JPS6115688A - 固定化酵素等およびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 技術分野 本発明は、酵素または菌体の固定化に関する。

さらに具体的には、本発明は、包括剤としてカードラン
ゲルを使用する酵素または菌体の固定化において、酵素
または菌体な包括させたカードランゲルの形成に特色を
有する固定化酵素ないし菌体の製造に関する。

従来より、酵素反応あるいは微生物反応を利用して有用
な物質を製造したり、食品を製造したり、更には産業排
水を処理したり、エネルギーを発生させたりすることが
行なわれている。

一般に、酵素反応は酵素を水に溶解した状態で基質゛に
作用させるいわゆる回分法で行なわれるため、反応終了
液中から酵素を変性させずに回収して、これを再び利用
することは技術的に非常に困難であった。そのため、反
応終了液中に活性をもった酵素が残存していても、通常
は、これを変性、失活させて除去して、反応生成物を分
離している。

すなわち、−反応ごとに酵素を捨てるという非常に不経
済な使用法をしていた。また、酵素の代りに微生物を用
いて酵素反応を行なう方法もあるが、この方法も活性の
残ってＶ）る微生物を変性、失活させて生成物と分離す
る方法がとられているため、酵素を用いる方法と同様の
欠点があった。

先行技術 このような欠点を解決するため、酵素または微生物を固
定化して酵素反応を連続的に行なおうとする試みがなさ
れるようになっている。

このような固定化法として種々の提案がなされている。

しかし、本発明者の知る限りでは、これらの方法はいす
ハも伺等かの問題点を抱えている。

たとえば、ポリアクリルアミドからなるゲル材料の微細
格子中に酵素または菌体を包括させて固定化する方法が
あるが、この方法は固定化のための系の調製に煩雑さが
あるほか、この包括処理時におけるアクリルアミドモノ
マー、重合促進剤、重合開始剤などの使用によって酵素
活性が失なわれたり、不溶化した酵素あるいは微生物の
酵素活性が低くなるという欠点が指摘されている（「醗
工誌」、旦、７８９（１９７３））。また、アクリルア
ミドモノマーが安全衛生上好ましくないことから、ポリ
アクリルアミドによる固定化標品を食品の製造に利用で
きないという欠点もある。別の方法として、に−カラギ
ーナンからなるゲル材料の格子中に酵素または菌体を包
括させて固定化する方法がある。この方法によれば、に
−カラギーナン水溶液と酵素または菌体の混合物を冷却
あるいはに＋、ＮＨ４などのゲル化剤を含む水溶液と接
触させることによってゲル化させることにより、酵素ま
たは菌体を包括固定化させている。しかし、この方法で
得られた固定化標品は水溶液中で徐々に溶解するため、
一般には反応液中にに＋、ＮＩ（４＋などのゲル化剤を
添加して使用することにより溶解を防ぐことが行なわれ
る。従って、このような固定化標品は、ゲル化剤を添加
することが不可卵な食品の製造には使えないという欠点
がある。また、水溶液中での溶解を防ぐために、例えば
ジアルデヒド試薬で固定化標品を処理することカー行な
われるが（特公昭５６−２９５１６号公報）この処理に
よってしばしば酵素または菌体の酵素活性が失活したり
低下するという欠点がある。更に別の固定化方法として
、アルギン酸カル／ウムで酵素または菌体を固定化する
方法も報告されているが、この方法で得られた固定化標
品は、硬度が不充分であることや、酵素反応でしばしば
使用されるリン酸イオンを含む水溶液中で徐々に溶解す
る（　Ｂ　１ｏｔｅｃｈ。

ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ、　１９．３８７（１９７７）と
いう欠点がある。

ところで、微生物多糖類の一つとしてカードランが知ら
れており、そのゲルを固定化酵素担体として使用するこ
とも知られている（「発酵と工業」、亜（２）、８６（
１９７８））。この公知の技術では、カードランの懸濁
水を単独でゲル化させて担体なつくり、これに酵素を所
謂担体結合法によって固定化させている。カードランの
水性ゲルを酵素用担体として使用する点でこの公知の技
術は有意義であるが、担持法が所謂担体結合法によるも
のであるところから、菌体、特に生菌体、を担持させる
には不適当であり、また担体形成と酵素担持とを別の工
程で行な５点でその、製造も煩雑さをまぬがれない。

発明の概要 要　　旨 本発明は上記の点に解決を与えることを目的とし、固定
化剤としてカードランを使用して特定の態様で酵素ない
し菌体の固定化を行なわせることによってこの目的を達
成しようとするものである、従って、本発明による固定
化酵素ないし菌体は、カードランの水性ゲルからなる連
続相とそこに分散した酵素または菌体からなる分散相と
からなること、を特徴とするものである。

一方、本発明による固定化酵素ないし菌体の製造法は、
カードランと酵素または菌体とを含む水懸濁液をつくり
、これを加温してカードランをゲル化させて、生成ゲル
の格子中に酵素または菌体を包括させること、を特徴と
するものである。

また、本発明によるもう一つの固定化酵素ないし菌体の
製造法は、カードランと酵素または菌体とを含む水懸濁
液をつくり、この水懸濁液を下記の群から選んだ補助剤
の存在下に加温してカードランをゲル化させて、生成ゲ
ルの格を中に酵素または菌体な包括させること、を特徴
とするものである。

（Ａｌ　　四ホウ酸ナトリウム、 （Ｂ）　　尿素および（または）塩酸グアニジン、（Ｃ
）（イ）四ホウ酸ナトリウムおよび（ロ）尿素および（
または）塩酸グアニジン 効　　果 このように、本発明は、それ自体担体として公知のカー
ドランの水性ゲルを利用して酵素または菌体（以下、酵
素等という）をその内部に包括させることによって、前
記の目的を達成するのに成功したものである。水に不溶
の力・−トラン粒子の水懸濁液に酵素等を分散させた状
態で加温するとカードランがゲル化してそのゲル格子中
に酵素等が包括されること、ならびにこのようにカード
ランの水性ゲル中に包括された酵素等がその酵素活性を
維持していて固定化標品として機能するだけでなくその
酵素活性が長期間安定であること、は思いがけなかった
ことということができよう。

本発明による固定化標品は酵素等をかなりの量で含んで
いても物理的に破接し難く、また水溶液中で溶解するこ
とがない。本発明固定化標品が水溶液中で溶解しないと
いうことは、カードランが食品添加物として認められて
いるということとあいまって、本発明固定化標品の食品
製造分野での使用を特に有利にするものである。

特定の補助剤を使用する第三の発明によれば、上記の効
果に加えて下記の効果を得ることができる。すなわち、
カードランの水性ゲルはそれ自身で充分な物理的強度を
持っているが、四ホウ酸ナトリウムの添加によってその
強度を著るしく増加させることができる。また、カード
ランのゲル化温度は包括すべき酵素等を失活させない程
度に低いけれども、尿素または塩酸グアニジンの添加に
よってゲル化温度を低下させることができる。尿素およ
び塩酸グアニジンは一般にタン／ぐり変性剤として知ら
れている化合物であるから、これらを酵素または菌体の
固定化の際に使用しえたということは思いがけなかった
ことというべきである。

清明の具体的説明 固定化標品 １、定　義 本発明による固定化標品は、カードランの水性ゲルから
なる連続相とそこに分散した酵素等からなる分散相とか
らなるものである。

本発明において（特許請求の範囲を解釈する場合を含む
）、「カー　トランの水性ゲルからなる」といい、また
［酵素または菌体からなる」ということは、それぞれ「
のみからなる」ということではない。従って、たとえば
、この水性ゲルをつくるに当って四ホウ酸ナトリウムを
使用した場合（詳細後躬）にこね、が水性ゲル中に含ま
れることがありうるが、七のような水性ゲルも本発明の
固定化体高の定義に含まれるのであり、またカードラン
以外の異種ゲルを少量含む場合を排除するものではない
。また、「分散相」とは、酵素等が水性ゲル中に溶解し
て存在する場合をも包含するものである。

