DE2636206A1

DE2636206A1 - Traegerfixierte enzyme sowie ihre herstellung und anwendung

Info

Publication number: DE2636206A1
Application number: DE19762636206
Authority: DE
Inventors: Windried Dr Hartmeier
Original assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Current assignee: CH Boehringer Sohn AG and Co KG
Priority date: 1976-08-12
Filing date: 1976-08-12
Publication date: 1978-02-16
Also published as: FR2361413B1; US4182655A; JPS5341489A; BE857718A; DE2636206C3; FR2361413A1; DK357677A; NO772816L; DE2636206B2; DK146446B; NL7708867A; NO149550B; BR7705326A; AU513438B2; JPS6221513B2; SE7709112L; CH632789A5; IT1079813B; ZA774855B; SE432779B

Description

Case 3/180 9CQ co η c

Dr.Ve/sa . Z63b205

3/ Dr.Ve/sa

CH. BOHiRINGER SOHN, INGELHEIII AI-I RHEIN Trägerfixierte Enzyme sowie ihre Herstellung und Anwendung

Die Erfindung betrifft trägerfixierte Enzyme, die mittels Glutardialdehyd in Gegenwart einer enzymfällend wirkenden Substanz an einen wasserunlöslichen hochmolekular-porösen Kunststoff gebunden sind, der aus gehärtetem Protein besteht und eine Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachen seines Trockengewichtes aufweist. Weiterhin betrifft die Erfindung die Herstellung dieser trägerfixierten Enzyme sowie ihre Anwendung zur Durchführung biotechnischer Reaktionen.

Aus der Fach- und Patentliteratur sind in den letzten Jahren zahlreiche Verfahren zur Fixierung von Enzymen an wasserunlösliche Trägerstoffe bekanntgeworden. Eine zusammenfassende Übersicht gibt z.B. R.A. Messing (Herausgeber): Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, Academic Press, New York, 1975. Grundsätzlich kommen nach dem bisherigen Erkenntnisstand für die Unlöslichiuachung eines Enzyms vier Bindungsarten in Betracht: 1. die Adsorption, 2. die ionische Bindung, 3. die Verkapselung und 4. die kovalente Bindung an einen Träger oder der Enzyme untereinander. Auch Kombinationen dieser Immobilisierungs-Grundtypen sind bekannt.

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Enzyme, die durch Adsorption an einen enzynfreien Träger wie z.B. Aktivkohle oder Polysaccharide gebunden sind, haben insbesondere den Nachteil, daß es infolge der relativ schwachen adsorptiven Bindung leicht zur Desorption kommt. Vor allem, wenn Änderungen der Ionenkonzentration und der Temperatur eintreten, kann es leicht zu Lösung der Adsorptionsbindung und zum sogenannten "Ausbluten" der Enzyme kommen.

Im Falle einer ionischen Bindung des Enzyms an einen polyanionischen oder polykationischen Träger (wie z.B. Ionenaustauscherharze) besteht ebenfalls der Nachteil der relativ schwachen Bindung zwischen polyionischem Träger und Enzym, da das Enzym in der Regel nur schwach ionische Gruppen aufweist. Ein entscheidender Nachteil ist auch die bei vielen Reaktionen störende Ionenaustauscherwirkung der derart fixierten Enzyme, die dazu führt, daß im Verlauf eines Einsatzes z.B. zur Getränkebehandlung unbeabsichtigt gewisse Ionen aus dem Getränk entfernt werden.

Enzyme, die in polymere Stoffe (z.B. vernetztes Polyacrylamid) eingeschlossen (verkapselt) sind, haben als Hauptnachteil die relativ schwierige Diffusion durch das Molekularsieb des Einschlußmaterials. Die scheinbare Michaeliskonstante des derart eingeschlossenen Enzyms wird dadurch auch schon gegenüber niedermolekularen Substraten erhöht. Zusätzlich besteht die Gefahr, daß die eingeschlossenen Enzyme infolge ihrer Elastizität durch die Poren des Einschlußmaterials hindurchdringen und so "ausbluten".

Bei dem vierten genannten Fixierungstyp ist das Enzym kovalent und damit sehr fest nn eine reaktive Gruppe eines wasserunlöslichen Trägers gebunden. Weitaus die meisten Publikationen über Enzyrafixierung und auch die vorliegende Patentanmeldung betreffen diese Art Immobilisierung. Eine ganze Reihe derart hergestellter bekannter Präparate sind jedoch schon deshalb wirtschaftlich-technisch nicht anwendbar, weil zu teure Kupplungsreagenzien oder Trägersubstanzen oder zu aufwendige Her-

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stellungsverfahren angewandt werden mUssen. Bei der Kupplung nach den bisher bekannten Verfahren muß nämlich zumeist mit einem erheblichen Enzymüberschuß gearbeitet werden, weil der überwiegende Teil der Enzyme bei der Kupplungsprozedur inaktiviert wird. Die meisten Verfahren lassen auch nur einen geringen Anteil Enzyme pro Trägerstoff zu, weil die Trägerstoffe nur an ihrer Oberfläche mit Enzymprotein besetzt werden können. Teilweise Abhilfe kann zwar in Form feinster Vermahlung (Mikronisierung) der Fertigprodukte geschaffen werden, diese Präparate sind ,iedoch aufgrund ihrer Feinheit bei Anwendung in gepackter Säule (packed bed-Reaktor) nur achwer von einem Flüssigkeitsstrom zu passieren. Tin weiterer Nachteil der meisten Verfahren zur unzjanfixierung ist, daß die Trägerstoffe (z.B. Glas, Diatomeenerde) an gewisse vorgegebene Formen gebunden sind und es nicht möglich ist, sie z.B. sowohl in Kugel-, Splitter-, oder Membranform oder als Überzug über anderen Materialien (z.B. Sieben) herzustellen. Manche Trägerstoffe und Kupplungsreagenzien sind auch wegen ihrer Toxizität bedenklich.

