CN100427940C - 含阳离子型生物相容性聚合物的传感器酶膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

含阳离子型生物相容性聚合物的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法，属于电化学生物传感器及其制备技术领域。该膜由阳离子型生物相容性聚合物、生物活性物质及高分子成膜物质组成。该敏感膜的制备方法是：将阳离子型生物相容性聚合物与生物活性物质分别配成溶液并均匀混合，然后滴涂于固体电极表面，待干燥后浸入高分子成膜物质溶液中固定，挥发掉溶剂后在固体电极表面得到一层含阳离子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜。利用阳离子型生物相容性聚合物带有正电荷、易溶于水、含有大量氢键等特性，可以缩短传感器的响应时间，提高传感器的灵敏度及稳定性，从而提高传感器的综合性能指标。

Description

含阳离子型生物相容性聚合物的传感器酶膜及其制备方法
技术领域
本发明属于电化学生物传感器及其制备技术领域，特别是涉及一种含阳离子型生物相容性聚合物的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。
背景技术
电化学生物传感器是一门由生物、化学、物理、医学、电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂的体系中进行在线连续监测的特点。电化学生物传感器的高度自动化、微型化与集成化，减少了对使用环境和技术的要求，适合野外现场分析的需求，在生物、医学、环境监测、食品、医药及军事等领域有着重要应用价值，已引起世界各国的极大关注。
通常生物物质固定化后的活性决定着传感器的灵敏度、稳定性和使用寿命等性能，因此选择具有良好生物相容性的酶载体来固定化酶是电化学生物传感器研究中的重要内容。聚合物材料具有良好的生物相容性，在电化学生物传感器领域具有十分广阔的应用前景。
在文献(1)Anal.Chem.，2002，74：1597中，Arkady A.Karyakin等人用含有1％的全氟磺酸聚合物(Nation)的乙醇-水(乙醇含量＞85％)混合溶液把葡萄糖氧化酶固定于沉积有普鲁士蓝的电极表面制成葡萄糖氧化酶膜，以该酶膜制作的电化学生物传感器对葡萄糖响应的线性范围为0.1μM～1mM，最低检测限为0.1μM，灵敏度为0.05A M-1cm-2。
在文献(2)Biosens.Bioelectron.，1996，11：103中，Haiying Liu等人用聚酯磺酸聚合物(Eastman AQ)、牛血清蛋白和戊二醛把葡萄糖氧化酶固定在玻碳电极表面制成酶膜，以该酶膜制作的电化学生物传感器对葡萄糖的响应时间＜40秒，表观米氏常数为23.5mM。
在文献(3)The Analyst，1998，123：1995中，Qing Deng等人用接枝共聚物聚乙烯醇接枝-4乙烯吡啶把葡萄糖氧化酶固定在沉积有普鲁士蓝膜层的感光石墨电极表面，得到的生物传感器对葡萄糖的响应时间＜20秒，线性响应范围为5μM～4.5mM，最低检测限为0.5μM，灵敏度为1.14mA M-1cm-2，表观米氏常数为18±0.2mM。
以上用于固定化酶的聚合物的价格都非常昂贵，不利于所得电化学生物传感器的商业化；另外，它们都带有负电荷，属于负离子型聚合物，不利于固定荷负电的生物活性物质。
发明内容
本发明的目的在于提供一种含阳离子型生物相容性聚合物的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。将价格低廉的新型阳离子型生物相容性聚合物引入到电化学生物传感器敏感膜中，提供一种含阳离子型生物相容性聚合物的电化学生物传感器酶功能敏感膜及其制备方法。利用阳离子型生物相容性聚合物带有正电荷、具有良好的水溶性、水溶液具有适于酶生存的pH范围、聚合物中含有大量氢键等特性，缩短传感器的响应时间，扩大线性响应范围，提高灵敏度及稳定性等，从而提高传感器的综合性能指标。
本发明提供的含阳离子型生物相容性聚合物的电化学生物传感器酶功能敏感膜，是由生物活性物质、阳离子型生物相容性聚合物和高分子成膜物质组成，其中生物活性物质含量是0.1～5.0mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.05～2.0mg/cm2，其余为高分子成膜物质。
