DE2950776C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein biologisches Nährsubstrat, enthaltend ein wachstumsangemessenes Gel, in einem Kulturgefäß.

Eine beträchtliche Anzahl von Nährsubstraten sind schon entwickelt worden. Im allgemeinen enthalten Substrate, die zum Wachstum lebender Zellen, Gewebe, oder Organismen benutzt werden, bestimmte Bestandteile. Darunter sind Wasser, Nährstoffe (normalerweise eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, und geringe Mengen anderer notwendiger Elemente), Puffer und oft ein Verfestigungsmittel, das dem Nährsubstrat eine geleeartige Konsistenz verleiht, welches hier auch als gelierende Agens bezeichnet wird.

Die Mehrzahl der biologischen Substrate, die bisher benutzt worden sind, benutzen Agar, Gelatine oder Silicagel als gelierende Agenzien. Nachteile sind mit jedem dieser gelierenden Agenzien verbunden. Agar wird aus Seealgen, die aus naturwüchsigen Stämmen geerntet werden müssen, erhalten. Daher schwankt die Agarquelle jährlich. Ferner steigt die Nachfrage nach gelierenden Agenzien fortdauerend. Der Preis für Agar steigt z. B. ständig. Ein zweites Problem, das mit dem Gebrauch von Agar verbunden ist, ist die Notwendigkeit, das Agar noch während es warm ist, in das Gefäß zu gießen, da die Agarlösung schon bei 40-45°C fest werden kann. Manche Zellen können jedoch eine Temperatur von 45°C ohne ungünstige Wirkung nicht überstehen.

Gelatine ist leicht erhältlich und relativ billig, aber es wird von vielen Mikroorganismen leicht hydrolisiert, wodurch die Gelatine flüssig wird. Außer in den Fällen, wo die Hydroylse als diagnostischer biochemischer Test verwendet wird, ist dies unerwünscht. Weiterhin wird die Gelatine oft von Lebewesen als Nahrungsmittel verwendet. Gelatine hat auch die unerwünschte Eigenschaft, daß es bei niedrigen Temperaturen flüssig wird, so daß Substrate, die Gelatine als gelierendes Agens benutzen, nicht über 25°C bebrütet werden können, um mit Sicherheit fest zu bleiben. Die Nachteile des Silicagels sind unter anderem der relativ hohe Preis und die komplizierten Verfahren, die beim Vorbereiten von Substraten, die Silicagel benutzen, notwendig sind.

Pektin wird oft in der Erzeugung von Marmeladen und Gelees als gelierendes Agens benutzt. Dabei macht man jedoch im allgemeinen Gebrauch von einer hohen Zuckerkonzentration und einem niedrigen pH-Wert. Diese Bedingungen sind für das Wachstum von Mikroorganismen oder Gewebekulturen jedoch ungeeignet.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein geliertes biologisches Nährsubstrat zu schaffen, welches nicht mehr die geschilderten Nachteile von Agar oder Gelatine aufweist.

Dies wird erfindungsgemäß mit dem im Anspruch 1 gekennzeichneten Nährsubstrat erreicht.

Nach der Erfindung wird ein methylolarmes Pektin, d. h. ein Pektin mit einem Methoxylationsgrad von 7 bis 50% benutzt. Der Methoxylationsgrad bezieht sich darauf, wieviele der Carboxylgruppen des Pektins mit Methoxylgruppen verestert sind. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das Pektin einen Methoxylationsgrad von 25 bis 40%.

Das Pektin sollte im vorhandenen Nährsubstratgel in genügender Menge vorhanden sein, damit das Nährsubstrat nach Kombination mit den Metallkationen sich verfestigt.

Die Menge des Pektins richtet sich danach, wie man den Methoxylationsgrad und wie fest man das Nährsubstratgel haben möchte. Wieviel Pektin man benutzen sollte, kann man leicht durch einfachen und direkten Versuch feststellen. Man hat festgestellt, daß das Pektin am besten in einer Konzentration von 10 bis 50, vorzugsweise 10 bis 30 Gramm pro Liter Nährsubstrat vorhanden sein sollte.

