 8 °C 7 Tage gären gelassen. Danach wurden die Biere geschlaucht und der Vergärungsgrad in üblicher Weise durch Spindeln ermittelt. Die jeweils abgesetzte Bierhefe mit bzw. ohne Amyloglucosidasepräparat wurde auf jeweils 20 ml reduziert und jeweils zum Anstellen einer weiteren Biergärung verwendet. In dieser Weise wurden 4 Führungen der Hefe vorgenommen. Im Falle der mit Amyloglucosidasepartikel durchsetzten Hefe erwies es sich als relativ einfach, diese Partikel komplett in die jeweils nächste Gärcharge zu überführen, weil sie sich nach Waschen des Hefesatzes jeweils am Boden von diesem absetzten. Tabelle 3 gibt die bei den 4 Führungen mit und ohne Amyloglucosidasepräparat erzielten Vergärungsgrade wieder.

Tabelle 3

ohne Präparat mit Präparat

Vergärungsgrad, 1. Führung

78,2%

89,3%

Vergärungsgrad, 2. Führung

78,5%

86,5%

Vergärungsgrad, 3. Führung

77,9%

87,6%

Vergärungsgrad, 4. Führung

78,0%

84,8%

Beispiel 8

25 g Abfall-Flüssiggelatine ohne Gelierfähigkeit mit 70% Trockensubstanzgehalt wurden in 100 ml entionisiertem Wasser bei 50 °C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 3 ml Formalin zugesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf eine vorher mit einem fettigen Lappen abgeriebene Glasplatte gegossen und zu einer dünnen Schicht verteilt. Die Glasplatten mit dem Reaktionsgemisch wurden im Umluft-Trockenschrank bei 105 °C getrocknet. Nach der Trocknung konnte der vernetzte Trägerstoff in Membranform von den Glasplatten abgelöst werden.

Eine 5x5 cm grosse Trägerstoffmembran mit einer Dicke von 0,1 mm in Trockenzustand wurde 2 Minuten lang in eine Lösung aus 10 ml handelsüblicher flüssiger Glucoseoxidase-Katalase (wie in Beispiel 1) und 50 ml dest. Wasser getaucht. Dann wurde die Membran bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in eine Mischung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und 12 ml 25%igem Glutardialdehyd gelegt. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgt eine gründliche Wässerung der Membran. Sie wurde sodann unter Glycerin bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Aktivitätsbestimmung mit einem Teil der Membran ergab eine Glucoseoxidaseaktivität von 112 SU/g Trockensubstanz und eine Katalaseaktivität von 96 BU/g Trok-kensubstanz.

Beispiel 9

20 g Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden mit 100 ml dest. Wasser unter Rühren bei 60 °C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 2 ml Formalin zugesetzt. Dann 5 wurde ein entfettetes Edelstahl-Rundsieb von 5 cm Durchmesser, einer Maschenweite von 0,1 mm und einer Drahtstärke von 0,1 mm in diese Reaktionslösung eingetaucht und sofort wieder herausgezogen. Überschüssiges Reaktionsgemisch wurde mit einem Luftgebläse abgeblasen, so dass die Drähte lediglich von to einer dünnen Reaktionsgemisch-Schicht benetzt blieben. Das Sieb wurde sodann 4 Stunden bei 105 °C im Umluft-Trocken-schrank getrocknet. Danach wurde das nunmehr mit einer feinen Trägerstoffschicht überzogene Sieb 2 Minuten lang in eine Lösung aus 10 ml handelsüblicher flüssiger Glucoseoxidase-i5 Katalase und 50 ml dest. Wasser getaucht. Dann wurde das Sieb bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in eine Mischung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und 15 ml 25%igem Glutardialdehyd gelegt. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgte eine gründliche Wässerung des Siebes.

