DE3115809A1

DE3115809A1 - Stereospezifische d- und l-asparaginase sowie verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3115809A1
Application number: DE19813115809
Authority: DE
Inventors: Graeme Roy Bedford Park Guy; Roy Daniel Hamilton McIver; Hugh William Morgan
Original assignee: Development Finance Corp of New Zealand
Current assignee: Development Finance Corp of New Zealand
Priority date: 1980-04-21
Filing date: 1981-04-18
Publication date: 1982-04-29
Also published as: US4473646A

Description

Die Erfindung betrifft stereospezifische D- und L-Asparaginase sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Der Inhalt dieser Patentanmeldung entspricht der europäischen Patentanmeldung 80 30 27 43.2, eingereicht am 8. August 1980.

Asparaginasen haben Bedeutung in der Chemotherapie, zur Herstellung optisch isomerer Verbindungen und als Feinchemikalien in der Biochemie erlangt. Es besteht ein Bedürfnis für Asparaginasen mit hoher Stereospezifität.

Es stellte sich daher die Aufgabe, dieses Bedürfnis zu erfüllen und stereospezifische Asparaginasen zur Verfü-■ gung zu stellen, mindestens aber die Wahl unter diesen Enzymen zu erweitern. Ferner war ein Verfahren zum Herstellen der stereospezifischen Asparaginasen anzugeben.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch die im Anspruch 1 bezeichnete D-Asparaginase und die im Anspruch 3 bezeichnete L-Asparaginase gelöst.

-A-

Das Verfahren zum Herstellen der D- und L-Asparaginase ist im Anspruch 5 angegeben.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den übrigen Ansprüchen aufgeführt.

Die stereospezifische D- und L-Asparaginase wird aus Thermus T-ZSl gewonnen. Thermus T-ZSl ist ein Mikroorganismus , der aus einem Heißwasserteich mit der Bezeichnung Nr. 351 auf der Karte "Whakarewarewa Hot Springs", 1 : 2000, 1. Auflage, New Zealand Geological Survey (Bibliographische Quelle: Lloyd, E.F. 1074, Geology of Whakarewara hot springs, DSIR-Informationsreihe Nr. 104, DSIR, Wellington, Neuseeland) isoliert worden ist. Er ist eine aerobe, keine Sporen bildende, gram-negative, stäbchenförmige und caldo-aktive Bakterie. Er ähnelt dem Mikroorganismus Thermus aquations (Brock et al., J. Bacteriology, 9%_, 289—297); Degryse et al., Arch. Microbiology, 117, 18), doch besteht zwischen dem Thermus aquat-iaus und dem Thermus T-ZSl ein wesentlicher Unterschied in der Zusammensetzung des Cytochroms. Thermus T-ZSl zeigt optische Aktivität bei 70 bis 80 ⁰C und praktisch keine Aktivität unterhalb 40 ⁰C. Andere Eigenschaften dieses Mikroorganismus werden von H i c k e y und Daniel in J. General Microbiology, 114, 195-200 (1979) beschrieben. Eine Kulturprobe dieses Mikroorganismus ist bei der American Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, V. St. A., unter der ATCC-Nr. 31 674 hinterlegt worden.

Eine Kultur des Mikroorganismus Thermus T-ZSl wird zunächst einer Zentrifugierbehandlung unterworfen, wie in der US-Patentanmeldung Ser. No. 176 578 (08.08.1980) beschrieben, um die von den ganzen Zellen als überstehende Flüssigkeit abgesonderte Protease zu entfernen. Die ganzen Zellen werden wiedergewonnen und nach dem im folgen-

den Flxeßdiagramm veranschaulichten und in den Beispielen 1 und 2 eingehend beschriebenen Verfahren weiterbehandelt.