Einige der vorgenannten Nachteile bekannter fixierter Enzyme werden bei nichtproteolytischen Enzymen nach dem Stand der Technik bereits dadurch übervranden, daß man diese Enzyme z.B. mittels Glutardialdehyd an Kollagen koppelt. Die derart hergestellten Präparate sind jedoch mikrobiell sehr anfällig und ihre spezifische Aktivität ist gering. Ähnlich verhält es sich mit Präparaten, die durch Vernetzung von Enzymen mit gelbildendem Protein erzielt werden (vgl. DT-OS 22 46 002). Hierbei entstellt ein homogenes Gemisch, da Enzyme und gelbildendes Protein wahllos miteinander vernetzt werden. Diese Präparate sind zwar mikrobiell stabiler, ihre Wirkung ist ,jedoch mangelhaft, weil die Enzyme eben gleichmäßig über den gesamten Partikelquerschnitt verteilt liegen. Im Hinblick auf einen hohen Aktivitätserhalt kann die Vernetzung nur relativ schwach vorgenommen v/erden. Das führt zu derart weichen Präparaten, daß es

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bei Anwendung z.B. in einer Säule zum Verstopfen und zum Ausbluten der Enzyme kommt. Im Falle stärkerer Vernetzung hingegen kommt es zur Inaktivierung infolge zu starker Bindung und infolge von l'.inschluß innenliegender Enz^Tinoleküle. Tin erheblicher Iipchtcil bei den letztgenannten Fixierungsverfahren ist auch, daß sie nicht für proteolytische Enzyme angewandt werden können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, wasserunlösliche nichtproteolytische und proteolytische Enzyme herzustellen, die möglichst gleichzeitig die folgenden Vorteile beinhalten:

. billige Herstellungsweise,

. hoher Aktivitätserhalt sowohl bei der Fixierungsprozedur wie auch nach langer oder wiederholter Anwendung,,

. große Resistenz gegenüber Mikroorganismen, . große Formvariabilität des Trägermaterials, . gute Durchflußeigenschaften bei Anwendung in gepackter Form, . hohe spezifische Aktivität,

. niedrige scheinbare Michaeliskonstante

. keine unerwünschten Ionenaustauscher- oder Adsorptionseigenschaften,

. verträgliche, toxisch unbedenkliche Trägerstoffe

Es wurde gefunden, daß trägerfixierte Fnzyme erhalten werden, die alle vorgenannten Kriterien erfüllen, wenn man die Enzyme zunächst in wäßrig gelöster Form von einen quellfähigen, gehärteten (denaturiert en) Protein mit der zwei- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit seines Trockengewichtes aufsaugen läßt und sie anschließend mittels Glutardialdehyd in Gegenwart einer enzynfällend wirkenden Substanz bindet. Hierbei entstehen Präparate, bei denen c^as ^nzyu an bestimmten Stellen auf der Außenseite und im Inneren des hoc^nolckular-porösen Trägerproteins mit vorgegebener Struktur gleichsam "angehängt" wird.

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Als Rohstoff zur Herstellung des wasserunlöslichen Trägerstoffes kommen v/asserlösliche Proteine verschiedener Art (z.B. Gelatine, Eiklar, Albumin, Sojaprotein u.a.) in Betracht. Wesentlich ist, daß diese Proteine durch Härtung (z.B. durch Formaldehyd,Glutardialdehyd oder Diisocyanat) wasserunlöslich gemacht und gegebenenfalls durch sonstige Behandlung (z.B. denaturierende Temperatureinwirkung) so modifiziert werden können, daß sie im Temperaturbereich zwischen O und 1OO°C eine im wesentlichen gleichbleibende Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis achtfachen ihres Trockengewichts erhalten. Das Quellverhalten der unbehandelten Ausgangsproteine kann hingegen verschieden sein; trockene Gelatine nimmt z.B. in kaltem Wasser nur etwa 10 Ji (= ein Zehntel seines Trockengewichtes) Wasser auf, während Albumin und Eiklar in kaltem Wasser voll löslich sind. Fs ist jedoch möglich, aus diesen beispielhaft genannten sowie anderen ursprünglich sehr unterschiedlichen Proteinen, in einfacher Weise einen Kunststoff mit den erfindunfsgemäi3 erwünschten Eigenschaften herzustellen, indem man das Ausganps^rotein in Wasser bei geeigneter Temperatur löst, mit einem Härtungs- bzw. Vernetzungsmittel (z.B. Formalin) vernetzt und dann einer trocknenden Wärmebehandlung unterwirft. Auf diese Weise ist die Erfindung nicht auf den Einsatz relativ teurer, gelbildender Proteine angewiesen, sondern es können auch minderwertige Proteine, z.B. Gelatine mit niedriger Bloomzahl oder auch überhaupt nicht mehr gelierende Abfall-Flüssiggelatine sowie andere nicht gelierende Eiweißstoffe verwendet werden.

