DE2551155A1 - Wasserhaltiges mikrobiales oder gewebezellen-kulturmedium - Google Patents

Wasserhaltiges mikrobiales oder gewebezellen-kulturmedium

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Description

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PATENTANWÄLTE
Dlpl.-lng. P. WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK DIpl.-Jng. G. DAN N EN BERG · Dr. P. WEIN HOLD · Dr. D. GUDEL
281134 β FRANKFURTAM MAIN
TELEF N C0611) 287014 GH. ESCKENHEIMEB STRASSE
SK/SK
WBP-35
WYO-ΒΞΝ PRODUCTS, INC. 1242 North 28th Street Billings, Montana 59103 / USA
Wasserhaltiges mikrobiales oder Gewebszellen-Kulturmedium
Das derzeitige Verfahren zur Züchtung mikrobialer Kulturen umfaßt das Mischen entsprechender Chemikalien für die Nährstoff zufuhr, Wasser und eines Trägers für die Kultur. Gewöhnlich ist der Träger ein Seetangextrakt, närclich Agar (auch als Agar-Agar bekannt). Agar wird hauptsächlich aufgrund seiner wünschenswerten Eigenschaften verwendet, nämlich:
1) Zurückhaltung des Wassers
2) im kalten Zustand eine feste wachsende Oberfläche
3) leichte Handhabung beim Lösen in siedendem Wasser k) mögliche Mobilität der Nährstoffionen.
Agar hat jedoch auch unerwünschte Eigenschaften; es ist eine organische Verbindung, insbesondere ein Polysaccharid, und daher ist es gegen Abbau und an-
(Verdauung)
schließende Digestion / durch gewisse Arten von Mikroorganismen anfällig. Agar verträgt weiterhin nicht den gesamten pH-Bereich, der manchmal beim Züchten von Mikroorganismen angewendet wird; seine Wasserbewahrungseigenschaften sind von begrenzter Dauer; in bebrüteten Petri—Schalen kann Agar innerhalb von 1-2 Wochen austrocknen, wodurch die Kolonie"einschläft" oder abstirbt.
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In verschlossenen Teströhrchen kann sich Agar länger halten, trocknet jedoch immer innerhalb von einigen Monaten aus. Neben den physikalischen und chemischen Nachteilen bei der Verwendung von Agar als mikrobiales Wachstumsmedium gibt es auch noch wirtschaftliche Nachteile. Agar hat sich innerhalb der letzten Jahre im Preis um das 2- bis 3-Fache erhöht, und der Nachschub wechselt in Abhängigkeit von den Meeresströmungen und anderen Erntebedingungen.
Aufgrund der obigen Nachteile bei der Verwendung von Agar als Trägermedium für mikrobiologische Kulturen wäre ein anderes Trägermedium sehr wertvoll, das die gewünschten Agareigenschaften zeigt und die weniger wünschenswerten Eigenschaften nicht aufweist.
Die vorliegende Erfindung besieht sich auf die Verwendung eines anorganischen, mit Wasser quellbaren Materials, z.B. ein natürlich vorkommendes, wasseradsor-,, bierendes Tonmineral^ als Träger für das Wachstum und die Züchtung von mikrobialen und Gewebezellkulturen in einem Kulturmedium. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf die Verwendung z.B. eines wasseradsorbierenden Tonminerals als Ersatz für Agar (und/oder Kieselsäuregel) als Wachstumsmedium bei der Züchtung aller Arten von Bakterien, Gewebekulturen (pflanzlich und tierisch), Schimmeln, Hefen und anderen Fungi. Ansonsten sind Züchtungsbedingungen und die Zusammensetzung der Kulturmedien identisch mit Ausnahme eines Ersatzes des Agarträgers durch einen durch das anorganische, mit Wasser quellbare Material und Wasser gebildeten Träger. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch Kulturmedien,;dde. ein natürliches oder künstliches anorganisches, mit Wasser quellbares Trägermaterial enthalten, sowie die Herstellung solcher Medien.