本发明所述的生物活性物质为葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素C、血红蛋白、肌红蛋白中的任意一种；所述的阳离子型生物相容性聚合物为阳离子纤维素(INCI编号：聚季铵盐-10)或瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵(INCI命名：阳离子瓜尔胶)中的任意一种；所述的高分子成膜物质为聚乙烯醇缩丁醛(PVB)、壳聚糖(Chitosan)中的任意一种。
本发明含阳离子型生物相容性聚合物的生物传感器酶功能敏感膜的制备方法是：将浓度为0.2％～2.0％(m/v)的阳离子型生物相容性聚合物的二次蒸馏水溶液与浓度为1～100mg/mL的生物活性物质的二次蒸馏水溶液按体积比为1∶1～7∶1的比例混合均匀，将混合液5～20μL滴涂在洁净的固体电极(Φ＝3～5mm)表面，在2～8℃冰箱中干燥10～30小时，然后将固体电极浸入到浓度为0.5～5.0％(m/v)的高分子成膜物质溶液中保持1～20分钟，用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，在2～8℃冰箱中放置10～30小时使溶剂全部挥发，即在固体电极表面形成一层含阳离子型生物相容性聚合物酶功能敏感膜。
上述的高分子成膜物质溶液中聚乙烯醇缩丁醛的溶剂为无水乙醇，壳聚糖的溶剂为含质量分数为0.5～2％的醋酸二次蒸馏水溶液；固体电极为玻碳电极、铂盘电极、金盘电极中的一种。
本发明的效果可以从利用本发明含阳离子型生物相容性聚合物的葡萄糖氧化酶敏感膜制做的电化学生物传感器看出。将含阳离子纤维素的葡萄糖氧化酶敏感膜修饰的玻碳电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极组成葡萄糖氧化酶电化学生物传感器。将葡萄糖氧化酶传感器的三电极体系置于pH值为5.5～8.0的磷酸盐缓冲溶液中，采用CHI660B电化学工作站进行电化学表征。采用i-t法测试电极对β-D葡萄糖的电化学响应，由图1可以看出，含阳离子纤维素的葡萄糖氧化酶敏感膜对β-D葡萄糖响应迅速，响应时间＜5秒，当信噪比为3时，检出限为7.7μM；由校正曲线(图2)得出该传感器的线性范围为0.07～13mM葡萄糖(线性相关系数0.9993)，灵敏度为4.54mA M-1cm-2；该传感器具有良好的长期稳定性，干态保存56天后电极对0.5mM葡萄糖的响应电流仅下降了25％，如图3所示。
采用不同聚合物固定葡萄糖氧化酶制备的敏感膜的响应时间、线性范围及表观米氏常数等主要性能的对照见下表：
表1.不同聚合物固定葡萄糖氧化酶制备的敏感膜的性能比较
 酶膜   响应时间(秒)   线性范围(mM)   表观米氏常数(mM)
 文献1   未给出   0.0001～1   未给出
 文献2   ＜40   未给出   23.5
 文献3   ＜20   0.005～4.5   18±0.2
 实施例1   ＜5   0.07～13   1.48
注：表观米氏常数越小说明酶与固定化载体的亲和力越强，酶存在状态越接近游离状态，越有利于酶活的保持。
由表1可以看出，采用本发明方法制备的含阳离子纤维素的葡萄糖氧化酶敏感膜的线性范围与文献相当，但在响应时间和与酶之间的亲和力方面明显优于文献所用聚合物制备的酶敏感膜，并且本发明采用的阳离子型生物相容性聚合物更加廉价。此外，阳离子型生物相容性聚合物带有正电荷，与带负电荷的生物活性物质之间有较强的静电作用力，可以提高酶功能敏感膜的稳定性。
附图说明
图1为本发明葡萄糖氧化酶电极的电流-时间响应曲线。其中，横坐标-时间t(单位：秒)，纵坐标-响应电流i(单位：μA)。曲线A-含生物相容性聚合物的葡萄糖传感器对葡萄糖做的电流-时间响应曲线，曲线B-其中一个阶梯的放大图。
图2为本发明葡萄糖氧化酶电极的校正曲线。横坐标-β-D葡萄糖浓度c(单位：mM)，纵坐标-响应电流i(单位：μA)，曲线A-校正曲线，曲线B-校正曲线的线性拟合。
图3为本发明葡萄糖氧化酶电极的稳定性曲线。横坐标-时间t(单位：天)，纵坐标-响应电流i(单位：μA)。
具体实施方式
实施例1