Fließdiagramm des Verfahrens zum Gewinnen und Reinigen von Asparagxnasen aus Thermus T-SSl

10

15

20

25 30 J!5

GANZE

ZELLEN

Zertrümmern mittels französischer Druckzelle in Gegenwart von 0,2 mg/ml DNSase

ZERTRi

RTE ZELLEN

ZELLTRUMMER

ATMUNGSTEILCHEN

D-ASPARAGINASE"

FRAKTIONEN

FRAKTIONEN (D-ASI'AUACLNASE)

Zentrifugieren mit niedriger
'rehzahl (10 000 g, 20 min)

ZELLFREIER ROHEXTRAKT

Zenti

irifugieren mit hoher Drehzahl (500 000 g, 120 min)

ZELLFREIER EXTRAKT

Dialyse, 12 h

DIALYSIERTER ZELLFREIER EXTRAKT

Ionenaus tausch-Chromato graphie mit QAE-A

IONENAUSTAUSCHFRAKTIONEN

I
.Prüfen.

-L-ASPARAGINASE

a) Entsalzen mit
Ultrafilter PM-IO

b) Hydroxyapatit-Chromatographie

Stufen-Elution mit 0,05- bis 0,5-m Phosphat

a) Konzentrieren mit Ultrafilter PM-10

b) Gel-Ausschlußchromatographie mit G-200

FRAKTIONEN

FRAKTIONEN (L-ASPARAGINASE)

Fließdiagramm des Verfahrens zum Herstellen und Reinigen von Asparaginase aus Thovmua T-351 (Fortsetzung)

FRAKTIONEN (D-ASPARAGINASE)

Ionenaustausch an QAE-A 50 Elution mit linearem Gradienten

VEREINIGTE AKTIVE GIPFELFRAKTIONEN

Chromatographie an selektivem Hydroxyapatit

VEREINIGTE AKTIVE FRAKTIONEN Celluloseacetat-Elektrophorese

+ physikalische Trennung

ENZYM + CELLULOSEACETAT

Zentrifugieren mit 10 000 g, 15 min

AKTIVE ÜBERSTEHENDE FLÜSSIGKEIT

Dialyse gegen Phosphatpuffer von abnehmender Konzentration

KRISTALLISIERTES ENZYM

3 χ Umkristallisieren

UMKRISTALLISIERTES ENZYM

Niederschlag verworfen

BEISPIEL 1

Isolierung und Trennung der Asparaginasen A. Herstellun2_zell£reier_Extrakte

120 g Zellkuchen aus ganzen Zellen von Thermus T-ZSl, der in flüssigem Stickstoff gelagert worden war, wurde aufgetaut und mit 0,5-m TRIS-HCl-Puffer (pH 8,2) plus 0,22-m NaCl-Lösung und 0,2 mg/ml DNSase unter Verwendung eines motorisch angetriebenen Gewebezerklexnerers zu einer

mäßig dicken Suspension aufgeschlämmt. Die ganzen Zellen wurden dann durch dreimalige Passage durch eine französiche Druckzelle bei 60 000 kPa (600 bar) zertrümmert. Zelltrümmer und nicht zertrümmerte Zellen wurden durch Zentrifugieren - 20 min mit 10 000 g - entfernt. Die bei diesem Zentrifugieren mit niedriger Drehzahl erhaltenen Zelltrümmer wurden noch einmal durch die französische Druckzelle gegeben und zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig mit einer Pipette abgehoben und in 1O-ml-Röhrchen eingeschlossen, die 2 h in einer

Ultrazentrifuge (MSE 75 Superspeed) mit 500 000 g ge-

^ schleudert wurden. Die oberen zwei Drittel der nach dem

Ultrazentrifugieren überstehenden Flüssigkeit wurde vorsichtig aus den Röhrchen entnommen, vereinigt und über Nacht in einem 1-cm-Dialyseschlauch gegen 0,05-m TRIS/ HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 8,2 dialysiert.

