DE3621303A1

DE3621303A1 - Polysaccharid-zusammensetzungen, deren herstellung und verwendung

Info

Publication number: DE3621303A1
Application number: DE19863621303
Authority: DE
Inventors: Richard Burbank Provonchee; Donald Walter Renn
Original assignee: FMC Corp
Current assignee: FMC Corp
Priority date: 1985-06-25
Filing date: 1986-06-25
Publication date: 1987-01-08
Also published as: SE8602805D0; JPS6230102A; SE8602805L; GB2176795A; US4774093A; GB2176795B; GB8615339D0

Description

Die Erfindung betrifft Polysaccharid-Zusammensetzungen vom gelbildenden β-1,3-Glucan-Typ und Verfahren zur Herstellung und Verwendung von Lösungen und Gelen der Polysaccharide. Die neuen, erfindungsgemäßen Gele führen zu weiteren Vorteilen bei bedeutenden Gebieten und eröffnen unzählige neue Anwendungen für die Polysaccharide in Nahrungsmitteln, industriellen Produkten und bei Verfahren sowie bei einem breiten Spektrum von Kosmetika, Pharmazeutika und biomedizinischen Anwendungen.

Die β-1,3-Glucan-polysaccharide sind einzigartig, da sie die einzigen bekannten, von Agarose verschiedenen Polysaccharide sind, die nicht nur neutral sind, sondern auch nahezu transparente, relativ feste Hydrogele bei niedrigen Konzentrationen bilden. Diese Polysaccharide sind exo-3-Glucanpolymere, die fast ausschließlich aus β-(1,3)-glucosidischen Bindungen bestehen. Die β-1,3- Glucan-polysaccharide sind in der Natur als Bestandteile von Hefen (Zellwände), Land- und Seepflanzen und Samen (ebenfalls in Form von Zellwänden) in großem Umfang verbreitet und können biologisch, z.B. durch mikrobielle Fermentation, gebildet werden. Mikroorganismen, die die β-1,3-Glucane bilden, schließen Bakterien der Gattungen Alcaligenes, Agrobacterium und Streptococcus ein, wovon die Species Alcaligenes faecalis, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes und Streptococcus mutans einschließlich der Varianten und Mutationen hiervon die meist bekannten sind. Die bakteriell gebildeten β-1,3-Glucan-polysaccharide sind auch bekannt als Curdlane (Der Begriff "Curdlane" ist in den nachstehenden Artikeln und in "Curdlan: A Gel Forming β-1,3-Glucan" von T. Harada in Polysaccharides In Food, (Butterworths Publications, 1979), Kapitel 18, S. 283-300 definiert.), Takeda Polysaccharid 13140, Scleroglucane, Succinoglucane, Schizophyllane, Pachymane (aus dem Fungus Poria cocos), Paramylone und aufgrund anderer Bezeichnungen.

Die β-1,3-Glucan-polysaccharide werden ausführlich in der Patent- und technischen Literatur beschrieben, wie den US-PSen 37 54 925 und 38 22 250; "Production, Properties, and Application of Curdlan", T.Harada, in Extracellular Microbial Polysaccharides, ACS Symposium Series Nr. 45, American Chemical Society, Washington, D.C., 1977, 265-283 (1977); und "Curdlan: Its Properties and Production in Batch and Continuos Fermentations", K.R.Philipps und H.G.Lawford, Progress in Industrial Microbiology, Ed.M.E.Bushell, 18, 201-229 (1983), Elsevier Scientific Publishing (Amsterdam). Der letztgenannte Artikel und die am 21. Juli 1982 veröffentlichte GB-Patentanmeldung 20 90 847A beschreiben ein kontinuierliches Zwei-Stufen-Verfahren zur Bildung von Polysacchariden des Curdlan-Typs aus Mikroorganismen, wie Alcaligenes faecalis var.myxogenes (ATCC 31749 und ATCC 31750). Die Polysaccharide vom Curdlan-Typ sind für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt.

Trotz der zahlreichen Untersuchungen, die der Herstellung und Verwendung von β-1,3-Glucan-polysacchariden dienen, wurden diese Materialien nicht kommerzialisiert. Ein Hauptgrund hierfür ist das Fehlen eines zweckmäßigen und wirtschaftlichen Verfahrens zur Bildung von Gelen. Bekannte Gelbildungsverfahren umfassen

(1) das Erhitzen einer gequollenen, wäßrigen Paste des Polysaccharidpulvers, das zu einem halbkontinuierlichen, teilchenförmigen Gel führt;
(2) das Erhitzen einer wäßrigen Suspension des Polysaccharids;
(3) das Ansäuern einer alkalischen Lösung des Polysaccharids durch Tropfen der Lösung in wäßrigen Chlorwasserstoff (US-PS 38 99 480) durch Behandlung mit einer langsam freisetzbaren Säure, die in eine polymere Matrix eingekapselt ist (GB-PS 15 00 456) oder durch Behandlung mit Säureanhydrid- Dampf, wie gasförmigem Kohlendioxid (US-PS 40 12 333);
(4) das Verdünnen mit Wasser einer Lösung des Polysaccharids in einem organischen Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid; und
(5) das Dialysieren alkalischer Lösungen gegenüber verschiedenen Lösungen.

All diese Methoden sind ungebührlich mühsam und/oder unwirtschaftlich in einem kommerziellen Maßstab. Überdies ergeben sie keine gute Kontrolle hinsichtlich der Polysaccharid- Konzentration, der Gelstruktur und der ionischen Umgebung durch das Gel hindurch, die bei zahlreichen Anwendungen der Gele erforderlich sind, insbesondere bei der Behandlung von empfindlichen, biologischen Materialien.

Ein Aspekt der Erfindung ist ein neues β-1,3-Glucan- polysaccharid-Gel, gekennzeichnet durch

(a) eine kohärente, gleichmäßige, nicht teilchenförmige Struktur, wie sie visuell bestimmt wird, und durch eine kontinuierliche, gleichmäßige Färbung mit Anilinblau, und
(b) einen im wesentlichen gleichbleibenden pH-Wert durch die Gelstruktur hindurch unmittelbar nach Bildung des Gels.

