DE2551155C3 - Wasserhaltiges Kulturmedium - Google Patents

Wasserhaltiges Kulturmedium

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DE2551155C3 DE2551155A DE2551155A DE2551155C3 DE 2551155 C3 DE2551155 C3 DE 2551155C3 DE 2551155 A DE2551155 A DE 2551155A DE 2551155 A DE2551155 A DE 2551155A DE 2551155 C3 DE2551155 C3 DE 2551155C3
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Description

Das derzeitige Verfahren zur Züchtung mikrobialer Kulturen umfaßt das Mischen entsprechender Chemikalien für die Nährstciflfzufuh'r, Wasser und eines Trägers für die Kultur. Gewöhnlich ist der Träger ein Seetangextrakt, nämlich Agar (auch als Agar-Agar bekannt). Agar ward hauptsächlich aufgrund seiner wünschenswerten Eigenschaften verwendet nämlich:
1) Zurückhaltung des Wassers,
2) im kalten Zustand eine feste Oberfläche,
3) leichte Handhabung beim Lösen in siedendem Wasser,
4) mögliche Mobilität der Nährstoffionen.
Agar hat jedoch auch unerwünschte Eigenschaften; es ist eine organische Verbindung, insbesondere ein Polysaccharide und daher ist es gegen Abbau und anschließende Verdauung durch gewisse Arten von Mikroorganismen anfällig. Agar verträgt weiterhin nicht den gesamten pH-Bereich, der manchmal beim Züchten von Mikroorganismen angewendet wird; seine Wasserbewahrungseigenschaften sind von begrenzter Dauer; in bebrüteten Petri-Schalen kann Agar innerhalb von 1—2 Wochen austrocknen, wodurch die Kolonie absterben kann.
In verschlossenen Teströhrchen kann sich Agar länger halten, trocknet jedoch immer innerhalb von einigen Monaten aus. Neben den physikalischen und chemischen Nachteilen bei der Verwendung von Agar als mikrobiales Wachstumsmedium gibt es auch noch wirtschaftliche Nachteile. Agar hat sich innerhalb der letzten Jahre im Preis um das 2- bis 3fache erhöht, und der Nachschub wechselt in Abhängigkeit von den Meeresströmungen und anderen Erntebedingungen.
Aufgrund der obigen Nachteile bei der Verwendung von Agar als Trägermedium für mikorbiologische Kulturen wäre ein anderes Trägermedium sehr wertvoll, das die gewünschten Agareigenschaften zeigt und die weniger wünschenswerten Eigenschaften nicht aufweist
Die Erfindung betrifft nun ein wasserhaltiges Kulturmedium für Fungi, Schimmel, Hefen, Bakterien oder pflanzliche und tierische Gewebezellen, im wesentlichen bestehend aus einem Mineralträger, Nährstoffen und Wasser, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Träger ein in Berührung mit Wasser mindestens auf das Dreifache quellbarer natürlicher oder synthetischer Ton ist
Erfindungsgemäß wird der wasseradsorbierende Ton als Ersatz für Agar oder Kieselsäuregel in einem wasserhaltigen Wachstiimsmedium bei der Züchtung aller Arten von Bakterien, Gewebekulturen (pflanzlich und tierisch), Schimmeln. Hefen und anderen Fungi verwendet Die sonstigen Züchtungsbedingungen und die Zusammensetzung der Kulturmedien sind identisch; so können die üblichen Mineralien, Quellen für
Stickstoff, Kohlenstoff etc. und manchmal Vitamine
. oder andere Wachstumsfaktoren, die sonst in den üblichen Kulturmedien verwendet werden, eingesetzt werden. Die Medien werden sterilisiert, und die
Beimpfung mit Mikroorganismen oder Gewebezellen
erfolgt nach den üblichen Verfahren.
Beim Mischen des Trägers mit Wasser wird eine thixotrope Mischung gebildet die sich zu einer festen oder halbfesten Masse absetzt; sie wird in dieser Form
ίο verwendet die eindeutig nicht feinzerteilt ist
Der natürliche oder synthetische Ton ist z. B. ein Tonmineral, wie Montmorillonite und insbesondere Bentonit; seine Verwendung ist besonders vorteilhaft in statischen Kulturen. Es können auch raffinierte Tone verwendet werden.
