NO149550B - Vannuopploeselig enzympreparat og fremgangsmaate for fremstilling derav. - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår bærerfikserte enzymer, som

ved hjelp av glutardialdehyd i nærvær av et stoff som virker enzymfellende, er bundet til et vannuoppløselig, høymolekylær-porøst kunststoff, som består av herdet protein og som har en vannopptagelsesevne fra to til åtte ganger sin tørrvekt. Videre angår oppfinnelsen fremstilling av disse•bærerfikserte enzymer som kan anvendes ved utførelse av biotekniske reaksjoner.

I fag- og patentlitteraturen er det i de siste år beskrevet tallrike fremgangsmåter for fiksering av enzymer på vannuoppløselige bærestoffer. En sammenfattende oversikt gir f.eks. R. A. Messing (utgiver): Immobilized Enzymes for Industrial Reactors, Academic Press, New York, 1975. På grunnlag av den kunnskap man hittil har hatt med hensyn til å gjøre et enzym uoppløselig, er det prinsipielt fire bindingsarter som kommer i betraktning: 1. adsorpsjon, 2. ionisk binding,

3. innkapsling og 4. kovalent binding til en bærer eller enzymene

med hverandre. Også kombinasjoner av disse immobiliserings-grunntyper er kjent.

Enzymer som ved adsorpsjon er bundet til en enzymfri bærer som f.eks. aktivt kull eller polysakkarider, har særlig den ulempe at det som følge av den relativt svake adsorptive binding lett kommer til desorpsjon. Særlig når det inntreffer endringer i ionekonsentrasjon og temperatur kan det lett fore-komme en løsning av adsorpsjonsbindingen og oppstå såkalt "utblødning" av enzymene.

Når det gjelder en ionisk binding av enzymet til en polyanionisk eller polykationisk bærer (som f.eks. ionebytter-harpiks) består likeledes ulempen i den forholdsvis svake binding mellom den polyioniske bærer og enzym, eftersom enzymet vanligvis bare inneholder svakt ioniske grupper. En avgjørende ulempe er også den ved mange reaksjoner forstyrrende ionebyttervirkning av slike fikserte enzymer, som fører til at under anvendelsen, f.eks. til behandling av drikkevarer, fjernes utilsiktet visse ioner fra drikken.

Enzymer som er innesluttet (innkapslet) i polymere stoffer (f.eks. fornettet polyakrylamid), har som hovedulempe den relativt vanskelige diffusjon gjennom molekylsikten i inneslutningsmaterialet. Den tilsynelatende Michaeliskonstant for et slikt innesluttet enzym blir derved også forhøyet i forhold til lav-molekylære substrater. Dessuten foreligger den fare at de innesluttede enzymer som følge av sin elastisitet trenger gjennom porene i inneslutningsmaterialet og således "utblør".

Ved den fjerde nevnte fikseringstype er enzymet kovalent og dermed méget fast bundet til en reaktiv gruppe på en vann-uoppløselig bærer. De aller fleste publikasjoner vedrørende enzymfiksering og også foreliggende oppfinnelse angår denne type immobilisering. En rekke av således fremstilte kjente preparater er imidlertid økonomisk og teknisk ikke anvendelige, fordi man må anvende for dyre koblingsreagenser eller bærestoffer eller for kompliserte fremstillingsmåter. Ved kobling i henhold til de tidligere kjente fremgangsmåter må man nemlig for det meste arbeide med et betydelig enzymoverskudd, mens den overveiende del av enzymene inaktiveres ved koblingsprosessen. De fleste fremgangsmåter tillater bare en liten andel enzymer i forhold til bærestoff, og bærestoffene kan bare bære enzymprotein på over-flaten. En delvis avhjelpning av problemet kan riktignok oppnås ved en finmaling (mikronisering) av ferdigproduktene, men disse preparater er imidlertid på grunn av sin finhet ved anvendelse i pakkede kolonner (packed bed-reactor) meget vanskelige å passere for en væskestrøm. En ytterligere ulempe ved de fleste fremgangsmåter for enzymfiksering er at bærestoffene (f.eks. glass, diatoméjord) er bundet til visse forhåndsbestemte former, og det er ikke mulig å fremstille dem f.eks. både i kule-, spon- eller membranform eller som overtrekk over andre materialer (f.eks. sikter). Mange bærestoffer og koblingsreagenser er også be-tenkelige på grunn av sin giftighet.

