JPH01313530A

JPH01313530A - 絹フイブロイン粉末の製法

Info

Publication number: JPH01313530A
Application number: JP14183588A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Asakura; 哲郎朝倉
Original assignee: Terumo Corp
Current assignee: Terumo Corp
Priority date: 1988-06-10
Filing date: 1988-06-10
Publication date: 1989-12-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野コ本発明は絹フィブロイン粉末の製法に関するものである
。

［従来の技術］従来、絹フィブロイン粉末を作製する方法として、特開
昭５６−１５６８７．特開昭５６−１８５９０、特開昭
５６−３９７８３に開示されているように金属塩濃度を
濃くし、絹フィブロインを沈澱させたのち乾燥させる方
法がある。しかしながら金属イオンが絹フィブロイン中
に残存するという問題があった。

また、酵素を含む、絹フィブロイン粉末を作製する方法
として特開昭５８−４６０９７に蚕糸等を水に浸漬し、
加圧し、加熱し、乾燥した後、粉砕する方法があるが酵
素固定化が難しい等の問題があった。

［発明の解決しようとする課題］本発明は、前記従来の欠点を除去し、架橋処理、化学修
飾等を施さずに、不溶化及びバイオ素材の固定化が同時
に行え、且つゲル、粉末、繊維等の様々な形態による成
型が可能な新規な絹フィブロイン粉末を提供する。

又、前記絹フィブロインを酵素固定化担体とする酵素の
失活及び溶出のない安定な酵素含有絹フィブロイン粉末
を提供する。

［課題を解決するための手段及び作用］この課題を解決
するための本発明の構成は、絹フィブロイン溶液を準備
し、該溶液を凍結乾燥処理する前または後にアルコール
を添加し、粉末にすることを特徴とする。

又、本発明の他の構成は、酵素を含む絹フィブロイン液
を準備し、該溶液を凍結乾燥処理する前または後にアル
コールを添加し、粉末にすることを特徴とする。

［実施例コ以下、本発明の実施例を図面を参照して具体的に説明す
る。

本実施例では、絹フィブロイン粉末は以下に述べる２通
りの方法で調整した。

〈実施例１〉数ＷＴ％の絹フィブロイン水溶液に７０％メタノールを
適量加えることにより、数時間後にゲル状態となる。こ
のゲルを取り出し、凍結乾燥機（東京理化器機株式会社
製、フリーズドライヤーＦＤ−８０）中で、液体窒素を
用い減圧して、凍結乾燥した後粉砕し、絹フィブロイン
粉末（以下Ｔｙｐｅ　Ｉという）を得る。メタノールを
希釈せずにそのまま加えると局所的にゲルが形成され、
均一なゲルに調整することが困難であるので、できるだ
け早くゲル化を起こし、且つメタノールの量が少ないこ
とが望ましく、７０％メタノールを選んだ。

〈実施例２〉数’ｗｔ％の絹フィブロイン水溶液をハンドミキサ等を
用いて激しく攪拌し、その応力により構造転穆させてフ
オーム状にする。これを取り出し凍結乾燥後粉砕し、絹
フィブロイン粉末を得る。この粉末は不溶化が完了して
いないので、更に、激しく攪拌させている８０％メタノ
ール中に懸濁させて、完全に不溶化された絹フィブロイ
ン粉末（以下ＴｙｐｅｌＩという）を得た。

各絹フィブロイン粉末は％Ｎ０．２のメツシュの濾紙で
殆ど濾別される程度の大きさであった。

〈実施例３〉インベルターゼ（シグマ社製；　ｆｒｏｍ　Ｂａｋ−ｅ
ｒｓ　Ｙｅａｓｔ、ＧｒａｄｅＶ　）　、　ａ−アミラ
ーゼ（和光純薬工業製：化学用）を、いずれも遠心分離
（５０ＱＯｒｐｍ、　１０分）して上清を酸素溶液とし
た。