Die dialysierte Fraktion wurde auf eine Säule (15 cm χ 2,5 cm) aus "Sephadex QAF₄-ASO" (Pharmacia Fine Chemicals) gegeben, die mit 0,5-m TRIS/HCl-Puffer (pH 8,2) äquilibriert worden war. Die Probe wurde auf der Säule mit etwa 100 ml des zum Äquilibrieren benutzten Puffers gewaschen. Alle Flüssigkeiten wurden mit einer Schlauchpumpe (Pharmacia) mit einer Geschwindigkeit von 1—2 ml/min durch die Säule gepumpt. Sodann wurde NaCl- in der Gradientenabstufung 0,05-, 0,10-, 0,15-, 0,20-, 0,30-, 0,40- und 0,50-m in der gleichen Pufferlösung auf die Säule gegeben, wobei die jeweils folgende/ Konzentration erst nach der Rückkehr des Schreibers zur Grundlinie aufgebracht wurde. Das Eluat wurde bei 220 nm in einer Durchflußküvette von 1 cm Weglänge kontrolliert, die sich in einem Cecil-Spektrophotometer 272 befand, das an einen Omniscribe-Diagrammschreiber angeschlossen war. Mit Hilfe eines Fraktionensammlers ("Ultrorac", LKB, Modell 7000) wurden Fraktionen von 80 Tropfen in Röhrchen aufgefangen.

Durch diese Behandlung wurde eine Trennung der D-Asparaginase von der L-Asparaginase erzielt. Alle weiteren Behandlungen der L-Asparaginase wurden in Gegenwart von 1 mmol Mercaptoäthanol zum Stabilisieren des Enzyms ausgeführt.

Beide Enzyme wurden dann, wie nachstehend beschrieben, weiter gereinigt.

BEISPIEL 2

Reinigung der D- und L-Asparaginase A. lonenaustausch-^nd^dsorgtionschromatogra^hie^it

Durch die Ionenaustauschbehandlung im Verfahrensschritt B des Beispiels 1 wurden die beiden stereospezifischen Asparaginasen getrennt. Sie wurden dann einzeln in einer Ultrafiltrationszelle (Chem-Lab, Modell C 50) bei Raumtemperatur mit Hilfe eines Ultrafilters PM 10 (Amicron) entsalzt.

Die Eluate wurden auf zwei getrennte Hydroxyapatit-Säulen (Biorad Bio-Gel HTP) von 2,5 cm χ 15 cm gegeben, die nach Vorschrift des Herstellers gefüllt und mit 10 ml destilliertem Wasser sowie einem vollständigen umgekehrten Durchlauf des Phosphat-Stufengradienten äquilibriert worden waren. (Alle Lösungen wurden mit einer Zulaufhöhe von 1,5 m durch die Säulen laufen gelassen.) Die Säulen wurden dann mit Phosphatpuffer folgender molarer Konzentrationen eluiert: 0,005, 0,01, 0,02, 0,04, 0,08, 0,2 und 0,5. Der pH-Wert aller Pufferlösvmgen betrug 6,9.

Die Fraktionen aus den beiden Hydroxyapatit-Säulen wurden einzeln geprüft, gepoolt, entsalzt, gewaschen und mit

Hilfe eines ültrafliters PM 10 konzentriert, purch das Konzentrieren wurde das Volumen der Asparaginase enthal tenden Fraktionen auf 7—10 ml vermindert; sie wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und gefriergetrocknet. Später wurden sie mit 2,0 ml TRIS/HCl-Puffer (pH 8,2) rekonstituiert, und jede x^urde getrennt auf eine Säule aus "Scphadox G-200" (Pharmacia Fine Chemicals) von 2,5 cm χ 65 cm gegeben. Diese Säulen waren nach der Vorschrift des Herstellers unter Anwendung abwärts gerichteter Elution gefüllt worden. Standardsubstanzen gum

Eichen der Säulen waren: Blaudextran (MG 2-10 ), Cätalase (MG 2,48-10⁵), γ-Globulin (MG 1,69*1O⁴), Lipoxydase (MG 9,74·10⁴), Eialbumin (MG 4,35·10⁴), α-Chymotrypsin (MG 2,37-10⁴) und Cytochrom C (Pferdeherz) (MG 1,3·10⁴).

Von jeder Standardsubstanz wurden 5,0 mg in 2,0 ml EIutionspuffer aufgegeben.