Alle Mikroorganismen und Gewebezellen, die auf einem Agar- oder Kieselsäuregelträger in einem wässrigen Kulturmedium gezüchtet und vermehrt werden, können auch unter denselben Bedingungen auf einem festen oder halbfesten Träger (aus
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einem anorganischen, rait Wasser quellbaren Material, z.B. ein wasseradsorbierendes Tonmineral, und Wasser) gezüchtet und vermehrt werden, der dieselben Mengen derselben Materialien (z.B. Mineralien, Quellen für Stickstoff, Kohlenstoff und Energie und manchmal Vitamine oder andere Wachstumsfaktoren) enthält, die das Kulturmedium mit dem Agar- oder Kieselsäuregelträger üblicherweise aufweist. Die Medien werden sterilisiert, und die Beimpfung mit Mikroorganismen oder Gewebezellen erfolgt nach den üblichen Verfahren.
Ein Energie liefernder Bestandteil, der somit Mittel für das Wachstum und die Vermehrung von mikrobialen oder Gewebezellkulturen liefert, wird Substrat genannt. Substrate für Kulturmedien sind gewöhnlich, jedoch nicht notwendigerweise, organisch. So dienen z.B. vier Klassen anorganischer Verbindungen als Energiequellen für chemolithotrophe Bakterien (vgl. Stanier, Doudoroff und Adelberg »The Microbial World", Seite
Die vorliegende Erfindung hat verschiedene Gesichtspunkt:
a) wässrige mikrobiale oder Gewebezellkulturmedien
b) die Verwendung eines anorganischen, wasseradsorbierenden Minerals als nicht Nährstoff liefernder Wachstumsträger im einem Kulturmedium
c) die Kombination eines Mikroorganismus (Fungus, Schimmel, Hefe oder Bakterium) mit einem Kulturmedium mit einem anorganischen Wachstumsträger
d) die Herstellung dieses Kulturmediums und
e) die Verwendung dieses Kulturmediums zum Wachstum und der Züchtung von Mikroorganismen oder Gewebe zellen.
Die Kulturmedien bestehen aus Nährstoff material (gewöhnlich ein organisches Substat), einem anorganischen, nicht Nährstoff liefernden, wasseradsorbierenden Trägermaterial und Wasser. Sin typisches organisches Substrat ist ein Kohlehydrat, wie Sucrose und Dextrose. Anorganische Substrate umfassen reduzierte Stickstoffverbindungen, z.B. Ammoniak und Nitrite; reduzierte Schwefelverbin-
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düngen, wie H2S, S und Thiosulfate; gasförmigen Wasserstoff und Ferro-Eisen.
Beim Mischen des anorganischen Trägermaterials mit Wasser wird eine thixotrope Mischung gebildet, die sich zu einer festen oder halb-festen Masse absetzt; sie wird in dieser Form verwendet, die eindeutig nicht fein-zerteilt ist.
Das natürliche oder künstliche anorganische Material ist z.B. ein hydratisiertes Aluminiumsilicat, wie Tonmineralien, z.B. Montmorillonite und insbesondere Bentonit; seine Vervrendung ist besonders vorteilhaft in statischen Kulturen.
Tonraineralien vom Montmorillonit-Typ zeigen viele für ein mikrobiales oder Gewebezellwächstumsmedium wünschenswerte Eigenschaften. Natürlich vorkommende, quälende Tone, die als derartige Wachstumsträger geeignet sind, umfassen z.B. Bentonit, Nontronit, Beidellit, Smectid, Vemicu-llit und quellbaren Chlorit. Diese unterschiedlichen Tone variieren in ihrer Wasseradsorptionsfähigkeit beträchtlich, wobei die Wasseradsorptionsfähigkeit von Vermicullit. z.B. nur etwa ein Drittel derjenigen von Bentonit ist. Das erfindungsgemäß bevorzugte Tonmineral ist ein hoch quellbarer Bentonit auf Natrium-Basis, der hauptsächlich aus Montmorillonit besteht.
In der vorliegenden Erfindung wird die Bezeichnung "mit Wasser quellbar" nur auf ein Material angewendet, das bei Berührung mit ausreichend Wasser mindestens um das Dreifache quillt. Bevorzugte, mit Wasser quellbare anorganische Träger quellen bei Berührung mit ausreichend Wasser mindestens um das Fünffache, und insbesondere um das Sieben- bis Achtfache oder mehr. Von hoch quellendem Bentonit auf Natrium-Basis wird berichtet, daß er bei Berührung mit Wasser um das Zehnfache quillt.