Unter "kohärent" wird in der vorliegenden Beschreibung ein kontinuierliches, kohäsives Aussehen, frei von ungelösten Teilchen (obgleich mikroskopische Fibrillen vorliegen können) und gequollenen Massen, jeweils im Hinblick auf das unbewaffnete Auge und nach Anfärben mit Anilinblau, verstanden. Im Gegensatz hierzu sind frühere β-1,3-Glucan-polysaccharid-Gele, wie die aus Suspensionen hergestellten, wie in den US-PS 38 22 250 und 37 54 925, durch Phasendiskontinuität und Einschlüsse von gequollenen, ungelösten Teilchen gekennzeichnet, wie sie durch Anilinblau-Färbung hervorgehobene Marmorierung bzw. Sprenkelung sichtbarer gemacht werden. Die Kohärenz spiegelt mehr die homogene Polysaccharid-Konzentration und Struktur wider, wodurch die Verwendbarkeit der Gele als Medien zum Stützen bzw. Verstärken, Trennen, Umwandeln und Behandeln biologischer Materialien erhöht wird.

Der im wesentlichen gleichmäßige pH-Wert durch die Gele der Erfindung hindurch unmittelbar nach der Bildung steht im Gegensatz zu dem Charakter der nach dem Verfahren der US-PS 40 12 333 von Towle hergestellten Gele. Bei Towle wird eine alkalische Lösung eines Polysaccharids vom β-1,3-Glucan-Typ durch Aussetzen einer Atmosphäre eines gasförmigen Säureanhydrids, wie Kohlendioxid, geliert. Die Gelierungstechnik erfordert eine langsame Diffusion des gasförmigen Säureanhydrids durch die Polysaccharid-Lösung mit dem Ergebnis, daß ein pH- Gradient (z.B. von etwa 4 bis 8) in dem Gel auftritt. Eine nachteilige Folge der Notwendigkeit, eine Lösung bei einem alkalischen pH-Wert zu halten, ist die, daß die Gele nicht verwendet werden können, um Materialien, wie Zellen, Enzyme, Antikörper und dergl., die einem alkalischen pH-Wert oder pH-Wert-Bereich gegenüber empfindlich sind, zu stützen bzw. zu verstärken.

Bei einem anderen Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren unter niedrigem Kostenaufwand (nachfolgend zuweilen als "kritische Temperaturneutralisation" oder "CTN"-Methode bezeichnet) entwickelt worden, um Lösungen und Gele der β-1,3-Glucan-polysaccharide herzustellen, das auf dem Auffinden eines engen Temperaturbereichs beruht, bei dem eine Neutralisation oder Verminderung des pH-Werts einer alkalischen Lösung der Polysaccharide bis auf 10,5 oder niedriger nicht unmittelbar eine Gelierung herbeiführt. Jedoch kann die einmal in dem kritischen Temperaturbereich gebildete Lösung, die einen pH-Wert von 10,5 oder niedriger besitzt, einfach geliert werden, indem man entweder unter Bildung eines thermisch reversiblen ("kaltverfestigten" oder "niedrigverfestigten") Gels kühlt oder indem man weiter erhitzt, um ein thermisch irreversibles ("in der Wärme verfestigtes" oder "hochverfestigtes") Gel zu bilden.

Bei der CTN-Methode zur Herstellung von Lösungen und Gelen der Erfindung wird ein geeignetes β-1,3-Glucan- polysaccharid in einem wäßrigen, alkalischen Medium (pH oberhalb 10,5) bei einer Temperatur von oder unterhalb ca. 55°C gelöst. Die entstandene Lösung wird dann erforderlichenfalls auf die kritische Temperatur (zumindest 50°C, jedoch geringer als eine Temperatur, die zu einer Zersetzung führt) erhitzt und der pH-Wert der Lösung auf 10,5 oder niedriger durch Zugabe einer Säure eingestellt. Wie angegeben, kann die entstandene, im wesentlichen neutralisierte Lösung rasch zu einem thermisch irreversiblen Zustand durch weiteres Erhitzen auf oberhalb 50°C oder zu einem thermisch reversiblen Zustand durch Kühlen geliert werden. In jedem dieser beiden Fälle sind die entstandenen, neuen Gele homogen und besitzen einen exakt bekannten Polysaccharid-Gehalt, pH-Wert und andere Merkmale, die zu neuen Anwendungen sowie zu erhöhten Vorteilen bei eingeführten Anwendungen führen.

Bei weiteren Aspekten der Erfindung ergeben die neuen Gele überlegene Medien bei Verfahren zum Stützen bzw. Verstärken, Trennen, Umwandeln (Züchten bzw. Kultivieren, Spalten bzw. Trennen, Klonen, etc.) oder Behandeln (einschließlich Reinigen) biologischer Materialien, wie Elektrophorese, Elektroimmuno-Assay, Immunoelektrophorese, Immunodiffusion, Immunopräzipitation, Zellkultivierung und -klonen, Nucleinsäure-Digestion, Enzym- Immobilisierung, isoelektrische Fokussierung, Affinitätschromatographie, Gelfiltration, Spezimen-Immobilisierung und eine Reihe anderer biotechnischer Anwendungen. Bei diesen gut bekannten Techniken wird das biologische Material eingebracht in (z.B. durch Diffusion nach der Gelierung) oder in Kontakt gebracht mit einem Gelmedium für die Untersuchung, den Assay, die Kulitivierung oder andere Zwecke. Die Gele sind auch in Nahrungsmitteln, als medizinische Filme, als Tablettierungsmaterialien und langsam freisetzende Überzüge für Pharmazeutika in wärmebeständigen Zahnpasten und einer Vielzahl von Faser- und Filmprodukten sowie zur Herstellung von verfügbaren bzw. wegwerfbaren Kontaktlinsen verwendbar. Kügelchen und Granulate werden auch zweckmäßig aus gelbildenden Lösungen der Erfindung in der in der US- PS 44 93 894 beschriebenen Weise hergestellt.