第一步：称取10mg阳离子纤维素溶于1mL二次蒸馏水中配成浓度为1％(m/v)的溶液(pH＝5.8)；
第二步：称取10mg的47U/mg葡萄糖氧化酶(等电点为4.9)溶于0.1mL二次蒸馏水中配成100mg/mL的酶溶液；
第三步：取10μL上述酶溶液与50μL上述阳离子纤维素溶液混合均匀得到混合液，取10μL混合液滴加在洁净的玻碳电极(Φ＝3mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再将电极置于2％聚乙烯醇缩丁醛无水乙醇溶液中1分钟，取出用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，在4℃冰箱中挥发掉溶剂，在固体载体表面形成一层含阳离子纤维素的复合酶功能敏感膜，其中生物活性物质含量是2.4mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为1.18mg/cm2，其余为高分子成膜物质。用0.1M，pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极，然后将修饰好的电极保存在4℃冰箱中。
以修饰玻碳电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，用i-t法检测电极对底物β-D葡萄糖的响应，该生物传感器的响应时间小于5秒，根据信噪比大于3的原则，测得酶电极的最低检测限为7.7μM葡萄糖；线性范围为0.07～13M葡萄糖(线性相关系数0.9993)，灵敏度为4.54mAM-1m-2；表观米氏常数为1.48μM；电极稳定性保持2个月以上。
实施例2
第一步：称取15mg阳离子瓜尔胶溶于1mL二次蒸馏水中配成浓度为1.5％(m/v)的溶液(pH＝8.9)；
第二步：称取10mg的250U/mg辣根过氧化酶(等电点为7.2)溶于1mL二次蒸馏水中配成10mg/mL的酶溶液；
第三步：取10μL上述酶溶液与60μL上述阳离子纤维素溶液混合均匀得到混合液，取15μL混合液滴加在洁净的铂盘电极(Φ＝5mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再将电极置于3％聚乙烯醇缩丁醛无水乙醇溶液中10分钟。取出用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，6℃冰箱中挥发掉溶剂，在铂盘电极表面形成一层含阳离子瓜尔胶的复合酶功能敏感膜，其中生物活性物质含量是0.11mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.98mg/cm2，其余为高分子成膜物质。用0.1M，pH＝6.5的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极，然后将修饰好的电极保存在6℃冰箱中。
以修饰铂盘电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝6.5的磷酸缓冲溶液，用i-t法检测电极对底物过氧化氢的响应，该生物传感器的响应时间小于20秒，根据信噪比大于3的原则，测得酶电极最低检测限为1.5μM过氧化氢；线性范围为0.01～115.1mM(线性相关系数为0.99925)，灵敏度为1.54mAM-1cm-2；电极稳定性保持2个月以上。
实施例3
第一步：称取5mg阳离子瓜尔胶溶于1mL二次蒸馏水中配成浓度为0.5％(m/v)的溶液(pH＝8.0)；
第二步：称取8mg血红蛋白(等电点为7.0)溶于1mL二次蒸馏水中配成8mg/mL的酶溶液；
第三步：取10μL上述酶溶液与40μL上述阳离子瓜尔胶溶液混合均匀得到混合液，取8μL混合液滴加在洁净的金盘电极(φ＝3mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再将电极置于1％壳聚糖醋酸(1％m/v)溶液中5分钟。取出用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，3℃冰箱下挥发掉溶剂，在金盘电极表面形成一层含阳离子瓜尔胶的复合酶功能敏感膜，其中生物活性物质含量是0.15mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.45mg/cm2，其余为高分子成膜物质。用0.1M，pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极，然后将修饰好的电极保存在3℃冰箱中。
