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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf Mikrobenmonitoring und, insbesondere,
auf ein Verfahren und einen Apparat zum Mikrobenmonitoring, die
vor Ort verwendet werden können.
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Die
quantitative und qualitative Bestimmung der Anzahl lebensfähiger Mikroorganismen,
wie z.B. Bakterien, in Proben (wie z.B. Flüssigkeiten), die anfällig für den Verderb
oder die Verunreinigung durch Mikroben sind, wurde konventionell
durchgeführt,
indem in der Probe vorhandene Mikroorganismen stimuliert wurden,
sich in oder auf einem geeigneten Nährmedium, wie z.B. Nähragar oder Ähnlichem,
zu reproduzieren, wobei sich jeder einzelne lebensfähige mikrobielle
Partikel reproduziert und eine entsprechende sichtbare Kolonie in
oder auf dem Nährmedium
bildet.
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Das
Nährmedium
wird mit der zu prüfenden Probe
beimpft, meistens mit einem Standardplattierungsverfahren, bei welchem
eine flüssige
oder feste Probe auf die Oberfläche
des Nährmediums
gestrichen oder das Nährmedium
auf eine Testoberfläche, bei
welcher eine Verunreinigung durch Mikroorganismen angenommen wird,
gedrückt
wird; bei einem ähnlichen
Verfahren wird ein kleines mit Nährmedium beschichtetes
Paddel in eine flüssige
Probe getaucht und das Paddel abtropfen gelassen. Bei Inkubation bilden
sich in dem Nährmedium
sichtbare Kolonien, die nach einer bestimmten Inkubationszeit (z.B.
ein bis fünf
Tage) überwacht
werden können
und eine Zählung
oder Schätzung
der Kolonienanzahl erlauben. Diese Zählung oder Schätzung lässt auf
die Anzahl lebensfähiger
mikrobieller Partikel in der Orignalprobe schließen. Das soeben beschriebene
Verfahren erfordert weitgehend sterile Bedingungen, um die Verunreinigung
der Probe mit Mikroorganismen, die nicht aus der zu testenden Probe
stammen, zu vermeiden. Das beschriebene Plattierungsverfahren ist
im Allgemeinen auf die Verwendung im Labor beschränkt. Das
Verfahren mit dem Paddel ist nicht streng quantitativ, ist relativ
langsam und nur zur Überwachung
von Proben geeignet, die eine relativ hohe mikrobielle Verunreinigung
aufweisen, da nur kleine Proben auf die Oberfläche des Nährmediums aufgetragen werden
können.
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Ein
weiteres bekanntes Verfahren umfasst die Beimpfung eines Nährmediums
(z.B. Nähragar), das
durch Erhitzen verflüssigt
(geschmolzen) wird, und dann geschüttelt wird, um die Probe im
Medium zu verteilen, und dann abgekühlt wird, um ein weitgehend
festes Gel zu ergeben. In der Probe vorhandene Mikroorganismen werden
dadurch im Nährmedium
verteilt und können
dann inkubiert werden, um in Kolonien heranzuwachsen, die dann ähnlich wie oben
für das
Plattierungsverfahren beschrieben überwacht werden können.
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Das
eben beschriebene Verfahren ist für die Überwachung größerer Proben
geeignet (normalerweise kann 1 ml Probe in 15 ml schmelzflüssigen Agar
in einer Petrischale eingeführt
werden) und für Proben
mit relativ geringer mikrobieller Verunreinigung. Allerdings hat
dieses Verfahren den Nachteil, dass die Mikroorganismen in der Probe
einem Schock ausgesetzt werden, wenn sie mit dem geschmolzenen Nährmedium,
normalerweise bei ca. 50 °C,
in Kontakt kommen; das kann die Reproduktion und somit die Entwicklung
von Mikrobenkolonien im Nährmedium
wesentlich hemmen. Außerdem
ist dieses Verfahren nicht für
Tests vor Ort (zum Beispiel an einer Fertigungslinie für Lebensmittel,
in einem Kraftstoffbehälter
oder im Laderaum eines Schiffes oder Ähnlichem) geeignet, da dafür schmelzflüssiges Nährmedium
notwendig ist und somit die Verwendung meist auf das Labor beschränkt ist.