Der kohärente Charakter der erfindungsgemäßen Gele ist normalerweise mit dem unbewaffneten Auge feststellbar. In Grenzfällen oder wenn es erwünscht ist, diese Eigenschaft dramatisch aufzuzeigen, kann das Gel jedoch mit Anilinblau, z.B. unter Verwendung der Technik von Natanishi et al., J.Gen.Appl.Microbiol. 22, 1-11 (1976), angefärbt werden. Die erfindungsgemäßen Gele färben sich kontinuierlich und vollständig, wohingegen sich frühere Polysaccharid-Gele unter Bildung eines diskontinuierlichen, gestreiften oder marmorierten Aussehens färben, was die Anwesenheit einer ungleichmäßigen Polysaccharid- Konzentration anzeigt, die zuweilen in Form von mehr oder weniger gequollenen Teilchen sichtbar wird.

Die gleichmäßige Polysaccharid-Konzentration der erfindungsgemäßen Gele führt zu signifikanten Vorteilen. Beispielsweise wird die Wanderung von Molekülen durch das Gel hindurch stärker kontrolliert, da die Poren des Gels einen gleichmäßigeren Abstand aufweisen. Die elektrophoretischen und anderen Methoden zur Trennung von biologischen Molekülen werden daher verbessert.

Der pH-Gradient wird, soweit er in einem Polysaccharid- Gel vorhanden ist, zweckmäßig potentiometrisch bestimmt oder indem man einen universellen Indikator zu der alkalischen, gelbildenden Lösung zugibt und dann die Gelierung einleitet. Wird ein nach der Säureanhydrid-Behandlung gemäß Towle (US-PS 40 12 333) hergestelltes Polysaccharid- Gel in Abschnitte geteilt, wird ein pH-Gradient aus den verschiedenen Farben zwischen den Abschnitten oder innerhalb der Abschnitte sichtbar. Sämtliche Abschnitte der erfindungsgemäßen Gele besitzen demgegenüber eine einzige Farbe. Wie angegeben, ist die Befähigung zur Kontrolle des pH-Wertes in einem Gel, insbesondere wenn ein Gel mit einem neutralen oder sauren pH- Wert hergestellt werden kann, von entscheidender Bedeutung, wenn man das Gel als Medium für alkali-empfindliche, biologische Materialien verwenden möchte. Ein alkalischer pH-Wert wird, selbst wenn er nur in einem Teil des Gels vorliegt, den Teil eines biologischen Materials, der sich im Kontakt hiermit befindet, zerstören oder anderweitig die Effizienz der Behandlung,für die das Gel vorgesehen ist, beeinträchtigen.

Bei der Herstellung von Lösungen der Polysaccharide gemäß dem "kritische Temperatur-Neutralisations"-Verfahren der Erfindung ist das Ausgangsmaterial ein natürliches oder mikrobiell gebildetes, neutrales β-1,3-Glucan- polysaccharid, das normalerweise in neutralem, wäßrigem Medium unlöslich, jedoch in alkalischem, wäßrigem Medium löslich ist. Das Ausgangsmaterial ist vorzugsweise das trockene Polysaccharid vom Curdlan-Typ, das aus einem Kulturmedium nach bekannten Methoden, wie in der US-PS 38 22 250 oder in der vorstehend genannten, veröffentlichten GB-Patentanmeldung 20 90 847A beschrieben, abgetrennt wurde. Ein solches Material ist normalerweise fest oder pulverförmig und bildet eine wäßrige Suspension oder Aufschlämmung, wenn es in einem wäßrigen Medium unterhalb eines pH-Werts von 10,5 dispergiert wird. Das Ausgangsmaterial kann auch ein kaltverfestigtes (reversibles) Gel sein, das nach den Verfahren des Standes der Technik hergestellt wurde.

Das Polysaccharid-Material kann direkt in einem wäßrigen, alkalischen Medium in Mengen von etwa 0,1 bis etwa 25 Gew.%, vorzugsweise etwa 0,5 bis etwa 5,0 Gew.%, gelöst werden oder es kann ein Alkali zu einer wäßrigen Suspension oder Aufschlämmung, die etwa die gleichen Mengen des Polysaccharids enthält, zugegeben werden, um die erforderliche Lösung zu bilden, wobei man in beiden Fällen die Temperatur der wäßrigen Mischung bei oder unterhalb etwa 55°C, z.B. in einem Bereich von etwa 10 bis 55°C, hält. Es können relativ geringe Mengen an alkalischem Material für die Auflösung verwendet werden,z.B. etwa 0,05 bis 10 Gew.% an NaOH, KOH, NH₄OH, einer organischen Base, wie eines Alkyl-, Aryl- oder Aralkylamins, eines Hydroxyl-substituierten Amins oder irgendeiner Mischung hiervon. Ist das Material so vollständig aufgelöst, besitzt die entstandene Lösung einen pH-Wert von oberhalb 10,5, z. B. von etwa 12.

Soweit sie nicht bereits eine erhöhte Temperatur besitzt, wird die entstandene Lösung auf zumindest 50°C erhitzt, wobei man jedoch dafür Sorge trägt, daß ein Anstieg der Temperatur auf den Punkt, bei dem sich das Polysaccharid zersetzt, vermieden wird. Eine bevorzugte Temperatur liegt im Bereich von etwa 50 bis etwa 60°C, jedoch hängen die Temperaturen in den einzelnen Fällen von dem speziellen, zu verarbeitenden Polysaccharid-Material ab. Ein überraschendes und unerwartetes Merkmal der Erfindung beruht darauf, daß die alkalische Lösung neutralisiert (nachstehend beschrieben) und in diesem engen Temperaturbereich ohne unmittelbare Gelierung gehalten werden kann. Das Auffinden dieses Sachverhalts ermöglicht die Handhabung des Polysaccharids, so daß reversible oder irreversible Gele mit hoher Festigkeit aus der Lösung in herkömmlicher und wirtschaftlicher Weise gebildet werden können, ohne auf die Herstellung von Suspensionen oder andere komplexe Behandlungen zurückgreifen zu müssen.