Die Hauptvorteile der Verwendung eines wasseradsorbierenden Tonminerals anstelle von Agar als Kulturträger sind:
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1. längere Wasserbewahrung - Tonmineralien, wie Montmorillonit, haben wesentlich bessere Wasserbewahrungeigenschaften, nämlich die drei- oder mehrfachen derjenigen von Agar. Die Notwendigkeit einer Überführung der Grundkulturen aufgrund schneller Dehydratisierung wird somit eliminiert oder wesentlich verringert, und die Bebrütungszeiten stellen eine geringere Belastung für
■ das Medium dar.
2. Kosten - Die Kosten zur Herstellung solcher Tonmineralien, wie Montmorillonit, sind wesentlich geringer als für Agar, (etwa 1/100-1/200 des Preises).
3· Verfügbarkeit - Die Verfügbarkeit von Montmorillonit ist wesentlich besser als von Agar. Agar ist ein Polysaccharidextrakt einer Seetangart (Gelidium), die im Pazifischen, Indischen Ozean und der Japanischen See wächst. Im Jahr I972 wurden 6OO t in die Vereinigten Staaten importiert; es gibt offenbar keinen Agarüberschuß, und die Kosten steigen ständig. (Der derzeitige Agarverbrauch in den USA beträgt pro Jahr mehrere 1000 tO
4. anorganisch anstelle von organisch - Manche Organismen können Agar als Nährstoff verwerten; somit ist eine Regulierung des Wachstums solcher Organismen auf Agar nicht möglich. Tonmineralien haben keinerlei verwendbares organisches Material.
5·- Herstellung der Medien an Ort und Stelle - das trockene Grundmaterial eines Tonraineralmediums braucht zur leichteren Hydratisierung nicht erhitzt zu werden; somit kann eine sterile Packung z.B. eines Bentonitmediums einfach an Ort und Stelle zu dest. Wasser zugefügt und das Medium ohne Erhitzen hergestellt werden.
Als Wachstumsträger für Kulturmedien sind rohe, unraffinierte Tonmineralien geeignet, jedoch liefert die Raffinierung des Tonminerals durch Hirxiuron .führung einer dünnen Aufschlämmung durch eine Zentrifuge ein zweckmäßigeres Produkt. Die verbesserte Eignung des zentrifugieren Produktes zeigt sich durch eine verbesserte Eignung der damit hergestellten Wachstumsmedien. Grobkörniges
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Material und Nicht-Kolloide werden entfernt, und man erhält ein glatteres, durchsichtigeres Produkt. Das zentrifugierte Produkt ist überlegen l)aufgrund einer höheren prozentualen Wasserbewahrung, ermöglicht durch Ent» fernung äußerlicher Materialien (wie Grieß und Allophane), 2) aufgrund einer durchsichtigeren und einheitlichen Farbe, auf der sich das mikrobiale Wachstum leichter beobachten läßt, und 3) aufgrund aufgrund einer erhöhten Thixotropie, die ein Verfestigen des Mediums unter Bildung einer festen Arbeitsoberfläche für das mikrobiale Wachstum liefert. Die Zugabe von Wasser und entsprechender Nähr stoff chemikalien zum gereinigten Tonmineral ergibt ein Wachs tumsmediurc von überlegener Zusammensetzung. Die Vorteile einer höheren Wasserbewahring und längeren Wachstumslebensdauer sind offensichtlich. Andere, zur Zeit noch nicht ganz verständliche Vorteile sind vermutlich dem einmaligen Verhalten von mikrobialen Kolonien auf dem Tonmineralwachstumsmedium zuzuschreiben.
Die Gewichts-Volumen-Beziehung (entsprechend g/ccm) zwischen dem anorganischen Trägermaterial und Wasser, das dieses zu einer festen oder halbfesten Masse quellen läßt, variiert mit der Wasseradsorptionsfähigkeit und -bewahrung des · anorganischen Materials selbst. Erfindungsgemäß beträgt diese Beziehung gewöhnlich mindestens 3:100, selbst für die am stärksten wasseradsorbierenden hydrativen Aluminiumsilicate, gewöhnlich jedoch mindestens 1:25 und vorzugsweise etwa 1:2 bis 1:10, insbesondere 3:25.