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Der
Zweck der vorliegenden Erfindung ist daher, derartige Schwierigkeiten
zu vermindern und ein Verfahren und einen Apparat zum Monitoring
von Mikroorganismen zu schaffen, ein Verfahren und einen Apparat,
die sowohl für
Tests von Proben vor Ort als auch im Labor verwendet werden können und
die schnell und einfach zu verwenden sind.
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Gemäß eines
ersten Aspekts der Erfindung wird ein Verfahren zum Monitoring von
Mikroorganismen in einer Probe geschalten, wobei diese Methode umfasst:
Das Einführen
der Probe in einen verschließbaren
Behälter
zusammen mit einem zur Vermehrung von Mikroorganismen geeigneten
Nährmediumgel,
Schütteln
des Behälters
zum Verflüssigen des
Gels und zum weitgehenden Verteilen der Mikroorganismen der Probe
im Gelmedium, Setzenlassen des Gelmediums im Behälter, Inkubieren des Mediums
und Monitoring des Wachstums und/oder der Aktivität von Mikroorganismen
in dem Gelmedium, dadurch gekennzeichnet, dass das Gelmedium thixotrop
oder pseudoplastisch ist; wodurch Schütteln zu seiner Verflüssigung
führt.
Die Inkubation erfolgt bei einer für die Mikroorganismen geeigneten
Temperatur.
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Ein
vorteilhaftes Merkmal der vorliegenden Erfindung ist, dass die Mikroorganismen
im Gelmedium durch einfaches Schütteln
leicht verteilt werden können
und sich dann, aufgrund der thixotropen oder pseudoplastischen Beschaffenheit
des Mediums, in einer festen räumlichen
Verteilung befinden, sobald sich das Gel gesetzt hat.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
erfordert keinen schmelzflüssigen
Agar oder Ähnliches
und ist besonders für
Tests vor Ort geeignet, da die Probe so einfach im Gelmedium verteilt
und anschließend überwacht
werden kann.
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Gemäß eines
zweiten Aspekts der Erfindung wird ein Apparat zum Monitoring des
Wachstums von Mikroorganismen geschaffen, wobei dieser Apparat einen
verschließbaren
Behälter
mit einem Nährmediumgel
zum Vermehren der darin befindlichen Mikroorganismen aufweist, dadurch
gekennzeichnet, dass das Gelmedium ein thixotropes oder pseudoplastisches
Gel oder ein Material, das ein thixotropes oder pseudoplastisches
Gel bilden kann, aufweist.
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Das
Gelmedium kann ein wasserhaltiges Medium sein, das ein oder mehrere
thixotrope oder pseudoplastische Mittel oder beides enthält. Beispiele
für geeignete
thixotrope oder pseudoplastische Mittel umfassen Folgendes:
Naturgummis,
gewonnen z.B. aus Exsudaten oder Extrakten von Pflanzen, Tieren
oder Mikroorganismen, wie z.B. Tragant, Guar, Gummi arabicum, Carrageenan,
Stärke,
Dextrinen, Algin, Pektin, Stärke, Ghatti,
Johannisbrot, Johannisbrotbaum, Tara, Aloe.Chia, Leinsamen, Quittensamen,
Psylliumsamen, Tamarinde, Maisfasern, Karaya, Chitin, Gelatine und
Xanthan. Die thixotropen oder pseudoplastischen Mittel können ebenfalls
halbsynthetische Polymere wie z.B. Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose,
Hydroxypropylcellulose, Ethylcellulose, Hydroxymethylcellulose,
Hydroxyalkylcellulose oder Alginate sein. Auch synthetisches Gelmaterial
wie Polyethylenoxid-Polymere und Silicagele kann als thixotropes
oder pseudoplastisches Mittel verwendet werden. Das thixotrope oder
pseudoplastische Mittel kann in einer weitgehend wasserfreien Form
geschaffen werden und durch Hinzufügen von Wasser vor der erfindungsgemäßen Verwendung
wieder in Gelform gebracht werden.