基質としては、サッカロース（国産化学製。

特級）と溶性デンプン（和光純薬製、１級）を用いた。

〈実施例４〉インベルターゼ溶液を絹フィブロイン水溶液に混入し、
これを上記実施例１と２と同様の方法により粉末化して
、インベルターゼ含有絹フィブロイン粉末を得た。比較
のために、アルコールによるインベルターゼ含有絹フィ
ブロインの不溶膜を調整した。

α−アミラーゼ溶液を絹フィブロイン水溶液に混入し、
これを前記実施例１と２と同様の方法により粉末化して
、α−アミラーゼ含有フィブロイン粉末を得た。α−ア
ミラーゼ溶液は、それ自身で絹フィブロインを粉末状沈
殿物を生じさせる能力を保持しており、膜に調整するこ
とはできなかった。これは、ここで用いたα−アミラー
ゼ溶液中に何等かの他の物質が存在するためと考えられ
、次の点の結果から、使用したα−アミラーゼ溶液中に
はプロテアーゼ等が含まれていることが判明した。

１）沈殿物を秤量すると、絹フィブロイン重量が約８割
減少していた。

２）絹フィブロイン−α−アミラーゼ混合系の１３Ｃ−
Ｎ　Ｍ　Ｒスペクトルに分解ピークが観測された。

（測定方法）絹フィブロイン粉末のＩＲ測測定、島津製作所製ＩＲ−
４３５型分光計を用い、試料形状はＫＢ、ｉであった。

＋３Ｃ−Ｎ　Ｍ　Ｒ測定は、ＪＥＯＬ−ＦＸ９０Ｑ　（
ＮＭＲ装置）で２２．５ＭＨｚで行った。蛋白定量はＬ
ｏｗｒｙ法、ＥＳＲ測定は、スピンラベルした絹フィブ
ロイン試料について、ＴＥＯＬ　ＦＥ−３ＡＸ　ＥＳＲ
装置で行った。

インベルターゼの活性評価は、グルコースオキシダーゼ
含有絹フィブロイン膜を用いて、生成されるグルコース
を定量することにより行った。

酵素反応条件は、４０℃、ＰＨ＝４゜６（クエン酸−Ｎ
　ａ　ＯＨ緩衛液：０．２Ｍ）、３０分であった。

α−アミラーゼの活性評価は、ヨウ素−デンプン反応を
用いて行った。具体的には、５５０　ｎｍにおける吸光
度を次式に示す前値で評価した。

前値（％）　−（Ａ　Ｂ　Ｓｓａｍｏｌｅ／　Ａ　Ｂ　
５ｂｒａｎｋ　）×　１００ここで、ＡＢ　ｓ　＊ａｍｏ＋ｅとＡＢＳｂｒａｎｋと
は、それぞれ酸素反応液と基質溶液のヨウ素−デンプン
反応後の吸光度である。α−アミラーゼ量と前値が直線
関係にある範囲で実験を行った。酵素反応条件は、４０
°、ｐＨ＝７．０　（リン酸緩衝液：Ｏ，ＩＭ）、２分
であった。

（測定結果）く絹フィブロイン粉末の構造特性〉第１図に絹フィブロイン粉末（ＴｙｐｅＩ　、　Ｉｒ　
）のアミドＶバンドＩＲスペクトルを示す。７００ａｍ
−’付近に吸収が観測されていることから、βシート構
造が存在することが分かる。このβシート構造が一部に
生じていることは、構造安定化がなされていることを示
すつもりである。

βシート構造とは、分子釦間で水素結合がなされた緻密
な構造を言う。

Ｔｙｐｅｌ　、　Ｈニついて、第２図に示すようにスピ
ンラベル絹フィブロインを粉末に調整し、水中でＥＳＲ
測定を行った。その結果を第２図に示す。多成分系スペ
クトルとなっていることから、不均一構造であると言え
る。ＴｙｐｅＩ、ＩＩの順番にシャープな成分が減少し
ているのが分かる。そこで、コンピューターシミュレー
ションにより成分分離を行い、その結果を表１に示した
。