Das Herstellungsverfahren für den Kunststoff, an den die Enzyme fixiert werden sollen, kann innerhalb weiter Grenzen variieren, .cnach dem verwendeten Ausgangsprotein, dem verwendeten Härtungsmittel, der gegebenen apparativen Einrichtung, der gewünschten Trnp^rstoff-Form (z.B. Splitter, Kugeln, Membranen, Siebe u.a.) etc. Die Beispiele ^jeben einige grundsätzliche Möglichkeiten ?m, deren beliebige Abänderung im Ermessen und handwerklichen Können des li'aciimannes liegt.

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Als Härtungsmittel kommen übliche Protein-IIärtungsmittel (z.B. Formaldehyd, Glutardialdehyd, Diisocyanat) in Frage. Besonders günstig ist die Verwendung von Formaldehyd, weil an einen derart gehärteten Trägerstoff anschließend mehr ■Enzymaktivität gebunden werden kann als z.B. an ein mittels Glutardinldehyd gehärtetes Protein. Außerdem hat uin z.B. mit Olutnrdialdehyd vprnptztcr Trägerstoff cüiu zusätzliche, oft unerwünschte (''erbstoffadsorbiurunde ',/irkunp:, die formaldehydgehartete Proteine nicht haben. Auch aus ökonomischen Gründen stellt die Forinaldehj^dhärtung der Proteine eine bevorzugte AüsfÜhrungsform der Erfindung dar.

Gemäß einer besondere bevorzugten Aus führung s form der Erfindung wird das zur Herstellung des Trägerstoffes vorgesehene wasserlösliche Ausgangsprotein zunächst in die dreibis zehnfache tfp.ssermenge (bezogen auf Proteinmenge) eingetragen und das Gemisch auf 40 bis 80⁰C erwärmt. Dieser Proteinlösung wird sodann eine Formaldehydlösung (z.B. Formalin) in solcher Menge zugesetzt, daß ca. 2 bis 5 % Formaldehyd bezogen auf die eingesetzte Proteintrockensubstanz in die Lösung gelangen. Die gerührte Lösung erstarrt nach einiger Zeit, wobei die Erstarrungszeit im Allgemeinen verkürzt werden kann durch möglichst hohe Temperatur, einen möglichst nahe an 8-10 liegenden pH-Wert und hohe Formaldehyd-Zugabe. Normalerweise ist ,jedoch eine allzu schnelle Erstarrung gar nicht erwünscht, weil sonst eine homogene Durchmischung des Protein-Formaldehyd- Wasser-Gemisches erschwert wird. Auch bietet eine verzögerte Erstarrung eine gute Möglichkeit, den Trägerstoff zuvor noch in eine ^ewünschte Form zu bringen. Zum Beispiel kann er durch Eintauchen von Gegenständen (Rührer, Siebe) als Überzug auf diese Gegenstände aufgebracht v/erden, oder er kann durch Sprühtrocknung in feinste Kugelpartikelform gebracht werden.

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Nicht geeignet als Trägerstoff gemäß der Erfindung sind dieunter dem Namen Kunsthorn bekannten gehärteten Eiweißstoffe. Es zeigte sich nämlich, daß Kunsthorn, das nur eine Wasseraufnahmefähigkeit von bis zu einem Drittel seines Trockengewichtes hat, nur sehr beschränkt mit Enzymen gekoppelt werdsn kann, so daß die derart hergestellten fixierten Enzymprüparate nur sehr geringe spezifische Aktivitäten erreichen.

Zur Ankopplung der Enzyme werden die gehärteten Trägerstoffe im trockenen Zustand mit den wässrig gelösten Enzymen bevorzugt in solcher Menge versetzt, daß die gesamte enzymhaltige Flüssigkeit unter Q,uellung der wasserunlöslichen Trägerstoffe aufgesogen wird. Dabei werden die äußeren und inneren Oberflächen der Trägerstoffe mit der Enzymlösung benetzt. Sodann wird eine übliche enzymfällend wirkende Flüssigkeit, in welcher Glutardialdehyd löslich ist,beispielsweise Aceton, Äthanol, Isopropanol, zusammen mit dem in ihr gelösten Glutardialdehyd als Kopplungsreagenz zubegeben. Nach erfolgter Bindung der Enzyme wird das Präparat vorzugsweise gut mit Wasser ausgewaschen und entweder in geeigneter Weise (z.B. mit Lösungsmitteln oder durch Sprühtrocknung) getrocknet oder in feuchter Korni, gewünschtcnfalls unter Zugabe von stabilisierenden Substanzen (z.B. Glycerin, Sorbit, Propylenglycol) aufbewahrt bzw. seiner v/eiteren Verwendung zugeführt.