２、カードラン 本発明固定化標品の分散相をなす水性ゲルを形成スヘキ
カードランは、β−１，３−グルコシド結合を主体とす
る水不溶性のβ−グルカンであって通常は粉末として入
手され、水の存在下に加熱すると不可逆的に水性ゲルを
形成する物質である。

この多糖類は微生物の産生じたものであることがふつう
であって、その場合の微生物としてはＡｌｃａｌ　ｉｇ
ｅｎｅｓおよびＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　に属する
ものが挙げられる。カードランの詳細については、たと
えば、「発酵と工業」１．翌（２）、８６　（１，９７
８）（前出）を参照することができる。

３、酵素または菌体 本発明による固定化標品の分散相を形成する酵素等は、
合目的的な任意のものでありうる。

具体的には、たとえば、グルコースイソメラーゼ、イン
ベルターゼ、ノミノミイン、α−アミラーゼ、β−アミ
ラーゼ、トリジトン等の酵素、ツユ−トモナス属、ノマ
チルス属等の細菌、ビール酵母、ワイン酵母等の酵母等
が考えられる。

しかし、所謂担体結合法で得られる従来のカードランに
よる固定化・標品がその結合態様から菌体、特に生菌体
、を担持させるのに不適当であったことを考慮すわば、
酵素等として菌体、特に生菌体、を対象とする場合に本
発明の恩恵を最もよく享受することができよう。

カードランと酵素等とを含む水懸濁液は、たとえばカー
ドランの水懸濁液に酵素等を分散させることによってつ
くることができる。

この水懸濁液の濃度は、水１００重量部に対してカード
ラン３〜５重量部、および酵素等（乾物換算）０．１〜
９１＠部程度であることがふつうである。

この水懸濁液は、これら必須成分だけからなる場合の外
に、各種の補助成分が溶存または分散しているものであ
ってもよい。そのような補助成分の一例が四ホウ酸ナト
リウム等であることは前記したところである（詳細後記
）。

２、ゲル化 上記の水懸濁液を４０〜５０℃程度までの温度に加温す
れば、カードランがゲル化して、酵素等が包括された水
性ゲル塊が得られる。

水性ゲル塊中での酵素等の分散が均一であるようにする
ためには、ゲル化前の水懸濁液中のカードランおよび酵
素等が均一に分散していることが望ましい。従って、ゲ
ル化直前まで水懸濁液を適当に攪拌することが好ましい
。

酵素等は一般に耐熱性が低いから、ゲル化のための加温
は必要温度に短時間持ちきたすことによって行なうべき
である。

加熱により生成したゲル塊は、所市バイオリアクターと
して使用するのに適当な大きさに細断し、必要に応じて
水洗することがふつうである。

３、改　変 本発明による固定化標品の分散相をなすカードランの水
性ゲルは、それ自身で充分な物理的強度を持っている。

しかし、ゲル化の際に前記水懸濁液に四ホウ酸ナトリウ
ムを存在させておくと、生成ゲルの強度は箸るしく増大
する。そのような目的のためには、該水懸濁液のモル濃
度として０．１Ｍ程度まで、特に帆０１−〇、Ｑ５Ｍ程
度、の量の四ホウ酸ナトリウムを使用することが好まし
い。