表１　（１−位％）後から十分に不溶化処理を行ったＴｙｐｅｌｌには、殆
ど運動性の高い領域がなくなる。以上より、ＥＳＲで見
る限り特にＴｙｐｅｌｌのアルコールによる構造転穆は
強固なものであるといえる。

く酵素含有絹フィブロイン粉末の特性〉インベルターゼ
含有絹フィブロイン粉末（ＴｙｐｅＩＩ　）の酵素活性
の熱安定性（７５℃、３０分）と溶出率（１週間後の濾
過液を評価）を表２に示す。

表２（単位％）Ｔｙｐｅ　Ｉでは溶出率が５０％と極めて高く、構造特
性と一致した結果となったが、Ｔｙｐｅｌｌでは、溶出
率は表２のように１５．７％におさえることができた。

その活性の熱安定性は遊離酵素に比較して、固定化に伴
ない８．７５％から８８．５％へと飛躍的に向上した。

α−アミラーゼ含有絹フィブロイン粉末（Ｔｙｐｅｌｌ
　）の酵素活性の熱安定性（９５℃、３．０分）と溶出
率（１週間後の濾過液を評価）の結果を表３に示す。

表３（単位％）この結果はインベルターゼでの結果と同様であり、固定
化に伴ない、その相対活性は４．７３％から１１．９％
へと向上した。このように、デンプンの様な高分子量の
ものであっても、フィブロイン粉末に固定することによ
り、酵素活性が得られる結果となった。尚、Ｔｙｐｅ　
Ｉの溶出率は大きく、活性の評価は困難であった。

以上説明したように、種々の作成方法により得らえた絹
フィブロイン粉末の構造特性をＩＲ及びＥＳＲ測定を用
いて解析した結果、膜についての知見（不均一な構造）
と対応することが判明した。すなわち、膜の場合は表面
付近が緻密なβシート構造となっており、酵素の溶出を
防止する。これに対し粉末は、作製方法によっては粉体
１粒子について全域に運動性の高い領域が分布し、これ
が高分子量の基質に対しても活性を示す原因と考えられ
る。このことは、基本的には、絹フィブロイン粉末はそ
の調整方法を選ぶことにより、どんな酵素でも固定化で
きることを示しており、バイオリアクタ用酵素固定化カ
ラム充填剤を始め、医薬品、医療１食品などに十分応用
できる素材となる。

更に、本発明の絹フィブロインは、酵素ばかりでなく熱
１強酸１強アルカリ、有機溶媒等による処理により二次
的な失活を起こすバイオ素材、例えば微生物等の固定化
担体として適用できる。

［発明の効果］本発明により、架橋処理、化学修飾等を施さずに、固定
化担体の不溶化及びバイオ素材の固定化が同時に行え、
且つゲル、粉末９ｗ４維等の様々な形態による成型が可
能な絹フィブロイン粉末を提供できる。

又、前記絹フィブロインを酵素固定化担体とする酵素の
失活及び溶出のない安定な酵素含有絹フィブロイン粉末
固定化物質を提供できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本実施例の絹フィブロイン粉末のアミドＶバン
ドＩＲスペクトルを示す図、第２図は本実施例の絹フィ
ブロイン粉末のスピンラベルＥＳＲスペクトルを示す図
である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）絹フィブロイン溶液を準備し、該溶液を凍結乾燥
処理する前または後にアルコールを添加し、粉末にする
特徴とする絹フィブロイン粉末の製法。
（２）酵素を含む絹フィブロイン溶液を準備し、該溶液
を凍結乾燥処理する前または後にアルコールを添加し、
粉末にすることを特徴とする絹フィブロイン粉末の製法
。