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Das
so entstandene Gelmedium ist vorzugsweise transparent oder transluzent
für sichtbares Licht,
um eine optische Überwachung
zuzulassen.
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Vorzugsweise
enthält
das Gelmedium des erfindungsgemäßen Verfahrens
und Apparats einen Indikator für
mikrobiellen Stoffwechsel, wobei ein solcher Indikator vorzugsweise
auf Mikrobenzellen oder -kolonien im Medium reagiert und eine Farbe
erzeugt, die leicht von der normalen Farbe des Gels zu unterscheiden
ist. Der Indikator kann zum Beispiel ein Tetrazoliumsalz, einen
chemischen Indikator für mikrobielle
Atmung, der seine Farbe in der Anwesenheit von lebensfähigen Mikroorganismen
von farblos zu blau/rot/violett ändert,
oder eine fluoreszierende Verbindung aufweisen. Weitere Indikatoren
können zusätzlich oder
alternativ verwendet werden, zum Beispiel zum Nachweis von mikrobiellen
Produkten der Atmung oder des Stoffwechsels, Enzymen, Sulfiden,
Säuren
und/oder Alkalien. Weitere Chemikalien können beigefügt werden, um die Leistung
der Indikatoren zu verbessern, zum Beispiel Elektronenkoppler wie
Menadion.
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Indikatoren
für Mikrobenaktivität können vorteilhafterweise
derartige Aktivitäten
schnell anzeigen, selbst innerhalb 10 bis 20 Minuten Inkubation.
Das erfindungsgemäße Verfahren
lässt sich
somit verwenden, um entweder qualitativ oder quantitativ die Anzahl
an Mikroorganismen in der Probe anzuzeigen.
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Wenn
eine erfindungsgemäß zu untersuchende
Probe stark mit Mikroorganismen verunreinigt und/oder die Inkubation
bereits weit fortgeschritten ist, können sich die Kolonien im Gelmedium
stark überlagern,
sodass es unter Umständen
nicht möglich
ist, die entstandenen Kolonien zu zählen. Das erfindungsgemäße Verfahren
ermöglicht
jedoch eine quantitative Anzeige der Anzahl an Mikroorganismen in
einer stark verunreinigten Probe, da die Intensität des Farbwechsels
der Kolonien im Gelmedium einen Maßstab für den mikrobiellen Verunreinigungs grad liefern
kann (zum Beispiel kann die Intensität der wahrnehmbaren Farbe des
Gelmediums zunehmen, wenn die Anzahl an Mikroorganismen höher als
1000 pro ml ist). Die Intensität
des Farbwechsels in dem Gelmedium durch das Wachstum der Kolonien
kann mit Eichstandards verglichen werden, um einen Hinweis auf die
Anzahl von vorhandenen Mikroorganismen zu liefern.
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Das
Gelmedium kann vorteilhafterweise bestimmte Chemikalien enthalten,
die das Wachstum bestimmter Gruppen von Mikroorganismen weitgehend
hemmen, oder Nährstoffe,
die selektiv bei anderen das Wachstum fördern. Ebenso können verschiedene
Nährstoffe
oder Chemikalien in das Gel gemischt werden, um so das selektive
Wachstum von Mikroorganismen mit bestimmten Merkmalen zu ermöglichen,
zum Beispiel Mikroorganismen mit der Fähigkeit Kohlenwasserstoff zu
metabolisieren oder Mikroben, die Schwefelverbindungen reduzieren können.
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Der
verschließbare
Behälter
mit dem Gelmedium kann eine transparente Phiole oder Ähnliches sein.
Der Behälter
kann zum Beispiel einen Schraubverschluss haben. Nach Verflüssigen des
Gels mit der Probe durch Schütteln
kann das Festwerden in verschiedenen Formen geschehen, zum Beispiel
als dickschichtiges Gel oder als dünner Film. Die Form des festen
Gels kann gemäß den bevorzugten Wachstumsbedingungen
der zu überwachenden
Mikroorganismen gewählt
werden.