Während man die alkalische Lösung bei erhöhter Temperatur hält, wird der pH-Wert auf 10,5 oder weniger, vorzugsweise auf etwa 7, jedoch gegebenenfalls so niedrig wie ein pH-Wert von 1, gewöhnlich durch Zugabe einer Säure eingestellt. (Auf diese Stufe wird zuweilen in der vorliegenden Beschreibung als "Neutralisation" oder "Azidifizierung" Bezug genommen. Werden sie angewandt, zeigen diese Ausdrücke im allgemeinen die Zugabe einer Säure an, um die hohe Alkalinität der Lösung durch Verminderung des pH-Werts der Lösung auf 10,5 oder niedriger oder bis zu einem neutralen oder sauren Zustand auszugleichen.) Es können entweder organische oder anorganische bzw. Mineralsäuren oder beliebige Mischungen hiervon für die pH-Wert-Einstellung einschließlich Citronensäure, Essigsäure und anderer Carbonsäuren, Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Salpetersäure und Phosphorsäure, oder eines Säure freisetzenden bzw. bildenden Materials, wie γ-Butyrolacton, verwendet werden. Die entstandene Lösung kann gewünschtenfalls gepuffert werden, um sie für spezielle Anwendungen zu stabilisieren.

So hergestellt, ist die Lösung (gegebenenfalls gepuffert) für die Gelierung entweder zu einem thermisch irreversiblen Zustand durch Erhitzen auf oberhalb 50°C oder zu einem reversiblen Zustand durch Kühlen, gewöhnlich auf unterhalb etwa 40°C, bereit. Bei den bakteriell gebildeten β-1,3-Glucanen erfolgt die Gelierung zu dem thermisch irreversiblen Zustand rasch durch Erhitzen der neutralisierten Lösungen auf einen Bereich von etwa 80 bis 90°C. Temperaturen, die zu einem Schmelzen der Gele, gegebenenfalls begleitet von einer Zersetzung, führen, sollten vermieden werden. Im Falle von Curdlanen beträgt die Schmelztemperatur etwa 140 bis 160°C in Abhängigkeit vom Polymerisationsgrad. Wie bei jedem Gelieren von Polysacchariden, versteht es sich, daß im Verlauf der Zeit die erfindungsgemäßen Lösungen gelieren. Jedoch kann die Gelierung nun auf bequeme Weise kontrolliert und sogar reversiert werden, wenn es sich um ein kaltverfestigtes Gel handelt, auf Basis des Auffindens des kritischen Temperaturbereichs, innerhalb dessen eine Gelierung der neutralisierten Lösungen während eines tragbaren Zeitraums nicht stattfindet.

Die β-1,3-Glucan-Gele können als solche mit oder ohne Additive, wie in der US-PS 35 27 712 beschrieben, aufbewahrt werden oder können teilweise oder vollständig getrocknet und später rehydratisiert werden, da sie gegenüber einer Autoklaven-Behandlung und Gefrier-Tau- Zyklen bemerkenswert stabil sind.

Die Gele sind, unabhängig davon, ob es sich um einen Hochtemperatur- oder Niedrigtemperatur-Typ handelt, fest, kohärent und besitzen eine gute Gelfestigkeit [in der Größenordnung von 65 bis 70 g/cm² bei einer Polysaccharid (Curdlan-Typ)-Konzentration von 1% (Gew./Vol.), gemessen mit einem Marine Colloids Gel Tester]. Andere β-1,3-Glucan-polysaccharide ergeben ähnliche Ergebnisse.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Eine pulverförmige β-1,3-Glucan-Probe (2,0 g), geliefert von Takeda Chemical Industries Ltd. und feststellbar als Takeda Polysaccharid 13140, wird in 200 ml einer 0,05N Natriumhydroxidlösung gelöst. Der die Lösung enthaltende Kolben wird dann auf ein Wasserbad von 55°C gebracht und der Gleichgewichtseinstellung überlassen. Unter Rühren und Beibehalten der Temperatur von 55°C werden 2 ml 5N Phosporsäure zu der Lösung zugegeben. Die entstandene, neutralisierte Lösung bleibt flüssig und wird dann annähernd gleichmäßig zwischen zwei Gelierschalen aufgeteilt. Eine Schale (Probe A) wird in ein Wasserband von 85°C während 1 h gebracht und die andere Schale (Probe B) läßt man auf Raumtemperatur (etwa 22°C) abkühlen. Jede Lösung geliert innerhalb von 10 min. Nach einer Stunde bei ihren jeweiligen Temperaturen werden die beiden Gelproben während 2 h auf etwa 4°C im Kühlschrank gekühlt. Nach der Kühlschrank-Kühlung werden Gelfestigkeitsmessungen (Bruchkraft) an den beiden Proben unter Verwendung eines Marine Colloids Division, FMC Corporation, Gel Testers vorgenommen. Das Gel der Probe A zeigt eine Gelfestigkeit von 68 g/cm²; das Gel der Probe B besitzt eine Gelfestigkeit von 65 g/cm². Die Probe A ändert beim Erwärmen auf 55°C nicht ihr Aussehen. Die Probe B verflüssigt sich jedoch bei 55°C, verfestigt sich jedoch wieder beim Erhitzen auf oberhalb 80°C oder Abkühlen auf Raumtemperatur.