Das Nährsubstratgel, das das methoxylarme Pektin beinhaltet, darf auch verschiedene andere Bestandteile aufweisen. Ein typisches Nährsubstratgel kann z. B. 2-10 Gramm/Liter eine Kohlenstoffquelle (wie z. B. Glucose oder anderer Zucker), 2-10 Gramm/Liter einer Stickstoffquelle und andere Nährstoffe in Form von natürlichen Produkten (z. B. Tryptone, Peptone, Rinderextrakt, Hefeextrakt, usw.) oder synthetische Stoffe (Kaliumnitrate und verschiedene andere Elemente) enthalten. Die Zuckerkonzentration des Nährsubstrats nach der Erfindung sollte normalerweise weniger als 10% sein, und der pH-Wert am besten zwischen 3,5 und 8, insbesondere zwischen 6 und 7. Dies im Unterschied zu Nahrungsmitteln, wie Marmelade oder Gelees, die oft zu mehr als 50% und manchmal bis zu 80% aus Zucker bestehen.

Das biologische Nährsubstrat nach der Erfindung enthält vorzugsweise auch einen oder mehrere Puffer, um den pH-Wert des Substrats zu kontrollieren. Die Puffer dürfen nicht mikroorganismusfeindlich sein, und dürfen auch das Pektin nicht beeinträchtigen. Normalerweise sind Puffer, die aus Kalium oder Natrium in Kombination mit Phosphat- oder Carbonat-Ionen bestehen, in kleineren Mengen nicht giftig. Um eine Beeinträchtigung des Pektins durch den Puffer möglichst auszuschließen, ist zu empfehlen, das Nährsubstrat und den Puffer getrennt zu sterilisieren und erst nach der Kühlung zu mischen. Unter den erfindungsgemäß brauchbaren Puffer seien genannt: NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, Na₃PO₄, NaHCO₃ und Na₂CO₃. Dabei ist das Na₃PO₄ besonders geeignet. Andere brauchbare Puffer sind Zitronensäure und Natriumcitrat; Essigsäure und Natriumacetat, Zitronensäure, Bernsteinsäure und Natriumhydroxid; monobasisches Kaliumphosphat und dibasisches Kaliumphosphat; und Tris- Maleat. Erfindungsgemäß kann man ein brauchbares festes Gel mit einem pH bis zu ungefähr 9 erhalten. Nach der Literatur soll Pektin als gelierendes Agens jedoch einen sauren pH erfordern, normalerweise unter 4. Es ist deshalb ein unerwartetes Ergebnis, daß ein Nährsubstrat mit Pektin als gelierendem Agens mit einem pH bis zu 9 brauchbar ist.

Das Nährsubstrat mit dem Pektin vermischt sich mit den mehrwertigen Metallkationen, um ein Gelieren des Substrats zu erreichen. Es ist bekannt, daß methoxylarmes Pektin sehr leicht auf verschiedene mehrwertige Katione wie z. B. Calcium reagiert und Gele formt, wenn es mit solchen Kationen kombiniert wird. Die mehrwertigen Metallkationen werden am einfachsten als Metallsalze angewendet; am besten sind diejenigen, die wasserlöslich sind. Wie im Fall des Pektins im Nährsubstrat muß genügend Metallkation da sein, um das erwünschte Gelieren des Substrats zu erreichen.

Die relativen Mengen von Pektin und Metallkationen, die zum Gelieren erforderlich sind, sind allgemein bekannt. Die Mengen können auch leicht durch entsprechende Versuche ermittelt werden. Genügend Kation ist erforderlich, um ein gutes festes Gel zu bekommen. Es ist jedoch nicht so viel Kation eingesetzt worden, daß das Gel hart oder spröde wird. Die Mengen des Pektins und/oder der Metallkationen werden am besten im voraus bestimmt, um das Gelieren herbeizuführen. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beträgt die Kationkonzentration zwischen 100 und 125 mg Calcium-Kation pro Gramm Pektin. Äquivalente Mengen anderer mehrwertiger Metallkationen könnten angewendet werden. Auf jeden Fall wird die bevorzugte Kationmenge vom Methoxylationsgrad und der Pektinmenge abhängen.