Die Wasseradsorptionsfähigkeit z.B. eines mit Wasser quellbaren hydratisierten Aluminiumsilicates ist ein begrenzender Faktor für das Verhältnis von Trägermaterial zu Wasser in der Formulierung jedes Kulturmediums. Die Menge an mit •Wasser quellbarem Träger (z.B. hydratisiertea Aluminiumsilicat) in jedem Kulturmedium muß mindestens ausreichen, alles in diesem Kulturmedium verwendete Wasser zu adsorbieren. Weiter kann die Wassermenge in einem solchen Kultur-
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medium nicht die Menge übersteigern die beim Mischen mit dem wasser quellbaren Träger und den Nährstoff materialien erlaubt, daß sich die erhaltene Mischung zu einer festen oder halbfesten Masse verfestigt. Bevorzugt vird hydratisiertes Aluminiumsilicat mit der höchsten Wasseradsorptionsfähigkeit, das somit zur Bildung einer festen oder halb-festen Masse das niedrigste Gew.-Vol.-Verhältnis aufweist.
Weiterhin muß das hydratisierte Aluminiumsilicat bein Mischen mit Wasser eino thixotrope Masse bilden, die sieh in den festen oder halb-festen Zustand verfestigt. Thixotropie ist eine wesentliche Eigenschaft der mit dem hydratisierten Aluminiumsilicat gebildeten, wässrigen Masse. Nach dem Verfestigen derselben muß sie praktisch ihr gesamtes Wasser - mit Ausnahme des durch Oberflächenverdarapfung verlorenen - über längere Zeit bewahren können. Erwartet werden Zeiten der Wasserbewahrung über 3t vorzugsweise über 6, Monate oder mehr.
Der feste oder halb-feste Träger ist über einen weiten pH-Bereich stabil, und zwar zwischen pH 2 bis 12.
Die e rf indungs gern äßen Medien eignen sich zur Züchtung verschiedener Mikroorganismen und Gewebezellen. Mikroorganismen und Gewebezellen werden nach üblichen Verfahren für die Züchtung vorbereitet und in üblicher Weise auf die Medien geimpft. Die auf solchen Medien züchtbaren Mikroorganismen sind z.B. Fungi, wie Ascomycetes, z.B. Penicillium notatum, Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus fumigatus; hefeartige Fungi, wie Candida albicans; Pflanzen- oder Tierparasiten, wie Phytophthora infestans, und Enterobactaiaceen, wie Escherichia coli, Aerobacter aerogenes und Serratia marcescens; Bacillaceen, wie Bacillus cereus, Bakterien, wie Mikrococcaceen, z.B. Sarcina lutea; und Actinomycetaceen, wie Actinomyces bovis. Weiter können auf den erfindungsgemäß
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Medien pflanzliche und tierische Gewebezellen, wie Zellen von Solanum tuberosum, Gallus Domestic, embryonische Fibroblasten und Nicotinana glauca, gezüchtet werden. r
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung, ohne sie zu beschränken.
Beispiel 1_
In einem Waring-Mischer wurden 1000 ecm dest. Wasser mit 70 g Bentonit von 200 mesh 5 Minuten zu einer glatten dicken Aufschlämmung gemischt, zu welcher die folgenden trockenen Nährstoffe zugefügt wurden:
Natriumnitrat 2,0
Kaliumchlorid ■ 0,5
Magnesiumgljcerophosphat 0,5
Ferrosulfatheptahydrat . 0,01 Kaliumsulfat" 0,35 ■
Sucrose 30,0
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 6,8. (Milchsäure kann verwen-
werden,
det/ um den pH-Wert entsprechend für aeidophile Organismen einzustellen.) Nach gründlichem Mischen wurde das erhaltene Medium in einem Autoklaven sterilisiert, dann in Petri-Schalen gegossen oder in Teströhrchen eingeführt, um anschließend beimpft zu werden.
Das Medium zeigt fast sofort seine thixotropen Eigenschaften, die eine leichte Verfestigung bewirken. Durch Oberflächentrocknung und die thixotrope Wirkung ergibt sich allmählich eine halb-feste Arbeitsoberfläche zum Züchten von Mikroorganismen. Die hohen Wasserbewahrungeigenschaften des Bentonit liefern ein für ein langes Wachsturas des Inoculums geeignetes Medium.
obige Medium wurde in drei Petri-Schalen mit Penicillium notatum, Aspergillus fumigatus bzw. Candida albicans beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet.
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Wenn der 200 mesh Bentonit durch ein anderes, wasseradsorbierendes hydratisiertes Aluminiumsilicat, das bei Berührung mit Wasser um mindestens das Dreifache quillt, ersetzt wird, wie z.B. ähnlich fein zerteilter Beidellit, Nontronit oder Saponit, so erhält man vergleichbare Ergebnisse. Alle diese Mineralien (in raffinierter oder unraffinierter Form) sind in den folgenden Beispielen mit vergleichbaren Ergebnissen anstelle des Bentonite verwendbar.