Tonmineralien vom Montmorillonit-Typ zeigen viele für ein mikrobiales oder Gewebewachstumsmedium wünschenswerte Eigenschaften. Natürlich *· jrkommende. quellende Tone, die als derartige Wachstumsträger geeignet sind, umfassen z. B. Bentonit Nontronit, Beidellit Smectid, Vermicullit und quellbaren Chlorit. Diese unterschiedlichen Tone variieren in ihrer Wasseradsorptionsfähigkeit beträchtlich, wobei die Wasseradsorptionsfähigkeit von Vermicullit z. B. nur etwa ein Drittel derjenigen von Bentonit ist Sehr gut verwendbar ist ein hoch quellbarer Bentonit auf Natrium-Basis, der hauptsächlich aus Montmorillonit besteht und bei Berührung mit Wasser um das Zehnfache quillt
Die Hauptvorteile der Verwendung eines in Berührung mit Wasser mindestens auf das Dreifache quellbaren natürlichen oder synthetischen Tons anstelle von Agar als Kulturträger sind:
1. Längere Wasserbewahrung — Tone, wie Montmorillonit haben wesentlich bessere Wasserbewahrungseigenschaften, nämlich die drei- oder mehrfachen derjenigen von Agar. Die Notwendigkeit einer Weiterimpfung der Grundkulturen aufgrund schneller Dehydratisierung wird somit eliminiert oder wesentlich verringert
2. Kosten — Die Kosten zur Herstellung solcher Tone, wie Montmorillonit sind wesentlich geringer als für Agar.
« 3. Verfügbarkeit — Die Verfügbarkeit von Montmorillonit ist wesentlich besser als von Agar. Agar ist ein Polysaccharidextrakt einer Seetangart (Gelidium), die nur im Pazifischen Ozean, Indischen Ozean und der Japanischen See wächst
4. Anorganisch anstelle von organisch — Manche Organismen können Agar als Nährstoff verwerten; somit ist eine Regulierung des Wachstums solcher Organismen auf Agar nicht möglich. Tone haben keinerlei verwendbares organisches Material.
5. Herstellung der Medien an Ort und Stelle - Das trockene Grundmaterial eines Tons braucht zur leichteren Hydratisierung nicht erhitzt zu werden; somit kann eine sterile Packung z. B. eines Bentonitmediums einfach an Ort und Stelle zu destilliertem Wasser zugefügt und das Medium ohne Erhitzen hergestellt werden. Die Herstellung erfolgt z. B. so, daß man Wasser mit ausreichend Ton zur Bildung einer glatten dicken Aufschlämmung mischt ein organisches Substrat und anderes
« Nährstoffmaterial mit der Aufschlämmung mischt die erhaltene Mischung sterilisiert und das sterilisierte Produkt sich zu einer festen oder halbfesten Masse verfestigen läßt
Als Träger für Kulturmedien sind entsprechende, rohe, unraffinierte Tone geeignet, jedoch liefert die Raffinierung des Tons durch Hindurchführung einer dünnen Aufschlämmung durch eine Zentrifuge ein zweckmäßigeres Produkt. Grobkörniges Material und Nicht-Kolloide werden entfernt, und man erhält ein glatteres, durchsichtigeres Produkt
Die Gewichts-Volumen-Beziehung (entsprechend g/ccm) zwischen dem Ton und Wasser, durch die dieser zu einer festen oder halbfesten Masse quillt, variiert mit der Wasseradsorptionsfähigkeit und -bewehrung des Tons selbst Dieses Verhältnis beträgt gewöhnlich 3:100bisl2:100.
Der wasserquellbare Ton kann 4-12% GewJVaU bezogen auf das Wasservolumen, ausmachen.