20 Zur Prüfung auf enzymatische Wirkung wurde das Sieb in 100 ml 3,5%ige Glucoselösung gelegt, die durch eine Fritte kräftig von unten belüftet wurde. Der ph-Wert dieser Lösung wurde automatisch durch einen Titrator konstant gehalten. Es wurden die in Tabelle 4 wiedergegebenen Verbräuche an 0,01 n 25 NaOH gemessen.

iP- Tabelle 4

Zeit [min] Verbrauch 0,01 n NaOH [ml]

0 0,00

15 0,35

30 0,85

45 1,41

35 60 * 1,85 75 * 2,41

90 2,96

105 3,58

120 4,19

40

Enzymaktivitätsbestimmungen

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgt nach den nachfolgend angegebenen Methoden. Im Falle von fixierten Enzymen wurden die Inkubationsansätze gerührt oder geschüt-45 telt, auch wenn das in der Originalvorschrift nicht angegeben war.

Katalaseaktivität: nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd Ed., S. 67-68, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

so Glucoseoxidaseaktivität: nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd Ed., S. 78-79, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Lactaseaktivität: nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd Ed., S. 81-83, Verlag National Academy of Sciences, Washing-55 ton, 1974.

Amyloglucosidaseaktivität: nach H. J. Pieper, Mikrobielle Amylasen bei der Alkoholgewinnung, S. 48-49, Verlag Ulmer, Stuttgart.

Papainaktivität: nach First Suppl. Food. Chem. Codex, 2nd 60 Ed., S. 86-87, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Cl

1 Blatt Zeichnungen

Claims

632 789 PATENTANSPRÜCHE

1. Wasserunlösliches Enzympräparat auf der Basis von mittels Glutardialdehyd kovalent an ein Trägerprotein fixierter Enzyme, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym oder ein Enzymgemisch an einen hochmolekular-porösen, aus gehärtetem Protein bestehenden Kunststoff, der eine Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachem seines Trockengewichts aufweist, gebunden ist.

2. Enzympräparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein mit Formaldehyd gehärtetes Protein, vorzugsweise formaldehydgehärtete Gelatine, handelt.

3. Enzympräparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Trägerstoff in bestimmten Anwendungsformen, z. B. als Splitter, Kugeln, Membranen oder Siebe, vorliegt.

4. Enzympräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine an ein gehärtetes Protein mit einer Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis vierfachen seines Trockengewichts gebundene Protease handelt.

5. Enzympräparate nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine an ein gehärtetes Protein mit der auf das Trockengewicht bezogenen zwei- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit gebundene Glucoseoxi-dase und Katalase handelt.

6. Enzympräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um an ein gehärtetes Protein mit der auf dessen Trockengewicht bezogenen zwei- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit gebundenes Labenzym handelt.

7. Enzympräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es zusätzlich noch stabilisierend wirkende Polyalkohole enthält.

8. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparates nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein aus einem wasserlöslichen Protein mittels eines Härtungsmittels und gewünschtenfalls durch anschliessende trocknende Wärmebehandlung erhaltener hochmolekular-poröser Kunststoff, welcher eine Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachen, bezogen auf sein Trockengewicht, aufweist, mit einer solchen Menge an enzymhaltiger Flüssigkeit versetzt wird, dass die Flüssigkeit vom Kunststoff unter Quellung voll aufgesaugt werden kann, und dass anschliessend eine Lösung von Glutardialdehyd in einer enzymfällenden Flüssigkeit zugesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoff ein mittels Formaldehyd gehärtetes wasserlösliches Protein ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Kunststoff aus mittels Formaldehyd gehärteter Gelatine besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der hochmolekular-poröse Kunststoff mit einer wässrigen Enzymlösung in geeigneter Menge versetzt und eine Lösung von Glutardialdehyd in einem niederen aliphatischen Alkohol und/oder Keton zugegeben wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass der hochmolekular-poröse Kunststoff mit wässriger Enzymlösung in bis zu achtfacher Menge bezogen auf das Trockengewicht des Trägerstoffs versetzt, dann die enzymfällende Flüssigkeit in solcher Menge hinzugefügt wird, dass keine wesentlichen Enzymmengen mehr in Lösung gehen können und die zur Fixierung verwendete Glutardialdehyd-menge auf 0,5 bis 5% bezogen auf den Reaktionssatz bemessen wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Kupplungsreaktion in einem Zeitraum von 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt wird.