BEISPIEL 3 Weitere Reinigung der D-Asparaginase

Nach der Gel-AusSchlußChromatographie bestand der nächste Verfahrensschritt darin, daß die gepoolten aktiven Fraktionen auf eine mit "Sephadex QAE-A 50" gefüllte Säule von 10 cm χ 2,5 cm aufgebracht wurden, die mit einer NaCl-Lösung mit linearer Gradientenabstufung von 0,1-m

25 bis 0,2-m, diesmal mit pH 7,0, eluiert wurde.

Bei diesem Extraktionsverfahren wurde die gleiche Hydroxyapatit-Säule wie zuvor verwendet. Das Verfahren beruht auf einer Anpassungsänderung, die spezifisch bei Asparaginase-Enzymen durch den Zusatz eines Produktes der Enzymreaktion, in diesem Falle Ammoniak, hervorgerufen wird. Dieses wird den 0,05-m und 0,2-m Phosphatpuffern in der Reihe des zugeführten linearen Gradienten zugesetzt.

0,1 mmol (NH.) 9^S04 ^wur<3-^e einer Gesamtmenge von 500 ml Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2 zugesetzt, und die Chromatographie wurde in der oben beschriebenen Weise ausgeführt.

5 C. Celluloseacetat-Elektroghorese

Die Celluloseacetat-Elektrophorese wurde sowohl zum Prüfen der Reinheit als auch als präparative Methode angewendet. Titan(III)-celluloseacetat-Platten wurden in Helena-HR-Puffer (pH 8,0) eingeweicht und nach dem Abtrocknen mit Fließpapier mit Hilfe eines Perspex-Proben- f.^ auf geber s in der Mitte mit einem Eindruck versehen. In

die so hergestellten Vertiefungen wurden Proben der Enzymlösung — 2—10 μΐ — eingefüllt. Durch die Platten wurde 60 min ein Strom von 450 V und 6 mA geleitet; dann wurden die Platten 4 min in Ponceau-S-Lösung gefärbt und anschließend 30 min in 5%iger Essigsäure unter mehrfachem Wechsel entfärbt. Das Verfahren wurde bei pH 6,5 und 4,5 wiederholt, um die Homogenität der Proteinbanden zu bestimmen.

Der vorletzte Trennungsschritt ergab zwei ausgeprägte

Banden, und eine Abwandlung des vorstehend beschriebenen

Verfahrens wurde zur Gewinnung eines reinen Endproduktes (^J$ benutzt.

In der Mitte einer 51 mm χ 51 mm großen Platte wurde eine durchgehende Vertiefung hergestellt, die etwa 5 mm vor den beiden Kanten endete. In die Vertiefungen von vier solcher Platten wurde eine konzentrierte Enzymprobe (bereitet durch Zusatz von 200 μΐ Puffer zu gefriergetrocknetem Enzym) eingebracht. Diese Proben wurden 60 min der Elektrophorese unterworfen; danach wurden die Kantenteile jeder Platte an beiden Seiten abgeschnitten und gefärbt, um die beiden Proteinbanden.-zu lokalisieren. Nach sorgfältigem Messen wurden mit einer Rasierklinge 0,5 bis 0,75 mm breite parallele Streifen aus den proteinhaltigen Bereichen geschnitten. Nach einer Vorinkubation von

■λ/- j^:-;-·:;;: ; 31158ο9

0,04 mol Asparagin mit dem von dem Kunststoffuntergrund abgelösten Celluloseacetat, mazeriert in 200 μΐ TRIS/HC1-Puffer, wurden Flecken von jeder Probe auf Chromatographiepapier Whatman Nr. 1 aufgetragen. Die absteigenden Chromatogramme wurden mit einem Phenol-Wasser-Gemisch (80:20) entwickelt und mit Ninhydrin besprüht, das die Lokalisation des aktiven Enzyms durch das Auftreten von Asparaginsäure, dem Reaktionsprodukt, anzeigt. Die das aktive Enzym enthaltenden Cellulosestreifen wurden vereinigt, vom Untergrund abgelöst und über Nacht in dem TRIS/HCl-Puffer mazeriert.