本発明による固定化標品の分散相をなすカードランの水
性ゲルは、それ自身で充分低い温度で形成される。しか
し、酵素等の固定化はできるだけ低い温度で行なうこと
が酵素活性の低下を抑えるうえで望ましいことはいうま
でもなく、耐熱性の劣る酵素等の固定化の場合は特にそ
うである。このような場合には、ゲル化の際に前記水懸
濁液に尿素および（または）塩酸グアニジンを存在させ
ておくと、カードランのゲル化温度を低下させることが
できる。一般に、尿素および塩酸グアニジンはタンツク
の変性剤として知られているものであるから、これらに
対して抵抗性のある酵素等の場合を除けば、その使用量
はあまり多くないことが好ましい。従って、一般に、尿
素および塩酸グアニジンの前記水懸濁液中の濃度はそれ
ぞｈ　ｏ、ｉ〜８Ｍおよび０．１〜１５Ｍ程度であるこ
とが好ましい。また、これらの濃度範囲で両者を併用し
てもよい。また、生じるかも知れないその後の酵素等の
失活を防止するため、尿素または塩酸グアニジンを使用
して生成したゲルは、充分に水洗して残存尿素等の含量
を低下させることが好ましい。

酵素等には、尿素および塩酸グアニジンにより失活しな
いものもある。たとえば、リボヌクレアーゼおよびリゾ
チームは８Ｍ尿素水溶液中でも失活しな”　（Ｐ、Ｄ、
　Ｂｏｙｅｒら：　’ｌ’ｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ、　Ｖ
ｏｌ　１．３２９（１９５９）、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　Ｎ、Ｙ、およびＪ。

１３　ｉｏｃｈｅｍ、　４８　（３）、３５８（１９６
０））。また、ペプノン、パノぐイン、およびカルポキ
ンペゾチダーゼも高漉度の尿素水溶液中でも失活しない
（ＴｈｅＥｎｚｙｍｅｓ、前出）。一方、インベルター
ゼ、トリプシンおよびホスホグルコムターゼは尿素水溶
液中で失活するけれども、その失活は可逆的であって、
尿素を除くと酵素活性が回復する（’ｌ’ｈｅ　Ｅｎｚ
−ｙｍｅｓ、前出）。８−キモ）　ＩＪシアンも尿素濃
度が４Ｍ以上のときにこのような可逆的失活を示す（Ａ
）ａｔｕｒｅ、　１７７　（４，５０６）、４７１　（
１９５６））。

従つて、このような酵素を使用するときは、尿素（また
は塩酸グアニジン）の使用量についてはあまり神経質に
なることはないであろう。尿素によって可逆的失活を示
す酵素等の場合は、前記のゲル化後の水洗が有益である
。なお、８−キモトリシアンの場合は、尿素濃度を適当
に選べば（４Ｍ以下）、失活させずに包括を行なうこと
ができる。

固定化標品の利用 本発明による固定化標品は、酵素等がカードランの水性
ゲル中に包括されているという点に留意すれば、この種
の固定化酵素等と同様の用途べ供することができる。

固定化酵素等が周知であることは前記した通りであるか
ら、本発明固定化標品の利用に関してはこれ以上耐雷す
る必要はないであろう。

実験例 実施例１ （１）グルコースを基質とし、攪拌培養した湿潤酵母菌
体（サツカロミセス・つ・々ルム：水分７５％含有）３
０．９を１４．３重量％のカードラン含有Ｕ濁水２８０
．９中に懸濁させ、該懸濁水を（資）℃に保った。

一方、９Ｍ尿素及び帆０３Ｍ四ホウ酸ナトリウムを含有
する水溶液（塩酸にてｐＨ８に調整）５２０Ｊ？をあら
かじめ５３℃に保ち、該水溶液を上記懸濁水に添加し、
直ちに均一に混合すると同時に４５℃に（資）秒間保温
して、固定化標品を得た。得られた固定化酵母標品を一
辺３間の立方体に細断し、これを８℃の流水で一夜水先
した。

（２）　　上記（１）で得られた固定化酵母標品をグル
コースを基質として攪拌培養してゲル内に酵母を充分に
増殖させてから、該固定化酵母標品を断面の直径５　、
４　ｃＷＬ、高さ３５Ｃｍの円筒カラムに充填し、糖度
１１°Ｐの麦芽汁を流速１００〜２００ｉＡ／時の上昇
流で送入した。反応温度８℃で送出液は３４９／リツト
ルのエタノールを含有しており、また刃口以上連続運転
ができた。