Jede Gelprobe zeigt beim Anfärben gemäß dem Verfahren von Nakanishi et al., J.Gen.Appl.Microbiol. 22, 1-11 (1976), unter Verwendung von 0,02% Anilinblau (Sigma) in 0,1M Natriumphosphat-Puffer (pH 7 eine kontinuierliche Färbung ohne Streifenbildung, Marmorierung oder anderem Erscheinen von Teilchen oder lokalisierter Polysaccharid- Konzentration, wie es der Fall ist, wenn die Gele aus Suspensionen, wie in den US-PSen 37 54 925 und 38 22 250 beschrieben, hergestellt werden. Darüber hinaus besitzen die gemäß dem vorliegenden Beispiel hergestellten, erfindungsgemäßen Gele glatte Oberflächen und zeigen, wenn sie aus Lösungen, die einen Universal- Indikator enthalten, hergestellt und danach in Abschnitte getrennt bzw. sektioniert wurden, eine einzige Farbe durch die Abschnitte hindurch, was einen durch und durch gleichmäßigen pH-Wert anzeigt. die nach der Towle-Methode hergestellten Gele (US-PS 40 12 333) zeigen im Gegensatz hierzu eine rauhe, orangenartige Oberfläche und lichtbrechende Streifungen innerhalb der Gele - Anzeichen für Konzentrationsdifferentiale. Überdies zeigen die Towle-Gele, wenn sie aus Lösungen hergestellt wurden, die einen Universal-Indikator enthalten und in Abschnitte aufgetrennt wurden, verschiedene Farben innerhalb spezieller Abschnitte sowie zwischen den einzelnen Abschnitten - ein Anzeichen dafür, daß die Gele so, wie sie gebildet wurden, in charakteristischer Weise einen pH-Gradienten besitzen.

Beispiel 2

Man wiederholt das Verfahren von Beispiel 1 in sämtlichen wesentlichen Aspekten, wobei man jedoch die Phosphorsäure durch Essigsäure (Eisessig) ersetzt. Wiederum gelieren die Lösungen nicht bei Zugabe der Säure bei 55°C. Bei weiterem Erhitzen und/oder Kühlen, wie in Beispiel 1, bilden sich feste, kohärente Gele mit hoher Festigkeit. Die auf oberhalb 80°C erhitzte Gelprobe ist gegenüber Temperaturänderungen irreversibel. Die Probe, die durch Kühlen von 55°C auf Raumtemperatur geliert wird, verflüssigt sich beim erneuten Erhitzen auf 55°C, kann jedoch reversibel wiederverfestigt werden, indem man kühlt,oder irreversibel wiederverfestigt werden, indem man auf oberhalb 80°C erhitzt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel veranschaulicht den im wesentlichen gleichmäßigen pH-Wert, der durch die erfindungsgemäßen Gele hindurch zutage tritt, im Gegensatz zu dem pH- Gradienten des Gels des Beispiels 5 der Towle US-PS 40 12 333, der von pH 6,9 am oberen Teil des Gels bis zu pH 7,4 am unteren Teil des Gels reichte.

Eine 5%ige Polysaccharid-Lösung in 0,2%iger NaOH wird in einem Wasserbad auf eine Temperatur von 55°C erhitzt. Unter Rühren und Beibehalten der Temperatur von 55°C wird ausreichend 10N Phosphorsäure zu der Lösung zugegeben, um den pH-Wert zwischen 3 und 4 zu bringen. Die Lösung wird in einen zylindrischen Behälter mit einem Innendurchmesser von etwa 1,5 cm bis zu einer Tiefe von etwa 13 cm gegossen. Die Lösung bildet ein festes Gel nach etwa 10 min langem Absitzenlassen bei Raumtemperatur. Nach mehreren Stunden wird das Gel aus dem Zylinder entnommen und der pH-Wert potentiometrisch bestimmt. Am oberen Teil des Gels beträgt der pH-Wert 3,34 und am unteren Ende 3,31. Da diese Werte innerhalb der experimentellen Fehlergrenze liegen, sind sie im wesentlichen die gleichen - ein Anzeichen dafür, daß der pH-Wert gleichbleibend ist.

Verwendungen der Polysaccharid-Zusammensetzungen

Die folgenden Abschnitte A bis D und H zeigen Arten des Stützens, Trennens, Umwandelns oder Behandelns von biologischen Materialien unter Verwendung der erfindungsgemäßen Polysaccharid-Lösungen und -Gele. Die verbliebenen Abschnitte erläutern andere Anwendungen. Äquivalente Anwendungen werden dem Fachmann hieraus unmittelbar ersichtlich.

A. Elektrophorese-Gelmedium 1. Serum-Elektrophorese

Man stellt, wie in Beispiel 1 beschrieben, eine 1%ige neutralisierte Lösung von Takeda Polysaccharid 13140 her. Man gibt Barbital-Puffer (etwa 0,04N) zu der Lösung zu, um den pH bei 8,2 zu halten. Die entstandene Lösung von etwa 50°C wird auf 10,2 cm × 12,7 cm (4″ × 5″) Folien eines FMC Corporation GelBond®-Films gegossen und auf etwa 22°C abkühlen gelassen, woraufhin eine Gelierung stattfindet. Die Serumproben (jeweils 2 µl) werden in vorgeschnittene Vertiefungen abgesetzt und unter Verwendung einer Standardenergiezufuhr und Elektrophoresekammer mit Löschpapierdochten und 0,04N (pH 8,2) Barbital-Puffer in den Behältern wird eine Elektrolyse bei 14 mA während 3 h durchgeführt. Die erhaltene Trennung wird durch Coomassie Blue Protein-Färbung sichtbar gemacht. Man beobachtet, wenn überhaupt, eine geringe Kathodenwanderung und das Trennmuster ist ähnlich dem für ein Agarosegel der gleichen Konzentration erwartetes. Werden Milchsäure-Dehydrogenase-Substratreagentien verwendet, um einen Ansatz sichtbar zu machen, wird ein zufriedenstellendes LDH-Muster erhalten. Die Verwendung eines von Hercules Corporation oder von George Weston Limited erhaltenes Curdlan-polysaccharid ergibt ähnliche Ergebnisse, und man kann zu den Lösungen geklärtes Johannisbrotschotengummi, Stärke oder andere Hydrokolloide zugeben, um die Gelsynärese zu kontrollieren.