Die Wasseradsorptionsfähigkeit des mit Wasser quellbaren Tons ist ein begrenzender Faktor für das Verhältnis von Trägermaterial zu Wasser in der Formulierung jedes Kulturmediums. Die Menge an mit Wasser quellbarem Ton in jedem Kulturmedium muß mindestens ausreichen, alles in diesem Kulturmedium verwendete Wasser zu adsorbieren. Weiter kann die Wassermenge in einem solchen Kulturmedium nicht die Menge übersteigen, die beim Mischen mit dem wasserquellbaren Ton und den Nährstoffmaterialien erlaubt, daß sich die erhaltene Mischung zu einer festen oder halbfesten Masse verfestigt An: besten eignet sich ein Ton mit der höchsten Wasseradsorptionsfähigkeit, der somit zur Bildung einer festen oder halbfesten Masse das niedrigste Gew.-Vol.-Verhältnis aufweist
Weiterhin muß der Ton beim Mischen mit Wasser eine thixotrope Mujse bilden, die sich in den festen oder halbfesten Zustand verfest'.gt Thbtotropie ist eine wesentliche Eigenschaft der mit dem Ton gebildeten, wäßrigen Masse. Nach dem Verfestigen derselben muß sie praktisch ihr gesamtes Wasser — mit Ausnahme des durch Oberflächenverdampfung verlorenen — über längere Zeit bewahren können. Erwartet werden Zeiten der Wasserbewahrung über 3, am besten über 6 Monate oder mehr. Ansonsten muß er selbstverständlich die im Patentanspruch angegebene Quellbarkeit besitzen.
Der feste oder halbfeste Träger ist über einen weiten pH-Bereich stabil, und zwar zwischen pH 2 bis 12.
Die erfindungsgemäßen Medien eignen sich zur Züchtung verschiedener Mikroorganismen und Gewebezellen. Mikroorganismen und Gewebezellen werden nach üblichen Verfahren für die Züchtung vorbereitet und in üblicher Weise auf die Medien geimpft Die auf solchen Medien züchtbaren Mikroorganismen sind z. B. Fungi, wie Ascomycetes, z. B. Penicillium nolatum, Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus fumigatus; hefeartige Fungi, wie Candida albicans; Pflanzen- oder Tierparasiten, wie Phytophthora infestans, und Enterobacteriaeeen, wie Escherichia coli, Aerobacter aerogenes und Serratia marcescens; Bacillaceen, wie Bacillus cereus; Bakterien, wie Mikrococcaceen, z. B. Sarcina lutea; und Actinomycetaceen, wie Actinomyces bovis. Weiter können auf den erfindungsgemäßen Medien pflanzliche und tierische Gewebezellen, wie Zellen von Solanum tuberosum, Gallus Domestic, embryonische Fibroblasten und Nicotinana glauca, gezüchtet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
Beispiel 1
In einem Mischer wurden 1000 ecm dest Wasser mit 70 g Bentonit 5 Minuten zu einer glatten dicken Aufschlämmung gemischt, zu welcher die folgenden trockenen Nährstoffe zugefügt wurden:
Natriumnitrat g
2,0
Kaliumchlorid 0,5
Magnesiumglycerophosphat 0,5
Ferrosulfatheptahydrat 0,01
Kaliumsulfat O,?1)
Saccharose 30,0
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 6,8. Milchsäure kann verwendet werden, um den pH-Wert entsprechend für aeidophile Organismen einzustellen. Nach gründlichem Mischen wurde das erhaltene Medium in einem Autoklav sterilisiert, dann in Petri-Schalen gegossen oder in Teströhrchen eingeführt um anschließend beimpft zu werden.
Das Medium zeigt fast sofort seine thixoeropen
Eigenschaften, die eine leichte Verfestigung bewirken. Durch Oberflächentrocknung und die thixotrope Wirkung ergibt sich allmählich eine halbfeste Arbeilsoberfläche zum Züchten von Mikroorganismen. Die hohen Wasserbewahrungseigenschaften des Bentonits liefern ein für ein langes Wachstum des Inoculums geeignetes Medium.