Bevorzugt werden folgende Bedingungen bei der Ankopplungsprozedur der Enzyme eingehalten: Die wäßrige Enzymlösung wird in bis zu achtfacher Menge des Trägerstoff-Trockengewichtes zugesetzt. Enzymfällend wirkende Flüssigkeit wird in solcher Menge zugesetzt, daß im wesentlichen keine Enzyme, deren Fixierung gewünscht, würde, von den Trägerstoffen _Weg mehr in Lösung gehen. Je nach Enzym und je nach Fällungsmittel schwanken diese Mengen bekanntermaßen sehr stark, sie können jedoch vom Fachmann in einfacher Weise durch Ausprobieren für ijedes beliebige Enzym ermittelt werden. Glutardialdehyd wird bevorzugt in solcher Menge angewandt, daß die Konzentration im Reaktionsansatz

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zwischen 0,5 und 5 % liegt. Die ganze Kupplungsreaktion wird bevorzugt bei Raumtemperatur innerhalb von 5 Minuten bis 5 Stunden durchgeführt.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren können im Gegensatz zu bekannten Verfahren auch proteolytisch aktive Enzyme gebunden werden. Durch die Verhärtung des Trägerstoffes gelingt es nämlich, die Proteine soweit resistent gegen den proteolytischen Abbau der zu bindenden Protease zu machen, daß die Fixierung ohne Trägerstoffzerstörung vorgenommen werden kann. Dabei werden bevorzugt auf zwei bis vierfache Wasseraufnahmefähigkeit vorgehärtete Proteine als Träger verwendet» Trägerstoffe mit der vier- bis achtfachen Wasseraufnahmefähigkeit eignen sich jedoch auch für gewisse proteolytische Enzyme, wie z.B. Lab. Die Ermittlung der im Einzelfall zweckmäßigen Grenzen ist dem Fachmann gegeben. GewUnschtenfalls kann der Trägerstoff auch durch z.B. niedrige Temperaturen bis zur Zugabe der enzymfällend wirkenden Substanzen zusätzlich vor dem proteolytischen Angriff der Proteasen geschützt werden. Nach der Glutaraldehyd-Kopplungsreaktion ist die Gefahr des Trägerstoffabbaues dann nicht mehr gegeben.

Die erfindungsgemäßen trägerfixierten Enzyme eignen sich im allgemeinen zur Durchführung der gleichen biotechnischen Reaktionen, zu dentn auch die entsprechenden löslichen Enzyme geeignet sind. Darüberhinaus eignen sie sich aber besonders für den wiederholten und kontinuierlichen Einsatz sowie für Fälle, in denen eine Wiederentfernung der Enzyme aus dem Reaktionsgemisch (z.B. aus Getränken) erwünscht bzw. gesetzlich vorgeschrieben ist. Für die wiederholte und Langzeit-Anwendung ist die hohe Resistenz dur Präparate gegen Mikroorganismen sowie ihre leichtu Desinfizlerbarkeit durch gängige Desinfektionsmittel (z.^. ouaternäre Ammoniumverbindungen, Lösungsmittel u.a.) besonders günstig.

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: In chf olgende Beispiele sollen die F^rfindung erläutern, ohne sie zu beschranken.

Beispiel 1

1 kg Pulverpelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloora) wurde in 6 1 kaltes Wasser wintetragen und auf 60⁰C erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 150 ml Formalin (= 35 Gew./vige BOrmaldehydlosun^) unter Rühren zugesetzt. Nach

2 Minuten und 30 Sekunden erstarrte die Masse zu einem Gel. Diese gelierte Masse wurde durch einen Fleischwolf gedreht, so daß grobe feuchte Gelkrümel entstanden. In ca. 5 cm hoher Schicht wurden die Gelkrümel ruf Hordenblechen im Trockenschrank mit Umluft bei 115⁰C I^ Stunden lang getrocknet. Die dann trockenen Partikrl wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so daß eine Partikelgröße vorwiegend zwischen 50 und 100/im entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und hatten eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 4,8-fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 0,5 kg des Trägerstoffpulvers wurden 1,5 1 einer Lösung zugerührt, die 0,1 !handelsübliches, flüssiges Glucoseoxidase-Katalase-Gemisch und 1,4 1 dest. Wasser enthielt. Das handelsübliche Glucoseoxidase-Katalase-Gemisch hatte eine Glucoseoxidaseaktivität von 1780 Sarrett-Einheiten/ml und eine Katalaseaktivität von 880 Baker-Einheiten/ml. Dann wurden dem Gemisch 2 1 Aceton und 200 ml 25%ige Glutardialdehydlösung zugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 6ΰ Minuten bei 30⁰C stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und die festen Partikel wurden auf dem Filter gründlich mit ca. 50 1 dest. Wasser ausgewaschen. Der zurückbleibende feuchte Filterkuchen hatte .ein Gewicht von 1,95 kg. Unter Zugabe von 1,05 kg Glycerin wurde die Masse fein suspendiert und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

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Vor Prüfung der Aktivität sowie vor sonstigen Untersuchungen wurde die GlycerinlÖsung jeweils mit Wasser gut ausgespült. Tabelle 1 gibt die wichtigsten Analysendaten des Präparates wieder.

Tabelle 1

Enzym-Trockensubstanzgehalt .....,..[g/100 g] ■ 17,6

Glucoseoxidaseaktivität ..fSU/g TJJ 178

Katalaseaktivität [BU/g TS¹ 36

Zur Prüfung der Auswaschstabilität des Präparates wurden 10 g in einer Gäule kontinuierlich mit dest. Wasser gewaschen. In eintägigen Abständen wurde die Aktivität der Knzympartikel überprüft. V.s ergab sich, daß innerhalb von 14 Tagen kein signifikanter Aktivitätsabfall stattfand. Fbenso verhielt es sich als anstelle von Wasser Bier als Auswaschflüssigkeit verwendet wurde.