Noen av de ovennevnte ulemper ved kjente fikserte enzymer overvinnes ved ikkeproteolytiske enzymer ifølge teknikkens stand ved at man f.eks. kobler disse enzymer ved hjelp, av glutardialdehyd til kollagen. De således fremstilte preparater er imidlertid mikrobielt meget ustabile og deres spesifikke aktivitet er liten. Tilsvarende forholder det seg med preparater som er oppnådd ved fornetning av enzymer med dannet protein (se tysk offentliggjørelsesskrift 22 46 002). Herved oppstår en homogen blanding eftersom enzymene og dannet protein fornettes tilfeldig med hverandre. Disse preparater er riktignok mikrobielt mer stabile, men deres virkning er mangelfull, eftersom enzymene ligger fordelt jevnt over hele partikkeltverrsnittet. Med hen-

blikk på et høyt aktivitetsnivå kan fornetningen bare foretas relativt svakt. Det fører til slike myke preparater at det ved anvendelse, f.eks. i en kolonne, forekommer tilstopning og ut-blødning av enzymene. I tilfelle av sterkere fornetning kommer det derimot til inaktivering som følge av for sterk binding og som følge av inneslutning av de enzymmolekyler som ligger inn-vendig. En betydelig ulempe ved de sistnevnte fikserings-

metoder er også at de ikke kan anvendes for proteolytiske enzymer.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å fremstille vannuoppløselige, ikke-proteolytiske og, proteolytiske enzymer som fortrinnsvis samtidig har de følgende fordeler:

billig fremstillingsmåte,

høyt aktivitetsinnhold både ved fikseringsprosessen og efter

lengere eller gjentatt anvendelse,

stor resistens mot mikroorganismer,

stor formvariabilitet av bærematerialet,

gode gjennomstrømningsegenskaper ved anvendelse i pakket form,

høy spesifikk aktivitet,

lav tilsynelatende Michaeliskonstant

ingen uønskede ionebytter- eller adsorpsjonsegenskaper, forlikelige, toksisk godtagbare bærestoffer.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes et vannuoppløselig enzympreparat hvor enzymene ved hjelp av glutardialdehyd er bundet kovalent til et bærerprotein. Preparatet karakteriseres ved at det er fremstilt ved a) å tilsette en vandig væske som inneholder en glukosidase, protease, katalase eller oksydase eller blandinger derav, til et med formaldehyd herdet protein, fortrinnsvis gelatin, som har en vannopptagelsesevne på 2 til 8 ganger sin tørrvekt, i en slik mengde at væsken oppsuges fullstendig av proteinet under svelling, og b) derefter til den erholdte blanding å tilsette en oppløsning av glutardialdehyd i en enzymfeIlende væske, fortrinnsvis en

lavere alifatisk alkohol og/eller et lavere alifatisk keton.

Ifølge oppfinnelsen tilveiebringes også en fremgangsmåte for fremstilling av et vannuoppløselig enzympreparat hvor enzymene ved hjelp av glutardialdehyd er bundet kovalent til et bærerprotein, og fremgangsmåten karakteriseres ved de ovenfor for preparatet karakteristiske trekk. På denne måte dannes preparater i hvilke enzymet på sett og vis er hengt fast på bestemte steder på utsiden og i det indre av det høymolekylær-porøse bæreprotein med forhåndsgitt struktur.

Som råstoff for fremstilling av det vannuoppløselige bærestoff kan f.eks. anvendes vannoppløselige proteiner av for-skjellig art (f.eks. gelatin, eggehvite, albumin, soyaprotein o.a.). Det er vesentlig at disse proteiner gjøres vannuoppløselige ved herdning med formaldehyd, og likeledes kan modifiseres ved annen behandling (f.eks. denaturerende temperaturinnvirkning), slik at de i temperaturområdet mellom 0 og 100°C får en tilnærmet konstant vannopptagelsesevhe på fra det dobbelte til det åttedobbelte av sin tørrvekt. Svelleforholdene for de ubehandlede utgangs-proteiner kan være helt forskjellige. Tørt gelatin opptar f.eks.

i kaldt vann bare ca. 10% (= 1/10 av sin tørrvekt) vann, mens albumin og eggehvite er fullstendig oppløselig i kaldt vann.