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Die
Probe kann direkt im Behälter
dem Gelmedium beigemischt werden, wenn die Probe zum Beispiel eine
wasserhaltige Flüssigkeit
ist. Alternativ kann die Probe auch vorbehandelt werden und dann im
Behälter
dem Gelmedium beigemischt werden.
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Wenn
die Probe aus einer nicht auf Wasser basierenden Flüssigkeit
gewonnen wurde, wie z.B. einem Öl
oder Ähnlichem,
kann die Probe direkt im Behälter
dem Gelmedium beigemischt werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße Verfahren
außerdem
einen Vorbehandlungsschritt aufweisen, der zum Beispiel das Beimischen
der Flüssigkeit
zu einer wasserhaltigen Flüssigkeit
aufweist, wodurch die Mikroorganismen vorteilhafterweise in die
wasserhaltige Flüssigkeit übergehen,
sobald das Öl
eine separate, von der wasserhaltigen Flüssigkeit getrennte Phase bildet.
Die wasserhaltige Flüssigkeit,
die jetzt die Mikroorganismen enthält, kann dann zur Inkubation und Überwachung
des Mikrobenwachstums dem Gelmedium im Behälter beigemischt werden. Ebenso kann,
wenn die Probe ein Stück
Lebensmittel oder Ähnliches
enthält,
die Probe dem Gelmedium direkt beigefügt oder alternativ zerbrochen
oder in einer wasserhaltigen Flüssigkeit
aufgelöst
werden.
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Die
Probe kann darüber
hinaus unter Verwendung eines Tupfers, wie zum Beispiel eines Watte-
oder Alginattupfers, gewonnen werden.
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Das
erfindungsgemäße Verfahren
ist vielseitig und kann für
eine große
Anzahl von Anwendungen benutzt werden, bei denen eine Anzeige der
Mikrobenaktivität
notwendig ist, besonders für
die Untersuchung von mikrobiellen Verunreinigungen vor Ort. Derartige
Anwendungen umfassen Folgendes:
- a) zum Testen
der mikrobiellen Verunreinigung von, zum Beispiel, Metallbearbeitungsmitteln, Brauchwasser,
Brennstoff und anderen in der Industrie verwendeten Flüssigkeiten;
- b) in der Lebensmittelindustrie und Getränkeherstellung, an Fertigungslinien
für Lebensmittel,
bei denen es notwendig ist, Prozessflüssigkeiten auf nahrungsmittelübertragene
Pathogene und den Verderb durch Mikroorganismen zu testen, auf Geräten und
Endprodukten;
- c) bei der Herstellung von Trinkwasser und abgefülltem Wasser;
- d) bei medizinischen Anwendungen, zum Beispiel bei Tests auf
bestimmte Mikroorganismen, wie zum Beispiel Pseudomonas-Stämme in Krankenhäusern (Mikroorganismen,
die für
viele Krankenhausinfektionen verantwortlich sind).