Beispiel 2_
Das Medium wurde gemäß Beispiel 1 mit den folgenden trockenen Nährstoffen hergestellt:
Pepton (Gelsat) 10,0
Lactose .10,0 Dikaliumhydrogenphosphat 2,0
Eosin Y 0Λ
Methylenblau 0,065
Das erhaltene Medium wurde in getrennten Petri-Schalen jeweils mit den Bakterien Escherichia coli, Aerobacter aerogenes bzw. Serratia marcescens beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet (vgl. "The Oxoid Manual". 3«Aufl., Oxoid Limited, Southward Bridge Road, London, (1971)).
Beispiel \
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen Nährstoffen ein Medium hergestellt:
Rindfleischextrakt 1,0
Hefeextrakt 2,0
Pepton (Gelsat) 5»0
Natriumchlorid 5,0
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 7,4. Das Median wurde in getrennten Petri-Schalen jeweils mit Escherichia coli, Bacillus cereus bzw. Sarcina lutea beimpft und in üblicher Weise bebrütet.
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Beispiel k
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen Nährstoffen ein Medium hergestellt:
Pepton (Gelsat) . 10,0
Hefeextrakt . 10,0
Glucose 10,0
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 7,0. Das erhaltene Medium eignet sich zum Züchten von Hefen und Schimmeln. Es wurde in getrennten Petri . Schalen mit Penicillium notatum bzw. Saccharomyces cerevisiae beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet.
Beispiel £
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen Nährstoffen ein Medium hergestellt:
Trypton (Casein) 17,0
Pepton (Gelsat) 3,0
Dextrose 2,5
Natriumchlorid 5»0
dibasisches Kaliumphosphat 2,5
Der pH-Wert der erhaltenen Mischung betrug etwa 7,3· Das Medium eignet sich zum Züchtung von Bakterien und Fungi; es wurde in getrennten Petri-Schalen mit Serratia marcescens, Bacillus cereus, Sarcina lutea, Penicillium notatum, Actonmyces bovis bzw Phytophthora infestans beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet.
Beispiel 6
Gemäß Beispiel 1 wurde aus den folgenden trockenen Nährstoffen ein Medium hergestellt:
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Sucrose
Glycin
Indole ss igsäure Kinetin
Myo-Inosit
Nicotinsäure
Pyridoxinhydrochlorid Thiaminhydrochlorid Ammoniuianitrat Kaliumnitrat
Calciumchlorid Magnes iumsulfatheptahydrat Monokaliumphosphat Eisen-EDTA
Borsäure .:
Mangansulfatmonohydrat Z inksulfatheptahydrat Kaliumiodid
N atriummoybdatdihydrat Kupfersulfatpentahydrat KobaltChlorid
30,0 0,002 0,002 0,0002 0,10 0,0005 0,0005 0,0001 1,65 1,90 0,44 0,37 0,17 0,04-29 " 0,00625 0,0223 0,0086 0,0008 0,00025 0,000025 0,000025
Das erhaltene Medium eignete sich zum Züchten von pflanzlichen Gewebezellen; es wurde in getrennten Teströhrchen mit vorbereiteten Gewebezellen von Solanum tuberosum afer Nicotinana glauca beimpft und unter üblichen Bedingungen bebrütet (vgl. Murashige, Toshio und Skoog, Folks 11A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assays with Tobacco Tissue Cultures" Physiologia Plantarum, 15» if73-^97 (1962)).
Beispiel £
Die folgenden Bestandteile wurden 5 Minuten in einem Waring-Mischer gemischt:
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.9 551155
Natriumnitrat * 0,50
Kaliumchlorid 0,125
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,125
Ferrosulfatheptahydrat 0,0025
Kaliumsulfat 0,0875
Sucrose 7,50
Mononatriumphosphat 0,125
Bentonit (200 mesh) 15,0
dest. Wasser 250 ecm
Die erhaltene Mischung wurde 20 Minuten bei 6,8 kg Druck in einem Autoklaven behandelt, in Petri-Schalen gegossen und mit Penicillium notatum beimpft und 6 Tage bebrütet. Anschließend bedeckte die Kultur 90 $> der Petri-Schalen, es lagen viele Penicillinperlen vor, und es wurde kein Trocknen der Oberfläche festgestellt.