実施例２ （１）　　キャンデイダ・ウチリスより得たインベルタ
ーゼ（生化学工業（株）１８品）１０ｍｇを０．１　Ｍ
酢酸緩衝液（ｐＨ４）２０嶋に（資）℃で溶解した。次
いで、該酵素溶液７　ｒｎｔにカードラフ１ｇを加え、
凹℃に保温した。一方、あらかじめ７３℃に保っておい
た０、０３　Ｍ四ホウ酸ナトリウム水浴液（塩酸″９Ｈ
４に調整）１３ｍＡを上記溶液に加え、混合すると同時
に５８’Ｃに加秒間保って、カードランをゲル化させて
インベルターゼを固定化した。得られた固定化インベル
ターゼ標品を一辺３ｍＭの立方体に細断し、８℃の流水
で一夜水洗した。

（２）　　上記）１）で得らｈた固定ｆヒインベルター
ゼ標品を２％蔗糖を含む０．１ＭＭ酢酸緩衝液ｐＨ４）
５０彪に添加して、３０’Ｃで閣分間酵素反応を行なっ
た。

生成するグルコースを酸素法により測定することにより
、インベルターゼ活性を潰（１定した。その結果、固定
化インイルターぜ標品の酵素活性は固定化しないインベ
ルターゼの活性と同じレベルを１呆持していた。

また、固定化インベルターゼ標品をくり返し酵素反応に
使用しても、第１表に示す通り活性は殆んど低下しなか
った。

第　　　１　　　表 ＊　固定化しないインベルターゼの活性を１００とした
ときの相対的な活性。すなわち酵素溶液７Ｒ８を基質溶
液５０厩に添加し、加℃、３０分間酵酵素応させた時に
生成するグル；−ス量を１００とした。

実施例３ （１）キャンディダーウチリスより得たインベルターゼ
（生化学工業（株）製品）ｌＯｒｎｇを０．１Ｍ酢酸緩
衝液（ｐＨ４）２０＋ｕに（至）℃で溶解した。次いで
、該酵累溶’ＩＱ７７　ｍｂにカードラン帆５ｇを加え
て、Ｉ℃に保温した。一方、あらかじめ４５℃に保って
おいた、９Ｍ＠酸グアニジ／及び帆０３Ｍ四ホウ酸ナト
リウムを含有する水浴液（塩酸にてｐＨ４に調整）１３
ｍＡを上記溶液に加え、直ちに混合すると同時に、４０
℃に１分間保って、インベルターゼを固定化した。得ら
れた固定化インベルターゼ標品を一辺３　ｔｎｔｘの立
方体に細断し、８℃の流水で一夜水洗した。

（２）上記（１）で得られた固定化インベルターゼ標品
の酵素活性を実施例２と同じ方法で測定した。

その結果、固定化インベルターゼ村品の酵素活性は固定
化しないイン（ルターゼの活性と同じレベルを保持して
いた。また、固定化インベルターゼ標品をくり返し酵素
反応に使用しても、第２表に第２表 ＊　第１表参照 実施例４ （１）　　キャンデイダ・ウチリスより得たインベルタ
ーゼ（生化学工業（株）製品）１０ｒｎ９を０．１Ｍ酢
酸緩衝液ＣｐＨ４）２０ｍｂに３０℃で溶解した。次Ｖ
・で、該酵素溶液７祷にカードラフ１ｇを加えて、Ｉ℃
に保温した。一方、あらかじめ７３℃に保っておいた帆
０３Ｍ四ホウ酸ソーダ水溶液（塩酸にてｐＨ４に調整）
１３幅を上記溶液に加え、直ちに混合すると同時に詔℃
にＩ秒間保って、インベルターゼを固定化した。得られ
た固定化インベルターゼ標品を一辺３闘の立方体に細断
し、８℃の流水で一夜水洗した。