In den Fig. 1 und 2 ist das biologische Nährsubstrat in einem Kulturgefäß 11 allgemein mit 10 bezeichnet. Das Gefäß 11, z. B. eine Petrischale oder ein Reagenzglas, enthält das Nährsubstrat 10 während des Wachstums einer Kultur. Ein wachstumsangemessenes Gel 13, das ein Metallkation enthält, wird in das Kulturgefäß 11 eingebracht, normalerweise an dessen Boden 12, und ein flüssiges Nährsubstrat und Pektin werden hinzugefügt. Der Kontakt des flüssigen Nährsubstrats mit dem wachstumsangemessenen Gel 13 führt zu einer Wanderung der Kationen durch die Pektinlösung und damit zur Bildung eines Nährsubstratgels 14.

Das wachstumsangemessene Gel 13 kann aus verschiedenen bekannten Gelen, die für biologische Wachstumsmedien verwendet werden, bestehen. Gele dieser Art sind Gele, die Agar, Gelatine, Silicagel oder Karaghen als gelierendes Agens verwenden. Andere Stoffe könnten auch als Träger der mehrwertigen Metallkationen benutzt werden. Sie müssen für lebendige Zellen ungiftig sein, und sollten nicht hydrolisiert werden. Das in das Kulturgefäß 11 eingebrachte wachstumsangemessene Gel 13 wird in üblicher Weise präpariert. Obwohl das wachstumsangemessene Gel 13 Nährstoffe und andere ungiftige und nicht störende Stoffe enthalten kann, sind solche nicht notwendig oder erwünscht. Das wachstumsangemessene Gel 13 enthält am besten nur die Bestandteile, die für das Gel selbst notwendig sind, sowie das mehrwertige Metallkation.

Die Menge des mehrwertigen Kations hängt von den jeweiligen Bedingungen ab. Wie erwähnt, muß genügend mehrwertiges Kation verwendet werden, um das erwünschte Gelieren des Nährsubstrats in Gegenwart des methoxylarmen Pektins herbeizuführen. Verständlicherweise werden die Eigenschaften des wachstumsangemessenen Gels zu einem gewissen Grad die Menge der notwendigen mehrwertigen Metallkationen bestimmen, um in ausreichendem Maß mit dem methoxylarmen Pektinstoff in Wechselwirkung zu treten und das erwünschte Nährsubstratgel zu produzieren. Weiterhin wird die Struktur des Kulturgefäßes und des wachstumsangemessenen Gels, welches darin enthalten ist, zu einem gewissen Grad die Menge der mehrwertigen Metallkationen im wachstumsangemessenen Gel bestimmen. Z. B. wird das Verhältnis zwischen der Oberfläche des wachstumangemessenen Gels und dem Volumen des wachstumangemessenen Gels die notwendige Menge der Metallkationen beeinflussen.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung befindet sich das wachstumsangemessene Gel in einer Petrischale als dünne, meist uniformierte Schicht, die den Boden der Schale bedeckt. Es hat sich eine Konzentration Calciumchlorid von 2-5 Gramm pro 100 Milliliter einer 2% Agarlösung als optimal erwiesen, besonders wenn es in einem Verhältnis von 1 zu 10 mit einer flüssigen Nährsubstratlösung, die 10 bis 30 Gramm Pektin pro Liter Nährsubstrat enthält, gemischt wird.

Das wachstumsangemessene Gel soll hingegen kein Pektin als wesentliches gelierendes Agens enthalten. D. h. obwohl kleine Mengen von Pektin da sein dürfen, ist es besser, wenn das Gelieren durch andere gelierende Agenzien bewirkt wird. Ein Grund, warum man nicht Pektin enthaltende, gelierende Agenzien im wachstumsangemessenen Gel verwenden sollte, besteht in der Wechselwirkung zwischen Pektin und den mehrwertigen Metallkationen. Ein Übermaß an mehrwertigen Metallkationen erzeugt nämlich Syneresis, d. h. das Gel zieht sich unter Abgabe von Flüssigkeit zusammen. Wenn man also Pektin als gelierendes Agens im wachstumsangemessenen Gel benutzt, ist die Menge der mehrwertigen Metallkationen eingeschränkt.