Beispiel 8
Gemäß Beispiel 7 wurden folgende Bestandteile gemischt
Nährbrühe l>,0 g
Bentonit (200 mesh) 30 g
dest. Viasser 500 ecm
dann in Petri-Schalen gegossen und mit Bacillus cereus beimpft. Man erhielt ein ähnliches Wachstum wie bei demselben Organismus auf Nähragar. Beispiel 9
Gemäß Beispiel 7 wurden folgende Nährstoffe gemischt _ _
Trypton (Casein) 17t0 Pepton (Gelsat) 3t0
Natriumchlorid 5$0
Dextrose 2,5
dibasisches Kaliumphosphat 2,5
Bentonit (200 mesh) 60,0
dest. Was'ser . 1,0
dann· in Petri-Schalen gegossen und mit Aspergillus niger, Micrococcus flavus bzw. Saccharemyces cerevisiae beimpft. Man konnte ein gutes Langzeit-
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? 5.5 1 1 5
wachstum feststellen.
Beispiel .10
Gemäß Beispiel 7 wurde aus den folgenden Bestandteilen ein Medium hergestellt:
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,2
dibasisches Kaliumphosphat 1,0
Ferrosulfatheptahydrat 0,05
Calciumchlorid 0,02
Manganchlorid 0,002
Natriummolybdatdihydrat 0,001
Ammoniumchlorid 1,0
Natriumtiiosulfatheptahydrat 7,0
Bentonit (200 mesh) 60,0
dest. Wasser 1,0 1
Der pH-Wert wurde auf neutral oder leicht sauer eingestellt. Dieses Medium eignet sich zum Züchten obligater chemolithotropher Bacterien, wie Thiobacillus thboxidans. Die Anwesenheit einer organischen Verbindung, einschließlich Agar, in diesem Medium würde das Wachstum von Thiobacillus thiooxidans inhibieren.
Beispiel 11_
Die folgenden Bestandteile wurden gemischt:
Lactalbuminhydrolysat 5»0 g
Natriumchlorid 8,9 g
Kaliumchlorid 0,4 g
Calciumchlorid 0,14 g
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,1 g
Magnesiumchloridhexahydrat 0,1 g
dibasisches Natriumphosphat 0,06 g
monobasisches Kaliumphosphat 0,06 g
Glucose 4,0 g
Phenol-Rot (o,5 $) 4,0 g
Natriurabicarbonat 0,35 g
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• . 9 5 5-1 155 ·
Kaliumpenicillin . 100 000 I.E.
Streptomycin 100 COO I.E.
Bentonit (200 mesh) . . 60,0 g
dest. Wasser . " 1,0 1
Das erhaltene Medium wurde 20 Minuten bei 6,8 kg Druck in einem Autoklaven behandelt, in saubere, sterile Gewebekulturflaschen gegossen und eignet sich zur Züchtung von Gewebezellen embryonischer Kükenfibroblasten Gallus domesticus, Der in diesem Mediim verwendete Bentonit wirkt als Grundlage für den Wachstumsträger und/oder als darüberliegende Schicht nach Wachstumsgebinn der Fibroblastzellen.
Beispiel 12
Die Reinigung von Natriumbsntonit durch Zentrifugieren wurde wie folgt durchgeführt:
1) es wurde eine Aufschlämmung durch Mischen von 5 $> pulverisiertem Bentonit und 95 i> dest. Wasser hergestellt. Es braucht nicht heftig gemischt zu werden; jede Art von Rühren genügt, je stärker jedoch gerührt wird, umso schneller bildet sich die gewünschte Aufschlämmung. Die erhaltene Aufschlämmung hat gewöhnlich eine Viskosität von 90 cps, gemessen an einem Fann-Viskositäts-Biesser; sie enthält die in dem ungereinigten Bentonit (wie geschürft) enthaltenen, unerwünschten Verunreinigungen, wie Sand oder SiO2 und niedrig kolloidale, als Allophane bezeichnete Tone. Diese Verunreinigungen werden in der Aufschlämmung durch das hoch kolloidale anwesende Material in Suspension gehalten.
2) Die erhaltene Aufschlämmung wurde in eine Super-D-Canter-Zentrifuge (Modell 3000j Sharpies) mit kontinuierlichem Fluß mit einer G Kraft von 3180 eingeführt; es wurden die folgenden Fraktionen gesammelt:
A. eine dicke feste Masse aus Sand und niedrig kolloidalem Ton (etwa 2-3
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? 5 R ! 1 5 5 .