Fra disse eksempelvis nevnte såvel som andre opprinnelig meget forskjellige proteiner, er det imidlertid mulig på en enkel måte å fremstille et kunststoff med de egenskaper som ønskes i henhold til oppfinnelsen, ved at man oppløser utgangsproteinet i vann ved egnet temperatur, fornetter det med formaldehyd og derefter under-kaster det en tørrende varmebehandling. På denne måte er oppfinnelsen ikke begrenset til anvendelse av relativt dyre, gel-dannende proteiner, men det kan også anvendes mindreverdige proteiner, f.eks. gelatiner med lavt "Bloom"-tall eller overhodet ikke mer gelatinerende flytende avfalls-gelatiner og andre ikke-gelatinerende eggehvitestoffer.

Fremstillingsmåten for kunststoffet på hvilket enzymene skal fikseres, kan varieres innenfor vide grenser, alt efter det anvendte utgangsprotein, den gitte apparatur, den ønskede bære-stof f -f orm (f.eks. spon, kuler, membraner, sikter o.a.) osv. Eksemplene illustrerer noen prinsipielle muligheter som imidlertid kan tilpasses slik som det vil være klart for en fagmann.

I

I henhold til en særlig foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen innføres det vannoppløselige utgangsprotein som skal anvendes til fremstilling av bærestoffet, først i den 3- til 10-dobbelte vannmengde (basert på proteinmengden), og blandingen opp-varmes til 40 til 80°C. Til denne proteinoppløsning settes derefter en formaldehydoppløsning (f.eks. formalin) i en slik mengde at ca. 2 til 5% formaldehyd basert på det anvendte protein-tørrstoff, innføres i oppløsningen. Den omrørte oppløsning størkner efter en viss tid, og størkningstiden kan vanligvis for-kortes ved høyest mulig temperatur, en pH-verdi som er nærmest mulig 8-10, og høy formaldehyd-tilsetning. Normalt er imidlertid en altfor rask størkning ikke ønsket, eftersom dette vanskelig-gjør en homogen gjennomblanding av protein-formaldehyd-vann-blandingen. En noe forsinket størkning gir også god mulighet til å bringe bærestoffet i en ønsket form. F.eks. kan dét ved neddykning av gjenstander (rører, sikt) anbringes som overtrekk på disse gjenstander, eller det kan ved spray-tørring overføres til sin kulepartikkelform.

Uegnet som bærestoff i henhold til oppfinnelsen er de herdede eggehvitestoffer som er kjent under navnet kunsthorn.

Det har nemlig vist seg at kunsthorn, som bare har en vannopptagelsesevne på opptil 1/3 av sin tørrvekt, bare i meget begrenset grad kan kobles sammen med enzymer, slik at således fremstilte fikserte enzympreparater bare har meget liten spesifikk aktivitet.

For tilkobling av enzymene tilsettes de herdede bærestoffer i tørr tilstand de i vann oppløste enzymer fortrinnsvis i slik mengde at den samlede enzymholdige væske oppsuges under svelling av de.vannuoppløselige bærestoffer. Derved fuktes de ytre og indre overflater av bærestoffene med enzymoppløsningen. Derefter tilsettes en vanlig enzymfellende væske i hvilken glutardialdehyd er oppløselig, f.eks. aceton, etanol eller isopropanol, sammen med det deri oppløste glutardialdehyd som koblingsreagens. Efter den resulterende binding av enzymene vaskes preparatet fortrinnsvis godt med vann og enten tørres på egnet måte (f.eks. med oppløsningsmidler eller ved spraytørring) eller oppbevares resp. anvendes videre i fuktig form, eventuelt under tilsetning av stabiliserende stoffer (f.eks. glycerol, sorbitol eller

propylenglykol).