Das obige Medium wurde in drei Petri-Schalen mit Penicillium notatum, Aspergillus fumigatus bzw. Candida albicans beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet
Wenn der 0,076 mm Bentonit durch ein anderes, wasseradsorbierendes hydratisiertes AluminiumsiBicat, das bei Berührung mit Wasser um mindestens das Dreifache quillt ersetzt wird, wie z. B. ähnlich l:ein zerteilter Beidellit, Nontronit oder Saponit, so erhält man vergleichbare Ergebnisse. Alle diese Mineralien (in raffinierter oder unraffinierter Form) sind in den folgenden Beispielen mit vergleichbaren Ergebnissen anstelle des Bentonits verwendbar.
Betspiel 2
Das Medium wurde gemäß Beispiel 1 mit den folgenden trockenen Nährstoffen hergestellt:
Pepton g
10.0
Lactose 10,0
Dikaliumhydrogenphosphat 2,0
Eosin 0,4
Methylenblau 0,066
Das erhaltene Medium wurde in getrennten P'etri-Schalen jeweils mit den Bakterien Escherichia coli, Aeiobacter aerogenes bzw. Serratia marcescens beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet (vgl. »The Oxoid Manual«, 3. Aufl., Oxoid Limited, Southward Bridge Road, London [1971]).
Beispiel 3
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen μ Nährstoffen ein Medium hergestellt:
Rindfleischextrakt 1.0 Hefeextrakt . 2,0
Pepton 5,0
''· Natriumchlorid 5,0
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 7,4. Das Medium wurde in getrennten Petri-Schialen
l Escherichia coli, Bacillus cereus bzw. Sarcina utea beimpft und in üblicher Weise bebrütet.
Beispiel 4
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen Nährstoffen ein Medium hergestellt:
Pepton 10,0
Hefeextrakt 10,0
Glucose 10,0
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 7,0. Das erhaltene Medium eignet sich zum Züchten von Hefen und Schimmeln. Es wurde in getrennten Petri-Schalen mit Penicillium notatum bzw. Saccharo- is myces cerevisiae beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet.
Beispiel 5
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen M Nährstoffen ein Medium hergestellt:
Kaseinhydrolysat 17,0
Pepton 3,0
Dextrose 2,5
Natriumchlorid 5,0
dibasisches Kaliumphosphat 2,5
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 73- Das Medium eignet sich zur Züchtung von Bakterien und Fungi; es wurde in getrennten Petri-Schalen mit Serratia marcescens. Bacillus cereus, Sarcina lutea, Penicillium notatum, Actonmyces bovis bzw. Phytopiithora infestans beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet.
Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures«, Physiologie Planlarum, 15, 473-497 [1962]).
Beispiel 7
Die folgenden Bestandteile wurden 5 Minuten in einem Mischer gemischt:
Natriumnitrat 0,50 g
Kaliumchlorid 0,125 g
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,125 g
Ferrosulfatheptahydrat 0,0025 g
Kaliumsulfat 0,0ß75g
Saccharose 7.50 g
Mononatriumphosphat 0.125 g
Bentonit (0,076 mm) 15,0 g
Dest. Wasser 250 ecm
Die erhaltene Mischung wurde 20 Minuten bei 6,8 kg Druck in einem Autoklav behandelt, in Petri-Schalen gegossen und mit Penicillium not?'-jm beimpft und 6 Tage bebrütet Anschließend bedeckte die Kultur 90% der Petri-Schalen; es lagen viele Penicillinperlen vor, und es wurde kein Trocknen der Oberfläche festgestellt.
Beispiel 8
Gemäß Beispiel 7 wurden folgende Bestandteile gemischt
Nährbrühe 4,0 g
Bentonit (0,076 mm) 30 g
Dest Wasser 500 ecm
dann in Peiri-Schalen gegossen und mit Bacillus cereus beimpft. Man erhielt ein ähnliches Wachstum wie bei demselben Organismus auf Nähragar.