Ein Netz aus natürlichen Stoffen oder Kunststoffen kann zusammen mit dem erfindungsgemäßen Nährsubstrat benutzt werden. Ein Netz mit gleichmäßiger Maschengröße, wie z. B. 5 mm, hat die Funktion dem Beobachter Felder in der Petrischale oder einem anderen Gefäß im Umriß darzustellen. Auch läßt ein Netz den Beobachter ganz durch das festgewordene Substrat sehen, ohne die Betrachtung von einer Seite einzuschränken, wie es bei einer undurchsichtigen, aufsaugenden Unterlage oder Papier der Fall ist. Es ist eine Besonderheit der vorliegenden Erfindung, daß methoxylarmes Pektin als einziges oder einzig wesentliches gelierendes Agens benutzt wird. Einziges gelierendes Agens heißt, es ist der einzige Bestandteil der Zusammensetzung, der eine erhebliche Funktion als gelierendes Agens hat. Dies schließt z. B. Agar oder Agenzien aus. Aber genau, wie geringe Spuren fremder Bestandteile nicht unbedingt die Funktion des Pektins unterstützen oder hindern, so könnten auch geringe Mengen Agar oder anderer gelierender Agenzien vorhanden sein, so lange sie nicht in solchen Mengen da sind, daß sie erheblich zum Gelieren des Nährsubstrats beitragen.

Der Ausdruck methoxylarmes Pektin weist hin auf Pektin mit einem Methoxylationsgrad von 7 bis 50%. Wie schon angegeben, wird die erforderliche Menge Metallkation vom Methoxylationsgrad des Pektins wie auch von anderen Umständen abhängen. Es ist festgestellt worden, daß, je geringer der Methoxylationsgrad des Pektins ist, desto leichter reagiert das Pektin auf die Metallkationen.

Deshalb reagiert ein Pektin, das einen sehr geringen Methoxylationsgrad hat, wie z. B. Pektinsäure (Pektinsäure hat im wesentlichen einen Methoxylationsgrad von 0%) zu schnell, um brauchbar zu sein. Die schnelle Reaktion auf Metallkationen führt zur sofortigen Bildung von Gel in der Umgebung der Kationen, was typischerweise zu Klumpen und unebenen Oberflächen des Substrats führt. Die umgekehrte Wirkung, die aus einer weniger leichten Reaktion auf Metallkationen entsteht, zeigt sich mit Pektin, das einen wesentlichen höheren Methoxylationsgrad hat, als er erfindungsgemäß vorgesehen ist.

Nach einer bevorzugten Methode zur Herstellung des erfindungsgemäßen gelierten biologischen Nährsubstrats wird eine bestimmte Menge eines flüssigen Nährsubstrats und eines methoxylarmen Pektins mit einer bestimmten Menge eines wachstumsangemessenen Gels, das mehrwertige Metallkationen enthält, zusammengebracht. Diese Mengen werden gewählt, um ein passendes Gelieren herbeizuführen. Das methoxylarme Pektin ist dabei das einzige wesentliche gelierende Agens.

Wie beschrieben, werden zweckmäßig eine oder mehrere dieser Bestandteile im voraus sterilisiert und gegebenenfalls abgepackt. In solcher abgepackter Form können die drei Bestandteile getrennt aufbewahrt und sterilisiert werden, oder das flüssige Nährsubstrat und das methoxylarme Pektin können in bestimmten Verhältnissen gemischt sein, um später mit dem wachstumsangemessenen Gel zusammengebracht zu werden. Das flüssige Nährsubstrat und das methoxylarme Pektin werden dann entweder einzeln oder als Mischung zu dem Kulturgefäß hinzugefügt. Das Gelieren folgt nach Kontakt zwischen dem methoxylarmen Pektin und den mehrwertigen Metallkationen.

Es sind auch andere Arbeitsweisen, um die mehrwertigen Metallkationen in das Kulturgefäß zu bringen, in Betracht gezogen worden, indem man einen Trägerstoff, wie eine Filterunterlage oder Papier, mit einer Lösung der Kationen imprägniert, oder indem man die Kationen direkt auf die Oberfläche des Gemisches aus flüssigem Nährsubstrat und Pektin spritzt, oder einfach indem man die Bestandteile zusammenmischt, ehe man sie in das Kulturgefäß aufgibt. Als Alternative kann eine Lösung der Metallkationen direkt in das Kulturgefäß eingebracht und getrocknet werden, um die Metallkationen an den Oberflächen des Kulturgefäßes abzulagern. Eine Lösung der mehrwertigen Metallkationen mit Wasser oder anderen Lösungsmitteln kann auf die Oberfläche des Kulturgefäßes gespritzt, gestrichen oder in sonstiger Weise aufgebracht und getrocknet werden. Durch das Auftragen der Lösung wird eine gleichmäßige Schicht der Metallkationen an der Oberfläche gebildet.