D. Kristallisation

Die das Enzym enthaltende Fraktion aus der vorstehend beschriebenen Verfahrensstufe wurde 10 min mit 10 000 g zentrifugiert, um unlösliche Celluloseteilchen in dem Niederschlag zu entfernen. Die überstehende Flüssigkeit wurde sorgfältig in einen 5-mm-Dialyseschlauch gefüllt und 24 h gegen TRIS/HCl-Puffer von abnehmender Konzentration bis hin zu destilliertem Wasser dialysiert. Die Lösung aus dem Dialyseschlauch wurde in ein Mikrobecherglas übergeführt und unter ständigem Rühren tropfenweise mit Äthanol bis zur beginnenden Trübung versetzt (etwa 1/3 des Volumens Äthanol). Das Gemisch wurde über Nacht bei 4 ⁰C stehengelassen. Es bildeten sich Kristalle, die mit 50%-igem Äthanol gewaschen und in destilliertem Wasser gelöst wurden. Unter ständigem Rühren wurde bei Raumtemperatur erneut tropfenweise Äthanol bis zur beginnenden Trübung zugesetzt. Die Lösung wurde durch 15 min Zentrifugieren mit 10 000 g geklärt. Beim Stehen der überstehenden Flüs-Hiijkoit über Nacht schieden sich Kristalle ab, die durch Zentrifugieren von der Lösung abgetrennt, mehrmals mit 502XgGm Äthanol gewaschen und im Vakuum getrocknet wurde. Die Umkristallisation wurde dreimal wiederholt. Zur Kontrolle wurde das gesamte Verfahren mit dem Celluloseacetat wiederholt, das kein Protein enthielt. Hierbei wurden keine Kristalle erhalten, während die D-Asparaginase-Kri-

stalle nach dem Lösen in kleinen Mengen Pufferlösung eine gute Aktivität zeigten.

Die Eigenschaften der Asparaginase-Enzyme gemäß der Erfindung und — zum Vergleich — der aus Esoherioh-La aoli (B) erhaltenen L-Asparaginase sind in Tabelle 1 wiedergegeben.

Tabelle 1; Eigenschaften von Asparaginasen

Eigenschaft	L-Asparaginase Thermus T-Z51	D-Asparaginase Ihevmus T-SbI	L-Asparaginase E. aoU (B)
Mo lekulargewicht	80 000	62 000	141 000
Untereinheiten — Anzahl — Molekulargewicht	4 20 000	2 30 000	2 70 000 und 35 000
Isoelektrischer Punkt	4,6	4,8	4,75
pH-Optimum	9,5	9,5	7,5 :
Sulfhydril-Enzym	Ja*	Nein	Nein !
Spezifität K	Nur für L-Asparagin	Nur für D-Asparagin 20.10~³-m	L-Asparagin 100 D-Asparagin 5 L-Glutamin 9 D-Glutamin 0,92 ' 4 · 10 -m tt»

Inhibitoren·

zunehmende Ionenstärke

p-CMB

Acetamid

Andere

* 6 Disulfidbindungen

Verlust der Aktivität mit zunehmender Konzentration (47% Verlust bei 0,1-m NaCl)

100% Aktivitätsverlust Kein Aktivitätsverlust

Verlust der Aktivität mit zunehmender Konzentration (wie L-Asparaginase)

Kein Aktivitätsverlust 100% Aktivitätsverlust

D- und L-Serin D- und L-Histidin a-Ketosäuren

Verlust der Aktivität
nur bei hohen Konzentrationen (4-m)

Kein Aktivitätsverlust
Kein Aktivitäts.verlust

Tabelle 1: Eigenschaften von Asparaginasen (Fortsetzung)

Eigenschaft
Enzymlokalisation

Beständigkeit gegen

Proteolyse:

Trypsin 50 mg/ml
Chymotrypsin 50 mg/ml
Caldolysin 29 mg/ml

L-Asparaginase Thermus T-3S1

D-Asparaginase Thermus T-Z51 L-Asparaginase E. ooli (B)