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Die
Erfindung lässt
sich mit folgenden Beispielen für
Ausführungsformen
besser verdeutlichen, die hier nur als Beispiel und unter Bezugnahme
auf die beigefügten
Zeichnungen gegeben werden:
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1 illustriert
einen Glasbehälter
von ca. 100 × 15
mm mit einem pseudoplastischen Gelmedium und einem Indikator für mikrobielle
Atmung, vor der Beimischung einer Probe;
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2 zeigt
den Behälter
aus 1 mit einer 1-ml-Probe, in der Bakterien verteilt
sind, nach dem Schütteln
und Setzenlassen des Gels im vertikal gelagerten Behälter;
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3a illustriert
eine mögliche
Anzahl von Ergebnissen nach einer zehnminütigen Inkubationszeit;
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3b illustriert
eine mögliche
Anzahl von Ergebnissen nach einer 24-stündigen Inkubationszeit;
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4 illustriert
einen Glasbehälter
von 85 × 25
mm mit einem pseudoplastischen Gelmedium und einem Indikator für mikrobielle
Atmung, vor Beimischung einer Probe;
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5 illustriert
den Behälter
aus 4 mit einer Probe, in der Bakterien verteilt sind,
nach dem Schütteln
und Setzenlassen des Gels als horizontalen Film;
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6 illustriert
eine mögliche
Anzahl von Ergebnissen nach einer 24-stündigen Inkubationszeit, bei
horizontal gelagerten Behältern
von oben betrachtet;
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Beispiel 1
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Eine
1-m-Probe mit Bakterien wurde in das Gelmedium im Glasbehälter aus 1 eingeführt. Die
in das Gelmedium eingeführten
Nährstoffe
sind Verdaue von Casein und Fleisch und Natriumsuccinat. Das Geliermittel
ist Xanthan und der Indikator für Mikrobenaktivität P.iodo.nitro.tetrazolium
violet. Natriumchlorid wird zur Regulierung des osmotischen Drucks
eingeführt.
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Nach
einer Inkubation von 10 Minuten wurde die rot/violette Färbung, deren
Intensität
sich bei Proben mit mehr als ca. 1000 Mikroorganismen pro ml, wie
in 3a gezeigt, unterscheidet, mit Eichstandards verglichen,
um semiquantitativ die Anzahl lebensfähiger Mikroben zu bestimmen,
vorausgesetzt, deren Anzahl ist groß.
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Nach
einer Inkubation von 24 Stunden wurde eine rot/violette Färbung, deren
Intensität
sich bei Proben mit mehr als ca. 1000 Mikroorganismen pro ml, wie
in 3b gezeigt, unterscheidet, mit Eichstandards verglichen,
um semiquantitativ die Anzahl lebensfähiger Mikroben zu bestimmen.
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Bei
Proben mit 1 bis 1000 Mikroorganismen pro ml ergibt sich ein fleckiges
Aussehen. Die Anzahl von Flecken (Kolonien) kann gezählt oder
geschätzt werden
und daraus die Anzahl der ursprünglich
in der Probe vorhandenen Mikroorganismen abgeleitet werden.
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Die
Verwendung einer Probenteilmenge von 0,01 ml, 0,1 ml oder 1 ml oder
zehnfacher Verdünnungen
würde die
Eichung um eine Größenordnung verändern; d.h.
Farbänderungen
oder die Zählungen oder
Schätzungen
von mikrobiellen Kolonien würden sich
auf 0,01 ml, 0,1 ml bzw. 1 ml beziehen.
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Große Mengen
von Mikroorganismen in einer Probe ergeben sich vereinigende oder überlagernde
Kolonien (3b); dies kann, wenn gewünscht, durch
Verdünnen
der Probe mit einer sterilen wasserhaltigen Flüssigkeit vor dem Test oder durch
Verwenden einer kleineren Probenteilmenge behoben werden.
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Beispiel 2
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Der
Glasbehälter
ist ca. 85 × 25
mm groß und
eine Probe mit Bakterien wird, wie in Beispiel 1 beschrieben, eingeführt. Die
Nährstoffe
sind Verdaue von Casein und Fleisch, Glucose und Natriumpyruvat;
das Geliermittel ist Carrageenan und der Indikator für Mikrobenaktivität P.iodo.nitro.tetrazolium
violet; Natriumchlorid wird zur Regulierung des osmotischen Drucks
eingeführt.
Diese Formulierung ist für den
Nachweis von Bakterien, Schimmelpilzen und Hefepilzen geeignet;
nach Beifügen
der Probe und nach Schütteln
zum Vermischen und Verflüssigen der
Verbindungen kann sich das Gel als horizontaler Film setzen.
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Typische
Ergebnisse dieser Zusammensetzung sind in 4, 5 und 6 illustriert.
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Nach
einer Inkubation von 24 Stunden ist eine rot/violette Färbung von
unterschiedlicher Intensität
sichtbar, die den Ergebnissen in Beispiel 1 ähnelt.