In den Zeichnungen zeigen Fig. 3 und 4 eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der ein Kulturgefäß 11′ benutzt wird. Die mehrwertigen Metallkationen bilden eine dünne Schicht 13′ auf einer Oberfläche des Gefäßes wie z. B. dem Boden 12′ des Kulturgefäßes 11′. Das Nährsubstratgel 14′ verdichtet sich darüber.

Das Nährsubstratgel besteht aus Nährstoffen und aus einem methoxylarmen Pektin als einzigem gelierenden Agens. Das Pektin ist zweckmäßig das einzige gelierende Agens im Nährsubstratgel der Erfindung. D. h. das Pektin bildet ein Gelgeflecht oder eine Gelstruktur.

Das Nährsubstratgel kann verschiedene Bestandteile enthalten. Es besteht bevorzugt hauptsächlich aus Wachstumsnährstoffen, Puffern, Wasser und dem methoxylarmen Pektin als einzig wesentliches gelierendes Agens. Das methoxylarme Pektin ist in einer Konzentration von 10 bis 50 Gramm pro Liter Substrat vorhanden.

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen gelierten biologischen Nährsubstrates kann ein Kulturnährgefäß mit einem wachstumsangemessenen Gel, das sich im Gefäß befindet, verwendet werden. Das wachstumsangemessene Gel wird dabei, wie schon beschrieben, hergestellt. Vorzugsweise enthält es die mehrwertigen Metallkationen in einer Mindestmenge von 4 Gramm pro 100 Milliliter einer Wasser/Agar-Mischung. Vorzugsweise besteht das wachstumsangemessene Gel im wesentlichen aus den mehrwertigen Metallkationen, Agar und Wasser. Bei dieser Ausführungsform der Erfindung wird das wachstumsangemessene Gel nach normalen Methoden in dem Kulturgefäß hergestellt. Das Kulturgefäß mit dem wachstumsangemessenen Gel, das die mehrwertigen Metallkationen enthält, kann dann dazu gebracht werden, um das gelierte biologische Nährsubstrat herzustellen. D. h. ein flüssiges Nährsubstrat und methoxylarmes Pektin werden in das Kulturgefäß gegeben und nach Kontakt mit dem wachstumsangemessenen Gel fest.

Das Kulturgefäß, das wachstumsangemessene Gel und das Nährsubstralgel können jedoch von vorneherein zusammen vorliegen. Das wachstumsangemessene Gel wird dann, wie beschrieben, hergestellt und bildet die erste Schicht im Gefäß. Das Nährsubstratgel bildet die zweite Schicht im Gefäß neben dem wachstumsangemessenen Gel und wird, auch wie schon beschrieben, hergestellt. Das Nährsubstratgel darf die Bestandteile, die in bezug auf das flüssige Nährsubstrat schon beschrieben worden sind, enthalten und enthält das methoxylarme Pektin als einziges wesentliches gelierendes Agens. Das methoxylarme Pektin ist das einzige wesentliche gelierende Agens für das Nährsubstratgel.

Im Hinblick auf das Nährsubstratgel ist es am besten, wenn das methoxylarme Pektin in Mengen von ungefähr 10 bis 30 Gramm Pektin pro Liter des Nährsubstrates vorhanden ist.

Das Nährsubstrat kann auch einen oder mehrere Puffer enthalten. Diese schließen Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₃PO₄, NaHCO₃, und Na₂CO₃ ein. Es ist weiterhin zu empfehlen, daß die mehrwertigen Metallkationen aus Calcium-Kationen bestehen. Vorzugsweise sind die Calcium-Kationen in einer Konzentration von 100 bis 125 Milligramm Calcium-Kationen pro Gramm Pektin enthalten. Es ist auch zu empfehlen, daß das wachstumsangemessene Gel aus einem Agar-Gel besteht, obwohl andere Gele, wie schon erwähnt, benutzt werden könnten. Am besten entspricht das Volumen des Nährsubstratgels dem 3- bis 20-fachen des Volumens des wachstumsangemessenen Gels. Nach einer bevorzugten Ausführung werden ungefähr zehn Milliliter Nährsubstratgel und ein Milliliter des wachstumsangemessenen Gels gemischt, was sich leicht in einer 60 Milliliter-Petrischale machen läßt.