Cytoplasmisch

Periplasmischer Bereich

Verlust bis zu 1% der ursprünglichen Aktivität erst nach 30 min Inkubation in jedem Falle

Kälteempfindlichkeit	Irreversibler	8%	Verlust	Völlig beständig: d.h
(25 ug/ml Enzym)	der Aktivität	10%	nach	kein Aktivitätsverlust
bei 0-4 ⁰C	12 h	12%		nach 30 Tagen
Haltbarkeit
Aktivitätsverlust
nach: 2 h		7%
12 h		9%
bei 75 ⁰C 24 h		13%

Gefundene Aminosäuren
an den aktiven Stellen

kein

Histidin + Lysin Arginin Tyrosin

__Serin _ Cytoplasmisch

Verlust von 95—100% der ursprünglichen Aktivität nach 10 min in jedem Falle

Irreversibler Aktivitätsverlust (100%) nach 4 Tagen

100% 100% 100%

Valin, Glycin, Alanin, Methionin, Arginin, Prolin, Serin, Threonin

BEISPIEL 4 Verfahren zur Reinheitsprüfung

Nach dem Verfahren von Weber und Osborn [J. Biol. ehem., 244, 4406-4412 (1969)] wurde in einem Shandon-Disc-Elektrophorese-Gerät eine Natriumdodecylsulfat-(NDS)-Polyacrylamidgel-Elektrophorese ausgeführt. Gele mit 7,5 und 3,75% Acrylamid wurden in Röhrchen von 10,4 cm Länge und 0,5 mm Innendurchmesser verwendet, und es wurde mit einem Strom von 8 mA gearbeitet. Die Stromzuführung wurde unterbrochen, sobald die Bromphenolblau-Front sich 1 cm vor dem Gel-Ende befand. Die Farbstoffstellen wurden markiert? dann wurde mit einer Injektionsnadel Ausziehtusche in das Gel eingespritzt. Zum Eichen der Gele wurden folgende Standardsubstanzen verwendet:

Lysozym (MG 14,3-10 ), Trypsinogen (MG 24,0-10 ), Pepsin (MG 34,7-10 ), Eialbumin (MG 45,0-10³) und bovines Serumalbumin (MG 66,0-10 ). Die R_f-Werte wurden mit einem Densitometer und einer Schieblehre bestimmt. Die Gele wurden mit Coomassie-Brillantblau gefärbt und in einem ständig gerührten, mehrmals gewechselten Methanol-Essigsäure-Wasser-Gemisch (20:1:20) entfärbt. Die (gereinigten) D-Asparaginase-Lösungen wurden mit Hilfe eines Ultrafilters PM 10 vierfach konzentriert und mit einer 1%igen NDS-Lö-

25 sung über Nacht bei 37 ⁰C inkubiert.

Die Wanderungsgeschwindigkeit (Mobilität) R^ wurde nach folgender Formel berechnet:

_ Strecke der Proteinwanderung f ~ Strecke der Farbstoffwanderung

30 B. Isoelektrischesfokussieren

Die gereinigten Enzyme wurden — falls notwendig — konzentriert und auf einer Platte aus ctAmpholine PAG" mit pH-Worten von 3,5 bis 9,5 (LKB, Stockholm, Schweden) aufge-

tragen. Von den Enzymen wurden etwa 10 bis 30 μΐ auf die von dem Hersteller gelieferten Auftragsstreifen aufgebracht. Die Platten wurden in einem Flachbett-Gerät FBE 3000 (Pharmacia) mit Netzgerät ISCO 949 weiterbehandelt. Die Anfangs spannung betrug 450 V, die Stromstärke 25 niA. Die Spannung wurde gegen Ende der Behandlung auf 510 V erhöht, die Stromstärke fiel auf 13 mA ab. Gefärbte Proteine, wie Cytochrom C und Hämoglobin, wurden bei jedem Versuch mitgeführt, um Ausmaß und Vollständigkeit der Fokussierung visuell festzustellen. Nach Beendigung des Versuchs wurde der pH-Gradient über der Platte mit Hilfe einer Oberflächenelektrode bestimmt und graphisch aufgezeichnet. Das Gel wurde 1 h in einer Trichloressigsäure-Sulfosalicylsäure-Lösung fixiert, danach 5 min entfärbt und 10 min in einer Coomassieblau-R-250-Lösung gefärbt. Die endgültige Entfärbung wurde 5 h in einem Äthanol-Essigsäure-Wasser-Gemisch (5:2:13) bei 55 ⁰C vorgenommen. Die Aktivität der Asparaginase in teilweise gereinigten Enzymlösungen wurde nach folgenden zwei Methoden be-