Fortrinnsvis overholdes de følgende betingelser ved tilkoblingen av enzymene: Den vandige enzymoppløsning tilsettes i 2 til 8 ganger mengden av bærestoff-tørrvekten. Væsken som virker enzymfellende, tilsettes i slik mengde at i alt vesentlig ingen enzymer som man ønsker fiksert, går i oppløsning fra bærestoffene. Alt efter enzym og alt efter fellingsmiddel varierer disse mengder som kjent meget sterkt, men de kan imidlertid av fagmannen fastslås på enkel måte ved utprøvning for hvert aktuelle enzym. Glutardialdehyd anvendes fortrinnsvis i slik mengde at konsentrasjonen i reaksjonsblandingen ligger mellom 0,5 og 5%. Hele koblingsreaksjonen utføres fortrinnsvis ved romtemperatur i løpet av 5 minutter til 5 timer.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan det i motsetning til kjente fremgangsmåter også oppnås binding av proteolytisk aktive enzymer. Ved herdning av bærestoffet lykkes det nemlig å gjøre proteinene såvidt bestandige mot den proteolytiske avbygning av proteasen som skal bindes, at fikseringen kan skje uten forstyrring av bærestoffet. For dette formål foretrekkes at det som bærer anvendes herdede proteiner med dobbelt til fire-dobbelt vannopptagelsesevne. Bærestoffer med 4- til 8-dobbelt vannopptagelsesevne er imidlertid også egnet for visse proteolytiske enzymer, som f.eks. løpe. Fagmannen kan bestemme de grenser som er hensiktsmessig i det enkelte tilfelle. Eventuelt kan bære-stof f et også beskyttes mot det proteolytiske angrep av proteaser, f.eks. ved anvendelse av lave temperaturer inntil de enzymfellende stoffer tilsettes. Efter glutaraldehyd-koblingsreaksjonen er det ikke lenger noen fare for nedbrytning av bærestoffet.

De bærerfikserte enzymer i henhold til oppfinnelsen er vanligvis egnet for gjennomføring av de samme biotekniske reaksjoner som også de tilsvarende oppløselige enzymer er egnet for. Dessuten er de også særlig egnet for gjentatt eller kontinuerlig anvendelse såvel som for de tilfeller hvor fjernelse av enzymene fra reaksjonsblandingen (f.eks. fra drikkevarer) er ønsket eller lovmessig foreskrevet. For gjentatt eller langtids-anvendelse er preparatenes høye bestandighet mot mikroorganismer og deres lette desinfiserbarhet ved hjelp av vanlige desinfeksjons-midler (f.eks. kvartære ammoniumforbindelser, oppløsningsmidler o.a.) særlig gunstig.

De følgende eksempler skal tjene til å illustrere oppfinnelsen ytterligere.

Eksempel 1

1 kg pulvergelatin (alkalisk oppsluttet, 80 Bloom) ble innført i 6 liter kaldt vann og oppvarmet til 60°C. Derved gikk gelatinen i oppløsning. Derefter ble 150 ml formalin (= 35 vektprosentig formaldehydoppløsning) tilsatt under om-røring. Efter 2 minutter og 30 sekunder størknet massen til en gel. Denne gelatinerte masse ble kjørt gjennom en kjøttkvern slik at det ble dannet grove, fuktige gelklumper. I ca. 5 cm høyt lag ble gelklumpene anbragt på en rist i et tørreskap og tørret med luftsirkulasjon ved 115°C i 15 timer. De tørre partikler ble malt på en luftmølle med siktinnsats, slik at man fikk en partikkelstørrelse hovedsakelig mellom 50 og 100 ym.

De sponformige partikler var vannuoppløselige og hadde en vannopptagelsesevne på 4,8 ganger sin tørrvekt.

Til 0,5 kg av bærestoffpulveret ble det under omrøring satt 1,5 1 av en oppløsning som inneholdt 0,1 1 handelsvanlig, flytende glukoseoksydase-katalase-blanding og 1,4 1 destillert vann. Den handelsvanlige glukoseoksydase-katalase-blanding hadde en glukoseoksydase-aktivitet på 1780 Sarrett-enheter/ml og en katalaseaktivitet på 880 Baker-enheter/ml. Derefter ble blandingen blandet med 2 1 aceton og 200 ml 25%ig glutardialdehydoppløsning. Reaksjonsblandingen fikk derefter stå i 60 minutter ved 30°C. Efter utløpet av denne tid ble blandingen filtrert, og de faste partikler ble vasket omhyggelig på filteret med ca. 50 1 destillert vann. Den gjenværende fuktige filterkake hadde en vekt på 1,9 5 kg. Under tilsetning av 1,05 kg glycerol ble massen finsuspendert og oppbevart i kjøleskap inntil videre anvendelse.

Før undersøkelse av aktiviteten og andre undersøkelser ble glyceroloppløsningen godt utvasket med vann. Tabell 1 gjengir de viktigste analysedata for preparatet.