Nach der vorliegenden Erfindung wird Pektin in biologischen Nährsubstraten als einziges gelierendes Agens benutzt. Die Erfindung stellt eine einfache Methode zur Verfügung, um Pektin als gelierendes Agens zu benutzen. Falls im voraus sterilisierte Bestandteile benutzt worden sind, kann auf den Gebrauch von besonderen Einrichtungen wie z. B. einem Autoklav oder Ofen verzichtet werden. So wird das flüssige Nährsubstrat, das das Pektin schon enthält, vorzugsweise im voraus sterilisiert und abgepackt. Auch das Kulturgefäß, das das wachstumsangemessene Gel (Metallkationen mit eingeschlossen) bereits enthält, kann in dieser Form bereitgestellt werden. Auch all die anderen Bestandteile (flüssiges Nährsubstrat, methoxylarmes Pektin, wachstumsangemessenes Gel, Nährsubstratgel oder Lösung der Metallkationen) können im voraus sterilisiert und abgepackt geliefert werden. In einem Kulturnährgefäß kann dann leicht eine Kultur in kurzer Zeit ohne den Gebrauch von anderen Einrichtungen erhalten werden. Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders zum Gebrauch in Lehrlabors oder anderen Stellen mit beschränkten Einrichtungen, beschränkter Zeit und/oder ohne Fachpersonal.

Das flüssige Nährsubstrat, das das methoxylarme Pektin enthält, kann heiß, warm oder gekühlt benutzt werden. Das Gelieren geschieht in allen Fällen im Kulturgefäß. Die Unabhängigkeit von der Temperatur ist besonders von Nutzen gegenüber Agarsubstraten im Hinblick auf die Verdünnungsmethode und das Plattengußverfahren zur Bestimmung von Stämmen oder zur Trennung von Mischungen verschiedener mikrobieller Typen. Bei der Verdünnungsmethode wird eine wäßrige Mischung von Mikroorganismen zum ungelierten Substrat hinzugefügt, gemischt und dann in Petrischalen gegossen, wo es gelieren soll. Mit Agar als gelierendes Agens für das Nährsubstratgel muß das Substrat eine Mindesttemperatur von 45°C haben in der Zeit, in der die Mikroorganismen hinzugefügt werden. Sonst wird die Mischung fest. Eine so hohe Temperatur ist aber vielen empfindlichen Mikroorganismen schädlich, kann manche sogar töten oder unerwünschte Änderungen hervorbringen, wie z. B. Umformungen. Dies könnte zu einem ungenauen Bild der ursprünglichen mikrobiellen Mischung führen. Solche Probleme sind durch die Erfindung vermieden, da die Mikroorganismen bei jeder erwünschten Temperatur mit dem flüssigen Nährsubstrat gemischt werden können.

Die Brauchbarkeit des erfindungsgemäßen biologischen Nährsubstrats zeigt sich in der schon beschriebenen Temperaturunabhängigkeit, wie auch darin, daß die meisten Mikroorganismen das gelierte Pektin nicht hydrolisieren können. Das Substrat kann auch bei prokaryotischen Protisten, bei eukaryotischen Mikroorganismen oder bei Zell- oder Gewebekulturen benutzt werden. Das Substrat kann auch dazu verwendet werden, zu zeigen, welche Organismen pektolytische Enzyme produzieren, da solche Organismen die Hydrolyse des Substrats bewirken könnten. Weiterhin sind die erfindungsgemäßen Substrate leicht und genau reproduzierbar, so daß eine Reihe von Proben genau und reprodzuierbar herstellbar sind.

Die vorliegende Erfindung wird durch folgendes Beispiel näher beschrieben.