B. eine flüssige, den hoch kolloidalen Ton und Wasser enthaltende Aufschlämmung (etwa 97-98 Gew.-).
Die Viskosität des hoch kolloidalen Tones betrug etwa 120 cps, gemessen an einem Fann-Viskositätsmesser. Diese flüssige Aufschlämmung hatte auch deutlichere thixotrope Eigenschaften als die ursprüngliche Tonaufschlämmung.
3) Das Wasser wurde vom gewünschen, hoch kolloidalen Tonmaterial in irgendeiner Weise ohne Erhitzen des Tones auf eine Temperatur über 1210C. entfernt. Oberhalb dieser Temperatur besteht die Gefahr einer Zerstörung gewisser wasseradsorbierender Eigenschaften des Tones.
k) Das erhaltene trockene Tonprodukt wurde auf eine Teilchengröße von 200 mesh vermählen und als Grundlage eines Kulturmediums verwendet.
Aufgrund der obigen Ausführungen erkennt der Fachmann verschiedene Änderungen und Modifikationen der vorliegenden Erfindung, ohne von deren Geist oder Umfang abzuweichen. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf Mikroorganismen oder Gewebezellen beschränkt, wie sie hier tatsächlich genannt wurden; es können Kulturmedien ganz allgemein verwendet werden, wann immer eine feste oder halb-feste Trägermasse gewünscht ist. Die Verwendung des erfindungsgemäßen anorganischen Trägers ist unabhängig von den zu züchtenden Mikroorganismen - und/oder Stoffwechselwegen.
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Claims (12)

2551Ί55 Patentansprüche
1.- Wasserhaltiges mikrobiales oder Gewebszellen-Kulturmedium, im wesentlichen bestehend aus ednem Mineralträger, Nährstoffen und Wasser, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger silicagelfrei ist, in Berührung mit Wasser mindestens auf das Dreifache quellbar ist und zusammen mit dem Wasser eine feste oder halb-feste, nicht zerteilte, anorganische, Wasser zurückhaltende, thixotrops Masse darstellt, die für dasmikrobiale ■ bzw. Zellgewebe-waehstum kein Nährstoff ist.
2,- Kulturmedium nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein Wasser adsorbierender Ton ist.
3·- Kulturmedium nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger bei Berührung mit ausreichend Wasser auf mindestens das Fünffache wasserquellbar ist.
4·.- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein hydratisiertes Aluminiumsilicat ist.
5·- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3t dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Montmorillonit ist.
6,- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Bentonit ist.
?.- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 3» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein raffinierter Ton ist.
8.- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß der Träger über einen pH-Bereich von 2-12 stabil ist.
9·- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Mischung aus a) einem organischen Substrat für ein mikrobiales oder Zellenwachstum oder -Vermehrung und b) anderen Nährstoffen enthält.
609822/0916
10.- Kulturmedium mach Anspruch 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der wasserquellbare Träger 4-12 #-(Gew./Vol.), bezogen auf das Wasservolumen im Medium, ausmacht.
11·- Kulturmedium mach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Närhstoffraaterial ein Kohlehydrat ist oder ein solches enthält.
12.- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das (Gew,/Vol.-)-Verhältnis zwischen anorganischem Träger und dem diesen zu einer festen oder halbfesten Masse quellenden Wasser zwischen 3:100 bis 3:25 liegt.
13·- Kulturmedium nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge des wasserquellbaren Trägers zur Adsorption allen Wassers ausreicht und die Wassermenge nach Mischen mit Nährstoff material und Träger es zuläßt, daß sich die erhaltene Mischung zu einer festen oder halbfesten Masse verfestigt.
lh,- Verfahren zur Herstellung eines Kulturmediums gemäß Anspruch 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man Wasser mit ausreichend wasseradsorbierendem Ton zur Bildung einer glatten dicken Aufschlämmung mischt, ein organisches Substrat und anderes Nährstoffmaterial mit der Aufschlämmung mischt, die erhaltene Mischung sterilisiert und das sterilisierte Produkt sich zu einer festen oder halbfesten Masse verfestigen läßt.
15·- Die Verwendung des Kulturmediums gemäß Anspruch 1 bis 13 zur insbesondere statischen Vermehrung von Fungi, Schimmel, Hefe, Bakterien oder Gewebezellen.
Der Patentanwalt:
609822/0916
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