For undersøkelse av preparatets utvaskningsstabilitet ble 10 g vasket kontinuerlig med destillert vann i en kolonne. Med

en dags mellomrom ble aktiviteten av enzympartiklene undersøkt.

Det viste seg at i løpet av 14 dager fant det ikke sted noen betydelig aktivitetsreduksjon. Likeledes forholdt det seg når det istedenfor vann ble anvendt øl som utvaskningsvæske.

Michaeliskonstantene for det fikserte enzympreparat og

for den oppløselige glukoseoksydase ble bestemt overfor glukose. Det viste seg at det ikke var noen betydelig forskjell mellom den oppløste og den fikserte enzymform. Se figuren som viser den relative reaksjonshastighet av det oppløselige og det immobili-serte enzym avhengig av glukosekonsentrasjonen.

Eksempel 2

3 g tørret eggehvite ble oppløst i 10 ml vann ved 40°C

og tilsatt 0,3 ml formalin. Denne blanding ble tørret i vakuum-tørreskap ved 100°C og 10-20 Torr. Det tørre kunststoff ble malt til en kornstørrelse på 100 til 200 ym og siktet. Det var vannuoppløselig og hadde en vannopptagelsesevne på 4 ganger sin tørrvekt.

0,1 g av en handelsvanlig laktase fra Aspergillus flavus, som oppviste en laktaseaktivitet på 520 LU/g, ble oppløst med 1,5 ml destillert vann. I denne enzymoppløsning ble 0,5 g av det ovenfor beskrevne kunststoffpulver innrørt. Derefter ble 3 ml aceton og 0,25 ml 25%ig glutardialdehydoppløsning tilsatt under omrøring. Denne blanding fikk stå i 60 minutter ved 25°C og ble derefter filtrert. Det bundne enzym som ble tilbake som filterrest, ble utvasket godt med destillert vann. Det hadde en aktivitet på 42 LU/g tørrstoff. Den samlede tørrstoffmengde i det bundne enzympreparat var 0,61 g.

Eksempel 3

1 kg pulvergelatin (surt oppsluttet, 80 Bloom) ble omrørt

i 5 1 kaldt vann og oppvarmet til 45°C. Efter oppløsning av gelatinen ble 100 ml formalin tilsatt. Oppløsningen ble videre holdt ved 45°C og' forstøvningstørret i en laboratorie-forstøvnings-tørrer med tostoffdyse ved 210°C luftinngangstemperatur, 100°C luftutgangstemperatur og en luftméngde på 500 Nm /time. Det ble dannet et vannuoppløselig, fint pulver med en vannopptagelsesevne på 7 ganger sin vekt.

0,50 ml av en katalasefri glukoseoksydaseoppløsning

med en aktivitet på 750 Sarrett-enheter/ml ble tilsatt 1 ml destillert vann. Derefter ble 0,5 g av det ovenfor beskrevne pulverformige kunststoff innrørt. Denne blanding ble omrørt med 2 ml aceton og 0,2 ml 25%ig glutardialdehydoppløsning og fikk stå i 60 minutter ved romtemperatur. Derefter ble preparatet godt utvasket over et filter med destillert vann. Man fikk i alt 0,59 g av det fikserte enzymtørrstoff med en glukoseoksydase-aktivitet på 290 Sarrett-enheter pr. g tørrstoff.

Eksempel 4

20 g pulvergelatin (surt oppsluttet, 80 Bloom) ble opp-løst i 100 ml destillert vann under omrøring ved 60°C. Den opp-løste gelatin ble tilsatt 2 ml formalin. Derefter ble en godt avfettet bladrører med en overflate på 20 cm 2 dyppet ned i gelatin-formalinblandingen og straks tatt ut igjen. Overskudd av gelatin-formalinblanding fikk dryppe av, og røreren ble anbragt i 5 timer i et tørreskap med en temperatur på 105°C

for tørring og fornetning av formalin-gelatin-blandingen.

Derefter ble røreren, som nu var overtrukket med et fint kunststoff-skikt, avkjølt og dyppet ned i en oppløsning av 20 g original kalveløpe (firam Hauser) i 100 ml vann i 1 minutt. Derefter fikk røreren, som var fuktet med løpeenzym, stå i en oppløsning av 70 ml aceton, 30 ml vann og 10 ml 2 5%ig glutardialdehyd i 60 minutter, Og ble derefter vasket i 60 minutter i rennende vann.