Beispiel 6
Gemäß Beispiel 2 wurde aus den folgenden trockenen Nährstoffen ein Medium hergestellt:
g
Saccharose 30,0
Glycin 0,002
Indolessigsäure 0,002
Kinetin 0,0002
Myo-Inosit 0,10
Nicotinsäure 0,0005
Pyridoxinhydrochlorid 0,0005
Thiaminhydrochlorid 0,0001
Ammoniumnitrat 1,65
Kaliumnitrat 1,90
Calciumchlorid 0,44
Magnesiumsulfatheptahydrat 037
Mo.Tiokaliumphosphat 0,17
Eisen-EDTA 0,0429
Borsäure 0,00625
Mangansuliatmonohydrat 0,0223
Zinksulfatheptahydrat 0,0086
Kaliumiodid 0,0008
Natriummolybdatdihydrat 0,00025
Kupfersulfatpentahydrat 0,000025
Kobaltchlorid 0,000025
Beispiel 9
7 wurden folgende Nährstoffe
Gemäß Beispiel
gemischt
Kaseinhydrolysat 17,0 g Pepton 3,0 g
Natriumchlorid 5,0 g
Dextrose 2,5 g
Dibasisches Kaliumphosphat 2,5 g
Bentonit (0,076 mm) 60,0 g
Dest. Wasser 1,01
Das erhaltene Medium eignete sich zum Züchten von pflanzlichen Gewcbczellen; es wurde in getrennten Teströhrchen mit vorbereiteten Gewebezellen von Solanum tuberosum oder Nicolinana glauca beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet (vgl. M u rash ige, Τυ·;Ίίο und Sk oog, Polks, »A dann in Petri-Schalen gegossen und mit Aspergillus niger, Micrococcus flavus bzw. Saccharemyces cerevisiae beimpft. Man konnte ein gutes Langzeitwachstum feststellen.
Beispiel 10
Gemäß Beispiel / wurde aus den folgenden γ, Bestandteilen ein Medium hergestellt:
Magnesiumsulfatheptahydral 0,2 g
Dibasisches Kaliumphosphat 1,0 g
Ferrosulfatheptahydrat 0,05 g
1,11 Caylciumchlorid 0,02 g
Manganchlorid 0,002 g
Natriummolybdatdihydrat 0,001 g
Ammoniumchlorid 1,9 g
Natriumthiosulfatheplahydrat 7,0 g
Bentonit (0,076 mm) 60,0 g
Dest. Wasser 1.01
Der pH-Wert wurde auf neutral oder leicht sauer
eingestellt. Dieses Medium eignet sich /um Züchten obligater chemolitholropher Baclcrien. wie 7 hiobaeillus ihioxiditns. Die Anwesenheit einer organischen Verbindung, einschließlich Agar, in diesem Medium würde das Wachstum von Thiobacillus thiooxidans inhibieren.
Hc is pi el Il Die folgenden Bestandteile wurden gemischt:
Glucose 4,0 g
I'henol-Rot(0.5%) 4.0 g
Niiiriumbiairbonui 0. J5 g
Kaliumpcnieillin 100 000 1.1
Streptomycin H)O(XK)LI
Hcntonit (0,076 mm) b(),0 g
Desl. Wasser 1,01
l.aclalbuminhydrolysat 5.0 g
Natriumchlorid H.9 μ
Kaliumchlorid 0,4 g
Calciumchlorid 0.14 g
Magnesiumsiilfatheptahydrat 0.1 g
Magnesiumchloridhexahydral 0.1 g
Dibiisi.schcs Nalriumphospliat 0.0hg
Monobasisches Kaliumphospli.il 0.0hg
Das erhaltene Medium wurde 20 Minuten bei 6.8 kg Druck in einem Autoklav behandelt, in saubere, sterile (icwclickiiltiirflaschcn gegossen und eignet sich /tu Züchtung von (iewebe/ellen embryonischer Kükenfi bioblastcii (iallus domeslicus. Der in diesem Medium verwendete lientonit wirkt als (irundlage für den Wachstiimstritger und/oder als dariiberliegende Schicht nach Wachsiiimsbeginn der libroblasl/ellen.

Claims (1)

  1. Patentanspruch:
    Wasserhaltiges Kulturmedium für Fungi, Schimmel, Hefen, Bakterien oder pflanzliche und tierische Gewebezellen, im wesentlichen bestehend aus einem MineraUräger, Nährstoffen und Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein in Berührung mit Wasser mindestens auf das Dreifache quellbarer natürlicher oder synthetischer Ton ist.
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