Zuerst wird Pektin mit einer Nährbrühelösung vermischt in einem Verhältnis von 20-30 Gramm pro Liter, und zwar so, daß sich keine unlösbaren Klumpen bilden. Die Nährpektinbrühe wird dann mit Na₃PO₄ gepuffert, um einen pH zwischen 6 und 7 zu erzielen. Die Nährpektinbrühe wird dann in einem Autoklav sterilisiert. In alternativer Weise könnten die Nährpektinbrühe und die Puffer getrennt sterilisiert werden und erst nach Sterilisation gemischt werden. In noch anderer Weise kann das Pektin in Wasser gelöst werden in einem Verhältnis von 20-30 Gramm/Liter und in einer Weise, daß sich keine unlösbaren Klumpen bilden, während der Nährstoff und der Puffer getrennt gemischt werden, und die zwei Lösungen nach getrennter Sterilisation gemischt werden.

Es wird eine Lösung, die 2% (2 Gramm pro 100 Milliliter deionisiertem oder destilliertem Wasser) Agar-Agar und Calcium-Chlorid enthält, hergestellt. Auch können andere Verbindungen, die mehrwertige Metallkationen enthalten, benutzt werden. Typischerweise sind die Calciumverbindungen Chloride, Nitrate oder Phosphate, wobei das ideale Agens wasserlöslich ist. Wie schon angegeben ist die Konzentration des Calciumchlorids oder anderen mehrwertigen Metallkationen derart, daß die richtige Metallkation- Konzentration hervorgebracht wird, um eine Verfestigung der Nährpektinbrühe zu erreichen, nachdem sie über das feste Agargel gegossen worden ist.

Die Lösung, die 2% Agar und Metallkationen enthält, kann z. B. durch Lösen der Stoffe in Wasser bei 120°C in einem Autoklav hergestellt werden. Die heiße sterile Agarmischung wird dann in eine Petrischale gegossen, um den Boden der sterilen Schale zu bedecken. Auch kann die Agarmischung in nichtsterile Petrischalen gegossen werden und nach Verfestigung in üblicher Weise z. B. durch Äthylenoxid-Gas oder Bestrahlung sterilisiert werden.

Die Nährpektinbrühe oder das flüssige Nährsubstrat wird am besten im voraus sterilisiert und dann in ein Gefäß oder Kulturgefäß über die wachstumsangemessene Agar-Gelschicht gegossen. Die Anwesenheit der mehrwertigen Metallkationen führt zur Verfestigung des flüssigen Nährsubstrats innerhalb von 2-4 Stunden. Das verfestigte Nährsubstrat wird dann mit Mikroorganismen geimpft und bebrütet.

Die vorliegende Erfindung ist für verschiedene Kulturgefäße brauchbar. Die Erfindung eignet sich besonders für Wegwerfgefäße. Vorzugsweise beträgt das Volumen des Nährsubstratgels das 3- bis 20-fache des wachstumsangemessenen Gels. Wenn man Petrischalen und andere Gefäße benutzt, besteht eine passende Mischung aus zwei Milliliter wachstumsangemessenen Gels und zehn Millimeter Nährsubstratgel in einer 60 Millimeter-Petrischale.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der erfindungsgemäßen biologischen Nährsubstrate.

Beispiel 1

Ein Substrat für das Wachstum von Bakterien, Schimmel und Hefe enthält folgende Bestandteile:

Typton2 Gramm Pepton2 Gramm Hefeextrakt2 Gramm Glucose2 Gramm methoxylarmes Pektin25 Gramm deionisiertes Wasser1 Liter

Diese Mischung wird in einem Autoklav sterilisiert, und nachdem das Substrat abgekühlt ist, wird eine vorher sterilisierte Mischung von Na₃PO₄ und Na₂CO₃ hinzugefügt, um den pH des Substrates einzustellen.

Beispiel 2

Ein Substrat, das als Eosin-Methylenblau-Agar bekannt ist, wird benutzt, um Escherichi coli von anderen ähnlichen Bakterien zu unterscheiden. Auf diesem Substrat wächst E. coli mit einem grünen Schimmer, im Gegensatz zu Enterobacter aerogenes, welches als klebrige, rosa Kultur wächst.

Mit folgendem Substrat, das präpariert wurde, konnten die zwei Organismen gut voneinander unterschieden werden.