For undersøkelse av løpeaktiviteten ble røreren anvendt til langsom omrøring av 200 ml frisk helmelk. Efter ca. 60 sekunde: fant det sted en kraftig kaseinutfelling som viste at røreren hadde løpeaktivitet. Røreren ble derefter vasket og igjen anvendt til langsom omrøring av 200 ml frisk helmelk. Det viste seg ved 10 gangers gjentagelse av denne prosess, at det i hvert tilfelle fant sted en sterk kaseinutfelling efter 50 til 70 sekunder.

Eksempel 5

1 kg pulvergelatin (alkalisk oppsluttet, 80 Bloom) ble innført i 6 1 kaldt vann og oppvarmet til 60°C. Derved gikk gelatinen i oppløsning. Derefter ble 250 nil 25%ig glutar-dialdehydoppløsning tilsatt under omrøring. Efter ca. 2 minutter størknet massen til en gel som ble ført gjennom en kjøttkvern og tørret i ca. 5 cm høyt lag på en rist i et tørreskap ved 120°C med luftsirkulasjon. De tørre partikler ble malt på en luft-mølle med siktinnsats, slik at man hovedsakelig fikk en partikkel-størrelse mellom 50 og 100 ym. De sponformige partikler var vannuoppløselige og hadde en vannopptagelsesevne på 3,1 ganger sin tørrvekt.

Til 0,5 kg av bærestoffpulveret ble satt under omrøring 1,4 1 av en oppløsning som inneholdt 0,1 1 handelsvanlig, flytende glukose-oksydase-katalase-blanding og 1,3 1 destillert vann. Den handelsvanlige glukoseoksydase-katalase-.blanding hadde en glukoseoksydase-aktivitet på 1780 Sarrett-enheter/ml og en katalaseaktivitet på 800 Baker-enheter/ml. Derefter ble blandingen tilblandet 2 1 aceton og 200 ml 25%ig glutardialdehyd-oppløsning. Reaksjonsblandingen fikk derefter stå i 60 minutter ved 30°C. Efter utløpet av denne tid ble den filtrert, og de faste partikler ble vasket omhyggelig på filteret med ca. 50 1 destillert vann. Den gjenværende fuktige filterkake hadde en vekt på 1,80 kg. Den ble finsuspendert i 1,20 kg glycerol og , oppbevart i kjøleskap inntil videre anvendelse.

Før undersøkelse av aktiviteten og før andre undersøkelser ble glyceroloppløsningen utvasket godt med vann. Tabell 2 gjengir de viktigste analysedata for preparatet.

Med hensyn til utvaskningsstabilitet og Michaeliskonstant overfor glukosesubstrat ble det innenfor de analytiske feilgrenser funnet de samme verdier som i eksempel 1.

Eksempel 6

10 kg pulvergelatin (alkalisk oppsluttet, 80 Bloom)

ble innført i 60 1 vann med en temperatur på ca. 20°C og ble oppvarmet i løpet av 30 minutter til 50°C. Derved gikk gelatinen i oppløsning. Derefter ble 3,5 1 formalin tilsatt under omrøring. Efter ca. 2 minutter størknet massen til en gel som ble ført gjennom

en kjøttkvern og anbragt i ca. 5 cm høye lag på en rist i et tørreskap med luftsirkulasjon hvor den ble tørret i 24 timer ved 108°C. De tørre partikler ble malt på en luftmølle med siktinnsats slik at man fikk et bærestoffpulver med en partikkel-størrelse på 50-100 ym. De sponformige partikler var vann-uoppløselige og hadde en vannopptagelsesevne på 3,2 ganger sin tørrvekt.

Til 5 kg av bærestoffpulveret ble ved 0°C satt 13 1 av

en til 0°C avkjølt oppløsning som inneholdt 0,5 kg handels-

vanlig papain med en aktivitet på 45.000 NF-enheter pr. mg. Derefter ble 30 1 isopropanol og 1 1 25%ig glutardialdehyd tilsatt under omrøring. Denne reaksjonsblanding ble i løpet av 5 minutter oppvarmet til 2 5°C og ble holdt ved denne temperatur i 60 minutter. Efter utløpet av denne tid ble blandingen filtrert og vasket omhyggelig med ca. 200 1 avionisert vann. Den gjenværende ca. 15 kg tunge filterkake ble suspendert påny i 20 1 avionisert vann og tørret over en laboratorieforstøvningstørrer med tostoffdyse ved 180°C luftinngangstemperatur, 85°C luftutgangstemperatur og en luftgjennomstrømning på 450 Nm 3/time. Dette resulterte i 5,35 kg av et bærerfiksert tørrpreparat med

en aktivitet på 520 NF-enheter pr. mg.