20 stimmt:

1. Gel-Duplikate wurden in kleine Stücke geschnitten. Jedes Stück wurde nach dem Zerkleinern mit einem Rührstab 10 h in einer kleinen Menge (1—2 ml) Boratpuffer (pH 9,2) mazeriert und dann einer normalen Prüfung un-

25 terworfen.

2. Die Lokalisierung wurde nach der Agar-Gel-Methode von P a d j a c k und P a d j a c k [Analyt. Biochem. , 50 , 317—320 (1972)] geprüft. Bei dieser empfindlichen und einfachen Methode wird ein Agar-Gel beschichtet, in dem Natriumtetraphenyloborat Na [B(CgH₅)₄] eingeschlossen ist. Dieses bildet mit NH₄ -Ionen einen unlöslichen weißen Komplex.

Die Polyacrylamid-Disc-Elektrophorese wurde zum Bestimmen der Endreinheit und auch als präparatives Verfahren benutzt, jedoch sollten Kristalle nach diesem Verfahren nicht hergestellt werden- Es wurde nach der Methode von Davis [Ann. N.Y. Acad. Sei., 121 , 404-427 (1964)] gearbeitet. Die Versuche wurden 1—2 h bei pH 9,0 mit Trenn-Gelen ausgeführt, die 4,5 oder 7,5% Acrylamid enthielten. Die Stromstärke je Röhrchen betrug 2,5 inA. Die Gele wurden in einer 1%igen Coomassieblau-Lösung, 1:20 mit 12,5-prozentiger Trichloressigsäure verdünnt, 1 h gefärbt und f nach Chrambach et al. [Analyt. Biochem., 2J^, 150

(1967)] in 10%iger Trichloressigsäure aufbewahrt. Für präparative Trennungen mit 0,2 mg Protein je Gel wurde ein repräsentatives Gel zum Lokalisieren von Banden gefärbt, während andere Gele zum Lokalisieren von Proteinbanden unter ultraviolettem Licht betrachtet wurden. Die Proteinbanden wurden dann einzeln abgetrennt. Die zerkleinerten Gele wurden mit TRIS/HCl-Puffer mazeriert und

20 zum Abtrennen von Gel-Teilchen dialysiert.

Die Reinheit der D-Asparaginase in den verschiedenen Stufen des in dem Fließdiagramm veranschaulichten Verfahrens sind in nachstehender Tabelle 2 angegeben.

Tabelle 2: Reinheit der D-Asparaginaso
(Kombinierte Daten von 4 Versuchen)

Gesamt- Gesamt- Spez. ReI.

Protein aktivität Aktivität Reini-

(mg) (Einheiten)* (Einheiten/mg) gung Ausbeute

2,4 - 100

14,1 5,88 53 3. Hydroxyapatit-

abgestuftem

40 16,67 35

170 70,83 30

1. Rohextrakt aus der Zentrifu- gation mit ho her Drehzahl	5000	12	000
2. Ionenaustauüch- Chromatographic mit QAE-A 50	450,70	6	360
3. Hydroxyapatit- Chromatographie u. Elution mit abgestuftem Gradienten	105,0	4	200
4. Gel-Ausschluß- Ghromatographie mit "Sephadex G-200"	21,2	3	600
5- Hydroxyapatit- Chromatographie u. Elution mit linearem Gra dienten	10,5	2	520
6. Ionenaustausch- Chromatographio	6,90	1	920
7. Celluloseacetat- Elektrophorese	3,87	1	200
8. Kristallisation	1,89		720

240 280

310 380

100,00	21
116,67	16
129,17	10
153,33	6

* 1 Aktivitätseinheit entspricht der Menge des Enzyms, die unter den Versuchsbedingungen in 30 min 1 mmol NH, -Ionen erzeugt.