以修饰金盘电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝6.5的磷酸缓冲溶液，用i-t法检测电极对底物过氧化氢的响应，该生物传感器的响应时间小于10秒，根据信噪比大于3的原则，测得酶电极最低检测限为7.5μM过氧化氢；线性范围为0.03～3.8mM(线性相关系数为0.9991)，灵敏度为0.835mAM-1cm-2；电极稳定性保持2个月以上。
实施例4
第一步：称取20mg阳离子纤维素溶于1mL二次蒸馏水中配成浓度为2％(m/v)的溶液(pH＝7.0)；
第二步：称取8mg酪氨酸酶(等电点为5.6)溶于0.1mL二次蒸馏水中配成80mg/mL的酶溶液；
第三步：取10μL上述酶溶液与50μL上述阳离子纤维素溶液混合均匀得到混合液，取15μL混合液滴加在洁净的玻碳电极(φ＝5mm)表面，待其在4℃冰箱下自然晾干后，再将电极置于2％壳聚糖醋酸(2％m/v)溶液中7分钟。取出用二次蒸馏水冲洗掉固定不牢固的酶，4℃冰箱下挥发掉溶剂，在玻碳电极表面形成一层含阳离子纤维素的复合酶功能敏感膜，其中生物活性物质含量是1.02mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为1.27mg/cm2，其余为高分子成膜物质。用0.1M，pH＝7.0的磷酸盐缓冲溶液冲洗电极，然后将修饰好的电极保存在4℃冰箱中。
以修饰金盘电极为工作电极，铂丝为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极，实验温度为25±1℃，测试体系为0.1M，pH＝7.0的磷酸缓冲溶液，用i-t法检测电极对底物儿茶酚的响应，该生物传感器的响应时间小于8秒，根据信噪比大于3的原则，测得酶电极最低检测限为0.5μM儿茶酚；线性范围为0.0005～0.16mM(线性相关系数为0.999)，灵敏度为6.35mAM-1cm-2；电极稳定性保持2个月以上。

Claims (4)

1.一种含阳离子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜，其特征在于：由生物活性物质、阳离子型生物相容性聚合物和高分子成膜物质组成，其中生物活性物质含量是0.1～5.0mg/cm2，阳离子型生物相容性聚合物为0.05～2.0mg/cm2，其余为高分子成膜物质；所述的生物活性物质为葡萄糖氧化酶、辣根过氧化酶、酪氨酸酶、细胞色素C、血红蛋白、肌红蛋白中的任意一种；所述的阳离子型生物相容性聚合物为阳离子纤维素或瓜尔胶羟丙基三甲基氯化铵中的任意一种；所述的高分子成膜物质为聚乙烯醇缩丁醛、壳聚糖中的任意一种。
2.一种制备如权利要求1所述的含阳离子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜的方法，其特征在于：工艺步骤为：将浓度为0.2％～2.0％m/v的阳离子型生物相容性聚合物的二次蒸馏水溶液与浓度为1～100mg/mL的生物活性物质的二次蒸馏水溶液按体积比为1∶1～7∶1的比例混合均匀，将混合液5～20μL滴涂在洁净的直径Φ＝3～5mm的固体电极表面，在2～8℃冰箱中干燥10～30小时，然后将固体电极浸入到浓度为0.5～5.0％m/v的高分子成膜物质溶液中保持1～20分钟，用二次蒸馏水洗掉固定不牢固的酶，在2～8℃冰箱中放置10～30小时使溶剂全部挥发，在固体电极表面形成一层含阳离子型生物相容性聚合物的酶功能敏感膜。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：高分子成膜物质溶液为聚乙烯醇缩丁醛溶液、壳聚糖溶液中的任意一种，聚乙烯醇缩丁醛溶液的溶剂为无水乙醇，壳聚糖溶液的溶剂为含质量分数为0.5～2％的醋酸二次蒸馏水溶液。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所用固体电极为玻碳电极、铂盘电极、金盘电极中的一种。
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