Eksempel 7

1 kg handelsvanlig amyloglukosidase på Aspergillus niger med 1070 glukoamylase-enheter pr. g ble oppløst med 14 1 avionisert vann. Derefter ble 5 kg bærestoffpulver, som var fremstilt som i eksempel 1, tilblandet. Efter oppsugning av enzymoppløsningen av bærestoffpulveret ble 20 liter aceton og 1 liter glutardialdehyd tilsatt under omrøring, og blandingen fikk stå i 60 minutter ved 30°C. Efter utløpet av denne tid ble den filtrert og vasket med ca. 300 liter vann. Den gjenværende filterkake ble suspendert påny i ca. 30 1 avionisert vann og tørret over en laboratorieforstøvningstørrer med tostoffdyse ved 170°C luftinngangstemperatur, 85°C luftutgangstemperatur og 400 Nm /time luftgjennomstrømning. Det resulterte i 5,20 kg bærerfiksert tørrpreparat med en aktivitet på 162 glukoamylaseenheter pr. g. 5 1 humleholdig, lys vørter ble tilsatt 20 ml grøtaktig ølgjær (stamme Rh fra forsøks- og læreanstalten for bryggeri-vesen i Berlin) og 1 g av det ovenfor beskrevne fikserte amyloglukosidasepreparat. Parallelt med dette ble det fremstilt en annen blanding på samme måte, men imidlertid uten amyloglukosidase-preparat, og begge blandinger fikk stå til gjæring i et temperert vannbad ved 8°C i 7 dager. Derefter ble ølet tappet av, og gjæringsgraden ble bestemt på vanlig måte med spindler. Det avsatte ølgjær med resp. uten amyloglukosidasepreparat ble hver gang redusert til 20 ml og anvendt til igangsettelse av en ytterligere ølgjæring. På denne måte ble det foretatt fire forsøk med gjæren. Når det gjelder gjæren inneholdende amyloglukosidase-partiklene, viste det seg som relativt enkelt å overføre disse partikler fullstendig til den neste gjæringsblanding, eftersom de efter vasking av gjærblandingen avsatte seg på bunnen.

Tabell 3 gjengir de forgjæringsgrader som ble funnet ved de

fire forsøk med og uten amyloglukosidase-preparat.

Eksempel 8

25 g flytende avfallsgelatin uten gelatineringsevne

med 70% tørrstoffinnhold ble oppløst i 100 ml avionisert vann ved 50°C. Den oppløste gelatin ble tilsatt 3 ml formalin. Derefter ble reaksjonsblandingen hellet på en glassplate som det på forhånd var strøket fett på, og den ble fordelt til et tynt skikt. Glassplaten med reaksjonsblandingen ble tørret i et tørreskap med luftsirkulasjon ved 105°C. Efter tørring kunne det fornettede bærestoff i membranform frigjøres fra glassplaten.

En 5 x 5 cm stor bærestoffmembran med en tykkelse på

0,1 mm i tørr tilstand ble neddykket i 2 minutter i en oppløsning av 10 ml handelsvanlig flytende glukoseoksydase-katalase (som i eksempel 1) og 50 ml destillert vann. Derefter ble membranen lagt i 60 minutter ved romtemperatur i en blanding av 70 ml iaceton, 30 ml vann og 12 ml 25%iq glutardialdehyd. 'Efter utløpet av denne tid ble det foretatt en grundig utvanning av membranen.

Den ble derefter oppbevart under glycerol til videre anvendelse. Aktivitetsbestemmelse med en del av membranen viste en glukose-oksydase-aktivitet på 112 SU/g tørrstoff og en katalaseaktivitet på 96 BU/g tørrstoff.