2. RNA, DNA-Elektrophorese

Man stellt kaltverfestigte, kohärente Gele, wie bei der vorstehenden Veranschaulichung der Serum-Elektrophorese beschrieben, her, wobei man jedoch anstelle des Barbital- Puffers einen Tris-Puffer (50 mM) verwendet. Man gibt 5 µl einer Standardlösung eines mit einer Restriktions- Endonuclease fragmentierten β-Bakteriophagen in jede von drei vorgeschnittenen Vertiefungen. Man wendet ein elektrisches Potential über dem Gel an, das für die Trennung ausreicht. Im Anschluß an diese Trennung wird eine Spur unter Verwendung von Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Es werden den DNA-Fragmenten entsprechende Flächen aus dem Gel herausgeschnitten und durch Zugabe von ausreichend 0,1N NaOH zur Lösung des Gels die DNA gewonnen. Nach Neutralisation unter Mischen, um das Polysaccharid auszufällen, und Zentrifugieren stellt man fest, daß der Überstand die gewonnene DNA enthält.

Ähnliche Verfahren können für RNA angewandt werden.

3. Denaturierende Lösungsmittel-Elektrophorese

Bestimmte elektrophoretische Trennungen, wie diejenigen, die zu Nachweis von DNA single-point-Mutationen notwenig sind, erfordern Gelmedien, die Konzentrationen an Formamid, Harnstoff und anderen derartigen denaturierenden Mitteln enthalten, was die Bildung von Agarosegelen ausschließt. Wie in Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 89, 1579-1583 (März 1983) beschrieben, können chemisch vernetzte Gele, wie Polyacrylamid, verwendet werden, jedoch schränken diese beträchtlich die Größe der Moleküle, die getrennt werden können, ein.

Um zu bestimmen, ob sich ein 1%iges β-1,3-Glucan-Gel in Anwesenheit hoher Konzentrationen an denaturierenden Mitteln bildet, werden die folgenden Gele hergestellt, indem man Polysaccharid-Lösungen im wesentlichen wie in Beispiel 1 beschrieben unter Zusatz von Harnstoff und/oder Formamid bildet und dann, ebenfalls wie in Beispiel 1 beschrieben, erhitzt oder kühlt.

(a) 0,87%ige Takeda Polysaccharid 13140-Lösung
5,2 M Harnstoff
(b) 1,0%ige Takeda Polysaccharid 13140-Lösung
9 M Harnstoff
(c) 1,0%ige Takeda Polysaccharid 13140-Lösungen
9 M Harnstoff
25% Formamid
(d) 1,0%ige Takeda Polysaccharid 13140-Lösung
9 M Lithiumbromid.

Alle vier Zusammensetzungen bilden feste, kohärente Gele mit geringer Synärese, was eine gute Befähigung zur Gelbildung in Anwesenheit von denaturierenden Mitteln anzeigt. Proteine und Nucleinsäure-Fragmente können in diesen Gelen unter Anwendung von Standard-Elektrophoresebedingungen getrennt werden.

4. Gele für die isoelektrische Fokussierung (IEF)

Aufgrund der sehr geringen, bis überhaupt nicht vorhandenen Elektro-Endosmose, die bei mit Takeda Polysaccharid 13140 hergestellten Gelen oder anderen Polysacchariden vom Curdlan-Typ nach dem Verfahren des Beispiels 1 hergestellt wurden, führt die Zugabe geeigneter Ampholyte zu den neutralisierten Lösungen vor ihrer Gelierung zu ausgezeichneten IEF-Gelmedien. Beispielsweise wird ein für IEF geeignetes Gel hergestellt, indem man 5 ml einer auf 55°C erhitzten und mit 5 M H₃PO₄ neutralisierten 2%igen Lösung von Takeda Polysaccharid in 0,2N NaOH verwendet. Ein gleiches Volumen Wasser von 55°C, das 0,63 ml Ampholyt (Marine Colloids Division, FMC Corporation) und 1 g d-Sorbit enthält, wird zugegeben. Die Mischung wird dann rasch und gleichmäßig auf eine 11 × 12,5 cm Folie eines GelBond®-Kunststoffilms ausgebreitet und gelieren gelassen. Man wendet Lösungen eines Standard-Protein pI-Markers unter Verwendung einer Applikationsmaske an. Diese werden in eine Standard-Elektrophoresekammer mit Papierdochten gebracht, die die Platte mit einem 0,5 M Essigsäure- Anolyten und einem 0,1 M NaOH-Katholyten verbinden. Man wendet 90 min ein 500 V-Potential an. Eine Färbung mit Coomassie Blue zeigt an, daß eine feststellbare Trennung stattfindet.

B. Immunopräzipitations-Gelmedien 1. Immunodiffusion

Man stellt einen 1,5 mm dicken Film eines 1% Takeda Polysaccharid 13140-Gels, gebildet wie in Beispiel 1 beschrieben, her. Unter Verwendung eines Vakuumstempels mit einem Durchmesser von 2 mm wird eine zentrale Vertiefung, umgeben von sechs äußeren Vertiefungen, die sich sämtlich in einem Abstand von 2 mm befinden, geschnitten. In der zentralen Vertiefung dieses Ouchterlony- Immuno-Diffusionsmusters werden 5 µl eines normalen Humanserums mit verschiedenen Kaninchen-Antihumanserumprotein- Fraktionsantisera in den umgebenden Vertiefungen einschließlich IgA, IgG, IgM, Albumin und α-1-Antitrypsin eingebracht. Sämtliche Antisera, sogar das IgM, bilden sichtbare Präzipitationslinien nach einer Inkubation über Nacht, was anzeigt, daß die Diffusion einer so großen Molekularspecies wie IgM nicht durch die 1% (Gew./Vol.) Glucan-Gelstruktur beschränkt wird. In der Tat erscheinen die IgM-Anti IgM-Präzipitationslinien auf halbem Weg zwischen den Vertiefungen.