Pepton5 Gramm Milchzucker5 Gramm Eosin y0,4 Gramm Methylenblau0,065 Gramm methoxylarmes Pektin25 Gramm deionisiertes Wasser1 Liter

Diese Mischung wurde sterilisiert und dann mit vorher sterilisiertem Na₂CO₃ und Na₃PO₄ auf einen pH von 7,1 gebracht.

Beispiel 3

Die oben genannten Substrate wurden zur Präparation eines gelierten biologischen Nährsubstrates gemäß der Erfindung benutzt. Dazu wurde eine Agarmischung, die wie schon beschrieben präpariert wurde, in Petrischalen gegossen, wo sie abkühlte und fest wurde. Die Produkte der Beispiele 1 und 2 wurden dann zu verschiedenen Petrischalen, die die feste Agarmischung enthielten, hinzugefügt. Diese Methode wurde mit gutem Erfolg mit verschiedenen Verhältnissen (das 3- bis 20-fache der Produkte der Beispiele 1 und 2 gegenüber dem Agargel) der Bestandteile angewandt.

Beispiel 4

Das Beispiel 3 wurde wiederholt, jedoch wurden statt der Agarmischung andere Standard-Gele als wachstumsangemessenes Gel benutzt. Die anderen wachstumsangemessenen Gele waren Gelatine, Karaghen und Silicagele als gelierende Agenzien.

Die Zugabe der Produkte der Beispiele 1 und 2 zu diesen wachstumsangemessenen Gelen führten zu sehr guten Nährsubstratgelen.

Beispiel 5

Das Beispiel 3 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß statt einem Agargel als Träger für Calciumchlorid direkt eine Lösung des Calciumchlorids auf die Petrischale gebracht wurde. Die Lösungen wurden entweder mit einem Zerstäuberungsapparat aufgespritzt oder direkt auf die Schalen gestrichen. In Kombination mit den Produkten aus den Beispielen 1 und 2 wurden geeignete Gele produziert. Dieselben Methoden wurden unter Verwendung einer wäßrigen Lösung des Calciumchlorids sowie mit einer Mischung aus 5 bis 10 Gramm Methylcellulose und ungefähr 4 Gramm Calciumchlorid pro 100 Milliliter Wasser durchgeführt, wobei gute Ergebnisse erzielt wurden.

Es wurden Variationen der oben angegebenen Beispiele durchgeführt. Bei Durchführung der oben angegebenen Beispiele mit einem methoxylarmen Pektin mit entweder ein, drei, fünf oder acht Prozent Methoxylgehalt wurden in jedem Fall geeignete Kultursubstratgele produziert. Auch erhält man ein geeignetes Gel, wenn das flüssige Nährsubstrat und methoxylarmes Pektin entweder getrennt oder in Mischung benutzt werden. Wenn man die Menge des Pektins von 10 bis 30 Gramm Pektin pro Liter Kultursubstratgel variiert, erhält man ebenfalls geeignete Gele. Vorzugsweise werden die mehrwertigen Metallkationen aus einem Calciumsalz gebildet. Variationen in der Calciumkationmenge von 100 bis 125 Milligramm Kation pro Gramm Pektin führen zur Bildung geeigneter Gele. Obwohl der Bereich der bevorzugten Pektinmenge und die Menge der mehrwertigen Metallkationen schon angegeben wurden, können auch geeignete Gele außerhalb dieses Bereiches hergestellt werden.

Claims (3)

1. Biologisches Nährsubstrat, enthaltend ein wachstumsangemessenes Gel, in einem Kulturgefäß, dadurch gekennzeichnet, daß

• a) durch das wachstumsangemessene Gel die erste Schicht im Kulturgefäß gebildet ist, wobei diese erste Schicht nicht Pektin als gelierendes Agens und außerdem ein mehrwertiges Metallkation, das das Gelieren von Pektin mit einem Methoxylationsgrad von 7 bis 50% verursacht, enthält, und
• b) darüber als zweite Schicht ein Nährsubstratgel gebildet ist, welches ein Nährsubstrat sowie Pektin mit einem Methoxylationsgrad von 7 bis 50% als einziges gelierendes Agens enthält.

2. Biologisches Nährsubstrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es als Pektin ein solches mit einem Methoxylationsgrad von 25 bis 40% enthält.

3. Biologisches Nährsubstrat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es das Pektin in einer Menge von 10 bis 30 Gramm pro Liter Nährsubstrat enthält.