Eksempel 9

20 g pulvergelatin (surt oppsluttet, 80 Bloom) ble opp-løst med 100 ml destillert vann under omrøring ved 60°C. Til den oppløste gelatin ble satt 2 ml formalin. Derefter ble en avfettet edelstål-rundsikt på 5 cm i tverrsnitt, en maskevidde på 1 mm og en trådtykkelse på 0,1 mm neddyppet i denne reaksjons-oppløsning og straks tatt ut igjen. Overskudd av reaksjonsblandingen ble avblåst med en luftblåse, slik at trådene bare for-ble fuktet med et tynt skikt av reaksjonsblandingen. Sikten ble derefter tørret i 4 timer ved 105°C i et tørreskap med luftsirkulasjon. Derefter ble sikten, som nu var overtrukket med et fint bærestoffskikt, neddyppet i 2 minutter i en oppløsning av 10 ml handelsvanlig flytende glukoseoksydase-katalase og 50 ml destillert vann. Derefter ble sikten lagt ved romtemperatur i 60 minutter i en blanding av 70 ml aceton, 30 ml vann og 15 ml 25%ig glutardialdehyd. Efter utløpet av denne tid ble det foretatt en grundig utvanning av sikten.

For å undersøke den enzymatiske virkning ble sikten lagt

i 100 ml 3,5%ig glukoseoppløsning som gjennom kalsinert glass ble kraftig luftet nedenfra. Denne oppløsnings pH-verdi ble automatisk holdt konstant ved en titrator. Det ble målt de i tabell 4 gjengitte forbruk av 0,01 N NaOH.

Enzymaktivitetsbestemmelser

Bestemmelse av enzymaktiviteten ble foretatt efter de nedenfor angitte metoder. Når det gjelder fikserte enzymer ble inkubasjonsblandingene omrørt eller rystet, også når det ikke var angitt i originalforskriften.

Katalaseaktivitet: I henhold til First Suppl. Food Chem. Codex, 2. utg., s. 67-68, forlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Glukoseoksydaseaktivitet; I henhold til First Suppl. Food Chem. Codes, 2. utg., s. 78-79, forlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Laktaseaktivitet: I henhold til First Suppl. Food Chem. Codex, 2. utg., s. 81-83, forlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Amyloglykosidaseaktivitet: I henhold til H.J. Pieper, Mikrobielle Amylasen bei der Alkoholgewinnung, s. 48-49,

Verlag Ulmer Stuttgart.

Papainaktivitet; I henhold til First Suppl. Food. Chem. Codex, 2. utg., s. 86-87, forlag National Academy of Sciences, Washington, 1974.

Claims (4)

1. Vannuoppløselig enzympreparat hvor enzymene ved hjelp av glutardialdehyd er bundet kovalent til et bærerprotein, karakterisert ved at det er fremstilt ved a) å tilsette en vandig væske som inneholder en glukosidase, protease, katalase eller oksydase eller blandinger derav, til et med formaldehyd herdet protein, fortrinnsvis gelatin, som har en vannopptagelsesevne på 2 til 8 ganger sin tørrvekt, i en slik mengde at væsken oppsuges fullstendig av proteinet under svelling, og b) derefter til den erholdte blanding å tilsette en opp-løsning av glutardialdehyd i en enzymfellende væske, fortrinnsvis en lavere alifatisk alkohol og/eller et lavere alifatisk keton.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av et vannuoppløselig enzympreparat hvor enzymene ved hjelp av glutardialdehyd er bundet kovalent til et bærerprotein, karakterisert ved at a) en vandig væske som inneholder en glukosidase, protease, katalase eller oksydase eller blandinger derav, settes til et med formaldehyd herdet protein, fortrinnsvis gelatin, som har en vannopptagelsesevne på 2 til 8 ganger sin tørrvekt, i en slik mengde at væsken oppsuges fullstendig av proteinet under svelling, og b) til den erholdte blanding settes derefter en oppløsning av glutardialdehyd i en enzymfellende væske, fortrinnsvis en lavere alifatisk alkohol og/eller et lavere alifatisk keton.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at det anvendes en vandig enzymoppløsning i en mengde på 2 til 8 ganger det herdede proteins tørrvekt, og for fiksering anvendes en glutardialdehydmengde på 0,5 til 5%, basert på reaksjonsblandingen.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 2 og 3, karakterisert ved at koblingsreaksjonen gjennomføres i et tidsrom på 5 minutter til 5 timer.