2. Immunoelektrophorese-Verfahren

Nach dem Elektrophorese-Gelmedien-Verfahren, A(1) wie vorstehend, hergestellte Gele werden der Elektroimmunodiffusion und Immunoelektrophorese angepaßt. Es werden Ergebnisse ähnlich denjenigen bei Agarose- Kontrollen erhalten.

C. Mikrobiologische Medien

Zu 50 ml einer Lösung von 1% Takeda Polysaccharid 13140 in 0,06N NaOH, erhitzt auf 60°C, gibt man 1,2 g Trypticase-Sojanährmedium-Komponenten. Der pH dieser Lösung wird auf 7,0 eingestellt und 15 ml-Anteile werden in 100 mm × 10 mm Petrischalen gegossen. Diese läßt man zu einem thermoreversiblen Zustand gelieren und einer wird einer Autoklavenbehandlung unterzogen, um ein wärmeverfestigtes Gel zu bilden. Beide werden dann mit E. coli und B. subtilis gestreift und inkubiert. Man beobachtet für jeden ein zufriedenstellendes Wachstum. Das wärmeverfestigte, mikrobiologische Mediengel hat einen besonderen Wert insoweit, als es als feste Nährmedien- Grundlage zur Kultivierung thermophiler Mikroorganismen bei Temperaturen von 90°C verwendet werden kann, bei denen Agar(ose)-Medien fluid bzw. flüssig würden.

D. β-1,3-Glucan-Gelteilchen als Träger für biologische Bestandteile

Kügelchen und andere β-1,3-Glucan-Teilchen der Erfindung werden nach den Lehren der US-PSen 41 43 201 und 44 93 894 hergestellt. Die entstandenen Kügelchen sind als Träger für immobilisierte Enzyme und andere biologische Materialien bei der Affinitätschromatographie, Gelfiltration und anderen Anwendungen verwendbar. Unter Verwendung des kritische Temperatur-Neutralisations-Verfahrens der Erfindung können jedoch nicht nur auf einfachere Weise die Kügelchen produziert und die in diesen Patentschriften genannten Anwendungen in die Praxis umgesetzt werden, sondern es sind zusätzliche Anwendungen möglich, wie die Mikroeinkapselung, die Einkapselung lebender Zellen, die Bildung von bioabbaubaren Mikroträgern für therapeutische Mittel, Agglutinationsmedien und Immunoassay-Substrate. Die meisten derselben wären nicht möglich, wenn die anfängliche Lösung, die mit den Reagentien in Kontakt gelangt, hoch alkalisch ist.

E. Überzüge oder Trägermedien mit geplanter Freigabe für Pharmazeutika

Es ist häufig erwünscht, Wirkstoffe zu transportieren, die in Magensäuren instabil sind oder in unerwünschter Weise mit der Magenauskleidung durch den Magen hindurch reagieren. β-1,3-Glucan-Gele dienen diesem Zweck aufgrund ihrer säureunlöslichen, baselöslichen Eigenschaften. Demzufolge ist es nun möglich,wie in Beispiel 1, in einer Stufe eine Lösung von β-1,3-Glucanen für die Gelierung im Kontakt mit einem Wirkstoff-Präparat herzustellen. Durch geeignete Selektionierung des Polysaccharids, der Dicke des Gels und der Konzentration des Wirkstoffs in dem Gel besitzt das so formulierte, pharmazeutische Mittel eine kontrollierte Freigabe, z.B.die Merkmale einer langsamen Freigabe.

F. Verzehrbare Gele

Menschliche und tierische Nahrungsmittel auf Basis von kohärenten β-1,3-Glucan-Gelen werden einfacher (z.B. gemäß den Lehren der US-PS 38 22 250) mit den erfindungsgemäßen Lösungen und Gelen, wie denjenigen des Beispiels 1, hergestellt.

G. Zahnpaste

Gelzahnpasten auf Basis von wärmebeständigem β-1,3-Glucan werden auf einfache Weise mit neutralisierten Lösungen und Gelen der Erfindung durch Zugabe geeigneter Mengen an Abriebsmitteln, verzehrbaren Farbstoffen, Geschmacksstoffen und/oder süßenden Mitteln und anderen bekannten Zahnpflegemittel-Bestandteilen zu einer neutralisierten Polysaccharid-Lösung des Beispiels 1 und Kühlen oder Erhitzen, um die Lösung zu einer Gelierung zu bringen, hergestellt.

H. Gelüberzüge für biologische Materialien

Durch Herstellung einer 1% (Gew./Vol.) Lösung von Takeda Polysaccharid 13140 in 0,05N NaOH, Erhitzen auf 55°C und Neutralisieren mit 5N H₃PO₄ können Sämlinge, Embryos, Pflänzchen und dergl. überzogen werden, indem man in die Lösung eintaucht und rasch zur Gelierung kühlt. Ein Trocknen ist fakultativ, ebenso wie die Zugabe von Nährbestandteilen, Befeuchtungsmitteln, Hormonen und dergl.