- 20 BEISPIEL 5 Verfahren zur Enzymimmobilisation

A. Covalente_Anlagerung

Die Asparaginase-Enzyme wurden nach dem Verfahren von Colowick und Kaplan [Methods in Enzymology, Band XLIV, Immobilised Enzymes, hrsgg. von K. Mosbatch, Academic Press, N.Y., (1976)] an Bromcyan-Sepharose (Pharmacia) angelagert.

f ^B ·

Die Asparaginase-Enzyme wurden nach folgender Methode an

"Sephadex QAE-A 50" (Pharmacia) adsorbiert:

a) Die bei den Standardversuchen verwendeten Enzymlösungen wurden durch Filtration durch ein Membranfilter PM 10 (Amicon) auf das Vierfache konzentriert.

b) Die konzentrierten Enzymlösungen wurden einem vorgequollenen Gel zugesetzt, dessen Menge nach Angaben des Herstellers so berechnet worden war, daß es in einem Überschuß von 50% über seiner Sättigungsmenge vorhanden war.

c) Das Gel wurde 30 min bei Raumtemperatur sanft geschüttelt, danach 10 min mit 10 000 g zentrifugiert und wieder in TRIS/HCl-Puffer (pH 8,5) suspendiert. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt, um alles nichtadsorbierte Enzym zu entfernen.

d) Nach Inkubation mit dem Substrat wurde eine Menge des enzymhaltigen Gels mit mehrmals gewechseltem Puffer gewaschen und wieder geprüft, um die bleibende Adsorption des Enzyms festzustellen.

Claims

Patentansprüche

1. D-Asparaginase mit einem Molekulargewicht von im wesentlichen 62 000, zwei Untereinheiten mit Molekulargewichten von jeweils etwa 30 000, einem isoelektrisehen Punkt von 4,8, einem optimalem pH-Wert von 9,5 und einem-K von 20· 10 ³-m.

2. D-Asparaginase nach Anspruch 1, gewonnen aus Thermus T-351, ATCC-Nr. 31 674.

3. L-Asparaginase mit einem Molekulargewicht von im wesentlichen 80 000, vier Untereinheiten mit Molekulargewichten von jeweils etwa 20 000, einem isoelektrischen Punkt von 4,6 und einem optimalen pH-Wert von
9,5.

4. L-Asparaginase nach Anspruch 3, gewonnen aus Thermus T-351, ATCC-Nr. 31 674.

5. Verfahren zum Herstellen von D-Asparaginase und L-Asparaginase nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man
ganze Zellen von Thermus T-351 einer Zellzertrümmerung unterwirft, aus dem bei der Zellzertrümmerung erhaltenen Gemisch eine asparaginasereiche Fraktion von den Zelltrümmern abtrennt, diese asparaginase Fraktion kon zentriert und reinigt und dann aus der asparaginasereichen Fraktion D-Asparaginase sowie L-Asparaginase

25 abtrennt.

35 101
ü/ -

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß man die ZeilZertrümmerung durch Druckzertrümmerung und/oder Beschallung herbeiführt.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet , daß man die asparaginasereiche Fraktion von den Zelltrümmern durch Zentrifugieren abtrennt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch g e -

kennzeichnet, daß man das Zentrifugieren zuerst mit niedriger Drehzahl ausführt und dann die überstehende Flüssigkeit aus dieser Zentrifugierbehandlung mit hoher- Drehzahl zentrifugiert.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man die D-Asparaginase und die von der D-Asparaginase abgetrennte L-Asparaginase einer weiteren Reinigung und Konzentrierung durch Dialyse- und Ionenaustauschbehandlungen. Ultrafiltration und Umkristallisation unterwirft.