Die Michaeliskonstanten des fixierten Enzympräparates sowie der löslichen Glucoseoxidase wurden gegenüber Glucose ermittelt. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen der gelösten und der fixierten Enzymform. Siehe dazu Figur 1, die die relative Reaktionsgeschwindigkeit des löslichen und des immobilisierten Enzyms in Abhängigkeit von der Glucosekonzentration darstellt.

Beispiel 2

3 g getrocknetes !.!klar wurden in 10 ml Wasser bei 40⁰C gelöst und mit Ö,? ml Formalin versetzt. Dieses Gemisch wurde im Vakuum-Trockenschrank bei 100⁰C und 10-20 Torr getrocknet. Der trockene Kunststoff wurde auf eine Korngröße von 100 bis 200 /am vermählen und ausgesiebt. Us war wasserunlöslich und hatte eine Wasseraufnahmefähigkeit vom vierfachen seines Trockengewichtes .

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0,1 β einer handelsüblichen Lactase aus Aspergillus flavus, die eine LactaseaktivitMt von 520 LU/g aufwies, wurde mit 1,5 ml destilliertem Wasser gelöst. In diese Enzymlösung wurden 0,5 g des oben geschriebenen Kunststoffpulvers eingerührt. Dann wurden 3 ml Aceton und 0,25 ml 25 %ige Glutardialdehydlösung hinzugerührt. Diese Mischung wurde 60 Minuten bei 25⁰C stehen gelassen und dann filtriert. Das als Filterrückstand verbleibende gebundene Enzym wurde gut mit dest. Wasser ausgewaschen. Es hatte eine Aktivität von 42 LU/g Trockensubstanz. Die Gesamt-Trockensubstanzmenge des gebundenen Enzympräparates betrug 0,61 g.

Beispiel 3

1 kg Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 5 1 kaltem Wasser gerührt und auf 45⁰C erwärmt. Nach Lösung der Gelatine wurden 100 ml Formalin zugesetzt. Die Lösung wurde weiter bei 4S⁰C gehalten und in einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 210⁰C Lufteingangstemperatur, 100⁰C Luftausgangstemperatur und einer Luftmenge von 500 Nm /h sprühgetrocknet. Fs entstand ein wasserunlösliches feines Pulver mit einer Wasseraufnahmefähigkeit vom siebenfachen seines Gewichtes.

0,50 ml einer katalasefreien Glucoseoxidaselösung mit einer Aktivität von 750 Sarrett-Einheiten/ml wurden mit 1 ml dest. Wasser versetzt. Dann wurden 0,5 g des oben beschriebenen pulvrigen Kunststoffes hinzugerührt. Diese Mischung wurde mit 2 ml Aceton und 0,2 ml 25#iger Glutardialdehydlösung verrührt· und 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Dann wurde das Präparat über ein Filter gut mit destilliertem Wasser ausgewaschen. Es wurden insgesamt 0,59 g fixierte Fnzymtrockensubstanz erhalten mit einer Glucoseoxidaseaktivität von 290 Sarrett-Einheiten pro g Trockensubstanz.

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Beispiel k

20 g Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden mit 100 ml dest. Wasser unter Rühren bei 60⁰C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 2 ml Formalin zugesetzt. Dann wurde ein

2 gut entfetteter Flüg-elrührer mit einer Oberfläche von 20 cm in die Gelatine-Formalinmischung eingetaucht und sofort wieder daraus entfernt. Überschüssige Gelatine-Formalinmischung wurde abtropfen gelassen und der Rührer dann 5 Stunden in einen Trockenschrank von 105⁰C zum Trocknen und Vernetzen des Formalin-Gelatinegemisches eingebracht. Danach wurde der nunmehr mit einer feinen Kunststoffschicht überzogene Rührer abkühlen gelassen und in eine Lösung von 20 g Original-Kälberlab (Fa. Hauser) in 100 ml Wasser 1 Minute lang eingetaucht. Dann wurde der mit Lrbenzym benetzte Rührer in einer Lösung aus 70 ml Aceton, 30 ml V/asser und 10 ml 25 tigern Glutardialdehyd 60 Minuten lang stehen gelassen und anschließend 60 Minuten lang im fließenden Wasser gewaschen.

Zur Prüfung auf Labaktivität wurde der Rührer zum langsamen Rühren von 200 ml frischer Vollmilch eingesetzt. Nach ca. 60 Sekunden trat eine starke Caseinausfällung ein, die anzeigte, daß der Rührer noch Labaktivität Ptifwies. Der Rührer wurde sodann gespült und nochmals zum langsamen Rühren von 200 ml frischer Vollmilch verwendet. Es zeigte sich bei 10-fächer Wiederholung dieses Vorgangs, daß jeweils nach 50 bis 70 Sekunden starke Caseinfällung eintrat.