（２）上記（１）で得られた固定化インベルターゼ標品
の酵素活性を実施例、２と同じ方法で測定した。

その結果、固定化インベルターゼ標品の酵素活性は固定
化しないインベルターゼの活性と同じ活性を保持してい
た。また、固定ｆにインベルターぜ標品なくり返し噛累
反応に使用しても、第３表に示す通り活性は殆んど低下
しなかった。

紀３表 ＊　第１表参照 遺りＵ汀 〔１）　　カードランの水懸濁液に四ホウ酸ナトリウム
を存在させてゲル化させた時の生成ゲル強度水１００祷
にカードラン５ｇを懸濁させ、この懸濁液を７０℃で３
分間加温してゲル化させる際に、この懸濁液に種々の濃
度で四ホウ酸ナトリウムを添加して生成ゲルの強度を調
べた。その結果、四ホウ酸ナトリウムの濃度が０．０１
〜０．０５　Ｍのときに生成ゲルの強度が最大となった
。

ｒ２＋　　カードランの水懸濁液に尿素を存在させて加
温した時のゲル化開始温度 水１００ｍＡにカードラン５ｇおよび四ホウ酸ナトリウ
ム帆８ｇを添加し、この懸濁液を加温する際に該懸濁液
に種々の濃度で尿素を添加して、ゲル化開始温度を測定
した。その結果、尿素の濃度が高くなるにつれてゲル化
開始温度は下がり、尿素の濃度が６〜７Ｍではゲル化開
始温度は約４０℃であった。

（３１カードランゲルの流水による水洗がゲル中に存在
する尿素を除去する効果 水１００ｍＡにカードラン５ｇを懸濁させ、この懸濁液
を４５℃に加温してゲル化させる際に、この懸濁液に四
ホウ酸ナトリウム帆８ｇおよび尿素３６９を存在させて
ゲル化させた。次に、得られたゲルを８℃の流水で水洗
して経時的にゲル中の残存尿素量を調べたところ、水洗
開始後約９０分でゲル中の尿素は完全に除去さ灼た。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、カードランの水性ゲルからなる連続相とそこに分散
   した酵素または菌体からなる分散相とからなることを特
   徴とする、固定化酵素ないし菌体。 ２、酵素または菌体の濃度が２〜７５重量％である、特
   許請求の範囲第１項に記載の固定化酵素ないし菌体（た
   ゞし、この重量％は、乾燥状態基準である）。 ３、カードランと酵素または菌体とを含む水懸濁液をつ
   くり、これを加温してカードランをゲル化させて、生成
   ゲルの格子中に酵素または菌体を包括させることを特徴
   とする、固定化酵素ないし菌体の製造法。 ４、カードランと酵素または菌体とを含む水懸濁液をつ
   くり、この水懸濁液を下記の群から選んだ補助剤の存在
   下に加温してカードランをゲル化させて、生成ゲルの格
   子中に酵素または菌体を包括させることを特徴とする、
   固定化酵素ないし菌体の製造法。 （Ａ）四ホウ酸ナトリウム、 （Ｂ）尿素および（または）塩酸グアニジン、（Ｃ）（
   イ）四ホウ酸ナトリウムおよび（ロ）尿素および（また
   は）塩酸グアニジン ５、水懸濁液中の四ホウ酸ナトリウムの濃度が０．００
   １〜０．１Ｍであり、尿素および塩酸グアニジンの濃度
   がそれぞれ０．１〜８Ｍおよび０．１〜１５Ｍである（
   たゞし、上記濃度範囲で両者を併用してもよい）、特許
   請求の範囲第４項に記載の方法。 ６、生成ゲルを水洗して、使用した補助剤の含量を低下
   させる、特許請求の範囲第４〜５項のいずれかに記載の
   方法。