I. Verfügbare bzw. wegwerfbare Kontaktlinsen

Unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 1 zur Herstellung neutralisierter β-1,3-Glucan-Lösungen und unter Verwendung als solcher oder unter Einschluß von polymeren Additiven, die später ausgelaugt werden können für eine erhöhte Porosität und daher Flüssigkeits- und/oder Gaspermeabilität, werden die Lösungen in Kontaktlinsenformen gegossen und dann wärmebehandelt, um Kontaktlinsen zu bilden. Die Linsen werden durch Sieden sterilisiert. Zur Veranschaulichung dieses Verfahrens wird 1 ml der in Beispiel 1 beschriebenen, neutralisierten Lösung (von 55°C) in eine der Halbkugelvertiefungen einer Tüpfelplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen bei 50°C eingebracht. Die die Lösung enthaltende Tüpfelplatte wird 10 min auf 100°C unter Bedingungen hoher Feuchtigkeit zur Verzögerung der Verdampfung erhitzt. Das entstandene Gel simuliert eine Kontaktlinse und kann zur Sterilisierung einem Sieden unterzogen werden. Wird Agarose oder ein anderes mit siedendem Wasser auslaugbares Hydrokolloid während der Herstellung der Lösung zugegeben, erhält man ein poröseres Endprodukt. Nach dem Trocknen ist eine zumindest teilweise Rehydratation möglich, indem man das gelierte Produkt in Wasser einbringt.

Claims

1. β-1,3-Glucan-polysaccharid-Gel, gekennzeichnet durch

(a) eine kohärente, gleichmäßige, nicht teilchenförmige Struktur und
(b) einen durch und durch im wesentlichen gleichbleibenden pH-Wert.

2. Gel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid biologisch gebildet wird.

3. Gel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid durch einen Mikroorganismus der Gattung Alcaligenes oder Agrobacterium gebildet wird.

4. Gel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid durch eine Mutante des Mikroorganismus Alcaligenes faecalis gebildet wird.

5. Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Polysaccharid-Lösung, die dazu befähigt ist, beim Abkühlen auf unterhalb 40°C ein reversibles Gel mit hoher Festigkeit zu bilden, und dazu befähigt ist, beim Erhitzen auf oberhalb 50°C ein thermisch irreversibles Gel mit hoher Festigkeit zu bilden, wobei das Gel eine kohärente, gleichmäßige, nicht teilchenförmige Struktur besitzt und durch und durch einen im wesentlichen gleichbleibenden pH-Wert aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ein β-1,3-Glucan-polysaccharid, das in neutralem, wäßrigem Medium normalerweise unlöslich, jedoch in alkalischem, wäßrigem Medium löslich ist, bereitstellt;
(b) das Polysaccharid in einem wäßrigen, alkalischen Medium bei einer Temperatur von 55°C oder darunter auflöst, um eine Lösung hiervon zu bilden; und
(c) indem man die Lösung bei einer Temperatur von mindestens 50°C, jedoch geringer als die Zersetzungstemperatur des Polysaccharids hält, den pH-Wert der Lösung auf 10,5 oder niedriger einstellt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid biologisch gebildet wird.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid durch einen Mikroorganismus der Gattung Alcaligenes oder Agrobacterium gebildet wird.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Polysaccharid durch eine Mutante des Mikroorganismus Alcaligenes faecalis gebildet wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert der Lösung durch Zugabe einer organischen Säure eingestellt wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die organische Säure Essigsäure ist.

11. Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung durch Zugabe einer Mineralsäure neutralisiert wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Mineralsäure Phosphorsäure ist.

13. Polysaccharid-Lösung, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5.

14. Verfahren zur Herstellung eines reversiblen Gels mit hoher Festigkeit eines β-1,3-Glucan-polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polysaccharid- Lösung gemäß Anspruch 13 auf unterhalb 40°C abkühlt.

15. Reversibles Polysaccharid-Gel, hergestellt nach einem Verfahren gemäß Anspruch 14.

16. Verfahren zur Herstellung eines thermisch irreversiblen Gels mit hoher Festigkeit eines β-1,3-Glucan- polysaccharids, dadurch gekennzeichnet, daß man die Polysaccharid-Lösung gemäß Anspruch 13 auf oberhalb 50°C erhitzt.

17. Thermisch irreversibles Polysaccharid-Gel, hergestellt nach dem Verfahren gemäß Anspruch 16.

18. Verfahren zum Stützen bzw. Verstärken, Abtrennen, Umwandeln oder Behandeln von biologischen Materialien, bei dem ein biologisches Material eingebracht wird in oder in Kontakt gebracht wird mit einem Gelmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gelmedium das β-1,3-Glucan-polysaccharid-Gel gemäß Anspruch 1 verwendet.

19. Verfahren zum Stützen bzw. Verstärken, Abtrennen, Umwandeln oder Behandeln von biologischen Materialien, bei dem ein biologisches Material eingebracht wird in oder in Kontakt gebracht wird mit einem Gelmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gelmedium das β-1,3-Glucan-polysaccharid-Gel gemäß Anspruch 14 verwendet.

20. Verfahren zum Stützen bzw. Verstärken, Abtrennen, Umwandeln oder Behandeln von biologischen Materialien, bei dem ein biologisches Material eingebracht wird in oder in Kontakt gebracht wird mit einem Gelmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Gelmedium das β-1,3-Glucan-polysaccharid-Gel gemäß Anspruch 17 verwendet.

21. Verfahren zur Herstellung eines Gelmediums, das ein biologisches Material enthält, bei dem das biologische Material in das Gel eingebracht wird, indem man das biologische Material in eine ein Verläufergel bildende Lösung einbringt und hiernach die entstandene Dispersion geliert, indem man auf unterhalb 40°C abkühlt oder auf oberhalb 50°C erhitzt, dadurch gekennzeichnet, daß man als gelbildende Lösung die Lösung gemäß Anspruch 5 verwendet.

22. Biologisches Produkt, umfassend ein biologisches Material und einen Träger hierfür, wobei dieser Träger durch ein Gel gemäß Anspruch 1 in Teilchenform gekennzeichnet ist.

23. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Wirkstoff und einen Träger hierfür, wobei der Träger durch ein Gel gemäß Anspruch 1 gekennzeichnet ist.

24. Biologisches Material mit einem Überzug des Gels gemäß Anspruch 1.

25. Verfügbare bzw. wegwerfbare Kontaktlinsen, gekennzeichnet durch ein Gel gemäß Anspruch 1 in Form von Kontaktlinsen.