Beispiel 5

1 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 80 Bloom) wurde in 6 1 kaltes Wasser eingetragen und auf 60⁰C erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 250 ml 25 !\-ige Glutardialdehydlösung unter Rühren zugesetzt. Nach ca. 2 Minuten erstarrte die Masse zu einem Gel, das durch einen Fleischwolf gedreht und in ca. 5 cm hoher Schicht auf Hordenblechen im Umluft-Trockenschrank bei 120⁰C getrocknet wurde.

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Die trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühlc mit Siebeinsatz gemahlen, so daß eine Partikelgrftße vorwiepend zwisciaen 50 und lOO^^un entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und hatten eine Wasseraufnahmefähigkeit von 3,1-fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 0,5 kg des Trägerstoffpulvers wurden 1,4 1 einer Lösung hinzugerührt, die 0,1 1 handelsübliches, flüssiges Glucose-oxidese-Katalase-Gemiscli und 1,^ 1 destilliertes Wasser enthielt. Das handelsübliche Glucoseo-s-iriase-Katalase-Gemisch hatte eine Glucoseoxidaseaktivität von 1780 Sarrett-Einheiten/ml und eine Katalaseaktivität von 800 Baker-Einheiten/ml. Dann wurden dem Gemisch 2 1 Aceton und 200 ml 25 ftige Glutardialdehydlösung zugemischt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 60 Minuten bei 30⁰C stehengelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und die festen Partikel wurden auf dem Filter gründlich mit ca. 50 1 dest. Wasser ausgewaschen. Der zurückbleibende feuchte Filterkuchen hatte ein Gewicht von 1,80 kg. Er wurde in 1,20 kg Glycerin fein suspendiert und bis zur weiteren Verwendung im Kühlschrank aufbewahrt.

Vor Prüfung der Aktivität sowie vor sonstigen Untersuchungen wurde die Glycerinlösung jeweils mit Wasser gut ausgespült. Tabelle 2 gibt die wichtigsten Analysendateii des Präparates wieder.

Tabelle 2

Enzym-Trockensubstanzgehalt [g/100g] 17,8

Glucoseoxidaseaktivität ...' [SU/g TS] 134

Katalaseaktivität [BU/g TS ] 58

Hinsichtlich Auswaschstabilität und Michaeliskonstante gegenüber Glucosesubstrat wurden innerhalb der analytischen Fehlergrenzen die gleichen Vierte wie in Beispiel 1 gefunden.

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Beispiel 6

10 kg Pulvergelatine (alkalisch aufgeschlossen, 30 Dloom) wurden in 60 1 Wasser von ca.2ü°C eingetragen und innerhab von 30 Minuten auf 50^oC erwärmt. Dabei ging die Gelatine in Lösung. Dann wurden 3,5 1 Formalin unter Rühren zugesetzt, !lach etwa 2 Minuten erstarrte die Masse zu einem Gel, das durch einen Fleischwolf gedreht und in ca. 5 cm hohen Schichten auf Hordenblnchen im Umluft-Trockenschrank 24 Stunden lang bei 108⁰C getrocknet wurde. Die trockenen Partikel wurden auf einer Gebläsemühle mit Siebeinsatz gemahlen, so daß ein Trägerstoffpulver mit einer Partikelgröße von 50 bis 100/am entstand. Die splitterförmigen Partikel waren wasserunlöslich und hatten eine Wasseraufnahmefähigkeit vom 3,2-fachen ihres Trockengewichtes.

Zu 5 kg des Trägerstoffpulvers wruden bei 0°C 13 1 einer auf O⁰C gekühlten Lösung zugesetzt, die 0,5 kg handelsübliches Papain mit einer Aktivität von 45.000 NF-Einheiten pro mg enthielt. Dann wurden 30 1 Isopropanol und 1 1 25. iges Glutardialdeltyd hinzugemischt. Diese Reaktionsmischun^ wurde innerhalb von 5 Minuten auf 25°C erwärmt und 60 Minuten bei dieser Temperatur stehen gelassen. Nach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und gründlich mit ca. 200 1 eabionisiertem Wasser gewaschen. Der zurückbleibende ca. 18 kr schwere Filterkuchen wurde in 20 1 entionisierten ^T.^rasser resuspendiert und über einem I aborspri'htrockner mit Zweistoff düse bei 180⁰C Lufteingangstemperatur, 85°C Luftausgangstemperatur und einem Luftdurchsatz von 450 Nnr /h getrocknet. Es resultierten 5,35 kg trägerfixiertas Trockenpräparat mit einer Aktivität von 520 NF-^inheiten pro mg.

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Beispiel 7

1 kg handelsübliche Amyloglucosidase am Aspergllus niger mit 1070Glucoamylase-Einheiten pro g wurden mit 14 1 entionisiertem Wasser gelöst. Dann wurden 5 kg Trägerstoffpulver, das wie in Beispiel 1 hergestellt worden war, hinzugemischt. Nach Aufsaugen der Enzymlösung durch das Trägerstoff pulver wurden 20 1 Aceton und 1 1 Glutardialdehyd unter Rühren zugegeben und die Mischung 6ü Minuten bei 30⁰C stehen gelassen. Mach Ablauf dieser Zeit wurde filtriert und mit ca ⁷^O 1 Wasser gev/aschen. Der zurückbleibende Filterkuchen wurde in ca.30 1 entionisiertem Wasser resuspendiert und über einem Laborsprühtrockner mit Zweistoffdüse bei 170⁰C Lufteingangstemperatur, 85⁰C Luftausgangstemperatur und 400 Nm /h Luftdurchsatz getrocknet. Es resultierten 5,20 kg trägerfixiertes Trockenpräparat mit einer Aktivität von 162 Glucoamylase-Einheiten pro g.

5 1 gehopfte helle Bierwürze wurden mit 20 ml dickbreiiger Bierhefe (Stamm Rh der Versuchs- und Lehranstant für Brauerei in Berlin) und 1 g des oben beschriebenen fixierten Anvrlo- £lucosidasepräparates versetzt. Parallel dazu wurde ein zweiter Ansatz in gleicher Weise, jedoch ohne Amyloglucosidasepräparat angestellt;beide Ansätze wurden im temperierten Wasserbad bei 8⁰C 7 Tage gären gelassen. Danach wurden die Biere geschlaucht und der Vergärungsgrad in üblicher Weise durch Spindeln ermittelt. Die jeweils abgesetzte Bierhefe mit bzw. ohne Amyloglucosidasepräparat wurde auf jeweils 20 ml reduziert und jeweils zum Anstellen einer weiteren Biergärung verwendet. In dieser ',/eise wurden 4 Führungen der Hefe vorgenommen. Im Falle der mit Amyloglucosidasepartikel durchsetzten Hefe erwies es sich als relativ einfach,diese Partikel komplett in die 'eweils nächste Gärcharge zu überführen, weil sie sich nach Waschen des Hefesatzes jeweils am Boden von diesem absetzten. Tabelle 3 gibt die bei den 4 Führungen mit und ohne Amyloglucosidasepräparat erzielten Vergärungsgrade wieder.

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Tabelle 3

ohne Präparat mit Präparat

Vergärungsgrad, 1. Führung 78,2 %

Vergärungsgrad, 2. Führung 78,5 %

VergMrungsgrad, 3. Führung 77,9 %

Vergörungsgrad, 4. Führung 78,0 %

89,3 % 86,5 Ά'

Beispiel 8

25 g Abfall-Flüssiggelatine ohne Gelierfähigkeit mit 70 ;■ Trockensubstanzgehalt wurden in 100 ml entionisiertem Wasser bei 50⁰C gelöst, ^er gelösten Gelatine- wurden 3 ml B'ormalin zugesetzt. Dann wurde das Reaktionsgemisch auf eine vorher mit einem fettigen Lappen abgeriebene Glasplatte gegossen und zu einer dünnen Schicht verteilt. Die Glasplatten mit dem Reaktionsgemisch wurden im Umluft-Trockenschrank bei 105°C getrocknet. Nach der Trocknung konnte der vernetzte Trägerstoff in Membranform von den Glasplatten abgelöst werden.

Eine 5 x 5 cm große Trägerstoffmembran mit einer Dicke von 0,1 mm im Trockenzustand wurde 2 Minuten lang in eine Lösung aus 10 ml handelsüblicher flüssiger Glucoseoxidase-Katalase (wie in Beispiel 1) und 50 ml dest. Wasser getaucht. Dann wurde die Membran bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in eine Mischung aus 70 ml Aceton, 30 ml Wasser und 12 ml 25 /oigem Glutardialdehyd gelegt. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgt eine gründliche Wässerung der Membran. Sie wurde sodann unter Glycerin bie zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die Aktivitätsbestimmung mit einem Teil der Membran ergab eine Glucoseoxidaseaktivität von 112 SU/g Trockensubstanz und eine Katalaseaktivität von Q6 BU/g Trockensubstanz.

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20 g Pulvergelatine (sauer aufgeschlossen, 80 Bloom) wurden mit 100 ml dest. Wasser unter Rühren bei 60°C gelöst. Der gelösten Gelatine wurden 2 ml Formalin zugesetzt. Dann wurde ein entfettetes Edelstahl-Rundsieb von 5 cm Durchmesser, einer Maschenweite von 1 mm und einer Drahtstärke von 0,1 mm in diese Reaktionslösung eingetaucht und sofort wieder herausgezogen. Überschüssiges Reaktionsgemisch wurde mit einem Luftgebläse abgeblasen, so daß die Drähte lediglich von einer dünnen Reaktionsgemisch-Schicht benetzt blieben. Das Sieb wurde sodann 4 Stunden bei 105⁰C im Umluft-Trockenschrank getrocknet. Danach wurde das nunmehr mit einer feinen Trägerstoffschicht überzogene Sieb 2 Minuten lang in eine Lösung aus 10 ml handelsüblicher flüssiger Glucoseoxidase-Katalase und 50 ml dest. Wasser getaucht. Dann wurde das Sieb bei Raumtemperatur 60 Minuten lang in eine Mischung aus 70 ml Aceton,30 ml Wasser und 15 ml 25 %igem Glutardialdehyd gelegt. Nach Ablauf dieser Zeit erfolgte eine gründliche Wässerung des Siebes.

Zur Prüfung auf pnzymatische Wirkung wurde das Sieb in 100 ml 3,5 #ige Glucoselösung gelegt, die durch eine Fritte kräftig von unten belüftet wurde. Der pH-Wert dieser Lösung wurde automatisch durch einen Titrator konstant gehalten. Es wurden die in Tabelle 4 wiedergegebenen Verbrauche an 0,01 η NaOH gemessen.

Tabelle- 4

Zeit [min] Verbrauch O₁Ol η NaOH [ml]

0 0,00

15 0,35

30 0,85

45 1,41

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Zeit [rain] Verbrauch 0,01 η HaOH [ml]

60	1,85
75	2,41
90	2,36
10ί>	3,58
120	4,19

Enzvmaktivitätsbestimmungen

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten erfolgt nach den nachfolgend angegebenen T>thoden. Im Falle von fixierten Enzymen wurden die Inkubationsansätze gerührt oder geschüttelt, auch wenn das in der OriginalVorschrift nicht angegeben war.

Katalaseaktivität; nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd. Ed., S. 67-68, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Crlucoseoxidaseaktivltät; nach First Suppl. B'ood Chem. Codex, 2nd. Ed., S. 78-79, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Lactaseaktivität; nach First Suppl. Food Chem. Codex, 2nd, Kd., S. 81-83, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Amylofclucosidaseaktivität: nach H.J. Pieper, Mikrobielle Amylaseii bei der Alkoholgewinnung, S. 48-/·°, Verlag Ulmer, Stuttgart.

Papainaktivität; nach B'irst Suppl. Food. Chem. Codex, 2nd. Ed., S. 86-87, Verlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

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Le e rs e ι \e

Claims

2 6 3 b 2 Q 6

Patentansprüche

1. Wasserunlösliches Enzympräparat auf der Basis von mittels Glutardialdehyd kovalent an ein Trägerprotein fixierter I'nzyme, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym odor ein Knzymgemisch an einen hochmolekular-porösen, aus gohMrtelern Protein bestehenden Kunststoff, der eine V/asseraufnalinu— .ffihigkeit vom zwrei- bis achtfachem seines Trocke.-nguwichts aufweist, gebunden ist.

". ' nzyupräparat nach Anspruch 1, dadurc¹"- ^'-^^zeichn«. t, dnΠ ΐΊ"? ~ehä.~tcte Protein rlurch Behandlung mit üblichen Härtungsmittelnund ggf. anschließende Temperaturbehandlung erhalten worden ist.

3. Enzympräparat nnch einein der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein mit Formaldehyd gehärtetes Protein, vorzugsweise formaldehydgehürtete Gelatine handelt.

4. Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Trägerstoff in bestimmte Anwendungsformen gebracht worden ist.

5. I-nzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine an ein gehärtetes Protein mit einer Wasseraufnahmefähigkeit vom zwei- bis vierfachen seines Trockengewichts gebundene Protease handelt.

6. Knzympräparat nach einem der Ansprüche 1-'-, dadurch gekenn zeichnet, daG es sjch um ein an ein gehärtetes Protein mit der (auf dieses Trockengewicht bezogenen) zwei- bis achtfachen '..'asseraufnahn^fähis-krit gebundene Glucoseoxidase und Katalase handelt.

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ORiGtNAL INSPECTED

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7. Fnzympräparat nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um an ein gehärtetes Protein mit (der auf dessen Trockengewicht bezogenen) zwei- bis achtfachen Viasseraufnahmefähigkeit gebundenes Lab-Knzym handelt.

8. Enzympräparat nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich noch stabilisierend wirkende Polyalkohole enthält.

3. Verfahren zur Herstellung eines Enzympräparats nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus einem wasserlöslichen Protein mittels eines Härtungsmittels und gewUnschtenfalls durch anschließende trodcnende Wärmebehandlung erhaltener hochmolekular-poröser Kunststoff welcher eine Wasseraufnahmefähigeit vom zwei- bis achtfachen, bezogen auf sein Trockengewicht, aufweist, mit einer solchen Menge an enzymhaltiger Flüssigkeit versetzt wird, daß die Flüssigkeit vom Kunststoff unter uullung voll aufgesaugt werden kann, und daß anschließend eine Lösung von ülutardialdehyd in einer enzymfall enden Flüssigkeit zugesetzt wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Kunststoff ein mittels Formaldehyd gehärtetes wasserlösliches Protein ist.

11. Verfahren nach einen der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnL-O, daß der Kunststoff aus mittels" Formaldehyd gehärteter Gelatine besteht.

12. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der hochmolekular-poröse Kunststoff mit einer wäßrigen '•lizymlösunc in geeigneter Menge versetzt und eine Lösung von Glutardialdehyd in einem niederen aliphatischen Alkohol und/oder Keton zugegeben wird.

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lo. Vorfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 1?, dadurch gekennzeichnet, daß der hochmolekular-poröse Kunststoff mit wäßriger \nzymlHsung in bis zu achtfacher I!enge Iu.-zogen auf das Trockengewicht des Trä^trstoffr versetzt, dann die enzymfallende Flüssigkeit in solcher Menge hinzugefügt vird, daß keine wesentlichen ^nzymmengen mehr in Lösung gehen können unu die zur Fixierung verwendetes Glutardialdehydmenge auf 0,5 bis 5 >5 bezogen auf den Reaktionsansatz bemessen v/ird.

14. -Verfahren nach einoin der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß dip Kupplungsreaktion in einem Zeitraum von 5 T'inuten bis 5 Stunden durchgeführt wird.

15. Verwendung von Enzympräparaten nach einem der Ansprüche 1 bis 8 zur Durchführung biotechnischer Verfahren.

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